專利名稱：確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的方法、試劑盒以及引物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學領域。具體而言，本發(fā)明涉及確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的方法、試劑盒以及引物。
背景技術：
ApoE是一種載脂蛋白，其遺傳多態(tài)性主要受控于兩個SNP位點rs429358和rs7412，這兩個SNP位點通過不同的核酸組合決定了 ApoE的三種等位基因型:ε 2(rs429358 為 T, rs7412 為 T)、ε 3 (rs429358 為 Τ, rs7412 為 C)、ε 4 (rs429358 為 C,rs7412為C)，這三種類型等位基因分別編碼三種ApoE蛋白亞型，即ApoE2 (其蛋白序列的112位和158位均為半胱氨酸)、ApoE3 (其蛋白序列的112位為半胱氨酸，158位為精氨酸)、ApoE4 (其蛋白序列的112位和158位均為精氨酸)。因此，ApoE基因有ε 2/ ε 2、ε 3/ε3、和ε 4/ε 4三種純合子型與ε 2/ε 3、ε 2/ε 4和ε 3/ε 4三種雜合子型。目前ApoE基因分型的方法主要有:傳統(tǒng)DNA測序法、等位基因特異性寡核苷酸探針雜交法、聚合酶鏈反應-單鏈構象多態(tài)性法、聚合酶鏈反應-限制性酶切片段長度多態(tài)性法、多重擴增受阻突變體系PCR技術法、高分辨率溶解曲線法以及雙色熒光分子探針法等。然而，目前確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的方法，仍有待改進。

發(fā)明內容
本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術中存在的技術問題之一。為此，本發(fā)明提出了可以有效確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的方法。在本發(fā)明的一 個方面，本發(fā)明提出了一種確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的方法。根據(jù)本發(fā)明 的實施例，該方法包括:利用第一引物和第二引物對所述核酸樣本進行PCR擴增，并且在所述PCR擴增體系中加入核酸探針，所述核酸探針對應兩個預定位點之間至少一部分的核酸序列；以及檢測反應體系的發(fā)光，以便確定所述核酸樣本的預定位點是否存在已知突變，其中，所述第一引物的近3’端包含與所述兩個預定位點之一已知突變對應的堿基，所述第二引物的近3’端包含與所述兩個預定位點另一個已知突變對應的堿基，所述第一引物和第二引物之一作為正向引物，所述第一引物和所述第二引物的另一個作為反向引物，所述核酸探針具有:發(fā)光基團，所述發(fā)光基團形成于所述核酸探針的5’端，調節(jié)基團，所述調節(jié)基團形成于所述核酸探針的3’端，并且所述調節(jié)基團可以調節(jié)所述發(fā)光基團的發(fā)光。根據(jù)本發(fā)明實施例的方法，能夠通過檢測PCR擴增體系所產(chǎn)生的熒光，有效地確定所檢測的核酸樣本的兩個預定位點同時存在相應的已知突變，并進一步可以有效地確定ApoE的等位基因分型，對于老年癡呆癥及心腦血管等與ApoE基因型相關疾病的預防、早期診斷以及疾病預后具有非常重要的意義。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，上述確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的方法還可以具有下列附加技術特征:根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述核酸樣本來源于人體組織或細胞、重組核酸或轉基因生物組織細胞，優(yōu)選地采用人類全基因組DNA。根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以對上述來源的核酸樣本進行有效地確定突變類型，從而可以對提供核酸樣本的個體進行有效地分析。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述預定位點是SNP rs429358和rs7412。由此，利用根據(jù)本發(fā)明實施例，可以有效地確定核酸樣本中在兩個預定位點SNP rs429358和rs7412是否具有已知突變，從而可以有效地確定ApoE等位基因分型。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述第一引物的近3’端包含與rs429358的已知突變對應的堿基，所述第二引物的近3’端包含與rs7412的已知突變對應的堿基。由此，利用根據(jù)本發(fā)明實施例的確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的方法對核酸樣本進行檢測，在PCR反應時引物可以與模板按照堿基配對原則選擇性結合，從而可以特異地擴增出ApoE的不同等位基因，并進一步可以有效地確定ApoE等位基因的類型。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述第一引物的3’端堿基為與rs429358的已知突變對應的堿基，所述第二引物的3’端堿基為與rs7412的已知突變對應的堿基。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述第一引物作為正向引物，所述第二引物作為反向引物。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述第一引物為選自下列的至少之一:5’ -CGGACATGGAGGACGTGT-3’，5’ -GCGGACATGGAGGACGTGT-3’，5’ - CGCGGACA TGGAGGA CGTGT - 3’，5’ -CGGACATGGAGGACGTGC-3> , - GCGGA CA TGGAGGA CGTGC - 3’，5’ -CGCGGACATGGAGGACGTGC-3’。所述第二引物為選自下列的至少之一:5’ -TGGTACACTGCCAGGCA-3’，5’ -CTGGTACACTGCCAGGCA-3’，5’ -CCTGGTACACTGCCAGGCA-3’，5，-TGGTACACTGCCAGGCG-3，，5，-CTGGTACACTGCCAGGCG-3，，5，-CCTGGTACACTGCCAGGCG-3，。由此，利用根據(jù)本發(fā)明實施例的確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的方法對核酸樣本進行檢測，在PCR反應過 程中，引物可以與模板按照堿基配對原則選擇性結合，從而可以特異地擴增出ApoE的不同等位基因，并進一步可以有效地確定ApoE等位基因的類型。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述核酸探針的長度為20個核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述核酸探針的序列為5’-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-3’。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述核酸探針的發(fā)光基團為熒光基團。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述熒光基團為FAM。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述調節(jié)基團為淬滅基團。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述淬滅基團為BHQ1。由此，利用根據(jù)本發(fā)明實施例的確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的方法對核酸樣本進行檢測，通過檢測各基因型對應的擴增體系中有無熒光信號，即可判斷待測樣品中是否含有該亞型的ApoE基因。在本發(fā)明的又一個方面，本發(fā)明提出了一種確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述試劑盒可以應用于前面所述的確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的方法。由此，利用根據(jù)本發(fā)明實施例的確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的試劑盒對核酸樣本進行檢測，可以有效地確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變，并進一步可以有效地確定ApoE的等位基因分型，對于老年癡呆癥和心腦血管疾病的預防以及早期診斷具有非常重要的意義。另外，前面針對確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的方法所描述的特征和優(yōu)點，也當然地適用該試劑盒，不再贅述。在本發(fā)明的又一個方面，本發(fā)明提出了一組確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的PCR引物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述PCR引物可以應用于前面所述的確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的方法以及試劑盒。由此，PCR擴增過程中引物可以與模板按照堿基配對原則選擇性結合，PCR擴增可以按照預定方向進行有效擴增，并且能夠特異地擴增出不同等位基因。另外，前面針對確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的方法及試劑盒所用引物的描述的特征和優(yōu)點，也當然地適用該PCR引物，不再贅述。根據(jù)本發(fā)明的實施例的確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的方法可以實現(xiàn)下列優(yōu)點至少之一:1、根據(jù)本發(fā)明的實施例的確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的方法，該方法操作簡便，僅需PCR擴增和熒光檢測兩個步驟；2、根據(jù)本發(fā)明的實施例的確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的方法，該方法容易實現(xiàn)自動化操作，可以大大減小手工操作過程中的人為誤差，使得到的結果更加準確；3、根據(jù)本發(fā)明的實施例的確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的方法，該方法快速省時，完成整個檢測的時間不到1.5小時，耗時少于現(xiàn)有的方法；4、根據(jù)本發(fā)明的實施例的確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的方法，該方法的成本較低，僅需一個熒光探針和常規(guī)PCR體系即可；5、根據(jù)本發(fā)明的實施例的確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的方法，該方法的檢測結果直觀，根據(jù)熒光信號的有無即可定性判斷待測樣本中是否具有該擴增體系引物對所對應的ApoE 等位基因型，無需繁瑣的分析過程。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。


本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:圖1是根據(jù)本發(fā)明一個實施例的確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的方法的不同引物對ApoE不同等位基因特異性擴增原理示意圖，在該圖中，I表示含SNPrs42358和rs7412的ApoE基因DNA片段示意圖；圖2是根據(jù)本發(fā)明一個實施例的確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的方法的ApoE基因PCR擴增體系示意圖，在該圖中，I表示ApoE基因DNA模板反義鏈，2表示正向擴增引物，3表示偶聯(lián)有熒光基團(F)和淬滅基團(Q)的DNA分子探針，4表示ApoE基因DNA模板正義鏈，5表示反向擴增引物，6表示DNA聚合酶；圖3是根據(jù)本發(fā)明一個實施例的確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的方法的熒光探針工作原理示意圖，在該圖中，I表示ApoE基因DNA模板反義鏈，2表示正向擴增引物，3表示熒光基團(F)脫離的DNA分子探針，4表示ApoE基因DNA模板正義鏈，5表示反向擴增引物，6表示DNA聚合酶；
圖4是根據(jù)本發(fā)明一個實施例的確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的方法的實例樣品檢測熒光信號讀值結果圖；圖5是根據(jù)本發(fā)明一個實施例的確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的方法的實例樣品檢測熒光信號讀值的柱型分析圖。
具體實施例方式下面詳細描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。在本發(fā)明的描述中，需要理解的是，術語“厚度”、“上”、“下”等指示的方位或位置關系為基于附圖所示的方位或位置關系，僅是為了便于描述本發(fā)明和簡化描述，而不是指示或暗示所指的裝置或元件必須具有特定的方位、以特定的方位構造和操作，因此不能理解為對本發(fā)明的限制。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提出了一種確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的方法可以包括以下步驟:SlOO:利用第一引物和第二引物對核酸樣本進行PCR擴增，并且在PCR擴增體系中加入核酸探針在該步驟中，針對核酸樣本的兩個預定位點之一的核酸序列設計一條PCR引物:第一引物，針對核酸樣本的兩個預定位點另一個預定位點的核酸序列設計一條PCR引物:第二引物，并且加入核酸探針，然后對核酸樣本進行PCR擴增。由此，獲得PCR擴增樣本，以便進一步對其進行熒光檢測。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在PC R擴增時，如果第一引物的近3’端包含與核酸樣本的兩個預定位點之一的已知突變對應的堿基，第二引物的近3’端包含與核酸樣本的另一個預定位點的已知突變對應的堿基，以及第一引物和第二引物之一作為正向引物，第一引物和所述第二弓丨物的另一個作為反向引物，則在PCR擴增時弓丨物可以與模板按照堿基配對原則選擇性結合，PCR擴增可以按照預定方向進行有效擴增，并且能夠特異地擴增出不同等位基因。根據(jù)本發(fā)明的實施例，第一引物的3’端堿基為與rs429358的已知突變對應的堿基，第二引物的3’端堿基為與rs7412的已知突變對應的堿基。根據(jù)本發(fā)明的實施例，第一引物作為正向引物，第二引物作為反向引物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，第一引物為選自下列的至少之一:5’ -CGGACATGGAGGACGTGT-3’，5’ -GCGGACATGGAGGACGTGT-3’，5’ -CGCGGACATGGAGGACGTGT-3’，5’ - CGGA CA TGGAGGA CGTGC - 3’，5’ -GCGGACATGGAGGACGTGC-3’，5’ -CGCGGACATGGAGGACGTGC-3’。所述第二引物為選自下列的至少之一:5，-TGGTACACTGCCAGGCA-3，，5，-CTGGTACACTGCCAGGCA-3，，5， -CCTGGTACACTGCCAGGCA-3，，5， -TGGTACACTGCCAGGCG-3，，5， -CTGGTACACTGCCAGGCG-3，，5’-CCTGGTACACTGCCAGGCG-3’。由此，PCR擴增時引物可以與模板按照堿基配對原則選擇性結合，PCR擴增可以按照預定5’到3’方向進行有效擴增，并且能夠特異地擴增出不同等位基因。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，針對SNP rs429358為T或C的核酸序列分別設計一條PCR正向引物(以下稱為pll2T或pll2C)，針對SNP rs7412為T或C的核酸序列分別設計一條PCR反向引物(以下稱為pl58T或pl58C)。根據(jù)ApoE基因型的區(qū)別可得知，ApoE不同基因型SNP rs429358和rs7412之間的核酸序列可由如下引物對在PCR反應中特異擴增:引物pll2T和pl58T能夠特異擴增ε 2型基因，引物ρ112Τ和pl58C能夠特異地擴增ε 3型基因，以及引物P112C和pl58C能夠特異地擴增ε 4型基因。由此，PCR能夠特異地擴增出不同等位基因，從而可以有效地確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變，進一步可以有效地確定核酸樣本中ApoE等位基因的類型。在該步驟中，針對核酸樣本的兩個預定位點之間的核酸序列設計一段具有特異性的核酸熒光探針，核酸探針對應兩個預定位點之間至少一部分對應的核酸序列。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，如果核酸探針具有:發(fā)光基團，發(fā)光基團形成于所述核酸探針的5’端，調節(jié)基團，調節(jié)基團形成于所述核酸探針的3’端，并且所述調節(jié)基團可以調節(jié)所述發(fā)光基團的發(fā)光，則當含有核酸探針對應核酸序列被PCR擴增時，探針能夠特異結合到擴增模板上，此時核酸聚合酶的外切酶活性能夠切下探針5’端基團，使發(fā)光基團和調節(jié)基團分離，從而發(fā)出可檢測的信號。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，核酸探針的發(fā)光基團為熒光基團，優(yōu)選熒光基團為FAM。根據(jù)本發(fā)明的實施例，核酸探針的調節(jié)基團為熒光基團，優(yōu)選調節(jié)基團為BHQ1。根據(jù)本發(fā)明的實施例，核酸探針的長度不受特別限制，例如，核酸探針的長度可以為20個核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，針對SNP rs429358和rs7412之間的核酸序列設計一段具有特異性的核酸熒光探針。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，核酸探針的序列為5’FAM-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-BHQ13’。由此，當檢測核酸樣本的ApoE基因型時，僅需在PCR擴增體系中加入按上述方法設計的核酸熒光探針，利用E2/E3/E4基因型各自對應的不同引物分別PCR擴增待測DNA模板。PCR反應結束后，檢測各基因型對應的擴增體系中有無熒光信號，即可判斷待測核酸樣本中是否含有該亞型的ApoE基因。根據(jù)本發(fā)明的實施例，核酸樣本的類型及來源并不受特別限制，例如，可以是人基因組DNA的至少一部分，可以來源于任何人體組織或細胞、重組核酸或轉基因生物組織細胞。由此，利用根據(jù)本發(fā)明 實施例的方法，可以有效地確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變，進一步可以有效地確定ApoE的等位基因分型，對于老年癡呆癥和心腦血管疾病的預防以及早期診斷具有非常重要的意義。在本發(fā)明中所使用的術語“核酸樣本”的含義是指在任何涉及人基因組DNA的至少一部分，檢測的核酸樣本可以來源于任何人體組織或細胞、重組核酸或轉基因生物組織細胞。在本發(fā)明中，除非特別說明，“第一與、第二”僅是為了便于描述本發(fā)明，不能理解為對本發(fā)明的限制。在本發(fā)明中，除非特別說明，“近3’端”指的是，距離3’末端的堿基為預定范圍以內的堿基，例如距離10個，9個，8個，7個，6個，5個，4個，3個，2個，I個或者O個(即3’末端)。S200:檢測反應體系的發(fā)光，以便確定核酸樣本的預定位點是否存在已知突變在該步驟中，對步驟SlOO中所得到的PCR擴增樣本進行熒光檢測，在熒光檢測時，根據(jù)PCR擴增體系中有無熒光信號即可定性判斷待測核酸樣本中是否具有該PCR擴增體系引物對所對應的ApoE等位基因分型。由此，可以確定核酸樣本的預定位點是否存在已知突變，并進一步可以有效地確定ApoE等位基因的類型。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，對人體基因組DNA的PCR擴增樣本進行熒光檢測，如果僅在ε 2擴增體系中檢測到熒光信號，則該樣品來源的待測人ApoE基因型為ε2/ε2;同理如果僅在ε3(或ε 4)擴增體系中檢測到熒光信號，則該樣品來源的待測人ApoE基因型為ε 3/ ε 3 (或ε 4/ ε 4);如果同時在ε 2和ε 3擴增體系中檢測到熒光信號，則該樣品來源的待測人ApoE基因型為ε 2/ε 3;同理如果同時在ε2和ε 4擴增體系中檢測到熒光信號，則該樣品來源的待測人ApoE基因型為ε2/ε4;同理如果同時在ε2和ε 4 (或ε3和ε 4)擴增體系中檢測到熒光信號，則該樣本來源的待測人ApoE基因型為ε 2/ ε 4 (或ε 3/ε 4)。由此，可以有效地確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變，進一步可以有效地確定ApoE的等位基因分型，對于老年癡呆癥和心腦血管疾病的預防、早期診斷以及疾病預后具有非常重要的意義。根據(jù)本發(fā)明的實施例，PCR擴增及熒光檢測的手段并不受特別限制，可以借助任何已知的方法與設備來進行PCR擴增及熒光檢測。例如根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，利用美國Applied Biosystems 公司的 7500Fast Real-Time PCR system,可以將 PCR熱循環(huán)、突光檢測及各種應用分析軟件結合在一起，可以動態(tài)觀察PCR每一循環(huán)各反應管中PCR擴增產(chǎn)物逐漸增加的情況，PCR實驗結束后可以馬上得到結果，無需凝膠電泳分析，無需純化PCR產(chǎn)物，具有時間省、靈敏度高、準確性好等優(yōu)點，再例如，相關技術人員可以根據(jù)具體實際需要的不同，對引物以及PCR溫度等進行相應的調整，在此不再贅述，這些均在本發(fā)明的權利保護范圍之內。在本發(fā)明的又一個方面，本發(fā)明提出了一種確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，該試劑盒可以應用于前面所述的確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的方法。由此，利用根據(jù)本發(fā)明實施例的確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的試劑盒對核酸樣本進行檢測，可以有效地確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變，并進一步可以有效地確定ApoE的等位基因分型。另外，前面針對確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的方法所描述的特征和優(yōu)點，也當然地適用該試劑盒，不再贅述在本發(fā)明的又一個方面，本發(fā)明提出了一組確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的PCR引物。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，該引物可以應用于前面所述的確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的方法以及試劑盒。由此，PCR擴增過程中引物可以與模板按照堿基配對原則選擇性結合，PCR擴增可以按照預定方向進行有效擴增，并且能夠特異地擴增出不同等位基因。另外，前面針對確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的方法及試劑盒所用引物的描述的特征和優(yōu)點，也當然地適用該PCR引物，不再贅述。本法明的確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的方法、試劑盒及引物可以應用在老年癡呆癥以及心腦血管等疾病的預防以及早期診斷方面，相關技術人員當然也可以將其擴大至其它其應用領域，在此不予贅述，這些均在本發(fā)明的權利保護范圍之內。下面通過具體的實施例， 對本發(fā)明進行說明，需要說明的是這些實施例僅僅是為了說明目的，而不能以任何方式解釋成對本發(fā)明的限制。另外，在下列實施例中如果沒有特別說明，則所采用的設備和材料均為市售可得的。一般方法:
I材料與試劑:I) DNA 引物 pll2T:5，-GCGGACATGGAGGACGTGT-3，，Tm=59.5 °C，GC 含量=63.2%，5.6nM/0D/管，加無菌去離子水55.6 μ I配制成100 μ M反應液，于4 °C儲藏；5’ -CGGACATGGAGGACGTGT-3’，Tm=57.2°C，GC 含量=61.1%，5.9nM/0D/ 管，加無菌去離子水58.9 μ I配制成100 μ M反應液，于4°C儲藏。引物均合成于上海博尚生物技術有限公司，純化方式為:PAGE純化。2) DNA 引物 pll2C:5，-CGGACATGGAGGACGTGC-3，，Tm=59.5。。，GC 含量=66.7%,5.91^/00/管，加無菌去離子水59111配制成100 μ M反應液，于4°C儲藏。引物均合成于上海博尚生物技術有限公司，純化方式為:PAGE純化。3) DNA 引物 pl58T:5，-CCTGGTACACTGCCAGGCA-3，，Tm=59.5。。，GC 含量=63.2%,
5.7nM/0D/管，加無菌去離子水57.2 μ I配制成100 μ M反應液，于4°C儲藏。引物均合成于上海博尚生物技術有限公司，純化方式為:PAGE純化。4)DNA 引物 pl58C:5，-CTGGTACACTGCCAGGCG-3，，Tm=59.5°C ,GC 含量=66.7%, 6nM/OD/管，加無菌去離子水60 μ I配制成100 μ M反應液，于4°C儲藏。引物均合成于上海博尚生物技術有限公司，純化方式為:PAGE純化。5)熒光 DNA 分子探針:5’ FAM-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-BHQ13’，Tm=65°C，GC 含量=70%，5.1nM/OD/管，加無菌去離子水51 μ I配制成100 μ M反應液，于4°C避光儲藏。熒光DNA分子探針合成于英濰捷基(上海)貿易有限公司，純化方式為:HPLC純化。6)PCR預混液:購于美國 Applied Biosystems 公司的 TaqMan Genotyping MasterMix (包括DNA聚合酶，dNTPs，R0X參比熒光)，ROX參比熒光在PCR反應中不會加入擴增，它作為熒光內參能夠矯正在PCR反應中由于濃度和體積改變引起的熒光信號變化。

7)無菌去離子水:去離子水取自英國ELGA純水儀(型號purelab3000)，并經(jīng)高壓蒸汽滅菌后所得。8) 1.5ml離心管:購于美國Axygen公司。9) PCR 板:MicroAmp 0ptical96-ffell Reaction Plate 購于美國 AppliedBiosystems 公司。10) PCR 封板膜:Mi_croAmp 96-Well Optical Adhesive Film 購于美國 AppliedBiosystems 公司。11) 一次性醫(yī)用無菌注射器:一次性醫(yī)用無菌注射器(5ml規(guī)格)購于河南新鄉(xiāng)市宇安醫(yī)用衛(wèi)材有限公司。12)人血液基因組DNA提取相關試劑:a、紅細胞裂解液:稱取3.735g氯化銨、三羥甲基氨基甲烷(Tris)L 3g加水溶解并稀釋至500ml, 0.22m濾膜(購于美國Millipore公司)過濾除菌,于4°C保存；b> Nuclei Lysis Solution (購于美國 Promega 公司)；c、Precipitation Solution (購于美國 Promega 公司)。13) ε 2/ ε 2DNA已知樣本:從ε 2/ ε 2基因組DNA中PCR擴增并測序驗證的DNA樣品。14) ε 3/ ε 3DNA已知樣本:從ε 3/ ε 3基因組DNA中PCR擴增并測序驗證的DNA樣品。
15) ε 4/ ε 4DNA已知樣本:從ε 4/ ε 4基因組DNA中PCR擴增并測序驗證的DNA樣品。16) ε 2/ ε 3DNA已知樣本:從ε 2/ ε 3基因組DNA中PCR擴增并測序驗證的DNA樣品。17) ε 2/ ε 4DNA已知樣本:從ε 2/ ε 4基因組DNA中PCR擴增并測序驗證的DNA樣品。16) ε 3/ ε 4DNA已知樣本:從ε 3/ ε 4基因組DNA中PCR擴增并測序驗證的DNA樣品。2儀器與設備:I)移液器:微量移液器(10 μ L, 20 μ L, 100 μ L, 1000 μ L)購于德國 Eppendorf 公司。2)離心機:小型高速離心機(型號:5424),購于德國Eppendorf公司。3)離心機:Universal32R型控溫高速離心機,購于德國Hettich zentrifugen公司。4)渦旋混合器: 購于江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司。5)全波長掃描式多功能讀數(shù)儀:Thermo Scientific Varioskan Flash全波長掃描式多功能讀數(shù)儀，購于Thermo Scientific公司。6) Real-Time PCR 儀器:7500Fast Real-Time PCR system,購于美國 AppliedBiosystems 公司。7)分析軟件:7500software V2.0.6,購于美國 Applied Biosystems 公司。在下列實施例中(詳細見下面的實施例1-3)，確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的方法的步驟如下:I引物設計:ApoE基因的DNA序列由美國國家生物科技信息中心(NCBI)網(wǎng)站提供，根據(jù)包含ApoE基因多態(tài)性位點SNP rs429358和SNP rs7412的DNA序列信息，對引物進行如下設計:I)針對SNP rs429358位點核酸形式為T的正向PCR擴增引物(ρ112Τ)，其DNA序列為:5’ -GCGGACATGGAGGACGTGT-3’ 和 5’ -CGGACATGGAGGACGTGT-3’ ；2)針對SNP rs429358位點核酸形式為C的正向PCR擴增引物(pll2C)，其DNA序列為:5’ -CGGACATGGAGGACGTGC-3’ ；3)針對SNP rs7412位點核酸形式為T的反向PCR擴增引物(ρ158Τ)，其DNA序列為:5’ -CCTGGTACACTGCCAGGCA-3，；4)針對SNP rs7412位點核酸形式為C的反向PCR擴增引物(pl58C)，其DNA序列為:5’ -CTGGTACACTGCCAGGCG-3，。2熒光DNA分子探針設計:根據(jù)美國國家生物科技信息中心(NCBI)網(wǎng)站提供的ApoE基因DNA序列信息，該基因 SNP rs429358 位點與 SNP rs7412 位點之間的 DNA 序列為:tgcggccgcctggtgcagtaccgcggcgaggtgcaggccatgctcggccagagcaccgaggagctgcgggtgcgcctcgcctcccacctgcgcaagctgcgtaagcggctcctccgcgatgccgatgacctgcagaagcgc，選取該序列中的一段作為探針的互補核酸序列部分，該序列為5’ -CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-3’。選用熒光探針，選取FAM熒光基團以及BHQl淬滅基團，F(xiàn)AM熒光基團偶聯(lián)在互補核酸序列的5’端，BHQl淬滅基團偶聯(lián)在互補核酸序列的 3’ 端，熒光探針為:5’ FAM-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-BHQ13’。以下部分以人血液基因組DNA樣本為檢測樣品進行闡述:3操作流程I)樣本采集:使用一次性醫(yī)用無菌注射器(5ml)抽取人靜脈血Iml于含有1.5mg EDTA鈉抗凝血劑的管中，放置4 °C冰箱儲藏待用。2)人血液基因組DNA提取:a、從4°C冰箱取出采集的人血液并輕輕混勻，然后用移液器取300ul血液轉移到含有900ul紅細胞裂解液的1.5ml離心管中，上下顛倒5_6次。b、室溫放置10分鐘(期間顛倒2-3次)，室溫條件下13000_16000g離心20秒。C、吸去上清，剩下約10_20ul于管底。d、潤旋振蕩重懸白細胞,加入Nuclei Lysis Solution,吹吸5-6次,可選步驟加入
1.5ul的RNA酶混勻，37°C條件下放置15分鐘。e、加入 IOOul Precipitation Solution,潤旋振蕩 10-20 秒。f、室溫條件下1 3000_16000g離心10分鐘。g、轉移上清到新的1.5ml離心管，加入300ul異丙醇，上下輕輕顛倒直到有白色絮狀DNA出現(xiàn)。h、室溫條件下13000-16000g離心I分鐘。1、吸去上清，加入70%乙醇，輕輕的上下顛倒幾次洗滌DNA，室溫條件下13000-16000g 離心 I 分鐘。j、輕輕吸去乙醇，將1.5ml離心管倒置在干凈的吸水紙上10-15分鐘。k、加入IOOul無菌去離子水溶解DNA，65°C水浴I小時，也可以4°C過夜。1、利用全波長掃描式多功能讀數(shù)儀中的DNA濃度測量程序測量所提DNA的濃度，取一部分DNA溶液用無菌去離子水稀釋至2ng/ml，作為后續(xù)PCR檢測模板，剩余DNA溶液存放于2 8°C或_20°C。3) PCR反應體系配制:根據(jù)ApoE基因的三個多態(tài)性，與三種檢測試劑(ε 2試劑、ε 3試劑和ε 4試齊[J)，分別用于人群中存在6種不同ApoE基因型ε2/ε2，ε 3/ ε 3, ε 4/ ε 4, ε 2/ ε 3, ε 2/ ε 4和ε 3/ ε 4的檢測。6種已知ApoE基因型DNA已知樣本(ε 2/ ε 2DNA已知樣本、ε 3/ ε 3DNA已知樣本、ε 4/ε 4DNA已知樣本、ε 2/ε 3DNA已知樣本、ε 2/ε 4DNA已知樣本和ε 3/ε 4DNA已知樣本)作為對照其中ε 2試劑包括:a、對應ApoE ε 2等位基因型SNP位點rs429358SNP核酸形式的正向引物ρ112Τ (該實例中核酸序列為 5’ -GCGGACATGGAGGACGTGT-3’ )。b、對應ApoE ε 2等位基因型SNP位點rs7412反向引物核酸形式的反向引物P158T(該實例中核酸序列為 5’ -CCTGGTACACTGCCAGGCA-3’)。C、熒光探針(該實例中探針形式為 5’ FAM-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-BHQ13’)。d、PCR 預混液 TaqMan Genotyping Master Mix。
其各成分具體劑量為:TaqMan Genotyping Master Mix 4.925 μ Iε 2 正向引物 ρ112Τ (ΙΟΟμΜ) 0.0125 μ Iε 2 正向引物 ρ158Τ (ΙΟΟμΜ) 0.0125 μ I熒光探針(100μ Μ)0.05 μ I其中ε 3試劑包括:a、對應ApoE ε 3等位基因型SNP位點rs429358SNP核酸形式的正向引物ρ112Τ (該實例中核酸序列為 5’ -CGGACATGGAGGACGTGT-3’ )。b J^SApoE ε 3等位基因型SNP位點rs7412反向引物核酸形式的反向引物pl58C(該實例中核酸序列為5’ -CTGGTACACTGCCAGGCG-3’)。C、熒光探針(該實例中探針形式為 5’ FAM-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-BHQ13’)。d、PCR 預混液 TaqMan Genotyping Master Mix。其各成分具體劑量為:TaqMan Genotyping Master Mix 4.925 μ Iε 3 正向引物 ρ112Τ (ΙΟΟμΜ) 0.0125 μ I
ε 3 正向引物 pl58C (ΙΟΟμΜ) 0.0125 μ I熒光探針(100μ Μ)0.05 μ I其中ε 4試劑包括:a、對應ApoE ε 4等位基因型SNP位點rs429358SNP核酸形式的正向引物pi 12C (該實例中核酸序列為 5’ -CGGACATGGAGGACGTGC-3’ )。b J^SApoE ε 4等位基因型SNP位點rs7412反向引物核酸形式的反向引物pl58C(該實例中核酸序列為5’ -CTGGTACACTGCCAGGCG-3’)。C、熒光探針(該實例中探針形式為 5’ FAM-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-BHQ13’)。d、PCR 預混液 TaqMan Genotyping Master Mix。其各成分具體劑量為:TaqMan Genotyping Master Mix 4.925 μ Iε 4 正向引物 pll2C (ΙΟΟμΜ) 0.0125 μ Iε 4 正向引物 pl58C (ΙΟΟμΜ) 0.0125 μ I熒光探針(100μ Μ)0.05 μ I使用ApoE基因分型檢測試劑需要10 μ I反應體系就可以充分檢測到信號。ε 2基因檢測的PCR反應體系為:ε2 試劑:5μ1待測DNA 樣品(2ng/ μ I): 5 μ Iε 2陽性對照檢測體系1:ε2 試劑:5μ1ε 2/ ε 2DNA 已知樣本(2pg/ul): 5 μ Iε 2陽性對照檢測體系2:ε2 試劑:5μ1ε 2/ ε 3DNA 已知樣本(2pg/ul): 5 μ I
ε 2陽性對照檢測體系3:ε2 試劑:5μ1ε 2/ ε 4DNA 已知樣本(2pg/ul): 5 μ Iε 2陰性對照檢測體系1:ε2 試劑:5μ1ε 3/ ε 3DNA 已知樣本(2pg/ul): 5 μ Iε 2陰性對照檢測體系2:ε2 試劑:5μ1ε 4/ ε 4DNA 已知樣本(2pg/ul): 5 μ Iε 2陰性對照檢測體系3:ε2 試劑:5μ1ε 3/ ε 4DNA 已知樣本(2pg/ul): 5 μ Iε 3基因檢測的PCR反應體系為:ε3 試劑:5 μ1待測DNA 樣品(2ng/ μ I): 5 μ Iε 3陽性對照檢測體系1:ε3 試劑:5μ1ε 3/ ε 3DNA 已知樣本(2pg/ul): 5 μ Iε 3陽性對照檢測體系2:ε3 試劑:5μ1ε 2/ ε 3DNA 已知樣本(2pg/ul): 5 μ Iε 3陽性對照檢測體系3:ε3 試劑:5μ1ε 3/ ε 4DNA 已知樣本(2pg/ul): 5 μ Iε 3陰性對照檢測體系1:ε3 試劑:5μ1ε 2/ ε 2DNA 已知樣本(2pg/ul): 5 μ Iε 3陰性對照檢測體系2:ε3 試劑:5μ1ε 4/ ε 4DNA 已知樣本(2pg/ul): 5 μ Iε 3陰性對照檢測體系3:ε3 試劑:5μ1ε 2/ ε 4DNA 已知樣本(2pg/ul): 5 μ Iε 4基因檢測的PCR反應體系為:ε 4 試劑:5 μ I待測DNA 樣品(2ng/ μ I): 5 μ Iε 4陽性對照檢測體系1:ε4 試劑:5μ1ε 4/ ε 4DNA 已知樣本(2pg/ul): 5 μ I
ε 4陽性對照檢測體系2:ε4 試劑:5μ1ε 2/ ε 4DNA 已知樣本(2pg/ul): 5 μ Iε 4陽性對照檢測體系3:ε4 試劑:5μ1ε 3/ ε 4DNA 已知樣本(2pg/ul): 5 μ Iε 4陰性對照檢測體系1:ε 4 試劑:5 μ Iε 2/ ε 2DNA 已知樣本(2pg/ul): 5 μ Iε 4陰性對照檢測體系2:ε4 試劑:5μ1ε 3/ ε 3DNA 已知樣本(2pg/ul): 5 μ Iε 4陰性對照檢測體系3:ε 4 試劑:5 μ I ε 2/ ε 3DNA 已知樣本(2pg/ul): 5 μ I4) PCR擴增反應:將待測樣品即人血液提取的基因組DNA (2ng/y I)與已知ApoE基因型的DNA已知樣品分別加入ε 2，ε3和ε4基因檢測的10μ1 PCR反應體系中。用滅菌的去離子水作為整個PCR體系的陰性對照。在PCR板中配制好所有PCR反應體系后，用PCR封板膜封閉好PCR板，殘留在PCR板孔壁上液體用Universal32R型控溫高速離心機離心到管底并排除氣泡。然后，將該 PCR 板放入 7500Fast Real-Time PCR system 儀器中，打開 7500softwareV2.0.6軟件,選擇軟件中的Genotyping模塊,在Plate setup中設置對應放入PCR板上每孔的檢測內容。然后在Run method中設置PCR反應程序及反應體系，這些項目設置完畢后，便可運行程序，該程序默認PCR反應之前先在60°C條件下預讀取本底熒光強度值再進行PCR擴增以消除背景熒光值。待PCR反應完成之后，儀器可自動在60°C條件下收集熒光數(shù)據(jù)。表I為該實例PCR反應過程的標準熱循環(huán)程序。表IPCR反應程序
權利要求
1.一種確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的方法，其特征在于，包括: 利用第一引物和第二引物對所述核酸樣本進行PCR擴增，并且在所述PCR擴增體系中加入核酸探針，所述核酸探針對應兩個預定位點之間至少一部分的核酸序列；以及檢測反應體系的發(fā)光，以便確定所述核酸樣本的預定位點是否存在已知突變， 其中， 所述第一引物的近3’端包含與所述兩個預定位點之一已知突變對應的堿基， 所述第二引物的近3’端包含與所述兩個預定位點另一個已知突變對應的堿基， 所述第一引物和第二引物之一作為正向引物，所述第一引物和所述第二引物的另一個作為反向引物， 所述核酸探針具有: 發(fā)光基團，所述發(fā)光基團形成于所述核酸探針的5’端， 調節(jié)基團，所述調節(jié)基 團形成于所述核酸探針的3’端，并且所述調節(jié)基團可以調節(jié)所述發(fā)光基團的發(fā)光， 任選地，所述核酸樣本來源于人體組織或細胞、重組核酸或轉基因生物組織細胞， 任選地，所述預定位點是SNP rs429358和rs7412， 任選地，所述述第一引物的近3’端包含與rs429358的已知突變對應的堿基，所述第二引物的近3’端包含與rs7412的已知突變對應的堿基， 任選地，所述第一引物的3’端堿基為與rs429358的已知突變對應的堿基，所述第二引物的3’端堿基為與rs7412的已知突變對應的堿基， 任選地，所述第一引物作為正向引物，所述第二引物作為反向引物， 任選地，所述第一引物為選自下列的至少之一:5， -CGGACATGGAGGACGTGT-3，5， -GCGGACATGGAGGACGTGT-3，5， -CGCGGACATGGAGGACGTGT-3，5， -CGGACATGGAGGACGTGC-3，5， -GCGGACATGGAGGACGTGC-3，5， -CGCGGACATGGAGGACGTGC-3，， 所述第二引物為選自下列的至少之一:5， -TGGTACACTGCCAGGCA-3’5， -CTGGTACACTGCCAGGCA-3’5’ -CCTGGTACACTGCCAGGCA-3’5， -TGGTACACTGCCAGGCG-3’5， -CTGGTACACTGCCAGGCG-3’5’ -CCTGGTACACTGCCAGGCG-3’， 任選地，所述核酸探針 的長度為20個核苷酸。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸探針的序列為:5， -CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-3，。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸探針的發(fā)光基團為熒光基團， 任選地，所述熒光基團為FAM，任選地，所述調節(jié)基團為淬滅基團， 任選地，所述淬滅基團為BHQl。
4.一種確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的試劑盒，其特征在于，包括: 第一引物，所述第一引物的近3’端包含與所述兩個預定位點之一已知突變對應的堿基， 第二引物，所述第二引物的近3’端包含與所述兩個預定位點另一個已知突變對應的堿基， 核酸探針，所述核酸探針與兩個預定位點之間至少一部分對應的核酸序列，并且所述核酸探針具有: 發(fā)光基團，所述發(fā)光基團形成于所述核酸探針的5’端， 調節(jié)基團，所述調節(jié)基團形成于所述核酸探針的3’端，并且所述調節(jié)基團可以調節(jié)所述發(fā)光基團的發(fā)光， 任選地，所述預定位點是SNP rs429358和rs7412， 任選地，所述述第一引物的近3’端包含與rs429358的已知突變對應的堿基，所述第二引物的近3’端包含與rs7412的已知突變對應的堿基， 任選地，所述第一引物的3’端堿基為與rs429358的已知突變對應的堿基，所述第二引物的3’端堿基為與rs7412的已知突變對應的堿基， 任選地，所述第一引物作為正向引物，所述第二引物作為反向引物， 任選地，所述第一引物為選自下列的至少之一:5， -CGGACATGGAGGACGTGT-3，5， -GCGGACATGGAGGACGTGT-3，5， -CGCGGACATGGAGGACGTGT-3，5， -CGGACATGGAGGACGTGC-3，5， -GCGGACATGGAGGACGTGC-3，5， -CGCGGACATGGAGGACGTGC-3，， 所述第二引物為選自下列的至少之一:5， -TGGTACACTGCCAGGCA-3’5， -CTGGTACACTGCCAGGCA-3’5’ -CCTGGTACACTGCCAGGCA-3’5， -TGGTACACTGCCAGGCG-3’5， -CTGGTACACTGCCAGGCG-3’5’ -CCTGGTACACTGCCAGGCG-3’， 任選地，所述核酸探針的長度為20個核苷酸。
5.根據(jù)權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述核酸探針的序列為:5， -CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-3，。
6.根據(jù)權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述核酸探針的發(fā)光基團為熒光基團， 任選地，所述熒光基團為FAM， 任選地，所述調節(jié)基團為淬滅基團，任選地，所述淬滅基團為BHQl。
7.一組確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的PCR引物，其特征在于，包括: 第一引物，所述第一引物的近3’端包含與所述兩個預定位點之一已知突變對應的堿基， 第二引物，所述第二引物的近3’端包含與所述兩個預定位點另一個已知突變對應的堿基， 核酸探針，所述核酸探針與兩個預定位點之間至少一部分對應的核酸序列，并且所述核酸探針具有: 發(fā)光基團，所述發(fā)光基團形成于所述核酸探針的5’端， 調節(jié)基團，所述調節(jié)基團形成于所述核酸探針的3’端，并且所述調節(jié)基團可以調節(jié)所述發(fā)光基團的發(fā)光， 任選地，所述預定位點是SNP rs429358和rs7412， 任選地，所述述第一 引物的近3’端包含與rs429358的已知突變對應的堿基，所述第二引物的近3’端包含 與rs7412的已知突變對應的堿基， 任選地，所述第一引物的3’端堿基為與rs429358的已知突變對應的堿基，所述第二引物的3’端堿基為與rs7412的已知突變對應的堿基， 任選地，所述第一引物作為正向引物，所述第二引物作為反向引物， 任選地，所述第一引物為選自下列的至少之一:.5， -CGGACATGGAGGACGTGT-3，.5， -GCGGACATGGAGGACGTGT-3，.5， -CGCGGACATGGAGGACGTGT-3，.5， -CGGACATGGAGGACGTGC-3，.5， -GCGGACATGGAGGACGTGC-3，.5， -CGCGGACATGGAGGACGTGC-3，， 所述第二引物為選自下列的至少之一:.5， -TGGTACACTGCCAGGCA-3’.5， -CTGGTACACTGCCAGGCA-3’.5’ -CCTGGTACACTGCCAGGCA-3’.5， -TGGTACACTGCCAGGCG-3’.5， -CTGGTACACTGCCAGGCG-3’5’ -CCTGGTACACTGCCAGGCG-3’。
全文摘要
本發(fā)明公開了確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變的方法、試劑盒以及引物。其中，該方法包括利用第一引物和第二引物對核酸樣本進行PCR擴增，并且在PCR擴增體系中加入核酸探針，核酸探針對應兩個預定位點之間至少一部分對應的核酸序列；檢測反應體系的發(fā)光，以便確定核酸樣本的預定位點是否存在已知突變，第一引物的近3’端包含與兩個預定位點之一已知突變對應的堿基，第二引物的近3’端包含與另一個已知突變對應的堿基，核酸探針具有發(fā)光基團，發(fā)光基團形成于核酸探針的5’端，調節(jié)基團，調節(jié)基團形成于核酸探針的3’端，并且調節(jié)基團可以調節(jié)發(fā)光基團的發(fā)光。利用該方法能夠有效地確定核酸樣本的兩個預定位點是否具有已知突變。
文檔編號C12Q1/68GK103103259SQ20121059241
公開日2013年5月15日 申請日期2012年12月31日 優(yōu)先權日2012年12月31日
發(fā)明者許華曦, 卜國軍, 張含, 張云武, 劉家珍 申請人:廈門人瑞生物醫(yī)藥科技有限公司