穩(wěn)定敲低Mon1A的細(xì)胞系及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種穩(wěn)定敲低Mon1A的細(xì)胞系，包括真核表達(dá)載體，所述真核表達(dá)載體包括用于抑制Mon1A表達(dá)的序列。這種穩(wěn)定敲低Mon1A的細(xì)胞系，通過抑制Mon1A的mRNA的轉(zhuǎn)錄，以明顯降低Mon1A的蛋白表達(dá)量。該穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立，不僅成功在體外模擬了乳腺癌細(xì)胞Mon1A的表達(dá)狀態(tài)為研究Mon1A在乳腺癌中的作用提供了模型，而且也為Mon1A的功能的研究提供了幫助。本發(fā)明還提供了一種上述穩(wěn)定敲低Mon1A的細(xì)胞系的構(gòu)建方法。
【專利說明】穩(wěn)定敲低MonIA的細(xì)胞系及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種穩(wěn)定敲低MonlA的細(xì)胞系及其構(gòu)建方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]連續(xù)的從初級(jí)內(nèi)體向次級(jí)內(nèi)體的轉(zhuǎn)變需要協(xié)調(diào)小GTP酶Rab5和Rab7活性。初級(jí)內(nèi)體向次級(jí)內(nèi)體的轉(zhuǎn)變可能是通過轉(zhuǎn)運(yùn)載體也可能是通過內(nèi)體上丟失Rab5同時(shí)獲得Rab7這樣的Rab蛋白的轉(zhuǎn)變所調(diào)控的，在線蟲內(nèi)的研究證明了后一種的調(diào)控方式。此外，后來研究表明在后生動(dòng)物中SAND-1/MonlA是Rab蛋白轉(zhuǎn)變的臨界開關(guān)。SAND-1在這一過程中有著雙重的作用。首先，它通過將RABX-5從內(nèi)吞小體的膜上去除來阻斷對(duì)RAB-5活性是正反饋調(diào)節(jié)；其次，它加倍了對(duì)RAB-7的募集，很可能是通過與同一膜上的HOPS復(fù)合物相互作用完成。因而SAND-1/MonlA調(diào)控著RAB-5和RAB_7GEFs的分布而成為RAB-5和RAB-7的轉(zhuǎn)換開關(guān)。
[0003]胞外物質(zhì)在細(xì)胞膜上的內(nèi)陷處被包裹從而被吸收進(jìn)入細(xì)胞。這些內(nèi)陷無論是管狀還是小泡結(jié)構(gòu)都是通過一種分裂方式進(jìn)而從質(zhì)膜上釋放到胞內(nèi)的。這些內(nèi)吞的產(chǎn)物與初級(jí)內(nèi)體融合，而初級(jí)內(nèi)體是被其所帶有的一種小GTP酶Rab蛋白家族的Rab5以及Rab5效應(yīng)蛋白(例如EEAl和磷酸肌醇激酶Vps34)所標(biāo)記的。初級(jí)內(nèi)體也被認(rèn)為是分選內(nèi)體，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)可以被再循環(huán)到質(zhì)膜，也可以被逮到轉(zhuǎn)運(yùn)高爾基網(wǎng)，或是成為溶酶體分解的底物。溶酶體的分選牽涉到轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)到次級(jí)內(nèi)體，也相當(dāng)于多泡體。次級(jí)內(nèi)體被另外一個(gè)小GTP酶Rab家族的Rab7所標(biāo)記。
[0004]從初級(jí)內(nèi)體向次 級(jí)內(nèi)體轉(zhuǎn)化的過程因涉及一個(gè)關(guān)系到Rab5的正反饋調(diào)節(jié)而十分復(fù)雜。Rab5依靠鳥嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)換因子(GEF)Rabex5來啟動(dòng)隨后的綁定并激活效應(yīng)分子，如磷酸肌醇激酶Vps34，從而被募集到初級(jí)內(nèi)體上。這樣會(huì)依次增加與Rab5和更多效應(yīng)分子的綁定。后來的研究發(fā)現(xiàn)了 SAND-1/MonlA是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)在Rab蛋白轉(zhuǎn)換過程中的重要調(diào)節(jié)器。SAND-1/MonlA是RAB-5活性是正反饋調(diào)節(jié)的阻斷劑。不僅如此，SAND-1/MonlA的活性驅(qū)使Rab7被募集到初級(jí)內(nèi)體上，很可能是通過與Rab7的鳥嘌呤轉(zhuǎn)換因子復(fù)合物HOPS相互作用完成的。
[0005]因此，SAND-1/MonIA是初級(jí)向次級(jí)內(nèi)體成熟的轉(zhuǎn)換器。SAND-1/MonlA在脊椎動(dòng)物里有兩個(gè)同源物，MonlA和MonlB。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]基于此，有必要提供一種穩(wěn)定敲低MonlA的細(xì)胞系及其構(gòu)建方法。
[0007]—種穩(wěn)定敲低MonlA的細(xì)胞系,包括真核表達(dá)載體,所述真核表達(dá)載體包括用于抑制MonlA表達(dá)的序列。
[0008]在一個(gè)實(shí)施例中，所述用于抑制MonlA表達(dá)的序列為SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0009]在一個(gè)實(shí)施例中，所述細(xì)胞系為MCF-7A細(xì)胞系。[0010]在一個(gè)實(shí)施例中，所述真核表達(dá)載體為pLK0.1質(zhì)粒。
[0011]在一個(gè)實(shí)施例中，所述用于抑制MonlA表達(dá)的序列插入到所述pLK0.1質(zhì)粒的Age I和EcoR I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間。
[0012]一種穩(wěn)定敲低MonlA的細(xì)胞系的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0013]構(gòu)建包括用于抑制MonlA表達(dá)的序列的真核表達(dá)載體；
[0014]將所述包括用于抑制MonlA表達(dá)的序列的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，得到所述穩(wěn)定敲低MonlA的細(xì)胞系。
[0015]在一個(gè)實(shí)施例中，所述用于抑制MonlA表達(dá)的序列為SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0016]在一個(gè)實(shí)施例中，所述細(xì)胞系為MCF-7A細(xì)胞系。
[0017]在一個(gè)實(shí)施例中，所述真核表達(dá)載體為pLK0.1質(zhì)粒。
[0018]在一個(gè)實(shí)施例中，所述用于抑制MonlA表達(dá)的序列插入到所述pLK0.1質(zhì)粒的Age I和EcoR I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間。
[0019]這種穩(wěn)定敲低MonlA的細(xì)胞系,通過抑制MonlA的mRNA的轉(zhuǎn)錄，以明顯降低MonlA的蛋白表達(dá)量。該穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立，不僅成功在體外模擬了乳腺癌細(xì)胞MonlA的表達(dá)狀態(tài)為研究MonlA在乳腺癌中的作用提供了模型，而且也為MonlA的功能的研究提供了幫助。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為原始的pLK0.1質(zhì)粒的圖譜；
[0021]圖2為一實(shí)施方式的穩(wěn)定敲低MonlA的細(xì)胞系的構(gòu)建方法的流程圖；
[0022]圖3為western檢測MCF-7A MonlA knock-down穩(wěn)定細(xì)胞系蛋白表達(dá)量的結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】做詳細(xì)的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進(jìn)，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實(shí)施的限制。
[0024]—實(shí)施方式的穩(wěn)定敲低MonlA的細(xì)胞系,包括真核表達(dá)載體。
[0025]真核表達(dá)載體包括用于抑制MonlA表達(dá)的序列
[0026]用于抑制MonlA表達(dá)的序列為SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0027]細(xì)胞系可以為MCF-7A細(xì)胞系，其原始來源為人的乳腺癌細(xì)胞，購買自美國菌種保藏中心(ATCC)。
[0028]真核表達(dá)載體可以為pLK0.1質(zhì)粒。
[0029]如圖1所示，具體來說，用于抑制MonlA表達(dá)的序列插入在pLK0.1質(zhì)粒Age I和EcoR I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間。。 [0030]如圖2所示的上述穩(wěn)定敲低MonlA的細(xì)胞系，包括如下步驟。
[0031]S10、構(gòu)建包括用于抑制MonlA表達(dá)的序列的真核表達(dá)載體。
[0032]真核表達(dá)載體可以為pLK0.1質(zhì)粒。[0033]pLK0.1 載體購自 Open Biosystems 公司。
[0034]oligo dT、各種限制性內(nèi)切酶和Taq酶均購自TaKaRa公司。
[0035]T4DNA連接酶購自NEB公司。
[0036]膠回收試劑盒和質(zhì)粒少量抽提試劑盒購自O(shè)MEGA公司。
[0037]質(zhì)粒大量抽提試劑盒購自Nucleo Bond公司。
[0038]原始的pLK0.1質(zhì)粒的圖譜如圖1所示，將用于抑制MonlA表達(dá)的序列插入到Age I和EcoR I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間,得到包括用于抑制MonlA表達(dá)的序列的真核表達(dá)載體。
[0039]用于抑制MonlA表達(dá)的序列為SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0040]該SEQ ID N0.1序列是根據(jù)我們所要抑制的目的基因用軟件設(shè)計(jì)得到的，再根據(jù)PLK0.1的說明，用引物退火連接的方法將該序列連入pLK0.1載體中。
[0041]得到的包括用于抑制MonlA表達(dá)的序列的真核表達(dá)載體可以通過PCR后酶切，跑DNA電泳鑒定。
[0042]S20、將SlO得到的包括用于抑制MonlA表達(dá)的序列的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，得到穩(wěn)定敲低MonlA的細(xì)胞系。
[0043]將包括用于抑制MonlA表達(dá)的序列的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，得到穩(wěn)定敲低MonlA的細(xì)胞系。
[0044]細(xì)胞系可以為MCF-7A細(xì)胞系。
[0045]DMEM1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購自HyClone公司；轉(zhuǎn)染試劑Magetran購自O(shè)rigene公司；MCF10A細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。倒置顯微鏡為Olympus產(chǎn)品，突光倒置顯微鏡為Nikon公司產(chǎn)品。
[0046]確定篩選培養(yǎng)基中合適濃度的G418濃度。
[0047]G418 的配制:配制 IM HEPES:23.8g HEPES 粉末溶于 100mL ddH20, IONNaOH 調(diào)節(jié)pH至7.3，過濾除菌，4°C保存，終濃度為lmol/L。
[0048]制備篩選培養(yǎng)基:用培養(yǎng)基將G418稀釋為O μ g/ml, 200 μ g/ml, 300 μ g/ml,400 μ g/ml>500 μ g/ml>600 μ g/ml>700 μ g/ml>800 μ g/ml>900 μ g/ml>1000 μ g/ml、Ι100μ g/ml ,1200 μ g/ml 24孔板，每孔Iml培養(yǎng)基(含有G418的完全培養(yǎng)基)，每個(gè)濃度4個(gè)重復(fù)，則每次換液需各個(gè)濃度培養(yǎng)基4ml，現(xiàn)用現(xiàn)配。
[0049]將凍存的細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)，傳代3至4次使細(xì)胞達(dá)到良好的生長狀態(tài)，鋪24孔板(20000/孔)，12h換液，加篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)。
[0050]確定G418最佳篩選濃度:將培養(yǎng)孔中培養(yǎng)基吸除，PBS洗滌一次，每孔加入不同濃度篩選培養(yǎng)基，隔天更換一次篩選培養(yǎng)基，培養(yǎng)10-14天，以最低細(xì)胞全部死亡濃度為基準(zhǔn)。
[0051]實(shí)驗(yàn)中所確定的最佳篩選濃度為1200μg/ml。
[0052]Magetran試劑轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞及抗性細(xì)胞克隆的篩選。
[0053]接種MCF7A細(xì)胞至6孔板，用含10%胎牛血清的DMEM1640培養(yǎng)基培養(yǎng)至密度約為70%~80%時(shí)可用于轉(zhuǎn)染。將Magetran試劑及質(zhì)粒pLKO-MonIAknockdown溶液平衡至室溫，在離心管內(nèi)準(zhǔn)備下列混合液:200μ I opt1-DMEM>2 μ g質(zhì)粒、6 μ I Magetran轉(zhuǎn)染試劑,震蕩混勻后靜置室溫孵育15min。給細(xì)胞更換新的培養(yǎng)基后將混合液加入培養(yǎng)盤中，搖勻。置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)12小時(shí)候移除培養(yǎng)基，更換為新鮮的含10%胎牛血清的DMEM1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后加最佳篩選濃度培養(yǎng)基，隔天換液。在換液一兩次后(換液后培養(yǎng)過夜)，細(xì)胞達(dá)50%-80%時(shí)，吸出所有培養(yǎng)液，離心3000-4000rpm，吸上清
0.22 μ m過濾，加入2倍體積的新鮮的最佳篩選濃度培養(yǎng)液，混勻4°C備用。培養(yǎng)6天左右細(xì)胞大量死亡時(shí)，可以換用適應(yīng)性培養(yǎng)基。或者可以增加血清濃度培養(yǎng)，例如原來用10%血清，此時(shí)則可以采用20%血清。培養(yǎng)10天后將G418濃度減半，維持篩選壓力。篩選約14天后可見有抗性克隆出現(xiàn)。挑單克隆:高倍鏡下標(biāo)記陽性克隆，套環(huán)法或刮除法結(jié)合有限稀釋法篩選陽性克隆，將其轉(zhuǎn)入多孔板培養(yǎng)。
[0054]單克隆鑒定:細(xì)胞大量擴(kuò)增后，提取總RNA，RT-PCR檢測目的基因的表達(dá)，同時(shí)western檢測目的基因表達(dá)。
[0055]RT-PCR檢測結(jié)果如下表所示，western檢測目的基因的結(jié)果如圖3所示。錯(cuò)誤！未找到引用源。有上表可見，MonlA敲除后與對(duì)照相比，表達(dá)量明顯降低。說明我們轉(zhuǎn)入的shRNA已整合到MCF7A細(xì)胞基因組內(nèi)并穩(wěn)定表達(dá)，抑制了 mRNA轉(zhuǎn)錄。
[0056]MCF-7A MonlA knock-down穩(wěn)定細(xì)胞系蛋白表達(dá)量的檢測。
[0057]由圖3可見，MonlA的蛋白表達(dá)量比正常細(xì)胞明顯降低，說明目的基因已整合進(jìn)MCF7A細(xì)胞基因組中可持續(xù)表達(dá)。
[0058]本實(shí)施例中使用Novus Biologicals 公司的 Monla:NBP1_52006 抗體。
[0059]將正常的MCF-7A細(xì)胞與我們所構(gòu)建的穩(wěn)定敲低MonlA (MonlAknock-down)的MCF-7A細(xì)胞系同時(shí)收樣做蛋白檢測。首先，去除培養(yǎng)基后加入4°C PBS將細(xì)胞用細(xì)胞刮刮下來放入15ml離心管中，2000轉(zhuǎn)5min離心，去除上清，再每管加入1ml 4°C PBS把細(xì)胞沉淀吹勻后轉(zhuǎn)移到1.5ml EP管內(nèi)再次離心并去上清。接著開始裂解細(xì)胞，將RAPA強(qiáng)裂解液與蛋白酶抑制劑，100:1的比例混合后加到細(xì)胞沉淀中，4°C搖晃裂解Ih后，4°C 14000轉(zhuǎn)離心，取上清即樣品。最后測樣品蛋白濃度，并加入Loading buffer煮沸8min,再調(diào)平上樣量用SDS-聚丙烯凝膠電泳跑膠。電泳3小時(shí)，轉(zhuǎn)膜2小時(shí)，之后抗體孵育，一抗2小時(shí)，二抗I小時(shí)，顯色曝光。
[0060]目的細(xì)胞的篩選。
[0061]將正常的MCF-7A細(xì)胞與我們所構(gòu)建的穩(wěn)定敲低MonlA (MonlAknock-down)的MCF-7A細(xì)胞系同時(shí)培養(yǎng)，正常的MCF 7A細(xì)胞近似菱形，貼壁生長。
[0062]轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，使用G418濃度為1200 μ g/ml的10%胎牛血清的DMEM1640培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，獲得抗性克隆。在含G418的培養(yǎng)液中，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞死亡。將獲得的抗性細(xì)胞混合克隆再用G418進(jìn)行系列稀釋、鑒定、選擇后得到單克隆抗性細(xì)胞株，用10%胎牛血清的DMEM1640培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)。
[0063]本研究首次成功構(gòu)建穩(wěn)定敲低MonlA (MonlA knock-down)的MCF-10A細(xì)胞系,通過抑制MonIA的mRNA的轉(zhuǎn)錄，以明顯降低MonlA的蛋白表達(dá)量。該穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立，不僅成功在體外模擬了乳腺癌細(xì)胞MonlA的表達(dá)狀態(tài)為研究MonlA在乳腺癌中的作用提供了模型，而且也為MonlA的很功能的研究提供了幫助。
[0064]以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的一種或幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫 離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。[0065]參考文件:
[0066]I Olivier ter B., Karen ; t H., Y.Liulj Mireille C., Karin J.and BenB.Lentiviral VectorDesign for Multiple shRNA Expression and Durable HIV-1Inhibition.MolecularTherapyj2008，vol.16(3):557-564.[0067]2 Li, MJ, Kimj J, Li，S，Zaia，J，Yeej JK, Anderson, J et al.(2005).Long-terminhibition ofHIV-1 infection in primary hematopoietic cells by lentiviralvector delivery of a triplecombinationof ant1-HIV shRNA，anti_CCR5 ribozyme, anda nucleolar-localizing TAR decoy.Mol Ther 12:900-909.[0068]3 Anderson, J, Li, MJ, Palmer B，Remling，L，Li，，S，Yam，P et al.(2007).Safetyand efficacyof a lentiviral vector containing three ant1-HIV genes—CCR5ribozyme, tat-rev siRNAj and TARdecoy—in SCID—hu mouse-derived T cells.Mol Ther15:1182-1188.[0069]4 Castanottoj Dj Sakuraij K, Lingemanj Rj Li, H, Shively L，Aagaard，L etal.(2007).Combinatorial delivery of small interfering RNAs reduces RNAiefficacy by selective incorporationinto RISC.Nucleic Acids Res 35:5154-5164.[0070]5 Bergesj BK, Wheat, WH, Palmer, BE，Connick，E and Akkina，R(2006).HIV-1infectionand CD4 T cell depletion in the humanized Rag2-/-gamma c-/_(RAG-hu)mouse model.Retrovirology 3:76.[0071]6 Ivan N.Colaluca, Daniela Tosonij Paolo Nuciforo，F(xiàn)rancescaSenic—Matμ glia，Numbcontrols p53 tumour suppressor activity, nature, January2008，Vol 4511 3.[0072]7 Salvatore PecejStefano ConfalonierijPascale R.Romano,Pier PaoloDiFiorej NUMB-1ng down cancer by more than just a NOTCH，Biochimica et BiophysicaActa 1815(2011)26-43.[0073]8 Uemura T，Shepherd S，Ackerman L，Jan LY, Jan YN.numb, a gene requiredindetermination of cell fate during sensory organ formation in Drosophilaembryos.Cell 1989;58 (2):349-60.[0074]9 Rhyu MS，Jan LY,Jan YN.Asymmetric distribution of numb protein duringdivision of thesensory organ precursor cell confers distinct fates to daughtercells.Cell 1994; 76 (3):477-91.[0075]10 Spana EP, Kopczynski C，Goodman CS，Doe CQ.Asymmetric localizationof numbautonomously determines sibling neuron identity in the Drosophila Cns.Development 1995;121 (11):3489-94.[0076]11 Pedersen WAj Chan SLj Zhu HY, Abdur-Rahman LA,Verdi JM，MattsonMP.Numbisoforms containing a short PTB domain promote neurotrophicfactor-1nduced differentiation andneurotrophic factor withdrawal-1nduced deathof PC12 cells.J Neurochem 2002;82 (4):976-86.[0077]12 Toriya M，Tokunaga A, Sawamoto K，Nakao K，Okano H.Distinct functionsof humanNumb isoforms revealed by misexpression in the neural stem cell lineage
【權(quán)利要求】
1.一種穩(wěn)定敲低MonlA的細(xì)胞系,其特征在于,包括真核表達(dá)載體,所述真核表達(dá)載體包括用于抑制MonlA表達(dá)的序列。
2.如權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定敲低MonlA的細(xì)胞系，其特征在于，所述用于抑制MonlA表達(dá)的序列為SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定敲低MonlA的細(xì)胞系，其特征在于，所述細(xì)胞系為MCF-7A細(xì)胞系。
4.如權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定敲低MonlA的細(xì)胞系，其特征在于，所述真核表達(dá)載體為pLK0.1 質(zhì)粒。
5.如權(quán)利要求4所述的穩(wěn)定敲低MonlA的細(xì)胞系，其特征在于，所述用于抑制MonlA表達(dá)的序列插入到所述pLK0.1質(zhì)粒的Age I和EcoR I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間。
6.一種穩(wěn)定敲低MonlA的細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟: 構(gòu)建包括用于抑制MonlA表達(dá)的序列的真核表達(dá)載體； 將所述包括用于抑制MonlA表達(dá)的序列的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，得到所述穩(wěn)定敲低MonlA的細(xì)胞系。
7.如權(quán)利要求6所述的穩(wěn)定敲低MonlA的細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，所述用于抑制MonlA表達(dá)的序列為SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
8.如權(quán)利要求6所述的穩(wěn)定敲低MonlA的細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，所述細(xì)胞系為MCF-7A細(xì)胞系。
9.如權(quán)利要求6所述的穩(wěn)定敲低MonlA的細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，所述真核表達(dá)載體為PLK0.1質(zhì)粒。
10.如權(quán)利要求9所述的穩(wěn)定敲低MonlA的細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，所述用于抑制MonlA表達(dá)的序列插入 到所述pLK0.1質(zhì)粒的Age I和EcoR I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間。
【文檔編號(hào)】C12N5/09GK103898054SQ201210580780
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月27日
【發(fā)明者】劉毅, 楊詩涵, 李紅昌, 李華順 申請(qǐng)人:深圳先進(jìn)技術(shù)研究院