專利名稱：一種高密度發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體涉及高密度發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的方法。
背景技術(shù)：
谷胱甘肽(glutathione, GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸結(jié)合而成的三肽，半胱氨酸上的巰基為其活性基團(tuán)。谷胱甘肽作為一種活性三膚，廣泛存在于大多數(shù)動物、植物和微生物中，是生物體內(nèi)最重要的一種非蛋白琉基化合物。谷胱甘肽分為還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)兩種，在生物體內(nèi)大量存在并起主要作用的是GSH，它在細(xì)胞內(nèi)主要作為抗氧化劑、免疫增加劑和解毒劑參與了許多生理活動，對生物機(jī)體的生化防御體系起著重要作用。
生物體內(nèi)谷胱甘肽的生成主要通過合成和還原兩條途徑谷胱甘肽生物合成由兩步依靠三磷酸腺苷的酶促反應(yīng)構(gòu)成，首先谷氨酸和半胱氨酸在Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶(Y -glutamylcysteine synthetase)催化下合成Y -谷氨酰半胱氨酸,合成的原料由細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)或通過谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶反應(yīng)而來，然后在谷胱甘肽合成酶(glutathionesynthetase)作用下，Y -谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸合成谷胱甘肽。而谷胱甘肽還原途徑可由谷胱甘肽還原酶作用于氧化性谷胱甘肽(GSSG)而獲得，參與還原作用的NADPH由磷酸戊糖途徑而來。在正常生理情況下，反應(yīng)主要向GSH方向進(jìn)行，但GSH和GSSG這兩種形態(tài)可以相互轉(zhuǎn)化。自從谷胱甘肽被發(fā)現(xiàn)以來，它不僅作為試劑廣泛用于生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物學(xué)和化學(xué)的研究測定中，并且已成為一種極其重要的生物化學(xué)藥物。根據(jù)國外情報機(jī)構(gòu)預(yù)測，谷胱甘肽作為一種多功能的生物活性添加劑在食品加工業(yè)中的應(yīng)用將會愈來愈廣，它的需求量正日益增大。隨著谷胱甘肽的生理生化功能和性質(zhì)被不斷研究發(fā)現(xiàn)，人們對其在醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)、體育運(yùn)動領(lǐng)域及有關(guān)生物研究領(lǐng)域上的興趣將日益增長，對其需求量也將不斷增加。所以，谷胱甘肽具有一個極其廣闊的市場前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于運(yùn)用高密度發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽，可以大幅度提高谷胱甘肽產(chǎn)量，并有效地降低發(fā)酵成本。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種高密度發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的方法，它包括以巴斯德畢赤酵母(Pichia. pastoris SL1220)為發(fā)酵菌株,通過一級培養(yǎng)和二級培養(yǎng)后的二級種子接種于酵母培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，當(dāng)發(fā)酵液OD達(dá)到100 200后，補(bǔ)加谷胱甘肽的前體氨基酸，控制發(fā)酵液中的碳源濃度在O. 01 O. 02mol/L,培養(yǎng)至48 64h為止。本發(fā)明選用巴斯德畢赤酵母(Pichia. pastoris SL1220)進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)。巴斯德畢赤酵母，是甲醇營養(yǎng)型酵母中的一類能夠利用甲醇作為唯一碳源和能源的酵母菌。與其它酵母一樣，在無性生長期主要以單倍體形式存在，當(dāng)環(huán)境營養(yǎng)限制時，常誘導(dǎo)2個生理類型不同的接合型單倍體細(xì)胞交配，融合成雙倍體。所選用的巴斯德畢赤酵母其特征在于所要求的菌株為高產(chǎn)生物工程改造菌。
進(jìn)一步在上述高密度發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的方法中，所述的一級培養(yǎng)和二級培養(yǎng)是指從新鮮斜面上挑取巴斯德畢赤酵母(Pichia. pastoris SL1220)發(fā)酵菌株的菌體，接入裝有50±5ml培養(yǎng)液的250ml搖瓶中，100±5rpm，32±2°C振蕩培養(yǎng)10 12h ;再以10%的接種量將一級種子接入二級種子培養(yǎng)液，控制pH值6. 5±0. 5，溶氧大于等于50%，32±2°C培養(yǎng)12 14h后得二級種子，所述的一、二級培養(yǎng)液均是本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的菌種培養(yǎng)液。二級種子接入到酵母培養(yǎng)基的接種量為O. 5 5%。優(yōu)選的接種量為1. 5%。接種量是指移入種子液的體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例，接種量的大小決定于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中生長繁殖的速度，采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵罐中菌絲繁殖達(dá)到高峰的時間，使產(chǎn)物的形成提前到來，并可減少雜菌的生長機(jī)會。但接種量過大或者過小，均會影響發(fā)酵。過大會引起溶氧不足，影響產(chǎn)物 合成；而且會過多移入代謝廢物，也不經(jīng)濟(jì)；過小會延長培養(yǎng)時間，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率。酵母培養(yǎng)基的碳源為葡萄糖、甲醇、糖蜜、麥芽汁、蔗糖中的至少一種，酵母培養(yǎng)基的氮源為酵母粉、酵母膏、蛋白胨、豆柏粉、氨水中的至少一種酵母培養(yǎng)基的碳源優(yōu)選的是糖蜜，酵母培養(yǎng)基的氮源優(yōu)選的是蛋白胨。在酵母培養(yǎng)基中的發(fā)酵培養(yǎng)pH為5. O 8. 0，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為25 32°C。在酵母培養(yǎng)基中最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)pH為6. 5，最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)溫度為30°C。谷胱甘肽的前體氨基酸是L-谷氨酸、L-半胱氨酸、L-甘氨酸中的至少一種，優(yōu)選的是L-半胱氨酸。與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明選用巴斯德畢赤酵母(Pichia. pastoris SL1220)進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)。巴斯德畢赤酵母，是甲醇營養(yǎng)型酵母中的一類能夠利用甲醇作為唯一碳源和能源的酵母菌。與其它酵母一樣，在無性生長期主要以單倍體形式存在，當(dāng)環(huán)境營養(yǎng)限制時，常誘導(dǎo)2個生理類型不同的接合型單倍體細(xì)胞交配，融合成雙倍體。所選用的巴斯德畢赤酵母其特征在于所要求的菌株為高產(chǎn)生物工程改造菌。所以本方法能大幅度提高谷胱甘肽產(chǎn)量，并有效地降低發(fā)酵成本。
具體實施例方式為更好理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步介紹，但需要說明的是，本發(fā)明所要求的保護(hù)的范圍并不局限于實施例所表述的范圍。實例I發(fā)酵菌株(Pichia. pastoris SL1220)經(jīng)過一級、二級培養(yǎng)后,將1% (v/v)接種量接種至含有糖蜜和蛋白胨的發(fā)酵培養(yǎng)基中，使用50升發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵，風(fēng)量O. 5 3. OM3,轉(zhuǎn)速100 700rpm，pH7. 0，溫度32°C，培養(yǎng)63h，通過ALLOXAN (四氧嘧啶)衍生法測定發(fā)酵液中的谷胱甘肽含量，結(jié)果谷胱甘肽產(chǎn)率為4. 32g/L。實例2發(fā)酵菌株(Pichia. pastoris SL1220)經(jīng)過一級、二級培養(yǎng)后,將1. 5% (v/v)接種量接種至含有糖蜜和蛋白胨的發(fā)酵培養(yǎng)基中，使用50升發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵，風(fēng)量0. 5
3.0M3，轉(zhuǎn)速100 700rpm，pH7. 0，溫度32°C，發(fā)酵后期加入L-半胱氨酸、L-甘氨酸，培養(yǎng)54h，通過ALLOXAN (四氧嘧啶)衍生法測定發(fā)酵液中的谷胱甘肽含量，結(jié)果谷胱甘肽產(chǎn)率為
4.81g/L。實例3發(fā)酵菌株(Pichia. pastoris SL1220)經(jīng)過一級、二級培養(yǎng)后,將2. 5% (v/v)接種量接種至含有糖蜜和蛋白胨的發(fā)酵培養(yǎng)基中，使用50升發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵，風(fēng)量O. 5 3. OM3,轉(zhuǎn)速100 700rpm，pH7. O,溫度32°C，發(fā)酵后期加入L-半胱氨酸，培養(yǎng)52h，通過ALLOXAN (四氧嘧啶)衍生法測定發(fā)酵液中的谷胱甘肽含量，結(jié)果谷胱甘肽產(chǎn)率為4. 53g/L。實例4發(fā)酵菌株(Pichia. pastoris SL1220)經(jīng)過一級、二級培養(yǎng)后,將1. 5% (v/v)接種量接種至含有糖蜜和蛋白胨的發(fā)酵培養(yǎng)基中，使用50升發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵，風(fēng)量O. 5 3. 0M3，轉(zhuǎn)速100 700rpm，pH6. 0，溫度32°C，發(fā)酵后期加入L-半胱氨酸、L-甘氨酸和L-谷氨酸，培養(yǎng)55h，通過ALLOXAN (四氧嘧啶)衍生法測定發(fā)酵液中的谷胱甘肽含量，結(jié)果谷胱甘肽產(chǎn)率為5. 43g/L。實例5發(fā)酵菌株(Pichia. pastoris SL1220)經(jīng)過一級、二級培養(yǎng)后,將1. 5% (v/v)接種 量接種至含有糖蜜和蛋白胨的發(fā)酵培養(yǎng)基中，使用50升發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵，風(fēng)量O. 5 3. 0M3，轉(zhuǎn)速100 700rpm，pH6. 5，溫度32°C，發(fā)酵后期加入L-半胱氨酸、L-甘氨酸和L-谷氨酸，培養(yǎng)55h，通過ALLOXAN (四氧嘧啶)衍生法測定發(fā)酵液中的谷胱甘肽含量，結(jié)果谷胱甘肽產(chǎn)率為5. 74g/L。實例6發(fā)酵菌株(Pichia. pastoris SL1220)經(jīng)過一級、二級培養(yǎng)后,將1. 5% (v/v)接種量接種至含有糖蜜和蛋白胨的發(fā)酵培養(yǎng)基中，使用50升發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵，風(fēng)量0. 5 3. 0M3，轉(zhuǎn)速100 700rpm，pH6. 5，溫度30°C，發(fā)酵后期加入L-半胱氨酸、L-甘氨酸和L-谷氨酸，培養(yǎng)53h，通過ALLOXAN (四氧嘧啶)衍生法測定發(fā)酵液中的谷胱甘肽含量，結(jié)果谷胱甘肽產(chǎn)率為6. 33g/L。實例7發(fā)酵菌株(Pichia. pastoris SL1220)經(jīng)過一級、二級培養(yǎng)后,將1. 5% (v/v)接種量接種至含有糖蜜和蛋白胨的發(fā)酵培養(yǎng)基中，使用50升發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵，風(fēng)量0. 5
3.0M3，轉(zhuǎn)速100 700rpm，pH6. 5，溫度25°C，發(fā)酵后期加入L-半胱氨酸、L-甘氨酸和L-谷氨酸，培養(yǎng)55h，通過ALLOXAN (四氧嘧啶)衍生法測定發(fā)酵液中的谷胱甘肽含量，結(jié)果谷胱甘肽產(chǎn)率為5. 84g/L。
權(quán)利要求
1.一種高密度發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的方法，其特征在于包括以巴斯德畢赤酵母 (Pichia. pastoris SL1220)為發(fā)酵菌株，通過一級培養(yǎng)和二級培養(yǎng)后的二級種子接種于酵母培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，當(dāng)發(fā)酵液OD達(dá)到100 200后，補(bǔ)加谷胱甘肽的前體氨基酸，控制發(fā)酵液中的碳源濃度在O. 01 O. 02mol/L，培養(yǎng)至48 64h為止。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高密度發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的方法，其特征在于所述的一級培養(yǎng)和二級培養(yǎng)是指從新鮮斜面上挑取巴斯德畢赤酵母(Pichia. pastoris SL1220)發(fā)酵菌株的菌體，接入裝有50±5ml培養(yǎng)液的250ml搖瓶中，100±5rpm，32±2°C振蕩培養(yǎng)10 12h ;再以10%的接種量將一級種子接入二級種子培養(yǎng)液，控制pH值6. 5±0. 5，溶氧大于等于50%，32±2°C培養(yǎng)12 14h后得二級種子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述高密度發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的方法，其特征在于二級種子接入到酵母培養(yǎng)基的接種量為O. 5 5%。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述高密度發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的方法，其特征在于優(yōu)選的接種量為1. 5%ο
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述高密度發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的方法，其特征在于酵母培養(yǎng)基的碳源為葡萄糖、甲醇、糖蜜、麥芽汁、蔗糖中的至少一種，酵母培養(yǎng)基的氮源為酵母粉、酵母膏、蛋白胨、豆柏粉、氨水中的至少一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述高密度發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的方法，其特征在于酵母培養(yǎng)基的碳源優(yōu)選的是糖蜜，酵母培養(yǎng)基的氮源優(yōu)選的是蛋白胨。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述高密度發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的方法，其特征在于在酵母培養(yǎng)基中的發(fā)酵培養(yǎng)pH為5. O 8. 0，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為25 32°C。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述高密度發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的方法，其特征在于在酵母培養(yǎng)基中的發(fā)酵培養(yǎng)pH為6. 5,發(fā)酵培養(yǎng)溫度為30°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述高密度發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的方法，其特征在于谷胱甘肽的前體氨基酸是L-谷氨酸、L-半胱氨酸、L-甘氨酸中的至少一種。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述高密度發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的方法，其特征在于谷胱甘肽的前體氨基酸是L-半胱氨酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高密度發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的方法，它包括以巴斯德畢赤酵母(Pichia.pastoris SL1220)為發(fā)酵菌株，通過一級培養(yǎng)和二級培養(yǎng)后的二級種子接種于酵母培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，當(dāng)發(fā)酵液OD達(dá)到100～200后，補(bǔ)加谷胱甘肽的前體氨基酸，控制發(fā)酵液中的碳源濃度在0.01～0.02mol/L，培養(yǎng)至48～64h為止。本方法能大幅度提高谷胱甘肽產(chǎn)量，并有效地降低發(fā)酵成本。
文檔編號C12R1/84GK103014104SQ201210574778
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月26日
發(fā)明者朱義福, 周新榮, 吳平剛, 黃健華 申請人:廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司