專利名稱：一株合成耐高滲氨基甲酸乙酯水解酶的糞腸球菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種糞腸球菌及其應(yīng)用，特別是ー種能合成耐高滲氨基甲酸こ酯水解酶的糞腸球菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
氨基甲酸こ酯(Ethyl Carbamate, EC)，在醫(yī)學(xué)上有重要用途，曾一度被用作治療多發(fā)性骨髄瘤及慢性骨髄性白血病，以及作為麻醉劑使用。近年研究發(fā)現(xiàn)，氨基甲酸こ酯是一種人類潛在致癌物質(zhì)，可導(dǎo)致肺癌、淋巴癌、肝癌等疾病，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)在2007年把氨基甲酸こ酯列為2A類致癌物。氨基甲酸こ酯是ー種伴隨發(fā)酵食品(如酒精飲料、豆醬、醬油等)的生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，對(duì)食品安全和生物體健康都有著嚴(yán)重的影響和危害。面對(duì)氨基甲酸こ酯所造成的食品安全問(wèn)題，以微生物及酶降解實(shí)現(xiàn)食品中氨基甲酸こ酯的無(wú)危害化，是較理想的解決方案。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一株合成耐高滲氨基甲酸こ酯水解酶的糞腸球菌(Enterococcus faecals) SW08,已于2012年10月19日保藏于中國(guó)典型微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為CCTCC M2012417，保藏地址為中國(guó)武漢武漢大學(xué)。菌落為白色圓形，表面干燥光滑，邊緣規(guī)則，不透明，菌落大小1_2_，兼性厭氧或厭氧，可用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基通氣培養(yǎng)或用MRS培養(yǎng)基厭氧靜置培養(yǎng)。菌體革蘭氏陽(yáng)性，有莢膜，1000X顯微鏡下觀察細(xì)胞呈球形。所述糞腸球菌分離自 成年雌性小鼠胃腸道，其保藏條件如下從生長(zhǎng)良好的平板上挑取單菌落轉(zhuǎn)接入營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在30°C，200rpm,培養(yǎng)16h，取500 y L培養(yǎng)液移入含有500 u L40%甘油的保藏管中，置于_80°C冰箱保存。上述的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基為ニ型營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，配方為蛋白胨IOg,牛肉膏IOg,氯化鈉5g，蒸餾水1L，如需固體培養(yǎng)基，再添加2%瓊脂。本發(fā)明的另ー個(gè)目的是提供上述糞腸球菌粗酶液的提取方法。本發(fā)明的另ー個(gè)目的是提供上述糞腸球菌的應(yīng)用，其合成的耐高滲氨基甲酸こ酯水解酶可以在NaCl濃度大于15%的條件下的條件下快速分解發(fā)酵食品中的副產(chǎn)物氨基甲酸こ酯并產(chǎn)生こ醇和氨氣。其在最適pH7. 0時(shí)具有最高酶活llU/g，在NaCl濃度大于15%的條件下，紡錘形賴氨酸芽孢桿菌所產(chǎn)生的耐高滲氨基甲酸こ酯水解酶能夠保持40%的酶活。本發(fā)明提供的糞腸球菌能合成耐高滲氨基甲酸こ酯水解酶，在pH為7. 0時(shí)具有最高酶活，能在高滲條件下快速分解氨基甲酸こ酷。在PH為7.0的條件下，其氨基甲酸こ酯水解酶酶活為llU/g，在NaCl濃度大于15%的條件下，其能保持40%的氨基甲酸こ酯水解酶酶活。


圖1糞腸球菌顯微照片圖2pH對(duì)糞腸球菌氨基甲酸こ酯水解酶酶活的影響圖3糞腸球菌氨基甲酸こ酯水解酶對(duì)NaCl的耐受性
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 :糞腸球菌篩選方法將25g每只5周大雌性昆明小鼠進(jìn)行五天的強(qiáng)飼氨基甲酸こ酯溶液(200mg/kgbody weight/day)后解剖，并用濃度為0. 9%的生理鹽水沖洗小鼠腸道組織,取組織懸浮液ImL于IOOOXg下離心IOmin,取上清液接種于富集培養(yǎng)基中(牛肉浸膏IOg,蛋白胨IOg,NaC15g，氨基甲酸こ酯IOgJjC 1000mL，pH7. 0)，30°C下通氣培養(yǎng)20h。培養(yǎng)液于2000Xg離心5min,取上清涂布于篩選培養(yǎng)基(牛肉浸膏IOg,蛋白胨10g,NaC15g,氨基甲酸こ酯30g,瓊脂20g，水lOOOmL，pH5. 0)中培養(yǎng)三天。挑選菌落形態(tài)較大的菌株轉(zhuǎn)移到營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)20h后進(jìn)行保藏。挑取_80°C保藏的菌株在營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂固體培養(yǎng)基上劃線，于37°C培養(yǎng)24h后，挑取單菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，37°C在轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床培養(yǎng)24h，離心5min (12000rpm, 4°C )后收集菌體，再用pH7. 0的磷酸鹽緩沖液重懸浮菌體至0. lg/mL。通過(guò)超聲破碎進(jìn)行酶粗提液的提取，對(duì)粗酶液進(jìn)行氨基甲酸こ酯水解酶酶活測(cè)定檢測(cè)到一株具有氨基甲酸こ酯水解酶活性的菌株，通過(guò)16S rDNA序列分析可知該菌株為ー株糞腸球菌，已于2012年10月19日保藏于中國(guó)典型微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為CCTCCM2012417，保藏地址為中國(guó)武漢武漢大學(xué)。實(shí)施例2 :糞 腸球菌中氨基甲酸こ酯水解酶粗酶液的提取方法挑取_80°C保藏的菌株在營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂固體培養(yǎng)基上劃線，于37°C培養(yǎng)24h后,挑取單菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，37°C在轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床培養(yǎng)24h，收集菌液50mL于冷凍高速離心機(jī)中低溫離心IOmin (lOOOOrpm, 4°C )后收集菌體，菌體沉淀中加入相同菌液體積的50mM PBS或50mM Tris-HCl (緩沖液pH應(yīng)根據(jù)所篩選的蛋白穩(wěn)定范圍選取)重懸洗滌三次。再用PH7. 0的PBS緩沖液懸浮菌體至0. lg/mL。將菌液在_80°C冰凍，室溫融解，反復(fù)凍融三次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剰余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。將反復(fù)凍融的菌液，置于冰水浴中進(jìn)行超聲破碎(必要時(shí)可加入適量的溶菌酶)，超聲條件25W，工作2S，間隔2S，重復(fù)工作30min，直至菌體溶液變清澈為止，大約花費(fèi)時(shí)間60min。將菌體超聲破碎后于低溫離心機(jī)中離心IOmin (lOOOOrpm, 4°C )，將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的Eppendorf管中，低溫保存。實(shí)施例3 :氨基甲酸こ酯水解酶粗酶液的酶活檢測(cè)方法氨基甲酸こ酯水解酶粗酶液酶活檢測(cè)方法的原理是利用在一定條件下，氨基甲酸こ酯降解酶科將氨基甲酸こ酯分解生成こ醇，氨氣和ニ氧化碳。氨與苯酚-次氯酸鈉反應(yīng)形成靛酚藍(lán)顯藍(lán)色，用分光光度計(jì)在630nm處測(cè)其吸光值，分析氨的生成量，從而得到氨基甲酸こ酯水解酶的酶活。酶活測(cè)定試劑的配制顯色劑1:稱取15g苯酚和0. 625g亞硝基鐵氰化鈉用超純水定容至250mL
顯色劑I1:稱取13. 125g氫氧化鈉和7. 5mL次氯酸鈉用超純水定容至250mL終止劑稱取IOg三氯こ酸用超純水定容至IOOmLNH4+標(biāo)準(zhǔn)溶液制備lmL氨水溶于超純水中并定容至145mL,配成0. lmol/L的NH4+溶液，并以此為母液，用超純水將之稀釋并配制成0.1mmol/L、0. 2mmol/L、0. 3mmol/L、
0.4mmol/L、0. 5mmol/L 的 NH4+ 標(biāo)準(zhǔn)溶液。氨離子標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精確移取ImL NH4+標(biāo)準(zhǔn)梯度液置于順序編號(hào)的IOmL比色管中。37°C下恒溫保溫15min，立即吸取ImL終止劑于比色管中，振蕩混勻。再依次加入ImL顯色劑I和顯色劑II，強(qiáng)烈振蕩，使之充分混勻，反應(yīng)20min。超純水定容至10mL，在630nm下比色測(cè)定OD值，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，NH4+梯度為橫坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶活的測(cè)定取兩支IOmL比色管,分別加入ImL酶液和超純水。然后在兩管中分別加入ImL超純水，在37°C恒溫水浴箱中反應(yīng)15min后，在兩管各加入ImL三氯こ酸終止劑，混勻后加入ImL的顯色劑I和ImL顯色劑II，強(qiáng)烈震蕩，繼續(xù)在37°C恒溫水浴箱中保溫20min后取出，用超純水稀釋到10mL,630nm處比色,并記錄OD值。酶活計(jì)算公式酶活力=A OD630 XnXkX 10/15式中A OD630 :酶反應(yīng)后樣品測(cè)定與空白試驗(yàn)光密度值之差n :酶活測(cè)定液稀釋倍數(shù)

k:標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的 倒數(shù)10 =ImL樣品液稀釋至IOmL的倍數(shù)15 :酶反應(yīng)的時(shí)間(min)(酶反應(yīng)的時(shí)間為15min)酶活定義酶活力定義在常壓、37°C條件下每分鐘分解底物產(chǎn)生I U mol氨為ー個(gè)酶活力單位。實(shí)施例4 :氨基甲酸こ酯水解酶粗酶液最適pH的確定按下表配置緩沖溶液，其溶液pH值以酸度計(jì)測(cè)定值為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一株合成耐高滲氨基甲酸こ酯水解酶的糞腸球菌SW08 (Enterococcusfaecalis SW08)，于2012年10月19日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCNO:M2012417。
2.權(quán)利要求1所述的糞腸球菌，其特征是能耐受3%(w/v)氨基甲酸こ酷。
3.權(quán)利要求1所述糞腸球菌，其能夠合成氨基甲酸こ酯水解酶。
4.權(quán)利要求1-3任一所述的糞腸球菌應(yīng)用于氨基甲酸こ酯水解酶的生產(chǎn)。
5.權(quán)利要求1-3任一所述的糞腸球菌應(yīng)用于氨基甲酸こ酯的降解。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一株合成酸性氨基甲酸乙酯水解酶的糞腸球菌(Enterococcus faecalis)SW08，已于2012年10月19日保藏于中國(guó)典型微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為CCTCC M2012417。該菌能夠在酸性環(huán)境下快速降解氨基甲酸乙酯和尿素，對(duì)發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯的消除起到了積極的作用。
文檔編號(hào)C12N9/18GK103060232SQ201210578408
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月27日
發(fā)明者陳堅(jiān), 堵國(guó)成, 方芳, 張繼冉 申請(qǐng)人:江南大學(xué)