專利名稱：一種高產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢桿菌工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌工程菌，特別是一種通過同源重組敲除nagA及nagB提高重組枯草芽孢桿菌乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量的方法，屬于遺傳工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乙酰氨基葡萄糖是生物體內(nèi)的一種單糖，廣泛存在于細(xì)菌、酵母、霉菌、植物以及動物體內(nèi)。在人體中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖單元的合成前體，其對修復(fù)和維持軟骨及關(guān)節(jié)組織功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被廣泛作為藥物和營養(yǎng)膳食添加來治療和修復(fù)關(guān)節(jié)損傷。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妝品和制藥領(lǐng)域也具有諸多應(yīng)用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解蝦殼或蟹殼中甲殼素生產(chǎn)，此方法產(chǎn)生的廢液對環(huán)境污染較為嚴(yán)重，而且得到的產(chǎn)品易引起過敏反應(yīng)，不適宜海鮮過敏的人群服用?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)是一種被廣泛用作食品酶制劑及重要營養(yǎng)化學(xué)品的生產(chǎn)宿主，其產(chǎn)品被FDA認(rèn)證為“generally regarded as safe”(GRAS)安全級另ij。因此，運(yùn)用代謝工程手段構(gòu)建重組枯草芽孢桿菌是生產(chǎn)食品安全級乙酰氨基葡萄糖的有效途徑。然而，乙酰氨基葡萄糖是枯草芽孢桿菌優(yōu)先利用的碳源物質(zhì)，當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖耗盡后，胞外乙酰氨基葡萄糖被轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)，通過脫氨基、脫乙酰作用，以果糖-6-磷酸形式進(jìn)入細(xì)胞糖酵解途徑，參與細(xì)胞代謝。因此，需要敲除乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶編碼基因(nagA)和乙酰氨基葡萄糖脫氨基酶編碼基因(nagB)，以阻斷乙酰氨基葡萄糖的降解，提高乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量。本發(fā)明通過同源重組敲除乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶編碼基因(nagA)和乙酰氨基葡萄糖脫氨基酶編碼基因(nagB)，阻斷宿主菌降解乙酰氨基葡萄糖途徑。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種高產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌工程菌，是將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) S288C中氨基葡萄糖乙?；妇幋a基因GNAl克隆到枯草芽孢桿菌，同時敲除該枯草芽孢桿菌乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶編碼基因nagA、乙酰氨基葡萄糖脫氨基酶編碼基因nagB及乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因nagP構(gòu)建而成的枯草芽孢桿菌工程菌。所述氨基葡萄糖乙?；妇幋a基因如NCB1-Gene ID:850529所示；乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶編碼基因如NCB1-Gene ID:936621所示；乙酰氨基葡萄糖脫氨基酶編碼基因nagB如NCB1-Gene ID:936619所示；乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因nagP如NCB1-GeneID :938807 所示。所述氨基葡萄糖乙?；妇幋a基因通過表達(dá)載體pP43NMK進(jìn)行表達(dá)；所述枯草芽抱桿菌為 Bacillus subtilisl68。本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種構(gòu)建上述枯草芽孢桿菌工程菌的方法，具體方法如下
敲除乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因(nagP)，阻斷宿主菌從胞外轉(zhuǎn)運(yùn)乙酰氨基葡萄糖至胞內(nèi)的途徑。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步敲除在已敲除乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶編碼基因(nagA)和乙酰氨基葡萄糖脫氨基酶編碼基因(nagB)，阻斷乙酰氨基葡萄糖降解途徑。在已敲除nagP、nagA及nagB的宿主菌內(nèi)，運(yùn)用表達(dá)載體pP43NMK過量表達(dá)釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) S288C中氨基葡萄糖乙酰化酶編碼基因(GNA1),通過代謝工程改造，實(shí)現(xiàn)乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量的提高。重組枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)及發(fā)酵種子培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCllO。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，胰蛋白胨10，酵母粉5，NaC110。培養(yǎng)條件將37°C C、200rpm下培養(yǎng)12h的種子以5%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，于37 °C C、200rpm條件下培養(yǎng)30h。乙酰氨基葡萄糖的測定方法高效液相 色譜(HPLC)檢測法Agilentl200,RID 檢測器，NH2 柱(250X4. 6mm,5 μ m),流動相:70%乙腈,流速O. 75mL/min,柱溫30°C C,進(jìn)樣體積為10 μ L。本發(fā)明提供的重組枯草芽孢桿菌可提高乙酰氨基葡萄糖在胞外積累，其濃度可達(dá)到1. 23gL，為進(jìn)一步代謝工程改造枯草芽孢桿菌生產(chǎn)氨基葡萄糖奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明提供的重組枯草芽孢桿菌構(gòu)建方法簡單，便于使用，具有很好地應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1敲除乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因(nagP)根據(jù)NCBI上公布的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilisl68，購自美國典型微生物保藏中心，ATCC No. 27370)乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因(nagP)上下游序列，設(shè)計(jì)敲除框同源臂擴(kuò)增引物，左臂上下游引物分別為nagP-L-F 5’ -AATGAGATGCCTGTGTCGGAATA-3’ 和 nagP-L-R 5’ -TCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCATCCACTCTCCAAACGAGTTGATAC-3’ ；右臂上下游引物分別為nagP-R-F:5， -ACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCCGCGGTCTTAACCGGGTTA-3，和 nagP-R-R:5，-TACGACAACGCCCAGCTTC-3 ’。運(yùn)用上述引物從枯草芽孢桿菌(Baci I Iussubtilisl68)基因組中 擴(kuò)增nagP敲除框左、右臂。根據(jù)NCBI上公布的p7Z6質(zhì)粒序列(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，聞新博士惠贈，NCBI accessionno. EU541492)，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增博來霉素抗性基因(zeo),上下游引物分別為nagP-Z_F:5， -GTATCAACTCGTTTGGAGAGTGGATAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3，和 nagP-Z-R:5，-TAAAGATAACCCGGTTAAGACCGCGGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC-3，。通過融合 PCR 方法，將敲除框左、右臂及抗性基因融合為nagP敲除框。通過測序確認(rèn)nagP敲除框構(gòu)建成功。將構(gòu)建好的敲除框轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilisl68),通過博來霉素抗性平板篩選、菌落PCR驗(yàn)證，確認(rèn)乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因(nagP)敲除成功，得到重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建BSGNl。實(shí)施例2敲除乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶編碼基因(nagA)和乙酰氨基葡萄糖脫氨基酶編碼基因(nagB)
將質(zhì)粒pTSC (南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，聞新博士惠贈，NCBI accession no. EU864234)轉(zhuǎn)化已敲除nagP重組枯草芽孢桿菌，消除博來霉素抗性。由于乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶編碼基因(nagA)和乙酰氨基葡萄糖脫氨基酶編碼基因(nagB)在枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilisl68)基因組同一操縱子內(nèi)，因此采用一次同源重組即可同時敲除nagA及nagB兩個基因。根據(jù)NCBI上公布的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilisl68)乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶編碼基因(nagA)和乙酰氨基葡萄糖脫氨基酶編碼基因(nagB)上下游序列，設(shè)計(jì)敲除框同源臂擴(kuò)增引物，左臂上下游引物分別為nagAB-L-F 5，-CTGTATCAATGATTTTCATGGTCTCTT-3，，nagAB-L-R 5，-TCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCTCATTTTCTGTCACGATCGCAA-3，;右臂上下游引物分別為nagAB-R-F 5，-ACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCAAGGAACATGCTGACTTATGAATATCA-3，，nagAB-R-F 5，-CAAAAAGGTGGAAACCGATTATT-3 ’。運(yùn)用上述引物從枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilisl68)基因組中擴(kuò)增nagA、nagB敲除框中包含的左臂和右臂。根據(jù)NCBI上公布的p7Z6質(zhì)粒序列(NCBI accession no. EU541492)，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增博來霉素抗性基因(zeo),上下游引物分別為nagAB-Z-F 5’ -ACATTGCGATCGTGACAGAAAATGAGAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’，nagAB-Z-R 5，-ATATTCATAAGTCAGCATGTTCCTTGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC-3 ’。通過融合 PCR 方法，將敲除框左、右臂及抗性基因融合為nagA、nagB敲除框。通過測序確認(rèn)nagA、nagB敲除框構(gòu)建成功。將構(gòu)建好的nagA 、nagB敲除框轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌(BSGN1),通過博來霉素抗性平板篩選，菌落PCR驗(yàn)證，確認(rèn)乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶編碼基因(nagA)和乙酰氨基葡萄糖脫氨基酶編碼基因(nagB)敲除，得到重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建BSGN3。實(shí)施例3構(gòu)建產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖重組枯草芽孢桿菌根據(jù)NCBI上公布的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288C,購自美國典型微生物保藏中心，ATCC204508)中氨基葡萄糖乙酰化酶編碼基因(GNA1)，設(shè)計(jì)引物GNAl-F 5’ -GGGGTACCATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGAGCTTACCCGATGGATTTTATA-3’，GNAl-R :5’ -CCCAAGCTTCTATTTTCTAATTTGCATTTCCACG-3’。使用上述引物從釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288C)基因組中擴(kuò)增氨基葡萄糖乙?；妇幋a基因(GNA1)。擴(kuò)增片段經(jīng)KpnI和HIndIII雙酶切后連接至pP43NMK表達(dá)載體(美國弗吉尼亞理工大學(xué)，張曉舟博士惠贈)。酶切驗(yàn)證并測序，確認(rèn)重組質(zhì)粒PP43-GNA1構(gòu)建成功。將構(gòu)建好的表達(dá)載體pP43-GNAl轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌BSGN3。采用GNAl-F及GNAl-R引物挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR，出現(xiàn)480bp條帶，驗(yàn)證重組枯草芽孢桿菌構(gòu)建成功。實(shí)施例4發(fā)酵生產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖將37°C C、200rpm下培養(yǎng)12h的種子以5%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，于37°C C、200rpm條件下培養(yǎng)30h。發(fā)酵30h，發(fā)酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量達(dá)到1. 23gL。通過在已敲除乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因(nagP)宿主菌中進(jìn)一步敲除乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶編碼基因(nagA)和乙酰 氨基葡萄糖脫氨基酶編碼基因(nagB)，并且在已敲除nagP、nagA及nagB宿主中過量表達(dá)氨基葡萄糖乙酰化酶編碼基因(GNA1)，實(shí)現(xiàn)了乙酰氨基葡萄糖在重組枯草芽孢桿菌胞 外產(chǎn)量的提高。
權(quán)利要求
1.一種高產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢桿菌工程菌，其特征是將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) S288C中氨基葡萄糖乙?；妇幋a基因GNAl克隆到枯草芽孢桿菌，同時敲除該枯草芽孢桿菌乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶編碼基因nagA、乙酰氨基葡萄糖脫氨基酶編碼基因nagB及乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因nagP構(gòu)建而成的枯草芽孢桿菌工程菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿菌工程菌，其特征在于，所述氨基葡萄糖乙?；妇幋a基因如NCB1-Gene ID :850529所示；乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶編碼基因如NCB1-GeneID:936621所示；乙酰氨基葡萄糖脫氨基酶編碼基因nagB如NCB1-Gene ID:936619所示；乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因nagP如NCB1-Gene ID:938807所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌工程菌，其特征在于，將氨基葡萄糖乙酰化酶編碼基因連接到表達(dá)載體PP43NMK上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的枯草芽孢桿菌工程菌，其特征在于所述枯草芽孢桿菌為 Bacillus subtilisl68。
5.權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿菌工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟 1)構(gòu)建乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因nagP敲除框，通過同源重組將敲除框中的博來霉素抗性基因zeo替代枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 168基因組中酰氨基葡萄糖脫乙酰酶編碼基因nagP ； 2)構(gòu)建乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶編碼基因nagA和乙酰氨基葡萄糖脫氨基酶編碼基因nagB敲除框，通過同源重組將敲除框中的博來霉素抗性基因zeo替代枯草芽孢桿菌基因組中乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶編碼基因nagA和乙酰氨基葡萄糖脫氨基酶編碼基因nagB ； 3)克隆釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)S288C的氨基葡萄糖乙?；妇幋a基因GNA1，連接到質(zhì)粒pP43NMK上，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化已敲除乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因nagP、乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶編碼基因nagA和乙酰氨基葡萄糖脫氨基酶編碼基因nagB的枯草芽孢桿菌，得到產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌工程菌。
6.應(yīng)用權(quán)利要求1-4任一所述枯草芽孢桿菌工程菌發(fā)酵生產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖的方法，將37°C C、200rpm下培養(yǎng)12h的重組枯草芽孢桿菌以5%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，于37 0C C、200rpm 條件下發(fā)酵 30h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢桿菌工程菌及其應(yīng)用，以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis168)作為出發(fā)菌株，在同源重組敲除乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因(nagP)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步敲除乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶編碼基因(nagA)和乙酰氨基葡萄糖脫氨基酶編碼基因(nagB)，從而阻斷了宿主菌中乙酰氨基葡萄糖降解途徑。在已敲除nagA及nagB的宿主菌中，過量表達(dá)來源于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288C)的氨基葡萄糖乙?；妇幋a基因(GNA1)，加強(qiáng)乙酰氨基葡萄糖合成途徑，得到了產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖重組枯草芽孢桿菌，產(chǎn)量達(dá)到1.23g/L，為進(jìn)一步代謝工程改造枯草芽孢桿菌生產(chǎn)氨基葡萄糖奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12R1/125GK103060252SQ20121057024
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月25日
發(fā)明者陳堅(jiān), 堵國成, 劉龍, 李江華, 劉延峰 申請人:江南大學(xué)