專利名稱：一種人星狀病毒核苷酸的檢測引物和探針及檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物檢測技術領域，特別涉及一種人星狀病毒核苷酸的檢測引物和探針及檢測方法。
背景技術：
人星狀病毒(Human astrovirus, HAstV)是無包膜的單股正鏈RNA病毒，屬于星狀病毒科哺乳動物屬。HAstV是導致幼小動物產生腹瀉的一種重要病原，世界各地均已有星狀病毒感染的報道，既可散發(fā)也可以引起暴發(fā)流行，亦可引起醫(yī)源性感染。與輪狀病毒相似，星狀病毒感染多發(fā)生在2歲以內尤其是I歲以內的嬰幼兒。目前認為人星狀病毒是嬰幼兒病毒性胃腸炎的第二位病因，僅次于輪狀病毒。此外，老年人和免疫缺陷患者也是星狀病毒感染的高危人群，人類免疫缺陷患者、接受骨髓移植及聯(lián)合免疫缺陷患者發(fā)生星狀病毒感 染均已有報道。人星狀病毒亦是健康成年人發(fā)生胃腸炎的病因之一。因此，疾病預防控制機構以及醫(yī)院急需特異性強，敏感性高，操作方便，可用于胃腸炎等暴發(fā)疫情和臨床病例的早期快速診斷的方法。1975年Madeley首次在電鏡下觀察到星狀病毒，由于病毒顆粒表面有5 6個星狀突起，故而得名。人星狀病毒顆粒直徑為28 41nm，當病毒存在于高pH值環(huán)境下，其表現(xiàn)為典型的星狀形態(tài)。它的基因組從5’端到3’端包括一個約85個核苷酸的5’非編碼區(qū)、3個開放讀碼框架(ORFla、ORFlb, 0RF2)、1個約80個核苷酸的3’非編碼區(qū)和I個大約30個核苷酸的多聚腺苷酸尾。ORFla和ORFlb編碼非結構蛋白，ORFla編碼絲氨酸蛋白酶，且其下游存在I個核定位信號；0RFlb編碼RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNApolymerase, RDRP), RDRP是通過核糖體讀框移位機制合成的I個融合蛋白。HAstV衣殼蛋白由0RF2編碼合成。在病毒復制的過程中，所感染的細胞內可檢測出2種病毒特異性的RNA，I個是6. 8KB的全長基因組RNA，另一個是2. 8Kb的亞基因組RNA，2種RNA的3’端均具有多聚腺苷酸尾。亞基因組RNA包含了全部的0RF2序列，可作為mRNA表達衣殼蛋白。0RF2編碼產物至少包括2個區(qū)域第I個區(qū)域(I 415個氨基酸)在各血清型之間是高度保守的;第2個區(qū)域(416個氨基酸 結束)是高度變異的，病毒的中和抗原決定簇即在此區(qū)域內。人星狀病毒在細胞培養(yǎng)中增殖困難，且多數(shù)星狀病毒在細胞培養(yǎng)物中不產生細胞病變，這為病毒分離帶來了難度。目前人星狀病毒的常規(guī)檢測方法主要是應用電鏡直接檢測糞中的病毒顆粒，或用免疫診斷方法檢測糞中的病毒抗原和血清中的特異性抗體。電鏡檢查病毒靈敏度較低，容易出現(xiàn)漏檢；免疫學方法特異性有待提高，而且都費時費力。傳統(tǒng)的RT-PCR也被用于人星狀病毒，但檢測時間需要6小時。

發(fā)明內容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術的缺點與不足，提供一種人星狀病毒核苷酸的檢測引物。
本發(fā)明的另一目的在于提供與上述檢測弓丨物配合使用的探針。本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測人星狀病毒核苷酸的方法，該方法通過使用上述檢測引物和探針進行實時熒光RT-PCR檢測，能夠快速簡單地判斷樣品是否有人星狀病毒，為人腹瀉和胃腸炎的病原學診斷提供科學依據(jù)。本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)一種人星狀病毒核苷酸的檢測引物，所述的檢測引物由正向引物和反向引物組成，其核苷酸序列如下正向引物5，-GCCAGACTCACAGAAGAGCAAC-3，；反向引物5’ -GGACTTGCTAGCCATCACACTTC-3，。與上述檢測引物配合使用的探針的核苷酸序列如下探針5’ -CCTCCCCTCCAAATGCGATGGAG-3’，該探針一端標記有報告熒光染料，另一端標記有淬滅熒光染料；優(yōu)選的，該探針的5’端標記有報告熒光染料,3’端標記有淬滅熒光染料。所述的報告熒光染料優(yōu)選為Fam、Hex、Tet、Joe、Vic、FITC、Cy3或Cy5。所述的淬滅突光染料優(yōu)選為Tamra、Rox> Dabcyl、BHQl或BHQ2。根據(jù)TaqMan技術，在常規(guī)PCR的基礎上添加了一條標記有兩個熒光染料基團的核苷酸探針，例如將報告熒光染料標記的探針的5’端，淬滅熒光染料標記在探針的3’端，兩者構成能量轉移結構，即報告熒光染料所發(fā)射的熒光可被淬滅熒光染料吸收，當二者距離變遠時，抑制作用減弱，報告熒光染料信號增強。在擴增反應過程中，探針同模板上的目的擴增片段雜交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在擴增延伸階段將探針切斷，淬滅熒光染料的抑制作用消失，報告熒光染料信號增強，在擴增延伸階段將探針切斷，淬滅熒光染料的抑制作用消失，報告熒光染料信號增強，從而實現(xiàn)對人星狀病毒的檢測。一種檢測人星狀病毒核苷酸的方法，包括如下步驟以待檢樣品RNA為模板，利用上述的正向引物、反向引物以及探針進行實時熒光RT-PCR擴增，每個循環(huán)結束采集數(shù)據(jù)，反應結束后根據(jù)擴增曲線判定結果。所述的檢測人星狀病毒核苷酸的方法的實時熒光RT-PCR反應體系包括如下組分2· 5 μ LlOXOne Step RNA PCR Buffer,2y L dNTP (各 2. 5mM)，上述正向引物和反向引物(10 μ M)各1. 5 μ L，O. 5 μ L 上述探針(10 μ Μ)，O. 5 μ L Taq 酶，O. 5 μ L RNase Inhibitor(40U/y L)，0. 5μ L AMV RTase XL (5U/y L),5y L RNA, 10. 5 μ L RNase Free dH20。當然，可以根據(jù)本發(fā)明給出的引物對或者其擴增產物序列設計其它類型的探針，以適用不同方法的熒光PCR檢測。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下的優(yōu)點及效果(I)本發(fā)明根據(jù)人星狀病毒基因組序列設計的引物特異性好，用于實時熒光RT-PCR檢測的靈敏度高。(2)本發(fā)明檢測方法準確性高，靈敏度高，其能夠快速簡單地判斷樣品是否有人星狀病毒，為人腹瀉、胃腸炎的病原學診斷及鑒別診斷提供了科學依據(jù)。


圖1是人星狀病毒核酸Real-time RT-PCR檢測方法的特異性試驗結果圖。
圖2是人星狀病毒核酸Real-time RT-PCR檢測方法的靈敏性試驗結果圖。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例1引物和探針的設計從NCBI數(shù)據(jù)庫下載所有的已知人星狀病毒全基因組序列，并進行比較分析，選擇無二級結構且高度保守的區(qū)段，設計引物和探針，其序列如下正向引物5，-GCCAGACTCACAGAAGAGCAAC-3，；反向引物5，-GGACTTGCTAGCCATCACACTTC-3’。探針的序列為5’ -CCTCCCCTCCAAATGCGATGGAG-3’ ；該探針的5’端用報告熒光染料VIC標記，3’端用淬滅熒光染料BHQ2標記。 實施例2人星狀病毒核酸熒光RT-PCR條件的優(yōu)化利用滅活的人星狀病毒作為待檢樣品，用商業(yè)RNA提取試劑盒提取病毒基因組RNA,分別分裝后儲存于_20°C備用。(I)引物濃度的優(yōu)化在反應體系中其它條件相同的情況下，將實施例1中的引物濃度分別從O.1 μ mol/L至1. 6 μ mol/L作倍比連續(xù)稀釋，通過試驗結果的分析比較，確定最佳引物終濃度為0.4μπιΟ1/1。(2)鎂離子濃度的優(yōu)化在反應體系中其它條件相同的情況下，將MgCl2的濃度從lmmol/L至10mmol/L以lmmol/L遞增,確定鎂離子最佳鎂離子濃度為5mmol/L。(3)反轉錄酶(AMV RnaseXL)用量的優(yōu)化使用不同濃度反轉錄酶的試驗結果比較，選定5U作為反轉錄酶的用量。(4) Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的優(yōu)化通過比較Taq酶用量的優(yōu)化實驗結果，選定5U作為Taq酶的用量。(5 ) dNTPs濃度的優(yōu)化通過使用不同濃度的dNTPs進行檢測，綜合評估后選lmmol/L作為dNTPs的使用量。(6)探針濃度的優(yōu)化在反應體系中其它條件相同的情況下，將實施例1中的探針濃度分別從0.1 μ mol/L至0. 5 μ mol/L作倍比連續(xù)稀釋后進行檢測，通過試驗結果的分析比較，確定最佳探針終濃度為0. 2 μ mol/L。利用實施例1的引物和探針進行反應體系的建立，最后確定采用的人星狀病毒實時熒光RT-PCR反應體系為25 μ I體系，所需各組分及相應濃度見表I。表I人星狀病毒實時熒光RT-PCR反應中的各組分情況
權利要求
1.一種人星狀病毒核苷酸的檢測引物，其特征在于所述的檢測引物由正向引物和反向引物組成，其核苷酸序列如下 正向引物5’ -GCCAGACTCACAGAAGAGCAAC-3’ ； 反向引物5’ -GGACTTGCTAGCCATCACACTTC-3，。
2.與權利要求1所述的檢測引物配合使用的探針，其特征在于所述探針的核苷酸序列如下5’ -CCTCCCCTCCAAATGCGATGGAG-3’ ；該探針的5’端標記有報告熒光染料，3’端標記有淬滅熒光染料。
3.根據(jù)權利要求2所述的探針，其特征在于所述探針的5’端標記有報告熒光染料，3’端標記有淬滅熒光染料。
4.根據(jù)權利要求2所述的探針，其特征在于 所述的報告熒光染料優(yōu)選為Fam、Hex、Tet、Joe、Vic、FITC、Cy3或Cy5 ； 所述的淬滅熒光染料優(yōu)選為Tamra、Rox, Dabcyl、BHQl或BHQ2。
5.一種檢測人星狀病毒核苷酸的方法，其特征在于包括如下步驟以待檢樣品RNA為模板，利用上述的正向引物、反向引物以及探針進行實時熒光RT-PCR擴增，每個循環(huán)結束采集數(shù)據(jù)，反應結束后根據(jù)擴增曲線判定結果。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于所述的實時熒光RT-PCR反應體系包括如下組分2· 5 μ LlOXOne Step RNA PCR Buffer, 2 μ L dNTP(各 2· 5mM)，上述正向引物和反向引物(10 μ M)各1. 5 μ L，O. 5 μ L 上述探針(10 μ Μ)，O. 5 μ LTaq 酶，O. 5 μ LRNase Inhibitor(40U/y L)，0. 5μ L AMV RTase XL (5U/y L),5y L RNA, 10. 5 μ L RNase Free dH20。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人星狀病毒核苷酸的檢測引物和探針及檢測方法，屬于生物檢測技術領域。一種人星狀病毒核苷酸的檢測引物，由正向引物和反向引物組成，其核苷酸序列如SEQ NO.1和2所示。與上述檢測引物配合使用的探針的核苷酸序列如SEQ NO.3所示；該探針一端標記有報告熒光染料，另一端標記有淬滅熒光染料。檢測人星狀病毒核苷酸的方法，包括如下步驟以待檢樣品RNA為模板，利用上述的正向引物、反向引物以及探針進行實時熒光RT-PCR擴增，每個循環(huán)結束采集數(shù)據(jù)，反應結束后根據(jù)擴增曲線判定結果。本發(fā)明根據(jù)人星狀病毒基因組序列設計的引物特異性好，用于實時熒光RT-PCR檢測的靈敏度高。
文檔編號C12N15/11GK103014180SQ201210584378
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月28日 優(yōu)先權日2012年12月28日
發(fā)明者肖性龍, 余以剛, 吳暉, 李曉鳳, 唐語謙, 袁琨 申請人:華南理工大學