專利名稱：一種活性物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種活性物及其應(yīng)用，屬生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
根結(jié)線蟲是一種極難防治的植物寄生線蟲。隨著設(shè)施蔬菜栽培的迅猛發(fā)展，根結(jié)線蟲的發(fā)生區(qū)域不斷擴(kuò)大，危害日益加劇。根結(jié)線蟲有90余種，其中南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)是危害最為嚴(yán)重的根結(jié)線蟲之一。南方根結(jié)線蟲(M.1ncognita)屬線蟲門(Nematoda)、側(cè)尾腺 P 綱(Secernentea)、墊刃目(Tylenchida)、墊刃亞目(Tylenchina)、墊刃總科(Tylenchoidea)、異皮線蟲科(Heteroderidae)、根結(jié)亞科(Meloidogyninae)、根結(jié)線蟲屬(Meloidogyne)。南方根結(jié)線蟲(Μ· incognita)寄主范圍 廣，受害后的植株根部形成大小不等的瘤狀根，水分和養(yǎng)料運(yùn)輸受阻，導(dǎo)致植株營養(yǎng)不良，發(fā)病嚴(yán)重時整株萎蔫枯死，是一種極難防治的土傳性病害。現(xiàn)有南方根結(jié)線蟲(M.1ncognita)病的防治方法包括化學(xué)防治、抗病育種、物理防治等，其中以化學(xué)殺線蟲劑為主。隨著化學(xué)藥劑對環(huán)境所造成的污染，一些有效的殺線蟲劑逐步被禁用，因此人們力求從自然界中尋找能防治南方根結(jié)線蟲(M.1ncognita)病的天然藥劑。微生物是產(chǎn)生活性天然產(chǎn)物的主要源泉之一，從微生物的代謝產(chǎn)物中尋找具有對南方根結(jié)線蟲(M.1ncognita)有毒殺活性的天然產(chǎn)物成為一個研究熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種活性物及其應(yīng)用。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的1、活性發(fā)酵液的制備本發(fā)明使用的細(xì)菌菌株是變形桿菌(Proteus sp.)⑶-126，菌株⑶-126已于2012年7月12日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所；保藏號=CGMCC No. 6357。變形桿菌(Proteus sp.)⑶-126保存在酵母提取物胰蛋白胨(LB)培養(yǎng)基(酵母提取物=5. O g,胰蛋白胨10. O g,氯化鈉10. O g，水1000 ml, pH :7. O)中，使用時在LB的液體培養(yǎng)基中活化24小時。將活化后菌種100 μ I接種于裝有50 ml - 250 ml液體LB培養(yǎng)基三角瓶中，在溫度為28-37°C，轉(zhuǎn)速為120-180rpm的條件下培養(yǎng)96小時，即得到培養(yǎng)液。將培養(yǎng)液8500 rpm離心10分鐘后，取上清放入4°C的冰箱中備用，得到本發(fā)明使用的活性發(fā)酵液。2制備試驗用的南方根結(jié)線蟲(M.1ncognita)番茄根系用于南方根結(jié)線蟲(M.1ncognita)的制備。取發(fā)病嚴(yán)重的番茄根系，洗凈后統(tǒng)計根結(jié)數(shù)量，放入水中浸泡過夜，收集浸泡液；同法再泡洗3次，棄去根系。殘液和泥土經(jīng)2000 rpm離心2 min,棄去上清液,加入494 g/L鹿糖,混勻后2000 rpm離心2 min,將上清液用800目的分離篩清洗，收集分離篩上的幼蟲和蟲卵。洗液再用100、200和500目的分離篩反復(fù)漂洗，收集500目分離篩上的收集物-大部分為蟲卵；500目分離篩上的濾過液再經(jīng)800目的分離篩清洗，收集分離篩上的蟲體-2齡幼蟲。所分離的蟲和蟲卵儲于4°C的冰箱中備。3.實驗方法液體浸泡法取5 ml稀釋10倍的測試樣品溶液、200 μ 含有±200條線蟲的懸液于直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中，輕輕混勻后將培養(yǎng)皿室溫放置。在解剖鏡下隨機(jī)選擇10個視野定時(6小時、12小時、24小時)進(jìn)行觀察，計數(shù)病蟲數(shù)(以線蟲不動作為標(biāo)準(zhǔn))和總線蟲數(shù)。每個測試樣品設(shè)三個重復(fù)，并以未接種菌株的培養(yǎng)基為對照，得到測試樣品對線蟲的致死率，以致死率高低評定樣品對線蟲的毒力。三格平板法取5 ml發(fā)酵液于三格板一格中，其余兩格各加入水瓊脂，在水瓊脂表面分別加入線蟲(約100條)。在顯微鏡下定時(12小時、24小時、48小時)進(jìn)行觀察，觀察到的僵直針刺無反應(yīng)線蟲計為死蟲，記下觀察到的死蟲數(shù)和總線蟲數(shù)，計算各發(fā)酵液對線蟲的致死率。每一處理重復(fù)三次，用等量LB培養(yǎng)基作為對照。本發(fā)明的活性發(fā)酵液在制備毒殺南方根結(jié)線蟲(M.1ncognita)生物農(nóng)藥中應(yīng)用。本發(fā)明對南方根結(jié)線蟲(M.1ncognita)具有良好的毒殺作用，綜合性狀好，高效低毒的優(yōu)點(diǎn)，能夠作為制備生物農(nóng)藥殺線劑的應(yīng)用，易于工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施例方式下面用實施例來進(jìn)一步詳述本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。實施例一將活化后的變形桿菌(Proteus sp. )CD_126 100 μ I接種于液體LB培養(yǎng)基中(500ml三角瓶裝250 ml培養(yǎng)基)，于28°C、180 rpm條件下培養(yǎng)96小時。將培養(yǎng)液8500 rpm離心10分鐘后，取上清作為測試樣品，稀釋十倍后用液體浸泡法測試活性。結(jié)果見表I。表I變形桿菌(Proteus sp. ) Q)_126發(fā)酵液對南方根結(jié)線蟲(Μ· incognita)液體浸泡法測定的活性
權(quán)利要求
1.一種活性物，其特征在于該活性物經(jīng)如下步驟得到 a.將保藏號為CGMCCNo. 6357的變形桿菌(Proteus sp. ) CD-126保存在酵母提取物胰蛋白胨(LB)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基包括酵母提取物5. 0 g,胰蛋白胨10. 0 g,氯化鈉10. 0g，水1000 ml,及pH 7. 0，使用時在同樣的液體培養(yǎng)基中活化24小時； b.將活化后菌種100接種于裝有50 ml - 250 ml液體LB培養(yǎng)基三角瓶中，在溫度為28°C -37°C，轉(zhuǎn)速為120-180rpm的條件下培養(yǎng)96小時，得到培養(yǎng)液；將培養(yǎng)液8500rpm離心10分鐘后，取上清放入4°C的冰箱中備用。
2.權(quán)利書I所述的活性物在制備殺南方根結(jié)線蟲(M.1ncognita)生物制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種活性物及其應(yīng)用，屬生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。該活性物經(jīng)如下步驟得到a. 將保藏號為CGMCC No. 6357的變形桿菌(Proteus sp.)CD-126保存在酵母提取物胰蛋白胨(LB)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基包括酵母提取物5.0g，胰蛋白胨10.0g，氯化鈉10.0g，水1000ml，及pH7.0，使用時在同樣的液體培養(yǎng)基中活化24小時；b. 將活化后菌種100μl接種于裝有50ml - 250ml液體LB培養(yǎng)基三角瓶中，在溫度為28℃-37℃，轉(zhuǎn)速為120-180rpm的條件下培養(yǎng)96小時，得到培養(yǎng)液；將培養(yǎng)液8500 rpm離心10分鐘后，取上清放入4℃的冰箱中備用。該活性物在制備殺南方根結(jié)線蟲(M. incognita)生物制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的活性物，具有成本低，制備方法簡便，高效低毒的優(yōu)點(diǎn)，能用于殺南方根結(jié)線蟲(M. incognita)的生物制劑的制備。
文檔編號C12R1/37GK103014068SQ20121058035
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月28日
發(fā)明者李國紅, 盧皓, 張克勤, 王芯 申請人:云南大學(xué)