蛋白BhHSP70-1及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種蛋白BhHSP70-1及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白，稱(chēng)為BhHSP70-1，來(lái)源于苦苣苔科的旋蒴苣苔（Boea?hygrometrica），是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；（b）將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，BhHSP70-1是與植物抗旱、抗鹽性相關(guān)的蛋白；對(duì)于培育抗旱、抗鹽性提高的作物、林草等新品種具有重要的理論及實(shí)際意義，可用于農(nóng)牧業(yè)和生態(tài)環(huán)境治理所需的抗性植物品種的培育與鑒定。
【專(zhuān)利說(shuō)明】蛋白BhHSP70-1及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種蛋白BhHSP70-l及其編碼基因與應(yīng)用?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]隨著全球水資源的缺乏和極端氣候事件的增長(zhǎng)，干旱對(duì)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)的影響日趨顯著。因此，通過(guò)分子操作技術(shù)提高作物的抗旱性日顯重要。
[0003]生物體受到干旱脅迫或其它不良環(huán)境因素后，會(huì)產(chǎn)生一系列的應(yīng)急反應(yīng)，其中熱激蛋白(heat shock protein,HSP)會(huì)在體內(nèi)迅速積累,在保護(hù)細(xì)胞、新生蛋白的折疊、變性蛋白的重新折疊和已經(jīng)形成聚合體的蛋白質(zhì)的分解等過(guò)程中具有關(guān)鍵作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HSPs的含量與生物體耐脅迫性呈正相關(guān)，且能夠提高生物體的應(yīng)激能力和在逆境中的
存活率。
[0004]復(fù)蘇植物可以忍受極度干旱的條件，待水份充足時(shí)又能很快恢復(fù)正常生命活動(dòng)。已知被子植物中的復(fù)蘇植物很少，且主要分布在南非、南美和澳大利亞。旋蒴苣苔(Boeahygrometrica)是在我國(guó)分布的一種苦苣苔科復(fù)蘇植物，該植物的葉片具有很強(qiáng)的耐旱復(fù)蘇能力，在室溫、相對(duì)空氣濕度為O的條件下生長(zhǎng)72小時(shí)后，葉片相對(duì)含水量降為3%左右，葉片面積皺縮至原葉片面積的1/3以下，光合作用基本停止。只要重新給水，葉片就可以吸水伸展，并恢復(fù)成未處理前的葉片表觀狀態(tài)和生理狀態(tài)(包括光合作用的恢復(fù))。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供蛋白BhHSP70_l及其編碼基因。
[0006]本發(fā)明提供的蛋白，稱(chēng)為BhHSP70_l，來(lái)源于苦苣苔科的旋蒴苣苔(Boeahygrometrica),是如下 Ca)或(b):
[0007](a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0008](b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
[0009]上述蛋白中，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0010]編碼上述蛋白的基因也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0011]上述基因是如下(1)-(4)中任--種的DNA分子:
[0012](I)編碼序列是序列表中序列I自5’末端第559-2508位核苷酸所不的DNA分子；
[0013](2)編碼序列是序列表中序列I自5’末端第559-2505位核苷酸所不的DNA分子；
[0014](3)在嚴(yán)格條件下與(I)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子；
[0015](4)與(I)或(2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。[0016]上述嚴(yán)格條件為在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65 ° C下雜交，然后用2 X SSC, 0.1%SDS 和 1 X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。
[0017]上述序列表中的序列I由2804個(gè)堿基組成，其開(kāi)放閱讀框架(ORF)為自5'末端第559-2508位堿基，編碼具有序列表中序列2的氨基酸序列的BhHSP70_l。
[0018]含有上述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0019]上述重組載體為將上述蛋白的編碼基因替換掉Binl9-35S-LEA_polyA中的LEA片段得到的載體pBinl9-BhHSP70-l ;具體為將上述蛋白的編碼基因插入取代Binl9-35S-LEA-polyA的BamHI和Xhol酶切識(shí)別位點(diǎn)間的小片段(LEA片段)得到的重組載體 pBinl9-BhHSP70-l。
[0020]可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有BhHSP70_l基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如PCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN 或其它衍生植物表達(dá)載體。
[0021]使用BhHSP70_l基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，可在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動(dòng)子、泛生素基因Ubiquitin啟動(dòng)子(pUbi)等，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
[0022]為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
[0023]擴(kuò)增上述基因全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0024]上述引物對(duì)在本發(fā)明的實(shí)施例具體為5’-TGGATCCATGGCAGGGAAAGGAG-3’所示的引物和 5’ -ACTCGAGTCAACCTCCTCGATCT-3’ 所示的引物。
[0025]上述蛋白、上述編碼基因或上述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在調(diào)節(jié)植物耐逆性中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；在上述應(yīng)用中，所述調(diào)節(jié)植物耐逆性具體為提高植物耐逆性；所述耐逆性具體為耐鹽性或耐旱性；
[0026]上述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物，上述雙子葉植物進(jìn)一步具體為擬南芥。
[0027]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0028]本發(fā)明提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為將上述蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参铮@得轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性高于所述目的植物。
[0029]上述方法中，所述耐逆性為耐鹽性或耐旱性；
[0030]上述蛋白的編碼基因通過(guò)上述的重組載體導(dǎo)入目的植物。[0031]上述方法中，所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物具體為擬南芥。
[0032]擴(kuò)增上述BhHSP70_l基因全長(zhǎng)或其任一片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0033]攜帶有本發(fā)明的與植物抗旱、抗鹽相關(guān)蛋白編碼基因BhHSP70_l的植物表達(dá)載體可通過(guò)Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞或組織中。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是水稻、小麥、大豆、煙草、玉米、油菜、高粱、棉花等農(nóng)作物，也可以是苜猜、三葉草、冰草等牧草以及草莓、西紅柿等果蔬花卉植物。
[0034]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明從復(fù)蘇植物旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)中篩選到一個(gè)受干旱誘導(dǎo)表達(dá)的BhHSP70-l基因，將該基因?qū)胍吧蛿M南芥，得到轉(zhuǎn)BhHSP70-l擬南芥，與野生型擬南芥相比，該轉(zhuǎn)BhHSP70-l擬南芥的抗旱、抗鹽性明顯提高，說(shuō)明BhHSP70-l是與植物抗旱、抗鹽性相關(guān)的蛋白。因此蛋白BhHSP70-l及其編碼基因?qū)τ谂嘤购怠⒖果}性提高的作物、林草等新品種具有重要的理論及實(shí)際意義，可用于農(nóng)牧業(yè)和生態(tài)環(huán)境治理所需的抗性植物品種的培育與鑒定。
[0035]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0036]圖1為BhHSP70_l基因在旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)干旱復(fù)蘇過(guò)程中的表達(dá)情況
[0037]圖2為T(mén)2代轉(zhuǎn)BhHSP70_l擬南芥的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果
[0038]圖3為T(mén)2代轉(zhuǎn)BhHSP70_l擬南芥的抗旱能力鑒定
[0039]圖4為T(mén)2代轉(zhuǎn)BhHSP70_l擬南芥的抗鹽能力鑒定
【具體實(shí)施方式】
[0040]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0041]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0042]下述實(shí)施例中載體Binl9記載在如下文獻(xiàn)中:D.A.Frisch, L.W.Harris-Hallerj N.T.Yokubaitisj Τ.L.Thomas, S.H.Hardin, T.C.Hal I, Completesequence of the binary vectorBinl9, Plant Mol.Biol.27 (1995) 405-409 ;公眾可從中國(guó)科學(xué)院植物研究所獲得。
[0043]實(shí)施例1、BhHSP70_l基因的克隆及表達(dá)
[0044]一、BhHSP70_l 基因的克隆
[0045]提取經(jīng)干旱脅迫處理8小時(shí)的旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)葉片總RNA,利用ZAP-cDNA*文庫(kù)構(gòu)建試劑盒(Stratagene, La Jolla, CA)構(gòu)建cDNA文庫(kù)。從中隨機(jī)挑選4800 個(gè)基因，用 BioGridrobot (BioRobotics Ltd, Cambridge, UK)自動(dòng)化點(diǎn)樣在 Hybond-N+尼龍膜(AmershamBiosciences, Freiburg, Germany)上，制成 cDNA 微陣列(cDNA 芯片)。將該cDNA芯片分別與未經(jīng)干旱處理正常生長(zhǎng)的旋蒴苣苔葉片和經(jīng)干旱脅迫處理8小時(shí)的旋蒴苣苔葉片的PolyA-RNA所制備的33P標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，分析它們?cè)谡l件及干旱誘導(dǎo)后基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有I個(gè)經(jīng)干旱誘導(dǎo)上調(diào)的基因，獲取該基因的方法具體如下:
[0046]提取經(jīng)干旱脅迫處理8小時(shí)的旋蒴苣苔(Boea hygrometrica ;記載在如下文獻(xiàn)中:Deng Xinj Hu Zhiangj Wang Hongxinj Wen Xiaogangj Kuang Tingyun.Effectsof dehydration and rehydration on photosynthesis of detached leaves of theresurrective plant Boea hygrometrica, Acta Botanica Sinica.2000，42(3):321-323 ;公眾可從中國(guó)科學(xué)院植物研究所獲得)葉片的總RNA并以其為模板，用基因特異性引物GSP-Racel:5’-AACACTAATCCCACCAA-3’進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系為:總 RNA (2μ g/μ 1)1.Ομ 1，GSP-Racel (I μ Μ) 2 μ 1，dNTP (2mM) 5 μ I, DEPC_H206.0 μ I, 5XM-MLV buffer4 μ I, RNase抑制劑(5ιι/μ1,購(gòu)自 Takara 公司)I μ I, M-MLV (購(gòu)自 Promega 公司)I μ I。37°C反應(yīng) Ih后再65°C lOmin，純化回收(三博PCR產(chǎn)物回收試劑盒)后加C尾。反應(yīng)體系為:cDNA5yl，DEPC-H2013.5 μ 1, 5 X buf f er5 μ I, dCTP (IOmm) 0.5 μ L.75°C 反應(yīng) 5min 后加入 I μ I TdT(購(gòu)自takara公司),再37。。反應(yīng)Ih,得到加C尾的cDNA序列。
[0047]以上述獲得的加C尾的cDNA序列為模板，PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為=CDNAly 1，IOXPCR bufferl μ l，dNTP(2mm)l μ 1，引物 GSP-Race2:5，-CGAAGATCTTCTTATCAGCAGCAG_3’(IOym) 0.5 μ I，多聚 G 錨定引物 5’ -GGCCACGCGTCGACTAGTACG-3’ (IOym) 0.5 μ I, Taq SI(購(gòu)自takara公司)0.1 μ I。反應(yīng)條件為:先95°C預(yù)變性4min，然后94°C變性30秒，55°C退火30秒，再72延伸2分鐘，共35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。得到PCR產(chǎn)物I。
[0048]將PCR產(chǎn)物I進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果得到2000bp左右的條帶；回收該2000bp左右的條帶，與載體pGEM-T (購(gòu)自promega公司)連接后進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物 5’ -TGGATCCATGGCAGGGAAAGGAG-3’ 和引物 5’ -ACTCGAGTCAACCTCCTCGATCT-3’。
[0049]以上述獲得的cDNA為模板，用引物5 ’ -TGGATCCATGGCAGGGAAAGGAG-3 ’和引物5’ -ACTCGAGTCAACCTCCTCGATCT-3’ 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，得到 PCR 產(chǎn)物 2。
[0050]上述PCR 反應(yīng)體系為:cDNAly I, IOXPCR bufferl μ 1，dNTP (2mm) I μ 1，引物各
0.5μ l，Taq 酶(購(gòu)自 takara 公司)0.1μ I。程序?yàn)?95°C 預(yù)變性 4min，94°C 變性 45 秒，52°C退火30秒，72°C延伸2分鐘，共27個(gè)循環(huán)；最后再72°C延伸10分鐘。
[0051]經(jīng)過(guò)測(cè)序，該P(yáng)CR產(chǎn)物2具有序列表中序列I自5’末端第559-2505位核苷酸，該序列所示的基因命名為BhHSP70-l，序列I包含完整的BhHSP70-l基因的開(kāi)放閱讀框(0RF)、5，-UTR(5，-非翻譯區(qū))和3，-UTR，其ORF為序列表中序列I自5'末端第559-2508位的核苷酸。該基因編碼的蛋白命名為BhHSP70-l，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。
[0052]二、BhHSP70_l基因在旋蒴苣苔干旱復(fù)蘇過(guò)程中的表達(dá)
[0053]對(duì)旋蒴苣苔進(jìn)行8種不同程度的干旱處理，分別為:新鮮植株(F)，新鮮植株土里慢速干旱5天(S5),新 鮮植株土里慢速干旱14天(S14),燒水復(fù)蘇3-4天(A), F和A從土里取出空氣中快速干旱2小時(shí)(F2、A2 )，F(xiàn)和A從土里取出空氣中快速干旱48小時(shí)(F48、A48)。分別提取8中處理旋蒴苣苔葉片的總RNA、反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。用基因特異性引物BhHSP70-1-f5，-TGAGAAGTGTCTGAGGGAGGC-3，，和 BhHSP70-l_r5，-TCTTTGCCATTGAAGAAGTCC-3，進(jìn)行Q-PCR擴(kuò)增。并以18SrRNA基因?yàn)閮?nèi)參，擴(kuò)增引物為18S_f5’ -CTTAGTTGGTGGAGCGATTTG-3’，和 5，-CCTGTTATTGCCTCAAACTTCC-3’。反應(yīng)體系為:cDNAl μ 1，10 μ 12X SYBR GreenMaster Mix，引物各0.5 μ 1，dd水8.5 μ I。程序?yàn)?95°C預(yù)變性30秒，95°C變性5秒，55°C退火30秒，72 °C延伸30分鐘，共50個(gè)循環(huán)。[0054]結(jié)果如圖1所示，可以看出該基因明顯受干旱誘導(dǎo)。
[0055]實(shí)施例2、BhHSP70-l在提高植物抗旱和抗鹽中的應(yīng)用
[0056]一、轉(zhuǎn)BhHSP70_l擬南芥的獲得
[0057]1、重組載體的獲得
[0058]將由實(shí)施例1得到的PCR產(chǎn)物2(也可以人工合成序列表中序列I自5’末端第559-2505位核苷酸)進(jìn)行回收，得到的回收產(chǎn)物連接到pEasy-blunt載體(北京全式金公司)上，獲得中間載體pBhHSP70-l。
[0059]具體構(gòu)建方法如下:
[0060]I)將中間載體pBhHSP70_l用BamHI和Xhol (購(gòu)自大連寶生物公司)雙酶切后，回收1961bp的片段(BhHSP70-l基因)；
[0061]2)將含CaMV35Sq啟動(dòng)子和pA 的載體Binl9-35S_LEA-polyA(Liu X.，Wang Z, WangL L，Wu R.H.Phill ips J.and Deng X0LEA4group genes from the resurrection plantBoea hygrometrica confer dehydration tolerance in transgenic tobacco, PlantSciencel76(2009)90 - 98 ;公眾可從中國(guó)科學(xué)院植物研究所獲得)用BamHI和Xhol酶切去掉LEA片段，回收約13kb的載體骨架，將載體骨架與I)得到的1961bp的片段連接，獲得重組載體pBinl9-BhHSP70-l (用BamHI和Xhol酶切驗(yàn)證，得到1961bp為陽(yáng)性)。
[0062]該重組載體pBinl9-BhHSP70-l 受 35S 啟動(dòng)子(Odell, JT; Nagy，F(xiàn); Chua, NH.1dentification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaicvirus35Spromoter.Nature.313 (2005): 810 - 812)控制。
[0063]2、重組農(nóng)桿菌的獲得
[0064]將上述重組載體pBinl9-BhHSP70_l 轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌 Gv3101 (Agrobacteriumtumefaciens strain GV3101 ； 文獻(xiàn):Binary Agrobacterium vectors for planttransformation, M Bevanin, Nucleic Acids Research (1984) 12 (22): 8711-8721 ;公眾可從中國(guó)科學(xué)院植物研究所獲得)細(xì)胞中，用含有50μ g/ml硫酸卡那霉素、50μ g/ml慶大霉素和50 μ g/ml利福平的YEB培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，得到重組菌Gv3101/pBinl9-BhHSP70_l (提取質(zhì)粒，用BamHI和Xhol酶切驗(yàn)證，得到1961bp為陽(yáng)性)。
[0065]3、轉(zhuǎn)BhHSP70_l擬南芥的獲得
[0066]將重組菌Gv3101/pBinl9-BhHSP70-l采用花器官浸泡法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥Col-O (ecotype Columbia, Arabidopsis thaliana ;中國(guó)科學(xué)院植物研究所，文獻(xiàn):Arabidopsis, a useful weed.Meyerowitz EM, Cell (1989) 56:263-270 ;公眾可從中國(guó)科學(xué)院植物研究所獲得)，得到Ttl代轉(zhuǎn)BhHSP70-l擬南芥。
[0067] 取Ttl代轉(zhuǎn)BhHSP70_l擬南芥種子全部均勻地播種于含有100 μ g/ml硫酸卡那霉素的MS培養(yǎng)基上，將具有抗性的成活幼苗移至溫室培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度22°C，光周期16/8小時(shí))，收集4株T1代轉(zhuǎn)BhHSP70-l擬南芥的種子。分別取以上4株100粒T1代轉(zhuǎn)BhHSP70_l擬南芥種子播種于含100 μ g/ml硫酸卡那霉素的MS培養(yǎng)基中，將分離比為3:1的T1代轉(zhuǎn)BhHSP70-l擬南芥的成活幼苗(5-10棵)移至溫室培養(yǎng)，收集T2代轉(zhuǎn)BhHSP70_l擬南芥的種子。分別取100粒T2代轉(zhuǎn)BhHSP70-l擬南芥種子播種于含100 μ g/ml硫酸卡那霉素的MS培養(yǎng)基中，將不發(fā)生分離轉(zhuǎn)基因的成活苗(10棵左右)移至溫室培養(yǎng)，收集T3代轉(zhuǎn)BhHSP70-l擬南芥的純合體種子。結(jié)果共獲得4個(gè)T3代轉(zhuǎn)BhHSP70-l擬南芥株系:1-3、2-1、3-3、4-1。[0068]提取10天苗齡的上述4個(gè)株系的T3代轉(zhuǎn)BhHSP70_l擬南芥的總RNA并以其為模板，以 HSP70-1-f5，-TGGATCCATGGCAGGGAAAGGAG-3，和 HSP70-l_r5，-ACTCGAGTCAACCTCCTCGATCT-3’為引物進(jìn)行RT-PCR，同時(shí)以未轉(zhuǎn)基因的野生型擬南芥作為對(duì)照。Actin的引物為actin F:5’-gtatggtgaaggctggatttgc-3’ ；actin R5’_tgaggtaatcagtaaggtcacgtcc_3’ ；
[0069]PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95°C預(yù)變性4min，94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸2分鐘，共30個(gè)循環(huán)；最后再72°C延伸10分鐘；同時(shí)以actin基因做為內(nèi)參，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95°C預(yù)變性4min，94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸30秒，共30個(gè)循環(huán)；最后再72°C延伸10分鐘。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，每組樣品進(jìn)行2次重復(fù)。
[0070]結(jié)果如圖2所示，可以看出，未轉(zhuǎn)基因的野生型擬南芥(WT)中沒(méi)有擴(kuò)增出條帶，T3代轉(zhuǎn)BhHSP70-l擬南芥株系:1-3、2-1、3-3、4-1中，皆有250bp的片段，說(shuō)明T3代轉(zhuǎn)BhHSP70-l擬南芥株系:1-3、2-1、3-3、4-1為陽(yáng)性T3代轉(zhuǎn)BhHSP70_l擬南芥純合體。
[0071]采用同樣的方法將空載體pBinl9轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中，得到轉(zhuǎn)空載體擬南芥(鑒定方法同上，結(jié)果與野生型擬南芥無(wú)顯著差異)。
[0072]2、轉(zhuǎn)BhHSP70_l擬南芥的抗旱、抗鹽性 [0073]將T3代轉(zhuǎn)BhHSP70_l擬南芥株系:1-3、2-1、3-3、4_1、轉(zhuǎn)空載體擬南芥和未轉(zhuǎn)基因的野生型擬南芥播于MS培養(yǎng)基上，4°C春化3天后，培養(yǎng)在22°C、50%濕度、光照16h和黑暗8h的條件下，4天后將小苗進(jìn)行分別轉(zhuǎn)移至含40% (質(zhì)量百分含量)PEG的MS培養(yǎng)基和含有IOOmM (質(zhì)量百分含量)NaCl的MS培養(yǎng)基上，15天后照相并統(tǒng)計(jì)根長(zhǎng)。每個(gè)株系8株，實(shí)驗(yàn)共設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果取平均值。
[0074]含40% (質(zhì)量百分含量)PEG的MS培養(yǎng)基處理的各株系結(jié)果如圖3所示，其中圖3A為表型觀察，可以看出，與野生型擬南芥(WT)相比，T3代轉(zhuǎn)BhHSP70-l擬南芥株系的根長(zhǎng)明顯大于野生型。統(tǒng)計(jì)根長(zhǎng)結(jié)果如圖3B所示，T3代轉(zhuǎn)BhHSP70-l擬南芥株系:1_3、2-1、4_1的根長(zhǎng)分別為 0.74cm、0.85cm、1.71 ；
[0075]野生型擬南芥(WT)的根長(zhǎng)為0.37cm ；
[0076]轉(zhuǎn)空載體擬南芥和未轉(zhuǎn)基因野生型擬南芥結(jié)果無(wú)顯著差異。
[0077]含有IOOmM (質(zhì)量百分含量)NaCl的MS培養(yǎng)基處理的各株系結(jié)果如圖4所示，其中圖4A為表型觀察，可以看出，與野生型擬南芥(WT)相比，T3代轉(zhuǎn)BhHSP70-l擬南芥株系的根長(zhǎng)明顯大于野生型。統(tǒng)計(jì)根長(zhǎng)結(jié)果如圖4B所示，T3代轉(zhuǎn)BhHSP70-l擬南芥株系:1_3、2-1、3-3、4-1 的根長(zhǎng)分別為 4.43cm、3.78cm、4.00cm、4.27cm ；
[0078]野生型擬南芥(WT)的根長(zhǎng)為2.82cm ；
[0079]轉(zhuǎn)空載體擬南芥和未轉(zhuǎn)基因野生型擬南芥結(jié)果無(wú)顯著差異。
[0080]上述結(jié)果表明，轉(zhuǎn)BhHSP70_l擬南芥在含PEG和NaCl的培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)均明顯優(yōu)于野生型，具體表現(xiàn)在根長(zhǎng)均明顯大于野生型，最高達(dá)到3倍。
[0081]綜上所述，BhHSP70_l基因過(guò)表達(dá)植株的抗旱、抗鹽性明顯優(yōu)于未轉(zhuǎn)基因的植株，說(shuō)明BhHSP70-l是與植物抗旱、抗鹽相關(guān)的蛋白。
【權(quán)利要求】
1.一種蛋白，是如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因是如下(1)-(4)中任一一種的DNA分子: (1)編碼序列是序列表中序列I自5’末端第559-2508位核苷酸所不的DNA分子； (2)編碼序列是序列表中序列I自5’末端第559-2505位核苷酸所不的DNA分子； (3)在嚴(yán)格條件下與(I)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子; (4)與(I)或(2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。
4.含有 權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.如權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于: 所述重組載體為將權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因替換掉表達(dá)載體Binl9-35S-LEA-polyA中的LEA片段得到的載體。
6.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)。
7.權(quán)利要求1所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述編碼基因或權(quán)利要求4所述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在調(diào)節(jié)植物耐逆性中的應(yīng)用； 所述耐逆性具體為耐鹽性或耐旱性； 所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物進(jìn)一步具體為擬南芥。
8.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為將權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参铮@得轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性高于所述目的植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:所述耐逆性為耐鹽性或耐旱性； 權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因通過(guò)權(quán)利要求4或5所述的重組載體導(dǎo)入目的植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于: 所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物具體為擬南芥。
【文檔編號(hào)】C12N1/15GK103897047SQ201210581636
【公開(kāi)日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月27日
【發(fā)明者】鄧馨, 張振南 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院植物研究所