專利名稱：產(chǎn)納他霉素的重組利迪鏈霉菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，特別涉及產(chǎn)納他霉素的重組利迪鏈霉菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著農(nóng)作物種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整和栽培方式的變化，許多作物真菌性病害的發(fā)生和危害日趨嚴(yán)重，如甘藍(lán)枯萎病(Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans)、小麥紋枯病菌(R. cereal is)、桃褐腐病菌(M. fructicola)、蘋果輪紋病菌(B. berengeriana)、百合根腐病菌(F. oxysporum)等病原菌的危害也十分嚴(yán)重(耿麗華等,2009)。一般的化學(xué)農(nóng)藥都難以湊效，且頻繁使用增加了病原菌的抗藥性，污染了生態(tài)環(huán)境，因此亟待開(kāi)發(fā)新的、環(huán)境友好型的高效微生物農(nóng)藥已成為近年病害生防領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。納他霉素(natamycin)是一種多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，也稱匹馬菌素或游霉素(Pimaricin)，分子式為C33H47O1315研究報(bào)道natamycin對(duì)幾乎所有的酵母菌、霉菌具有抗性，是一種極具有潛力的廣譜抗菌劑，能夠顯著抑制甘藍(lán)枯萎病菌(F. oxysporumf.s. conglutinans)、蘋果輪斑病菌(A. mali)、辣椒灰霉病菌(B. cinerea)、葡萄灰霉病菌(B. cinerea)、黃瓜枯萎病菌(F. f. sp. cucumerinum)、爺子早疫病菌(A. solani)、番爺灰霉病菌(B. cinerea)、桃褐腐病菌(M. fructicola)、李子褐腐病菌(M. fructicola)等病原菌的生長(zhǎng)，并且不易產(chǎn)生抗藥性，在防治植物真菌病害方面顯示了良好的應(yīng)用前景(teWelscher et al. , 2008; Du et al. , 2009;隋勤等，2007)。此外，natamycin 作為食品防腐劑是我國(guó)批準(zhǔn)使用僅有的2種食品生物防腐劑之一(另一個(gè)是乳酸鏈球菌素，Nisin)，還被應(yīng)用于臨床醫(yī)療，用于治療真菌引起的皮膚和粘膜感染等(Davidson andDoan, 1993;程良英，2010)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供納他霉素產(chǎn)量高的重組利迪鏈霉菌及其構(gòu)建方法。本發(fā)明所提供的構(gòu)建重組利迪鏈霉菌的方法，包括將納他霉素合成正調(diào)控基因?qū)胱鳛樗拗骶睦湘溍咕泻Y選得到納他霉素產(chǎn)量高于所述宿主菌的重組利迪鏈霉菌的步驟；所述納他霉素合成正調(diào)控基因編碼如下a)或b)的蛋白質(zhì)a)氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白質(zhì)；b)將SEQ ID No.1中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與納他霉素合成相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)。其中，SEQ ID No.1由192個(gè)氨基酸殘基組成。上述方法中，所述納他霉素合成正調(diào)控基因的編碼序列為SEQ ID No. 2的第433-1011位。所述納他霉素合成正調(diào)控 基因的序列具體可為SEQ ID No. 2的第14-1011位。其中，SEQ ID No. 2由1019個(gè)核苷酸組成，第1_13位為Nde I識(shí)別位點(diǎn)和保護(hù)堿基，第14-432位為紅霉素抗性基因啟動(dòng)子，第433-1011位為納他霉素合成正調(diào)控基因的編碼序列，第1012-1019為EcoRI識(shí)別位點(diǎn)和保護(hù)堿基。上述方法中，所述將納他霉素合成正調(diào)控基因?qū)胱鳛樗拗骶睦湘溍咕ㄈ缦虏襟E將所述納他霉素合成正調(diào)控基因的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中得到重組大腸桿菌，再將所述重組大腸桿菌與所述作為宿主菌的利迪鏈霉菌進(jìn)行雙親接合獲得所述重組利迪鏈霉菌；所述納他霉素合成正調(diào)控基因的表達(dá)載體中，啟動(dòng)所述納他霉素合成正調(diào)控基因的啟動(dòng)子是紅霉素抗性基因啟動(dòng)子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述紅霉素抗性基因啟動(dòng)子的核苷酸序列是SEQIDNo. 3。其中，SEQ ID No. 3由199個(gè)核苷酸組成。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述納他霉素合成正調(diào)控基因的表達(dá)載體為將所述納他霉素合成正調(diào)控基因插入PIB139的所述紅霉素抗性基因啟動(dòng)子下游得到的重組表達(dá)載體，具體是將SEQ ID No. 2所示的DNA片段經(jīng)NdeI和EcoRI酶切后插入pIB139的NdeI和EcoRI位點(diǎn)得到的重組表達(dá)載體pIB139-slnM。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述作為宿王囷的利迪鏈霉囷可為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus) A02CGMCC No. 1654,所述大腸桿菌為去甲基化E. coliET12567(pUZ8002)。本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供由上述任一種方法得到的重組利迪鏈霉菌。

所述重組利迪鏈霉菌具體可為利迪鏈霉菌AM02，其在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC No. 6815。本發(fā)明所要解決的再一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供所述重組利迪鏈霉菌的用途。本發(fā)明所提供的用途是下述I)或2)或3):I)所述重組利迪鏈霉菌在生產(chǎn)那他霉素中的應(yīng)用；2)所述重組利迪鏈霉囷在制備植物病原真囷抑制劑中的應(yīng)用；3)所述重組利迪鏈霉菌在抑制植物真菌病害中的應(yīng)用。上述應(yīng)用中，所述植物病原真菌為下述至少一種甘藍(lán)枯萎病菌(Fusariumoxysporum f. sp. conglutinans)和西瓜枯萎病菌(F. oxysporum f. sp. niveum)；所述植物真菌病害為下述至少一種由甘藍(lán)枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp.conglutinans)引起的病害和由西瓜枯萎病菌(F. oxysporumf. sp. niveum)引起的病害。實(shí)驗(yàn)證明，利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus) AM02 CGMCC No. 6815 納他霉素產(chǎn)量在YEME培養(yǎng)基上約是野生型菌株利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCCNo. 1654的3倍(圖3)，在發(fā)酵培養(yǎng)基上約是野生型菌株利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus) A02 CGMCC No. 1654 的 2 倍(圖 4)。利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus)AMO2CGMCC No. 6815對(duì)甘藍(lán)枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans)的抑菌活性是利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No. 1654的1. 8倍,對(duì)西瓜枯萎病菌(F. oxysporum f. sp. niveum)的抑菌活性是利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No. 1654的2. 2倍。本發(fā)明的重組利迪鏈霉菌，具有比野生型顯著提高的產(chǎn)納他霉素和抑菌能力，由于納他霉素可以作為食品保鮮劑及飼料添加劑，因此，本發(fā)明的重組利迪鏈霉菌可以應(yīng)用于食品、生物能源及飼料添加等方面。生物材料信息分類命名利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus)菌株編號(hào)AM02保藏機(jī)構(gòu)中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏機(jī)構(gòu)簡(jiǎn)稱CGMCC地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)保藏日期2012年11月12日保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)CGMCC No. 6815下面結(jié)合具體實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，這些實(shí)施例用于理解而不是限制本發(fā)明。


圖1 為 pIB139_slnM 的 NdeI 和 EcoRI 酶切結(jié)果。其中，泳道M為DNA分子`量標(biāo)準(zhǔn)，I為pIB139_slnM。圖2為阿泊拉霉素抗性PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子的電泳圖譜。圖3為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus) AM02和利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus) AO2在YEME培養(yǎng)基中的納他霉素產(chǎn)量比較。圖4為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus) AM02和利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus) AO2在發(fā)酵培養(yǎng)基中的納他霉素產(chǎn)量比較。圖5為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus) AM02和利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus) AO2 的抑菌活性比較。A中的病原菌為甘藍(lán)枯萎病菌,左側(cè)為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus) A02對(duì)甘藍(lán)枯萎病菌的抑菌圈，右側(cè)為利迪鏈霉菌(Str印tomyces lydicus)AM02對(duì)甘藍(lán)枯萎病菌的抑菌圈。B中的病原菌為西瓜枯萎病菌,左側(cè)為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus) A02對(duì)西瓜枯萎病菌的抑菌圈，右側(cè)為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)AM02對(duì)西瓜枯萎病菌的抑菌圈。圖6A為利迪鏈霉菌活性產(chǎn)物的HPLC第一次分離譜圖。圖6B為利迪鏈霉菌活性產(chǎn)物的HPLC第三次分離譜圖。圖7為納他霉素樣品的紫外掃描圖譜。圖8為納他霉素樣品的紅外吸收光譜。圖9A為納他霉素樣品的高分辨質(zhì)譜圖(負(fù)離子)。圖9B為納他霉素樣品的高分辨質(zhì)譜圖(正離子)。圖10A為納他霉素樣品的核磁共振碳譜(500MHz)。圖10B為納他霉素樣品的核磁共振氫譜(500MHz)。
具體實(shí)施方式
以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中的鏈霉菌表達(dá)載體pIB139 (Christopher J. Wilkinson, etal.1ncreasingthe Efficiency of Heterologous Promoters in Actinomycetes. J. Mol.Microbiol. Biotechnol. (2002)4(4) :417426.)公眾可從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得，以重復(fù)本申請(qǐng)實(shí)驗(yàn)。下述實(shí)施例中的去甲基化E. coliET12567(pUZ8002) (Sun-UkChoi,Chang-KwonLee,Yong-1l Hwang, Hiroshi Kinoshita, and Takuya Nihira (2004)Cloning and FunctionalAnalysis by Gene Disruption of a Gene Encodinga y -Butyrolactone Autoregulator Receptorfrom Kitasatospora setae.JOURNAL OFBACTERIOLOGY, 186:34233430.)公眾可從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得，以重復(fù)本申請(qǐng)實(shí)驗(yàn)。下述實(shí)施例中的病原菌甘藍(lán)枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp.conglutinans)和西瓜枯萎病菌(F. oxysporumf. sp. niveum)(隋勤，劉偉成，裘季燕，劉霆，潘爭(zhēng)艷，劉學(xué)敏.利迪鏈霉菌A02的抑菌譜及其抑菌活性的穩(wěn)定性.植物保護(hù)，2007, 33(5)67-71 ;盧彩鴿，劉偉成，劉霆，董丹，張濤濤，劉德文.利迪鏈霉菌AOl活性代謝產(chǎn)物對(duì)甘藍(lán)枯萎病菌的抑制作用及其機(jī)理.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)2012，45(18) :3764-3772)公眾可從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得，以重復(fù)本申請(qǐng)實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例1、構(gòu)建高產(chǎn)納他霉素的重組利迪鏈霉菌一、纖維素酶基因表達(dá)載體pIB139_slnM的構(gòu)建本實(shí)施例構(gòu)建的納他霉素合成正調(diào)控基因的表達(dá)載體名稱為pIB139_slnM，該載體中含有納他霉素合成正調(diào)控 基因slnM。納他霉素合成正調(diào)控基因slnM的序列如SEQIDNo. 2所示。SEQ ID No. 2由1019個(gè)核苷酸組成，第1_13位為Nde I識(shí)別位點(diǎn)和保護(hù)堿基，第14-432位為紅霉素抗性基因啟動(dòng)子，第433-1011位為納他霉素合成正調(diào)控基因的編碼序列，第1012-1019為EcoRI識(shí)別位點(diǎn)和保護(hù)堿基。pIB139-slnM中啟動(dòng)該納他霉素合成正調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子是紅霉素抗性基因啟動(dòng)子(SEQ ID No. 3)。pIB139_slnM的具體構(gòu)建方法如下^fSEQ ID No.1所示的兩端帶有NdeI和EcoRI酶切位點(diǎn)的slnM片段經(jīng)NdeI和EcoRI酶切后與經(jīng)過(guò)相同酶切的鏈霉菌表達(dá)載體pIB139(攜帶SEQ ID No. 3的紅霉素抗性基因啟動(dòng)子PermE)連接，得到將pIB139的NdeI和EcoRI之間的片段替換為帶有自身啟動(dòng)子納他霉素合成正調(diào)控基因slnM序列的重組表達(dá)載體pIB139_slnM。pIB139_slnM轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α ,以阿泊拉霉素(apramycin)抗性篩選從而獲得攜帶正調(diào)控基因及其自身啟動(dòng)子序列的轉(zhuǎn)化子，該轉(zhuǎn)化子以pKGGAATTCCATATGCGGTCGGAGGTGCGGGCATGAC)和 p2 (GGAATTCTCACTTCACGAAGTCGTCCAC)為引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增得到約IlOlbp的片段，用NdeI和EcoRI酶切pIB139_slnM得至Ij 5. 9kb的pIB139質(zhì)粒片段及約998bp的帶有自身啟動(dòng)子納他霉素合成正調(diào)控基因slnM序列(圖1)，從而確定該正調(diào)控基因雙啟動(dòng)子表達(dá)載體構(gòu)建成功。二、利用pIB139_slnM將帶有自身啟動(dòng)子納他霉素合成正調(diào)控基因slnM導(dǎo)入利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus) A02CGMCC No. 1654得到納他霉素高產(chǎn)菌株-利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus) AM02CGMCC No. 6815將pIB139-slnM載體轉(zhuǎn)化去甲基化Ε· coliET12567 (pUZ8002)，通過(guò)兩親接合的方法，轉(zhuǎn)化利迪鏈霉菌A02，通過(guò)阿伯拉霉素抗性篩選得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，PCR驗(yàn)證得到正確的轉(zhuǎn)化子。具體轉(zhuǎn)化方法如下I)將 pIB139-slnM 載體轉(zhuǎn)化去甲基化 E. coliET12567 (pUZ8002)通過(guò)熱激法將pIB139-slnM 載體導(dǎo)入 E. coliET12567 (pUZ8002)并經(jīng)過(guò) 60 μ g/ml阿泊拉霉素抗性篩選得到轉(zhuǎn)入pIB139-slnM載體的重組菌E. coliET12567 (pUZ8002) /pIB139_slnM。2)兩親接合構(gòu)建那他霉素高產(chǎn)的重組利迪鏈霉菌參考文獻(xiàn)(Bierman M et al. 1992)進(jìn)行兩親接合，具體方法如下將重組菌E. coliET12567(pUZ8002)/pIB139-slnM接種到含有氯霉素、卡那霉素和阿泊拉霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基，370C，200rpm,培養(yǎng)過(guò)夜，次日早晨按1%的接種量接到新鮮LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD6qq=O. 4-0. 6，收集菌液，40C，4000rpm,離心2min，棄上清，用20mL冰冷的純的LB培養(yǎng)液重懸沉淀，4°C,4000rpm,離心2min,棄上清，目的是洗去抗生素。用2mL冰冷的純的LB培養(yǎng)液重懸沉淀。(2)將PDA斜面生長(zhǎng)2周的利迪鏈霉菌(Sti^ptomyceslydicus)A02CGMCC No. 1654 (CN100467588C)孢子用無(wú)菌雙蒸水洗脫下來(lái)，并用加樣器吹打均勻，制備得到孢子懸浮液。(3)250 μ L鏈霉孢子懸液加入500 μ L2XYT培養(yǎng)液，輕輕混勻。50°C熱擊 lOmin，活化孢子。500 μ L 重組菌 E. coliET12567 (pUZ8002)/pIB139_slnM 菌液與500 μ L活化好的利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No. 1654孢子懸液,輕輕混勻。4000rpm，室溫離心3min，去上清，混勻沉淀涂布于MS培養(yǎng)基+10mM/L MgCl2, 28°C倒置培養(yǎng)至次日早晨(18h)，之后涂抗生素溶液(將O. 5mg萘啶酮酸和60 μ g阿泊拉霉素溶于ImLddH2O中得到的液體)。2-3天后挑取單菌落到新的加入上述抗生素溶液的MS平板上。挑取在該 MS 平板上的菌落用上述 p3(AGCTCATCGGTCAGCTTCTC)和 p4(GGCATCGCATTCTTCGCATC)進(jìn)行PCR擴(kuò)增阿泊拉霉素抗性基因，將其中一株可以得到731bp的擴(kuò)增產(chǎn)物的重組菌命名為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus) AM02。利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus) AM02已于2012年11月12日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)CGMCC No. 6815。利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus) AM02CGMCC No. 6815 菌體的形態(tài)特征如下革蘭氏染色陽(yáng)性；在GYM瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7天后，基內(nèi)菌絲發(fā)育良好，無(wú)橫隔，不斷裂；氣生菌絲生長(zhǎng)良好，多分枝；孢子絲柔曲或彎曲，孢子橢圓形。三、利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus) AM02CGMCC No. 6815 的合成納他霉素能力所用的培養(yǎng)基如下高氏一號(hào)斜面培養(yǎng)基=K2HPO4O.5g，NaClO. 5g，KNO31. Og,FeSO4 · 7Η200· 01g, MgSO4 · 7Η200· 5g，可溶性淀粉 20g，瓊脂 20g，水 1000ml ；pH7. 2-7. 4。種子培養(yǎng)基15g黃豆粒( 加蒸懼水煮沸0. 5-lh,取濾液),5g蛋白胨,2. 5g硫酸銨，20g葡萄糖，IOg淀粉，0. 25g硫酸鎂，0. 2g磷酸二氫鉀，5g氯化鈉，配成水溶液，調(diào)pH7_8后，加Ig碳酸韓，加水定容至1000ml。發(fā)酵培養(yǎng)基15g黃豆粒(加蒸懼水煮沸0. 5-lh,取濾液),5g蛋白胨,2. 5g硫酸銨，IOg蔗糖，IOg淀粉，O. 25g硫酸鎂，O. 2g磷酸二氫鉀，5g氯化鈉，配成水溶液，調(diào)pH7_8后，力口Ig碳酸I丐，加水定容至1000ml。不加蔗糖的YEME培養(yǎng)基3g酵母提取物，5g蛋白胨，3g麥芽提取物，IOg葡萄糖，加水定容至1000ml,滅菌后加2ml2. 5M MgCl2。A、在發(fā)酵培養(yǎng)基中生產(chǎn)納他霉素將利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus) AO2CGMCC No. 1654 和利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus) AM02CGMCC No. 6815分別接種到高氏一號(hào)斜面培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)7-10天，待其產(chǎn)生足量的孢子，用無(wú)菌鉬環(huán)刮取其孢子2 - 3環(huán)接種于250ml三角瓶?jī)?nèi)的50ml種子培養(yǎng)基內(nèi)，置可控溫?fù)u床上,在28°C條件下，200rpm (旋轉(zhuǎn)半徑13mm)恒溫振蕩培養(yǎng)24h-30h ;然后在無(wú)菌條件下將其分接于60個(gè)500ml三角瓶?jī)?nèi)的發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)(每瓶裝液量為100ml),利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus) A02CGMCC No. 1654和利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus) AM02CGMCC No. 6815 的接種量相同，每瓶接種后 OD6tltl 值均為 O.1 ；接種后的搖瓶在31°C條件下，以240rpm (旋轉(zhuǎn)半徑13mm)的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)0、24、48、72、96、120h，取發(fā)酵液測(cè)定納他霉素的產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。B、在不加蔗糖的YEME培養(yǎng)基中生產(chǎn)納他霉素將利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus) A02CGMCC No. 1654 和利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus) AM02CGMCC No. 6815 分別接種到高氏一號(hào)斜面培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)7-10天，待其產(chǎn)生足量的孢子，用無(wú)菌鉬環(huán)刮取其孢子2 - 3環(huán)接種于250ml三角瓶?jī)?nèi)的50ml種子培養(yǎng)基內(nèi)，置可控溫?fù)u床上，在28°C條件下，200rpm (旋轉(zhuǎn)半徑13mm)恒溫振蕩培養(yǎng)24h-30h ;然后 在無(wú)菌條件下將其分接于70個(gè)500ml三角瓶?jī)?nèi)的不加蔗糖的YEME培養(yǎng)基內(nèi)(每瓶裝液量為100ml)，利迪鏈霉菌(Str印tomyceslydicus) A02CGMCCNo. 1654 和利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus) AM02CGMCC No. 6815 的接種量相同，每瓶接種后0D600值均為0.1 ;接種后的搖瓶在31°C條件下，以240rpm (旋轉(zhuǎn)半徑13mm)的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)0、24、48、72、96、12011，取發(fā)酵液測(cè)定納他霉素的產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。C、納他霉素產(chǎn)量分析將以上步驟獲得的ImL發(fā)酵液加入9mL甲醇，充分振蕩后，進(jìn)行30min超聲波提取，5000rpm/min離心10 — 15min沉降菌絲體及固形物，上清液稀釋10倍后用0. 45 μ m的無(wú)菌微孔濾膜過(guò)濾，收集濾液，所得樣品用于HPLC檢測(cè)。色譜柱C18柱(5 μ m, 4. 6mm X 200mm);檢測(cè)波長(zhǎng)303nm;流速1. OOmT ,/mi η ;進(jìn)樣量10μ ;檢測(cè)柱溫30°C ;實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相為V(甲醇)V(水)=65 35。以納他霉素(sigma_P9703)為標(biāo)準(zhǔn)品采用外標(biāo)法(標(biāo)準(zhǔn)曲線法)對(duì)納他霉素進(jìn)行定量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus) AM02CGMCC No. 6815 搖瓶發(fā)酵在不加蔗糖的YEME培養(yǎng)基上發(fā)酵72小時(shí)產(chǎn)量為1. 148g/L培養(yǎng)基，在發(fā)酵培養(yǎng)基上發(fā)酵96 小時(shí)產(chǎn)量為 5. 338g/L 培養(yǎng)基；利迪鏈霉菌(Sti^ptomyces lydicus) A02CGMCC No. 1654搖瓶發(fā)酵在不加蔗糖的YEME培養(yǎng)基上發(fā)酵72小時(shí)產(chǎn)量為0. 375g/L培養(yǎng)基，在發(fā)酵培養(yǎng)基上發(fā)酵96小時(shí)產(chǎn)量為2.546g/L培養(yǎng)基。說(shuō)明利迪鏈霉菌(Sti^ptomyces lydicus)AM02CGMCC No. 6815納他霉素產(chǎn)量在不加蔗糖的YEME培養(yǎng)基上約是野生型菌株利迪鏈霉菌(Sti^ptomyces lydicus)A02CGMCC No. 1654的3倍(圖3)，在發(fā)酵培養(yǎng)基上約是野生型菌株利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus) A02CGMCC No. 1654 的 2 倍(圖 4)。
其中，利迪鏈霉菌發(fā)酵液中納他霉素的粗提和鑒定方法如下一)發(fā)酵液中納他霉素的粗提將上述利迪鏈霉菌的發(fā)酵液分別用3倍體積的無(wú)水乙醇預(yù)處理，4°C靜置2h，以沉淀菌體、固形顆粒、可溶性粘膠狀物、核酸和雜蛋白質(zhì)以及中間代謝產(chǎn)物等，上清液用2層濾紙以布氏漏斗真空抽濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45°C下減壓濃縮，濃縮液即為納他霉素粗提物，4°C保存?zhèn)溆?。?)、納他霉素粗提物的分離純化通過(guò)大孔樹(shù)脂柱層析、硅膠柱層析和高效液相色譜儀HPLC進(jìn)行逐步分離純化。1、大孔樹(shù)脂吸附柱層析選用40cmX2. 6cm玻璃層析柱，X_5大孔樹(shù)脂(天津南開(kāi)大學(xué)化工廠)。大孔樹(shù)脂按廠家說(shuō)明預(yù)處理后用適量去離子水調(diào)勻，緩慢加入裝有1/3體積去離子水的層析柱中，同時(shí)從柱底部以勻速緩慢放出蒸餾水，使柱中液面始終保持在樹(shù)脂層上面。裝至約3/4柱高度，自然沉降6 10h，使平衡后的裝柱體積為150ml。取納他霉素粗提物與樹(shù)脂按1:1的體積比進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附。洗脫過(guò)程為2倍柱體積的無(wú)離子水洗脫除去部分色素和大量水溶性雜質(zhì)；2倍柱體積的30% (體積百分含量)甲醇洗脫去色素；最后用2倍柱體積的70% (體積百分含量)乙醇洗脫活性成分。分管收集洗脫液，每管15ml，濾紙片法進(jìn)行活性測(cè)定。結(jié)果表明活性洗脫液集中在第48 56管(即自4. 8倍柱體積至5. 6倍柱體積之間的洗脫液)。將活性洗脫液，45°C下減壓濃縮后供下一步分離。2、硅膠吸附柱層析 選用40cmX2. 6cm玻璃層析柱，100目 200目硅膠，以體積比為8 I I的乙醇、氨水和水的混合液為洗脫液；取約150g硅膠用去離子水浸泡3h，傾去細(xì)小顆粒，布氏漏斗真空抽濾除去水分；再用6mol/LHCl浸泡12h，然后用去離子水洗至中性，真空抽干；用無(wú)水乙醇浸泡過(guò)夜，真空抽干；臨用前在120° C下活化2h，干燥至恒重；層析柱中裝入1/3柱體積的洗脫液，然后緩慢加入用洗脫液混合均勻的硅膠，約至3/4柱高時(shí)停止加入，靜置6 10h，使硅膠緩慢沉降。然后用2 3倍體積的洗脫液以lmL/min的流速?zèng)_洗柱體，使之平衡。平衡后的柱體積為150ml。取步驟I的大孔樹(shù)脂活性洗脫濃縮液IOml上柱進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，用2 3倍柱體積的洗脫液按O. 5ml/min的流速進(jìn)行洗脫，用自動(dòng)部分收集器分管收集洗脫液，每管5ml。以釀酒酵母菌ACCC20036為指示菌，利用濾紙片瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)每管洗脫液活性。結(jié)果表明其洗脫液中的活性組分集中在第7 36管(即自O(shè). 23倍柱體積至1. 2倍柱體積之間的洗脫液)。將活性洗脫液，45°C下減壓濃縮后供下一步分離。3、制備型HPLC分離純化采用LC-9101 型循環(huán)制備 HPLC，JAIGEL-ODS-AP 型 SP-120-15 制備柱。取步驟2的硅膠柱層析后的活性洗脫濃縮液，用O. 45 μ m微孔濾器過(guò)濾，自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，每次進(jìn)樣量6ml ;以甲醇水(體積比為7 3)為流動(dòng)相進(jìn)行分離，利用UV檢測(cè)器在波長(zhǎng)305nm處檢測(cè)并自動(dòng)形成分離圖譜；利用餾分收集器分別收集圖譜中各曲線峰所對(duì)應(yīng)的洗脫液；以釀酒酵母菌ACCC20036為指示菌，利用濾紙片瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)每管洗脫液活性。以2ml/min的泵流速進(jìn)行第一次分離后，再以3ml/min的泵流速相繼分離2次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，第一次HPLC分離共檢測(cè)到30個(gè)峰，其中保留時(shí)間為57. 866min的強(qiáng)吸收峰為活性峰(圖6A)，其相對(duì)峰面積為35. 121% ;對(duì)其進(jìn)行的第二次分離檢測(cè)到6個(gè)峰，其中保留時(shí)間為41. 699min的峰為活性峰，其相對(duì)峰面積為97. 020% ;第三次分離檢測(cè)到保留時(shí)間為39. 766min的峰為活性峰(圖6B)，通過(guò)峰面積計(jì)算其純度為99. 845%。將第三次分離得到的活性峰樣品進(jìn)行真空濃縮，干燥后呈白色或奶油色粉末，該樣品即為納他霉素樣品。利用島津分析型HPLC采用下述方法對(duì)其進(jìn)行純度驗(yàn)證取少量樣品溶于70%甲醇水溶液，以甲醇(A)和水(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。色譜條件為C18反相柱，柱溫30°C，UV檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)305nm，SIL-1OADVP自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣10 μ 1，以Iml/min的流速洗脫60min。梯度洗脫步驟如下
時(shí)f"j (分)Λ(%)Β(%)
O 103565
11 205050
21 306535
3卜 408020
41 50955
SI 60100O`
結(jié)果顯示洗脫曲線為單一的峰，說(shuō)明其為單一組分，純度達(dá)到化學(xué)結(jié)構(gòu)測(cè)定的要求。四、純化樣品化學(xué)結(jié)構(gòu)的解析鑒定1、紫外吸收光譜(UV)將上述步驟三純化的納他霉素樣品極微量溶于超純水中，用日立UV — VIS3010紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在190nm 400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)以超純水為空白對(duì)照進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，自動(dòng)形成紫外吸收?qǐng)D譜。由紫外掃描圖譜可見(jiàn)，納他霉素樣品表現(xiàn)出典型的四烯類抗生素譜型，即在波長(zhǎng)281nm、291nm、305nm和319nm附近均有典型的共軛四烯發(fā)色基團(tuán)的吸收峰,其中波長(zhǎng)305nm處吸收值最大，281nm處吸收值最小(圖7)，說(shuō)明該物質(zhì)屬于多烯類中的四烯抗生素。2、紅外吸收光譜(IR)采用KBr壓片法，用德國(guó)BRUKER公司TENS0R27傅立葉紅外光譜儀進(jìn)行400cm 1^OOOcm 1區(qū)域內(nèi)掃描。納他霉素樣品的紅外光譜如圖8所示，其中v_3416. 78CHT1為-OH的特征吸收峰；vmax3288. 23cm-1為N-H的伸縮振動(dòng)特征吸收峰；vmax2940. 44和2980. 27cm-1是-CH3的特征吸收峰；vmax3017. 23CHT1是-CH2的特征吸收峰；vmax1715. 38^1表現(xiàn)典型的羰基強(qiáng)吸收峰；vmax1571. 44cm—1表現(xiàn)-C=C-的強(qiáng)吸收峰；vmax1634. 40cm—1表現(xiàn)-C=C-的弱吸收峰。3、高分辨質(zhì)譜采用德國(guó)BRUKER公司超高分辨率9. 4T混合型四級(jí)桿傅立葉串聯(lián)質(zhì)譜儀(9. 4TQ-FT-MS);條件capillary4000,Dry Gas :4. 01/s,源溫180° C, scan range :300 2000, syringe pump :1. 5ml/min,數(shù)據(jù)分析軟件為 Bruker DaltonicsDataAnalysis3. 4。結(jié)果表明，納他霉素樣品進(jìn)行分析的圖譜中，采用正離子檢測(cè)方式檢測(cè)到加合離子[Μ+Na]+為m/z688. 2937 (圖9B);采用負(fù)離子檢測(cè)方式檢測(cè)到準(zhǔn)分子離子[M_H]+為m/z664. 2975的化合物(圖9A);采用正、負(fù)離子檢測(cè)方式對(duì)納他霉素樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，確定664. 2975為分子離子峰。綜上所述，納他霉素樣品的主要活性組分的分子式均為C33H47NO13，分子量為665 ；由公式不飽和度(n) =1+Nc+ (Nn-Nh) /2 (Ne :碳原子數(shù)；Nn :氮原子數(shù)；Nh :氫原子數(shù))計(jì)算其分子式的不飽和度為11，表明其分子結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)不飽和鍵與環(huán)等。4、核磁共振譜(NMR)以氘代-二甲基甲 酰胺(d-DMF)為溶劑，以四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標(biāo)，室溫下測(cè)定。采用Bruker AVANCE DRX-500核磁共振譜儀(德國(guó)Bruker光譜儀器公司)，以氘代-二甲基甲酰胺(d-DMF)為溶劑，四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行氫譜(1HNMR)和碳譜(13CNMR)的測(cè)定；前者共振頻率為500. 1325156MHZ，采樣次數(shù)32768次；后者共振頻率125. 7577612MHZ，采樣次數(shù)為 65536 次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，納他霉素樣品的核磁共振13C圖譜(圖10A)中可以看出，分子中有一個(gè)羧基碳原子的化學(xué)位移(δ 165. 217)；一個(gè)羰基碳原子的化學(xué)位移(δ 178. 603)；一組共軛四烯碳原子的化學(xué)位移(δ 125. 089 145. 447);一組與羥基相連的碳原子的化學(xué)位移(δ 66. 102 70. 326);糖環(huán)上五個(gè)碳原子共振峰(δ 71. 194 97. 894);甲基碳原子共振峰(δ 18.062，δ 20. 360)。500兆赫的核磁共振1H圖譜(圖10Β)中可以看出，多烯環(huán)上和四個(gè)雙鍵相連的質(zhì)子氫(-CH=CH-)的化學(xué)位移(δ 5. 686 6. 625ppm);五個(gè)羥基中的質(zhì)子氫的化學(xué)位移值(δ 4. 187 4. 741ppm);五個(gè)亞甲基和兩個(gè)甲基中的質(zhì)子氫的化學(xué)位移(δ1. 274 2. 439ppm)。綜合分析上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，納他霉素樣品的主要活性組分為納他霉素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為
權(quán)利要求
1.構(gòu)建重組利迪鏈霉菌的方法，包括將納他霉素合成正調(diào)控基因?qū)胱鳛樗拗骶睦湘溍咕泻Y選得到納他霉素產(chǎn)量高于所述宿主菌的重組利迪鏈霉菌的步驟； 所述納他霉素合成正調(diào)控基因編碼如下a)或b)的蛋白質(zhì) a)氨基酸序列如SEQID No.1所示的蛋白質(zhì)； b)將SEQID No.1中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與納他霉素合成相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述納他霉素合成正調(diào)控基因的編碼序列為 SEQ ID No. 2 的第 433-1011 位。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述納他霉素合成正調(diào)控基因的序列為 SEQ ID No. 2 的第 14-1011 位。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述將納他霉素合成正調(diào)控基因?qū)胱鳛樗拗骶睦湘溍咕ㄈ缦虏襟E將所述納他霉素合成正調(diào)控基因的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中得到重組大腸桿菌，再將所述重組大腸桿菌與所述作為宿主菌的利迪鏈霉菌進(jìn)行雙親接合獲得所述重組利迪鏈霉菌；所述納他霉素合成正調(diào)控基因的表達(dá)載體中，啟動(dòng)所述納他霉素合成正調(diào)控基因的啟動(dòng)子是紅霉素抗性基因啟動(dòng)子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述作為宿主菌的利迪鏈霉菌為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus) A02CGMCC No. 1654。
6.由權(quán)利要求1至5中任一所述方法得到的重組利迪鏈霉菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組利迪鏈霉菌，其特征在于所述重組利迪鏈霉菌的菌株號(hào)為AM02，其在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCCNo.6815。
8.權(quán)利要求6或7所述的重組利迪鏈霉菌在生產(chǎn)那他霉素中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求6或7所述的重組利迪鏈霉菌在制備植物病原真菌抑制劑中的應(yīng)用；或在抑制植物真菌病害中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物病原真菌為下述至少一種甘藍(lán)枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans)和西瓜枯萎病菌(F. oxysporumf. sp. niveum)； 所述植物真菌病害為下述至少一種由甘藍(lán)枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp.conglutinans)引起的病害和由西瓜枯萎病菌(F. oxysporum f. sp. niveum)引起的病害。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了產(chǎn)納他霉素的重組利迪鏈霉菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。本發(fā)明的構(gòu)建產(chǎn)納他霉素的重組利迪鏈霉菌的方法，包括將納他霉素合成正調(diào)控基因?qū)胱鳛樗拗骶睦湘溍咕泻Y選得到納他霉素產(chǎn)量高于所述宿主菌的重組利迪鏈霉菌的步驟；所述納他霉素合成正調(diào)控基因編碼如下a)或b)的蛋白質(zhì)a)氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示的蛋白質(zhì)；b)將SEQ ID No.1中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與納他霉素合成相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的重組利迪鏈霉菌，具有比野生型顯著提高的產(chǎn)納他霉素和抑菌能力，可以應(yīng)用于食品、生物能源及飼料添加等方面。
文檔編號(hào)C12N15/76GK103060364SQ20121057981
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月27日
發(fā)明者吳慧玲, 劉偉成, 燕繼曄, 董丹, 劉霆, 盧彩鴿, 張殿朋, 張濤濤, 田兆豐, 盧向陽(yáng) 申請(qǐng)人:北京市農(nóng)林科學(xué)院