一種簡便的細菌基因敲除的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種細菌基因敲除的方法，包括以下步驟：pSIM19轉(zhuǎn)化E.coliO56，得到含pSIM19的重組E.coliO56；制備含pSIM19的E.coliO56電感受態(tài)細胞；以質(zhì)粒pKD4為模版，PCR擴增帶有目的基因wfaQ同源臂的kana基因片段，向電感受態(tài)細胞重組菌E.coliO56/pSIM19中加入帶有目的基因wfaQ同源臂的kana基因片段；高壓電擊完成后立即加入SOC液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)，篩選得到目的基因已經(jīng)被消除的陽性重組子。本方法非常簡便，省去了誘導劑使用濃度摸索等繁瑣的環(huán)節(jié)。
【專利說明】一種簡便的細菌基因敲除的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的是涉及一種簡便的細菌基因敲除的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]同源重組作為體內(nèi)基因工程的新方法使DNA修飾變得更容易、更有效，它是功能基因組分析的高效方法，可以在沒有限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶的情況下實現(xiàn)DNA修飾。
[0003]傳統(tǒng)同源重組方法是利用RecA重組系統(tǒng)，但是以RecA同源重組為基礎(chǔ)的基因敲除有很大的不足，如需要較長的靶基因同源臂，重組率很低，很難獲得所需要的重組子等。1998年，Murphy首次報道了利用λ噬菌體Red重組系統(tǒng)在大腸桿菌染色體上進行基因替換的方法，將λ噬菌體的重組功能基因exo，bet, gam在多拷貝質(zhì)粒上表達，用于野生型E.coli宿主菌的基因替換。近年來，Red重組以其較短的同源臂和較高的重組效率等優(yōu)點廣泛用于大腸桿菌的基因修飾中。Red同源重組由λ曬菌體的exo, bet, gam 3個基因組成，分別編碼Exo、Beta、Gam 3種蛋白質(zhì)。Exo作為雙鏈核酸外切酶，可以結(jié)合在雙鏈DNA.的末端，從5'向3'降解DNA單鏈，產(chǎn)生3'末端單鏈懸突(3' single strand DNAoverhangs)。Beta作為單鏈退火蛋白，結(jié)合在由核酸外切酶(Exo)外切產(chǎn)生的3'末端單鏈懸突上，促進DNA互補鏈的退火。Gam蛋白作為Exo、Beta的輔助蛋白，可與RecB⑶核酸外切酶結(jié)合，抑制RecBCD核酸外切酶活性，抑制體內(nèi)的外源DNA的降解。RecBCD是高度ATP依賴的雙鏈DNA核酸外切酶，在大腸桿菌中用于基因的同源重組和DNA復制叉的修復。研究表明，Gam蛋白對于反應(yīng)進行中的RecBCD雙鏈DNA核酸外切酶的抑制作用很小。事實上，Gam蛋白并不能抑制一個正在進行的反應(yīng)，而是在ATP的存在下分離連在雙鏈DNA末端的 RecBCD。
[0004]對于敲除細菌基因的Red重組系統(tǒng)共需要三種質(zhì)粒:一種質(zhì)粒是表達重組酶相關(guān)的Exo、Beta、Gam這3種蛋白質(zhì)的輔助質(zhì)粒；另一種質(zhì)粒含有兩側(cè)帶有翻轉(zhuǎn)酶結(jié)合位點(flipase recognition target, FRT)的抗性基因,用作PCR模板；最后一種質(zhì)粒是抗性基因消除質(zhì)粒，其含有的重組酶能特異識別FRT位點，從而消除染色體上同源重組的抗性基因。對于整個基因敲除過程中，最重要的是控制同源所需的三個蛋白的表達。表達這三個蛋白的質(zhì)粒如pKD46、pRedET。這兩個質(zhì)粒均含有溫度敏感型復制起始點oriRlOl，在37°C培養(yǎng)時能夠正常復制，而高于37°C時會自動丟失。此外，pKD46上還含有ParaB啟動子調(diào)控的exo、bet、gam基因，它們通過L-阿拉伯糖誘導表達，并攜帶氨芐青霉素抗性基因作為篩選標記。而PRedET上調(diào)控exo、bet、gam基因的表達的啟動子則是Pbad啟動子；同樣是通過L-阿拉伯糖誘導表達；但是Pbad啟動子比ParaB啟動子的調(diào)控方式更嚴謹，Pbad啟動子同時還受araC基因產(chǎn)物的正調(diào)控和負調(diào)控，araC作為轉(zhuǎn)錄阻遏物可以與L-阿拉伯糖形成復合物，從而啟動轉(zhuǎn)錄。
[0005]對于敲除細菌基因組中的靶基因目前常選用Red重組系統(tǒng)。不同的質(zhì)粒上λ噬菌體的重組功能基因exo，bet, gam的表達調(diào)控方式不一樣。對于選用由L-阿拉伯糖誘導重組功能蛋白表達的質(zhì)粒，敲除不同基因則需要摸索L-阿拉伯糖的誘導濃度，此過程耗時耗力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]基于此，本發(fā)明提供一種簡便的細菌基因敲除的方法。
[0007]實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0008]一種細菌基因敲除的方法，包括以下步驟:(l)pSM19轉(zhuǎn)化E.coli 056得到含PSIM19 的重組 E.coli 056 ；
[0009](3)制備含pSM19的E.coli 056電感受態(tài)細胞:挑取重組E.coli 056的陽性克隆，培養(yǎng)，菌體濃度0D_為0.4-0.5時放入42°C水浴搖床中，震蕩搖勻后置于冰上冷卻后，離心后，用預(yù)冷的無菌三蒸水懸浮菌體，分裝至2-3管預(yù)冷的無菌的EP管中；然后用預(yù)冷的無菌超純水水洗EP管中菌體四次，最后每管加入無菌水，制備到電感受態(tài)細胞E.coli056/pS頂19 ；
[0010](3)以質(zhì)粒PKD4為模版，PCR擴增帶有目的基因wfaQ同源臂的kana基因片段，向電感受態(tài)細胞重組菌E.coli056/pSIM19中加入所述帶有目的基因wfaQ同源臂的kana基因片段；高壓電擊完成后立即加入SOC液體培養(yǎng)基，370C，培養(yǎng)1.5 ±0.2h后，離心后倒掉部分上清，取適量菌體懸浮液涂布含50±2g/mL的卡那霉素抗性平板，培養(yǎng)，長出單菌落，將單菌落劃線于含50±2g/mL的卡那霉素抗性平板中，長出較濃菌苔，篩選得到目的基因已經(jīng)被消除的陽性重組子。
[0011]在其中一個實施例中，所述PSM19轉(zhuǎn)化E.coli 056的步驟為:將質(zhì)粒加入到E.coli 056感受態(tài)細胞中，輕輕混勻后冰??；42°C水浴熱激90s，迅速轉(zhuǎn)移至冰上，繼續(xù)冰浴2 ± Imin ;無菌條件下，加入LB培養(yǎng)基，37°C，100 ± IOrpm慢搖，恢復培養(yǎng)I ±0.2h ;離心培養(yǎng)物后取適量培養(yǎng)物涂布含100±2g/mL Amp的固體LB瓊脂平板上，待液體被固體培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置，37±2°C恒溫培養(yǎng)，12-16h，得到含pSM19的重組E.coli 056。
[0012]在其中一個實施例中，步驟(2)中用預(yù)冷的無菌超純水水洗EP管中菌體時，每次均在12000±20rpm，4±l°C的條件下離心1±0.1min以除去超純水。
[0013]在其中一個實施例中，步驟(3)中PCR擴增帶有目的基因WfaQ同源臂的kana基因片段的擴增引物為SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2。
[0014]在其中一個實施例中，所述無菌超純水為MiliQ超純水。
[0015]對于敲除細菌基因組中的靶基因目前常選用Red重組系統(tǒng)。不同的質(zhì)粒上λ噬菌體的重組功能基因exo，bet, gam的表達調(diào)控方式不一樣。對于選用由L-阿拉伯糖誘導重組功能蛋白表達的質(zhì)粒，敲除不同基因則需要摸索L-阿拉伯糖的誘導濃度，此過程耗時耗力。本發(fā)明選用由溫度誘導重組功能蛋白表達的溫度敏感型質(zhì)粒PSIM19，從而省去了誘導劑使用濃度摸索這一繁瑣的環(huán)節(jié)。同時，本發(fā)明選用MiliQ超純水作為線性DNA電轉(zhuǎn)緩沖液，洗滌菌體時12000rpm離心lmin，洗滌4_5次即可，相比用10%甘油作為電轉(zhuǎn)緩沖液節(jié)省了很多時間。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為pSM19質(zhì)粒圖譜；
[0017]圖2為圖1菌落PCR驗證陽性重組子056/AwfaQ/kana;其中，1:以野生型E.coli056模板；3-11和13:以陽性重組子056/Δ wfaQ/kana為模板；2和12:以假陽性重組子為模板。
【具體實施方式】
[0018]為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特舉以下實施例結(jié)合附圖詳細說明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人,分子克隆:實驗室手冊(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例中所用到的各種常用化學試劑，均為市售產(chǎn)品。
[0019]本發(fā)明選用的質(zhì)粒pSIM19由Donald L Court實驗室饋贈，該質(zhì)?？蓮脑S多實驗室無償獲得。參見文獻:Sharan K S, et al.Recombineering:ahomologousrecombination-based method of genetic engineering.Nat Pr0.2009(4).,如Donald LCourt (conrtQmai 1.ncifcrf.gov)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員也可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，根據(jù)圖譜自行構(gòu)建得到。其圖譜請見圖1。
[0020]實施例一:用RED重組系統(tǒng)敲除E.coli 056中的基因wfaQ。[0021]一、pSM19 轉(zhuǎn)化 Ε.coli 056
[0022]①將2L質(zhì)粒加入到IOOL E.coli 056感受態(tài)細胞中，輕輕混勻后冰浴30min ；
[0023]②42°C水浴熱激90s，迅速轉(zhuǎn)移至冰上，繼續(xù)冰浴2min ；
[0024]③無菌條件下，加入900L LB培養(yǎng)基，37°C，IOOrpm慢搖，恢復培養(yǎng)Ih ；
[0025]④5000rpm離心培養(yǎng)物，5min后取適量培養(yǎng)物涂布含100g/mL Amp的固體LB瓊脂平板上，待液體被固體培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置，37°C恒溫培養(yǎng)12-16h，得到含pSM19的重組 E.coli 056。
[0026]二、制備含pSM19的E.coli 056電感受態(tài)細胞
[0027]挑取重組E.coli 056(含有溫度敏感性質(zhì)粒pSM19)的陽性克隆，30°C，200rpm過夜培養(yǎng)。次日，取I %過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接50mL SOB液體培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基的配方為:將2g胰蛋白胨，0.5g酵母粉，0.0585g氯化鈉，0.0186g氯化鉀溶解到純水中，混勻后定容至IOOmL,121 °C濕熱滅菌20min備用。)，同時加入500L濃度為IM的無菌MgCl2，待菌體濃度OD6tltl為0.4-0.5 (大約生長2h)后將其放入42°C水浴搖床中，200rpm震蕩15min，然后立刻將搖瓶置于冰上,5-10min后開始制作電感受態(tài)細胞。4°C, 12000rpm離心7min后,用2mL預(yù)冷的無菌三蒸水懸浮菌體，分裝至2-3管預(yù)冷的無菌的1.5mLEP管中。然后用預(yù)冷的無菌超純水(MiliQ超純水)水洗管中菌體四次(每次均在12000rpm，4°C的條件下離心Imin以除去超純水)，最后每管加入無菌水至終體積為50-60L,由此制備的電感受態(tài)細胞(命名為E.coli056/pSIM19)可以于 _80°C存放一周。
[0028]三、帶有wfaQ同源臂的抗性基因電轉(zhuǎn)進上述電感受態(tài)細胞E.coli056/pSIM19中
[0029]先以質(zhì)粒pKD4(商業(yè)化質(zhì)粒)為模版，以引物056-wfaQ-k-F/wfaQ-k-R為敲除引物(序列見表1)通過聚合酶鏈式反應(yīng)PCR的方法(PCR反應(yīng)體系請參考fermentas貨號S#EP0502(Pfu DNA polymerase)給出的反應(yīng)體系；本實驗擴增條件為98°C預(yù)變性2min，98°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸1.5min，共30個循環(huán)；最后72°C延伸5min。)擴增帶有目的基因wfaQ同源臂的kana基因片段。向電感受態(tài)細胞重組菌E.coli 056/pSIM19中加入40L濃度為200-300ng/L的基因片段(即上述帶有目的基因wfaQ (GeneBank號為:DQ220293.1)同源臂的kana基因片段(卡那霉素核苷酸轉(zhuǎn)移酶基因，其GeneBank號為:NC_002952))，混勻后轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的無菌的厚度為2mm的電轉(zhuǎn)杯中，2.5kV高壓電擊完成后立即加入ImL SOC液體培養(yǎng)基(即加入了終濃度為20mM葡萄糖的SOB液體培養(yǎng)基)，37°C, IOOrpm恢復培養(yǎng)1.5h后，6000rpm離心5min后倒掉部分上清，取適量菌體懸浮液涂布含50g/mL的卡那霉素抗性平板(含終濃度為50g/mL卡那霉素的瓊脂糖固體培養(yǎng)基)。將平板放于37°C培養(yǎng)箱中，約16-20h長出單菌落，將單菌落劃線于含50g/mL的卡那霉素抗性平板中，12h后長出較濃菌苔。通過菌落PCR(PCR反應(yīng)體系請參考Transgene貨號為APlll (EasyTaq DNA polymerase)給出的反應(yīng)體系；本實驗擴增條件為94°C預(yù)變性4min,94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin，共30個循環(huán)；最后72°C延伸5min。)鑒定的方法判斷目的基因的敲除情況，瓊脂糖凝膠電泳圖請見圖2。
[0030]在E.coli 056基因組中，表1所示的敲除引物056-wfaQ-k-F/wfaQ-k-R之間相距1149bp,檢測引物wfaQ-t-F/wfaQ-t-R(序列見表1)之間相距1250bp,因此用檢測引物進行菌落PCR驗證O 56/ Δ wfaQ/kana陽性重組子時，以野生型056 (陰性對照)菌液為模板的PCR產(chǎn)物大小應(yīng)為1250bp ;而陽性重組子056/Λ wfaQ/kana的敲除引物之間由于重組了大小為1496bp的kana抗性基因，因此陽性重組子的檢測引物之間應(yīng)相距1760bp。所以，以檢測引物wfaQ-t-F/wfaQ-t-R為引物，以E.coli 056為陰性對照，通過菌落PCR驗證陽性重組子056/Awfa0/kana，電泳結(jié)果由圖2可知，編號為3_11和13為陽性重組子，即E.coli056中的目的基因wfaQ已經(jīng)被消除。
[0031]表1:擴增引物
[0032]
【權(quán)利要求】
1.一種細菌基因敲除的方法，其特征是，包括以下步驟:
(1)pSIM19轉(zhuǎn)化 E.coli056，得到含 pSIM19 的重組 E.coli056 ； (2)制備含pSM19的E.coli056電感受態(tài)細胞:挑取重組E.coli 056的陽性克隆，培養(yǎng)，菌體濃度OD6tltl為0.4-0.5時放入42°C水浴搖床中，震蕩搖勻后置于冰上冷卻后，離心后，用預(yù)冷的無菌三蒸水懸浮菌體，分裝至2-3管預(yù)冷的無菌的EP管中；然后用預(yù)冷的無菌超純水水洗EP管中菌體三至五次，最后每管加入無菌水，制備到電感受態(tài)細胞E.coli056/PSIM19 ； (3)以質(zhì)粒pKD4為模版，PCR擴增帶有目的基因WfaQ同源臂的kana基因片段，向電感受態(tài)細胞重組菌E.coli 056/pSIM19中加入所述帶有目的基因wfaQ同源臂的kana基因片段；高壓電擊完成后立即加入SOC液體培養(yǎng)基，37 ±0.5°C，培養(yǎng)1.5±0.2h后，離心后倒掉部分上清，取適量菌體懸浮液涂布含50±2g/mL的卡那霉素的抗性平板，培養(yǎng)，長出單菌落，將單菌落劃線于含50±2g/mL的卡那霉素的抗性平板中，長出較濃菌苔，篩選得到目的基因已經(jīng)被消除的陽性重組子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細菌基因敲除的方法，其特征是，所述PSIM19轉(zhuǎn)化E.coli056的步驟為:將質(zhì)粒加入到E.coli056感受態(tài)細胞中，輕輕混勻后冰浴；42°C水浴熱激90±2s，迅速轉(zhuǎn)移至冰上，繼續(xù)冰浴2±lmin ;無菌條件下，加入LB培養(yǎng)基，37±0.5 °C，100± IOrpm慢搖，恢復培養(yǎng)1±0.2h ;離心培養(yǎng)物后取適量培養(yǎng)物涂布含100±2g/mL Amp的固體LB瓊脂平板上，待液體被固體培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置，37±0.5°C恒溫培養(yǎng)，12-16h，得到含 pSM19 的重組 E.coliO 56。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細菌基因敲除的方法，其特征是，步驟(2)中用預(yù)冷的無菌超純水水洗EP管中菌體時，每次在12000±20rpm，4±l°C的條件下離心1±0.1min以除去超純水。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的細菌基因敲除的方法，其特征是，所述無菌超純水是MiliQ超純水。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的細菌基因敲除的方法，其特征是，步驟(3)中PCR擴增帶有目的基因wfaQ同源臂的kana基因片段的擴增引物為SEQ IDN0.1和SEQ ID N0.2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的細菌基因敲除的方法所制備得到的目的基因wfaQ被敲除的陽性重組子E.coli056。
【文檔編號】C12N1/21GK103898143SQ201210572241
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月25日
【發(fā)明者】萬曉春, 黨利君, 金言 申請人:深圳先進技術(shù)研究院