專利名稱：一種高產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖重組枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖重組枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用，屬于遺傳工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乙酰氨基葡萄糖是生物體內(nèi)的一種單糖，廣泛存在于細(xì)菌、酵母、霉菌、植物以及動(dòng)物體內(nèi)。在人體中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖單元的合成前體，其對(duì)修復(fù)和維持軟骨及關(guān)節(jié)組織功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被廣泛作為藥物和營(yíng)養(yǎng)膳食添加來(lái)治療和修復(fù)關(guān)節(jié)損傷。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妝品和制藥領(lǐng)域也具有諸多應(yīng)用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解蝦殼或蟹殼中甲殼素生產(chǎn)，此方法產(chǎn)生的廢液對(duì)環(huán)境污染較為嚴(yán)重，而且得到的產(chǎn)品易引起過(guò)敏反應(yīng)，不適宜海鮮過(guò)敏的人群服用?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)是一種被廣泛用作食品酶制劑及重要營(yíng)養(yǎng)化學(xué)品的生產(chǎn)宿主，其產(chǎn)品被FDA認(rèn)證為“generally regarded as safe” (GRAS)安全級(jí)別。因此，運(yùn)用代謝工程手段構(gòu)建重組枯草芽孢桿菌是生產(chǎn)食品安全級(jí)乙酰氨基葡萄糖的有效途徑。然而，乙酰氨基葡萄糖是一種枯草芽孢桿菌優(yōu)先利用的碳源物質(zhì)，當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖耗盡后，胞外乙酰氨基葡萄糖被轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)并且被分解利用，導(dǎo)致胞外乙酰氨基葡萄糖濃度迅速降低。為實(shí)現(xiàn)乙酰氨基葡萄糖的積累需要敲除乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因(nagP)，可以通過(guò)阻斷乙酰氨基葡萄糖從胞外轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)的過(guò)程，從而提高氨基葡萄糖產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是構(gòu)建一種能提高重組枯草芽孢桿菌生產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖的方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案為所述重組枯草芽抱桿菌為將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S288C中氛基葡萄糖乙?；妇幋a基因GNAl克隆到枯草芽孢桿菌，同時(shí)敲除該枯草芽孢桿菌乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因nagP構(gòu)建而成的重組枯草芽孢桿菌。所述氨基葡萄糖乙?；妇幋a基因如NCBI-Gene ID:850529所示，乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因如NCBI-Gene ID:938807所示。本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種構(gòu)建上述重組枯草芽孢桿菌的方法。敲除乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因(nagP )，阻斷宿主菌從胞外轉(zhuǎn)運(yùn)乙酰氨基葡萄糖至胞內(nèi)的途徑。在已敲除nagP的宿主菌內(nèi)，運(yùn)用表達(dá)載體PP43NMK過(guò)量表達(dá)釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288C)中氨基葡萄糖乙?；妇幋a基因(GNA1),通過(guò)改造代謝途徑，實(shí)現(xiàn)乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量的提高。重組枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)及發(fā)酵種子培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCllO。
發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，胰蛋白胨10，酵母粉5，NaC110。培養(yǎng)條件將37° C、200rpm下培養(yǎng)12h的種子以5%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，于37。C、200rpm條件下培養(yǎng)30h。乙酰氨基葡萄糖的測(cè)定方法高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)法Agilentl200,RID 檢測(cè)器，NH2 柱(250X4. 6mm,5 μ m),流動(dòng)相:70%乙腈,流速O. 75mL/min,柱溫30。C,進(jìn)樣體積為10 μ L。本發(fā)明提供的重組枯草芽孢桿菌可提高乙酰氨基葡萄糖在胞外積累，其濃度可達(dá)到415mg/L，為進(jìn)一步代謝工程改造枯草芽孢桿菌生產(chǎn)氨基葡萄糖奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明提供的重組枯草芽孢桿菌構(gòu)建方法簡(jiǎn)單，便于使用，具有很好地應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I敲除乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因(nagP)根據(jù)NCBI上公布的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis 168，購(gòu)自美國(guó)典型微生物保藏中心，ATCCNo. 27370)乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因(nagP)上下游序列，設(shè)計(jì)敲除框同源臂擴(kuò)增引物，左臂上下游引物分別為nagP-L-F:5’ -AATGAGATGCCTGTGTCGGAATA-3’ 和 nagP-L-R 5’ -TCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCATCCACTCTCCAAACGAGTTGATAC-3’ ；右臂上下游引物分別為nagP-R-F:5， -ACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCCGCGGTCTTAACCGGGTTA-3，和 nagP-R-R: 5，-TACGACAACGCCCAGCTTC-3 ’。運(yùn)用上述引物從枯草芽孢桿菌(Baci I Iussubtilis 168)基因組中擴(kuò)增敲除框中包含的左臂和右臂。根據(jù)NCBI上公布的p7Z6質(zhì)粒序列(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，聞新博士惠贈(zèng)，NCBI accession no. EU541492),設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增博來(lái)霉素抗性基因(zeo),上下游引物分別為nagP-Z_F:5’ -GTATCAACTCGTTTGGAGAGTGGATAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’ 和 nagP-Z-R:5，-TAAAGATAACCCGGTTAAGACCGCGGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC-3，。通過(guò)融合 PCR 方法，將敲除框左、右臂及抗性基因融合為敲除框。通過(guò)測(cè)序確認(rèn)nagP敲除框構(gòu)建成功。實(shí)施例2重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建將構(gòu)建好的敲除框轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis 168),通過(guò)博來(lái)霉素抗性平板篩選、菌落PCR驗(yàn)證，確認(rèn)乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因(nagP)敲除成功，得到重組枯草芽孢桿菌BSGNl。根據(jù)NCBI上公布的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288C,購(gòu)自美國(guó)典型微生物保藏中心，編號(hào)ATCC204508)中氨基葡萄糖乙?；妇幋a基因(GNA1)，設(shè)計(jì)引物 GNAl-F :5’ -GGGGTACCATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGAGCTTACCCGATGGATTTTATA-3’，GNAl-R :5’ -CCCAAGCTTCTATTTTCTAATTTGCATTTCCACG-3’。使用上述引物從釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288C)基因組中擴(kuò)增氨基葡萄糖乙酰化酶編碼基因(GNA1)。擴(kuò)增片段經(jīng)KpnI和HIndIII雙酶切后連接至pP43NMK表達(dá)載體(美國(guó)弗吉尼亞理工大學(xué)，張曉舟博士惠贈(zèng))。酶切驗(yàn)證并測(cè)序，確認(rèn)重組質(zhì)粒PP43-GNA1構(gòu)建成功。將構(gòu)建好的表達(dá)載體pP43-GNAl轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌BSGNl。采用GNAl-F及GNAl-R引物挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR，出現(xiàn)480bp條帶，驗(yàn)證重組枯草芽孢桿菌構(gòu)建成功。
實(shí)施例3發(fā)酵生產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖將37° C、200rpm下培養(yǎng)12h的種子以5%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，于37° C、200rpm條件下培養(yǎng)30h。發(fā)酵30h，發(fā)酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量達(dá)到415mg/L。通過(guò)敲除乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因(nagP)，并且在已敲除nagP宿主中過(guò)量表達(dá)氨基葡萄糖乙?；妇幋a基因(GNA1)，實(shí)現(xiàn)了乙酰氨基葡萄糖在重組枯草芽孢桿菌胞外產(chǎn)量的提聞。
權(quán)利要求
1.一種高產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖重組枯草芽孢桿菌，其特征在于是將釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)S288C中氨基葡萄糖乙?；妇幋a基因GNAl克隆到枯草芽孢桿菌，同時(shí)敲除該枯草芽孢桿菌乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因nagP構(gòu)建而成的重組枯草芽孢桿菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，所述氨基葡萄糖乙酰化酶編碼基因如NCBI-Gene ID:850529所示，乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因如NCBI-GeneID :938807 所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，將氨基葡萄糖乙?；妇幋a基因連接到表達(dá)載體PP43NMK上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于所述枯草芽孢桿菌為Baci IIussubti Iisl68ο
5.權(quán)利要求I所述重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟 1)敲除乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因 構(gòu)建乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因敲除框，通過(guò)同源重組將敲除框中的博來(lái)霉素抗性基因zeo替代枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 168基因組中乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因nagP ； 2)構(gòu)建產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖重組枯草芽孢桿菌 克隆釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) S288C的氨基葡萄糖乙酰化酶編碼基因，連接到質(zhì)粒PP43NMK上；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化已敲除乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因枯草芽孢桿菌，得到產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖重組枯草芽孢桿菌。
6.應(yīng)用權(quán)利要求1-3任一所述重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖的方法，將37° C、200rpm下培養(yǎng)12h的重組枯草芽孢桿菌以5%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，于37° C、200rpm條件下發(fā)酵30h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖重組枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用，屬于遺傳工程領(lǐng)域。本發(fā)明是以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis168)作為出發(fā)菌株，通過(guò)同源重組敲除乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因(nagP)，阻斷了宿主菌從胞外轉(zhuǎn)運(yùn)乙酰氨基葡萄糖至胞內(nèi)途徑。在已敲除nagP的宿主菌內(nèi)，過(guò)量表達(dá)來(lái)源于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288C)的氨基葡萄糖乙?；妇幋a基因(GNA1)，加強(qiáng)乙酰氨基葡萄糖合成途徑，提高了重組枯草芽孢桿菌中乙酰氨基葡萄糖的產(chǎn)量，達(dá)到415mg/L，為進(jìn)一步代謝工程改造枯草芽孢桿菌生產(chǎn)氨基葡萄糖奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102978149SQ201210570249
公開日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月25日
發(fā)明者陳堅(jiān), 堵國(guó)成, 劉龍, 李江華, 劉延峰 申請(qǐng)人:江南大學(xué)