專利名稱：引物及該引物篩選9種已知bcr/abl融合基因方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是一種引物及該引物篩選9種已知BCR/ABL
融合基因方法。
背景技術(shù)：
白血病是一類造血干細(xì)胞異常的克隆性惡性疾病。其克隆中的白血病細(xì)胞失去進(jìn)一步分化成熟的能力而停滯在細(xì)胞發(fā)育的不同階段。根據(jù)白血病細(xì)胞的成熟程度和自然病程，白血病可分為急性和慢性兩大類。急性白血病病情進(jìn)展迅速，自然病程僅有數(shù)周至數(shù)月。一般可根據(jù)白血病細(xì)胞系列歸屬分為急性髓系細(xì)胞白血病(AML)和急性淋巴細(xì)胞白血 病(ALL)兩大類。而慢性白血病的發(fā)生是由于有功能的已分化成熟的細(xì)胞過度增生，因此慢性白血病應(yīng)是一種由于信號傳導(dǎo)不良或細(xì)胞增殖失控所至的疾患，而非成熟障礙所至。慢性白血病常見有慢性粒細(xì)胞性白血病(CML)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)。由于白血病類型不同，治療方案及預(yù)后亦不盡相同，因此確診后，應(yīng)進(jìn)一步分型。關(guān)于人類白血病的病因與發(fā)病機(jī)理，至今仍未完全明了。已知病因有感染因素、電離輻射、化學(xué)物質(zhì)，遺傳因素及免疫功能異常等。目前認(rèn)為白血病病因是以上各種因素相互作用的結(jié)果。白血病的診斷和治療，一直是國際性的重大難題。近年來，隨著各種診斷技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是分子生物學(xué)研究手段的不斷更新，其在血液病診斷中所起的作用越來越重要。尤其是對有明顯檢測靶標(biāo)的白血病的診斷，分子生物學(xué)的檢測結(jié)果已經(jīng)不可或缺。Ph染色體是在血液病中最早確定的染色體異常，主要出現(xiàn)在慢性粒細(xì)胞白血病和部分急性淋巴細(xì)胞白血病中，它是由9號和22號染色體易位造成的。這種易位也造成了位于22號染色體上的BCR基因和位于9號染色體上的ABL基因的融合，產(chǎn)生了一個新的BCR/ABL融合基因(圖、I)。應(yīng)用分子生物學(xué)方法(RT-PCR)檢測該融合基因的存在，已經(jīng)成了確診CML或ALL的重要參考依據(jù)之一。近年來慢性粒細(xì)胞白血病(CML)的分子生物學(xué)研究不斷有新的進(jìn)展，其中之一就是陸續(xù)報道了多種不同融合位點的BCR/ABL融合基因。而且不同的融合型的BCR/ABL融合基因?qū)Σ〕痰挠绊懞椭委煹姆磻?yīng)是不盡相同的。例如P190比P210的致癌能力更高，表達(dá)更傾向于導(dǎo)致AL表型。因此，從CML和ALL病人中檢測出存在BCR/ABL融合基因與否，以及確定具體的融合型，對于CML和ALL病人的診斷和治療方案的選擇均有重大意義。在實際應(yīng)用中，用于檢測BCR/ABL融合基因的方法主要為熒光原位雜交和RT-PCR法。但目前使用這兩種方法來對BCR/ABL融合基因進(jìn)行檢測的，均是只針對某種特定的融合型進(jìn)行檢測。如要對目前已知的所有融合型的BCR/ABL融合基因進(jìn)行檢測，則只能一個一個單獨(dú)進(jìn)行檢測，費(fèi)時費(fèi)力，且檢測成本非常昂貴。因而急需一種能同時對所有已知的融合型的BCR/ABL融合基因進(jìn)行篩查的方法，省時省力，更有利于患者的及時診治。多重PCR技術(shù)則能夠解決這種需求。多重PCR技術(shù)是在傳統(tǒng)PCR原理上進(jìn)行改進(jìn)，即在同一體系中加入多對特異性引物，對多個DNA模板或同一模板的不同區(qū)域擴(kuò)增出多個目的DNA片段。應(yīng)用多重PCR技術(shù)，設(shè)計出針對9 種已知融合型 BCR/ABL 融合基因(ela2, ela3, e6a2, e8a2, el3a2, el3a3, el4a2,el4a3,el9a2)(圖、2)的公共特異性引物，并避免各對特異性引物之間的相互干擾，即可實現(xiàn)在同一檢測體系中，對這些不同型的BCR/ABL融合基因進(jìn)行一次性檢測。節(jié)約了大量的檢測時間和檢測成本。因此本研究采用多重PCR技術(shù)應(yīng)用于9種已知融合型的BCR/ABL融合基因的篩查檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明設(shè)計了檢測內(nèi)參/目的基因用引物序列，采用多重PCR技術(shù)，一次性檢測9種已知融合型BCR/ABL融合基因的存在與否，試劑盒通 過調(diào)整公共檢測引物的比例，以及PCR反應(yīng)條件，使擴(kuò)增效率和速率均達(dá)到最佳。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種引物，所述引物序列如下BCR-1:ACCTCCAGCGAGGAGGACTTCTCBCR-6:AACCTGAGAGCCAGAAGCAACAAAGATG
BCR-12:GGAGAACATCCGGGAGCAGCAGAAGBCR-19:GCACTGAAGGCAGCCTTCGACGBCR-R:GGATGTCCGTGGCCACACCGGACABL-3:CCCCATTGTGATTATAGCCTAAGACCCGG。本發(fā)明的另一個目的是利用該引物篩選9種已知BCR/ABL融合基因方法，包括如下步驟(I)、RNA 的提??；(2 )、將 RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA ；(3)、PCR 反應(yīng)；(4 )、PCR反應(yīng)產(chǎn)物檢測；(5)、結(jié)果判斷。進(jìn)一步的所述步驟(3)中PCR反應(yīng)的反應(yīng)液包括cDNA模板,GoTaq GreenMasterMix (2 X )，檢測已知融合型的BCR/ABL融合基因用上下游公共引物BCR-1、BCR-6、BCR-12、BCR-19和ABL-3，檢測內(nèi)參基因BCR用引物為BCR-12、BCR-R和ddH20 ;其中BCR-1:ACCTCCAGCGAGGAGGACTTCTCBCR-6:AACCTGAGAGCCAGAAGCAACAAAGATGBCR-12:GGAGAACATCCGGGAGCAGCAGAAGBCR-19:GCACTGAAGGCAGCCTTCGACGBCR-R:GGATGTCCGTGGCCACACCGGACABL-3:CCCCATTGTGATTATAGCCTAAGACCCGG。進(jìn)一步的所述的PCR反應(yīng)條件為94°C IOmin循環(huán)數(shù)I次；94°C 30s、58°C 30s、72°C 45s 循環(huán) 35 次；72°C 5min 循環(huán) I 次。本發(fā)明的有益技術(shù)效果是本發(fā)明利用多重PCR技術(shù)，設(shè)計檢測9種已知融合型BCR/ABL融合基因的公共特異性引物，對這些BCR/ABL融合基因進(jìn)行一次性篩查檢測，使初診和復(fù)查的CML和ALL患者能一次性得到更全面更及時的檢測，節(jié)約檢測時間和檢測成本；盡早確定存在的BCR/ABL融合型有助于臨床上CML和ALL的早期預(yù)防、早期診斷；還可對于疑似進(jìn)入慢性粒細(xì)胞白血病(CML)加速期、急變期的高危人群進(jìn)行較為準(zhǔn)確的篩查。


圖1. BCR和ABL基因的轉(zhuǎn)錄本；圖2.各型BCR-ABL融合基因的轉(zhuǎn)錄本；圖3.各型BCR-ABL融合基因檢測結(jié)果電泳圖。
具體實施例方式下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范 圍。引物及該引物篩選9種已知BCR/ABL融合基因方法；包括如下步驟1、RNA 的提取(I)向經(jīng)高壓滅菌處理過的15ml離心管中加入采集的新鮮血液及7ml的紅細(xì)胞裂解液，漩渦振蕩混勻。(2)冰浴15分鐘后，低速離心3分鐘(1500r/min)。(3)離心完后，倒掉上層液體，再向沉淀中加入4ml的紅細(xì)胞裂解液，漩渦振蕩混勻后，低速離心3分鐘(1500r/min)o(4)離心后去掉上清，再加入8mlPBS，漩渦振蕩混勻，低速離心3分鐘(1500r/min)。(5)離心完后去掉上清。(6)向沉淀中加入1. 5ml的PBS，將沉淀吹打混勻后，分別取Iml和O. 5ml至兩個經(jīng)過滅菌的干凈離心管中。Iml的為實驗用，O. 5ml的留作備份。(7)將上述離心管進(jìn)行低速離心3分鐘(1500r/min)。(8)離心完后去掉上清，分別向兩個管子中加入Iml的Trizol和300ul的白細(xì)胞裂解液，并吹打混勻。加Trizol為實驗用的，加白細(xì)胞裂解液的為備份，放入_20°C保存。(9)給每一個Iml Trizol管寫一個干凈的滅菌的備份管，并向加入了 ImlTrizol的離心管中加入200ul的三氯甲燒,劇烈振蕩后,4 , 12000r/min離心lOmin。(10)在離心的過程中，向備份管中加入500ul的異丙醇。等離心完后，將上清取至對應(yīng)的干凈離心管中，上下混勻后，_20°C冷藏20min。(11)20 分鐘后，將離心管取出，4°C，15000r/min 離心 12min。(12)離心完后，去掉上清，再加lml75%的乙醇，上下混勻后，_4°C，12000r/min離心 8min。(13)離心后，倒掉上清，在通風(fēng)櫥中將乙醇風(fēng)干，再向沉底中加入適量的超純水，得到總RNA。2、參考Promega公司的M-MLV PCR RT Kit試劑盒說明書，將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄體系
權(quán)利要求
1.一種引物，其特征在于所述引物序列如下BCR-1:ACCTCCAGCGAGGAGGACTTCTCBCR-6:AACCTGAGAGCCAGAAGCAACAAAGATGBCR-12:GGAGAACATCCGGGAGCAGCAGAAGBCR-19:GCACTGAAGGCAGCCTTCGACGBCR-R:GGATGTCCGTGGCCACACCGGACABL-3:CCCCATTGTGATTATAGCCTAAGACCCGG。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述該引物篩選9種已知BCR/ABL融合基因方法，其特征在于包括如下步驟 (1)、RNA的提?。? (2)、將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA; (3)、以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)； (4)、PCR反應(yīng)產(chǎn)物檢測； (5)、結(jié)果判斷。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述該引物篩選9種已知BCR/ABL融合基因方法，其特征在于所述步驟(3)中PCR反應(yīng)的反應(yīng)液包括cDNA模板,GoTaq Green MasterMix (2X),檢測已知融合型的BCR/ABL融合基因用上下游公共引物BCR-1、BCR-6、BCR-12, BCR-19和ABL-3，檢測內(nèi)參基因BCR用引物為BCR-12、BCR-R和ddH20 ;其中BCR-1:ACCTCCAGCGAGGAGGACTTCTCBCR-6:AACCTGAGAGCCAGAAGCAACAAAGATGBCR-12:GGAGAACATCCGGGAGCAGCAGAAGBCR-19:GCACTGAAGGCAGCCTTCGACGBCR-R:GGATGTCCGTGGCCACACCGGACABL-3:CCCCATTGTGATTATAGCCTAAGACCCGG。
4.根據(jù)權(quán)利要求2、3所述該引物篩選9種已知BCR/ABL融合基因方法，其特征在于所述的PCR反應(yīng)條件為94°C IOmin循環(huán)數(shù)I次；94°C 30s,58°C 30s,72°C 45s循環(huán)35次；.72 °C 5min 循環(huán) I 次。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是一種引物及該引物篩選9種已知BCR/ABL融合基因方法，是一種臨床檢驗用途的基因融合檢測試劑盒，采用PCR技術(shù)，能夠?qū)θ祟惵粤＜?xì)胞白血病(CML)、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、以及少數(shù)急性粒細(xì)胞白血病(AML)患者體內(nèi)各種融合型的BCR/ABL融合基因進(jìn)行檢測，一次性確定具體的BCR/ABL融合型，利于后期的定量檢測和療效監(jiān)測?？捎行У墓?jié)約檢測時間，節(jié)約檢測成本，提高檢測效率。
文檔編號C12N15/11GK103013994SQ201210575819
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月26日
發(fā)明者李小青, 孫黎, 李金歡, 葉貴, 陳然, 郝瑋, 梁超, 韓韜, 涂贊兵, 方國偉, 陳忠, 黃士昂 申請人:武漢康圣達(dá)醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司