專利名稱：一種漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)，進(jìn)一步還涉及該漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
酵母菌作為低等的單細(xì)胞真核微生物，既具有原核生物生長快、遺傳操作簡單的特點，又具有真核生物的翻譯后加工和修飾功能，是生產(chǎn)真核生物活性蛋白較為理想的表達(dá)系統(tǒng)。釀酒酵母作為第一個表達(dá)外源基因的真核系統(tǒng)，應(yīng)用至今已有三十多年了，大量的蛋白都得到了成功表達(dá)。但這一表達(dá)系統(tǒng)在工業(yè)化生產(chǎn)中存在著諸多不足，如菌株不穩(wěn)定、外源基因表達(dá)水平不高、產(chǎn)量和分泌效率低、蛋白過度糖基化等。甲醇營養(yǎng)型酵母(簡稱甲醇酵母)是最近二十年逐漸發(fā)展起來 的一類表達(dá)真核生物基因的較為理想的系統(tǒng)。這類酵母能在以甲醇為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基上生長。這類酵母主要包括假絲酵母(Candida)、球擬酵母(Torulopsis)、漢遜酵母(Hanseaula)和畢赤酵母(Pichia)。漢遜酵母是這類酵母中的佼佼者，是目前國際上公認(rèn)的最為理想的高效表達(dá)外源基因的真核表達(dá)系統(tǒng)，與其他酵母相比具有獨特的優(yōu)勢I)可以利用甲醇氧化酶基因(MOX)啟動子和甲醛脫氫酶基因(FMD)啟動子實現(xiàn)外源基因的高效表達(dá)；2)重組質(zhì)粒多以非同源重組的方式高拷貝整合于染色體上，較易獲得高拷貝高表達(dá)的重組菌株；3)表達(dá)的外源蛋白貯存在過氧化物酶體里，可使其免受菌體內(nèi)的蛋白酶降解；4)外源蛋白基因遺傳穩(wěn)定性好，不易丟失；5)外源蛋白即可在胞內(nèi)表達(dá)又可進(jìn)行分泌表達(dá)；6)能在廉價的合成或半合成培養(yǎng)基上進(jìn)行高密度發(fā)酵，易放大，生產(chǎn)成本低，產(chǎn)物易分離純化。漢遜酵母是一種優(yōu)于大腸桿菌和其他酵母菌的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，近年來已有大量難以高效表達(dá)的外源蛋白在漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)中都得已成功表達(dá)。有效的漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)包括兩個元件能夠啟動外源基因高效表達(dá)的載體系統(tǒng)和具有特殊篩選標(biāo)記的宿主菌。漢遜酵母菌作為理想的外源基因表達(dá)宿主菌，需要不同種類的篩選標(biāo)記，篩選標(biāo)記主要包括如下兩類一類為營養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記，如URA3、LEU2、HIS4等標(biāo)志基因，標(biāo)志基因發(fā)生缺失的宿主菌只能在完全培養(yǎng)基中生長，而不能在選擇培養(yǎng)基中生長，只有帶有篩選標(biāo)記的重組表達(dá)載體整合到宿主菌后，才能使宿主菌在選擇培養(yǎng)基中生長；另外一類為顯性選擇標(biāo)記，如抗G418、抗Zeocin的基因等。目前獲得的營養(yǎng)缺陷型酵母菌的方法大部分都是通過化學(xué)誘變、雜交或原生質(zhì)體融合等的傳統(tǒng)方法獲得的相應(yīng)選擇標(biāo)記，這些方法存在許多明顯的缺點，例如大部分為單點突變，易回復(fù)突變、存在多重突變效應(yīng)、突變位點不明確、遺傳穩(wěn)定性差、難以獲得較為理想的菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)；本發(fā)明的另一目的在于提供該漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。本發(fā)明首先提供了一株多型漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha) AU-0501,其為尿嘧啶缺陷型漢遜酵母菌，乳清酸苷-5-磷酸脫羧酶基因被阻斷，其保藏編號為CGMCCNo.7013。本發(fā)明使用的ATCC26012尿嘧啶缺陷性宿主細(xì)胞為多型漢遜酵母AU-0501，其保藏編號為CGMCC No. 7013，已于2012年12月18日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，簡稱CGMCC，郵編100101)保藏,分類命名為多型漢遜酵母(Hansenula polymorpha)。本發(fā)明提供了多型漢遜酵母菌AU-0501在生產(chǎn)外源蛋白中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了含有多型漢遜酵母菌AU-0501的漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明提供了一種構(gòu)建尿嘧啶缺陷型漢遜酵母菌的方法，包括以下步驟(I)以漢遜酵母野生型宿主菌基因組DNA為模板，分別以引物Pl和P2進(jìn)行PCR擴增獲得Ura3的5’端基因片段，以引物P5和P6進(jìn)行PCR擴增獲得Ura3的3’端基因片段；以Pichia pastoris表達(dá)載體pPIC9K為·模板，以P3和P4為引物進(jìn)行PCR擴增獲得G418基因片段；所述引物ΡΓΡ6的核苷酸序列如SEQ ID NO. 13 18所示；(2)將上述三個基因片段進(jìn)行純化，以純化好的Ura3的5’端基因片段、G418基因片段、Ura3的3’端基因片段為模板，以引物Pl和P6進(jìn)行PCR擴增獲得U5’ -G418-U3’基因片段，將純化獲得U5’ -G418-U3’基因片段通過電穿孔轉(zhuǎn)化到漢遜酵母野生型宿主細(xì)胞中，U5’ -G418-U3’基因片段通過同源重組方式整合于漢遜酵母野生型宿主細(xì)胞中；(3)將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂YPD+G418固體培養(yǎng)基于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)至長出菌落；挑選菌落依次轉(zhuǎn)接到Y(jié)NB選擇性固體培養(yǎng)基、YNB+尿嘧啶固體培養(yǎng)基、YPD+G418固體培養(yǎng)基上置37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，挑選在YNB+尿嘧啶固體培養(yǎng)基、YPD+G418固體培養(yǎng)基上均生長而在YNB選擇性固體培養(yǎng)基上不生長的菌落即為漢遜酵母尿嘧啶缺陷型宿主細(xì)胞。進(jìn)一步地，步驟(2)中，Ura3基因的阻斷通過同源重組的方式，在乳清酸苷-5-磷酸脫羧酶基因的第396-546位處插入G418抗性基因，從而獲得乳清酸苷_5_磷酸脫羧酶基因共計150個核苷酸缺失的營養(yǎng)缺陷型漢遜酵母菌。在本發(fā)明的一個實施例中，所用的漢遜酵母野生型宿主菌為漢遜酵母ATCC26012。本發(fā)明提供了一種應(yīng)用于漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)啟動外源基因表達(dá)的載體，其為PMV-05，其含有啟動子Μ0Χ-Ρ、終止子MOX-T、復(fù)制子HARS、ura3基因、ColEl復(fù)制子、Amp抗
性基因。表達(dá)載體PMV-05，通過如下方法制備獲得(I)以漢遜酵母基因組DNA為模板，分別以引物MOXP-F、MOXP-R ;M0XT_F、MOXT-R ；HARS-F、HARS-R (見 SEQ ID NO. 8) ;Ura3_F、Ura3_R 進(jìn)行 PCR 擴增，獲得基因 MOXP、MOXT、HARS、Ura3 ;上述引物的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 3 10所示；(2)以 PBR-SK 質(zhì)粒為模板，以引物 Amp+ColEl-F、Amp+ColEl-R 進(jìn)行 PCR 擴增，獲得基因Amp+ColEl，上述引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 1Γ12所示；(3)將以上5個基因片段純化，取純化好的Μ0ΧΡ、MOXT基因片段作為模板，以引物MOXP-F和MOXT-R進(jìn)行PCR擴增獲得Μ0ΧΡ+Μ0ΧΤ基因片段；分別取純化好的HARS、Ura3、Amp+ColEl基因片段各I μ I作為模板，以引物HARS-R和Amp+ColEl-R進(jìn)行PCR擴增獲得HARS+Ura3+Amp+ColEl 基因片段；將基因片段 M0XP+M0XT、HARS+Ura3+Amp+ColEl 進(jìn)行純化，將純化好的基因片段M0XP+M0XT、HARS+Ura3+Amp+ColEl用Sac1、SalI分別進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分離后，切膠回收酶切基因片段，連接，將連接后的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化克隆篩選得到重組表達(dá)載體PMV-05。表達(dá)載體PMV-05能夠在表達(dá)外源蛋白中發(fā)揮作用。表達(dá)載體PMV-05能夠在合適的宿主細(xì)胞中成功表達(dá)HPV LI蛋白(16、18、31、33、52、58)及EV71 (Pl和3CD基因共表達(dá))、乙肝(HBsAg)、戊肝(0RF2)。本發(fā)明提供了一種漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)，包括啟動外源基因表達(dá)的載體和具有特定篩選標(biāo)記的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為尿嘧啶缺陷型漢遜酵母菌，其乳清酸苷-5-磷酸脫羧酶基因被阻斷；所述啟動外源基因表達(dá)的載體為PMV-05，其含有啟動子Μ0Χ-Ρ、終止子MOX-T、復(fù)制子HARS、ura3基因、ColEl復(fù)制子、Amp抗性基因。進(jìn)一步地，所述尿嘧啶缺陷型漢遜酵母菌為多型漢遜酵母AU-0501，其保藏編號為CGMCC No. 7013。進(jìn)一步地，所述的特定篩選標(biāo)記為尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型和G418抗性基因2個篩選標(biāo)記。本發(fā)明提供了上述漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)在生產(chǎn)類病毒顆粒疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的尿嘧啶缺陷型漢遜酵母菌AU-0501具有突變位點明確、回復(fù)突變率低、遺傳穩(wěn)定性好、生物表達(dá)量高等優(yōu)勢，在基因工程疫苗的研究和生產(chǎn)中作用重大，相對于目前采用的其他真核表達(dá)系統(tǒng)具有產(chǎn)量更高、成本低的優(yōu)點。本發(fā)明還提供了應(yīng)用于該漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。本發(fā)明的表達(dá)載體可以實現(xiàn)同時共表達(dá)兩個或多個基因。兩個目的基因在漢遜酵母營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞中可以無干擾地高水平表達(dá)。


圖1 為 PCR 擴增電泳檢測結(jié)果，1、2、3、4、5 分別為 MOXP、MOXT、HARS, Ura3、Amp+ColEl ;其中M :DL2000bp plus (北京全式金生物技術(shù)有限公司)。圖2為Μ0ΧΡ+Μ0ΧΤ基因片段PCR擴增電泳檢測結(jié)果；其中M DL2000bp plus (北京全式金生物技術(shù)有限公司)。圖3為HARS+Ura3+Amp+ColEl基因片段電泳結(jié)果；其中M DL2000bp plus (北京全式金生物技術(shù)有限公司)。圖4為不同引物(M0XP-F/M0XP-R ;Ura3_F/Ura3_R)對表達(dá)載體PMV單克隆菌落1-8號進(jìn)行PCR鑒定的電泳檢測結(jié)果；其中ml-m8為引物M0XP-F/M0XP-R鑒定結(jié)果，ul_u8為引物Ura3-F/Ura3-R鑒定結(jié)果；其中M :DL2000bp plus(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。圖5為表達(dá)載體PMV-05電泳檢測結(jié)果，其中M :DL15000(寶生物工程有限公司)。圖6為表達(dá)載體PMV-05雙酶切(Sac1、Sail)電泳檢測結(jié)果，I為重組表達(dá)載體PMV-05，2為重組表達(dá)載體PMV-05雙酶切，其中M DL15000 (寶生物工程有限公司)。圖7為重組表達(dá)載體PMV-05-HPV16Ll-f PCR鑒定電泳檢測結(jié)果，其中M:DL2000bpplus (北京全式金生物技術(shù)有限公司)。圖81、2、3、4均為重組表達(dá)載體PMV-05_HPV16Ll-f電泳檢測結(jié)果，M:DL15000 (寶
生物工程有限公司)。圖9為重組表達(dá)載體PMV-05-HPV16Ll-f雙酶切(BamH1、EcoRI)電泳檢測結(jié)果，其中1、3、5、7為重組表達(dá)載體對照，2、4、6、8為進(jìn)行雙酶切的表達(dá)載體，M DL15000 (寶生物
工程有限公司)。圖101、2、3 分別為 Ura35’端、Ura33’端、G418PCR 擴增電泳檢測結(jié)果，M DL2000bpplus (北京全式金生物技術(shù)有限公司)。圖11為U5’ -G418-U3’基因片段PCR電泳檢測結(jié)果，M DL2000bp plus (北京全式金生物技術(shù)有限公司)。圖12顯示漢遜酵母表達(dá)的HPV16L1菌株F (PMV-05_HPV16Ll-f質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌)經(jīng)小瓶甲醇誘導(dǎo)表達(dá)72h后的蛋白SDS-PAGE檢定結(jié)果。M :為低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)(北京全式金公司)；1 :為原核表達(dá)陽性對照菌株；2 :為不帶外源基因的宿主細(xì)胞蛋白(陰性對照);9、10、
11、12、13 :為菌株誘導(dǎo)樣品。圖13顯示漢遜酵母表達(dá)的HPV16L1菌株F經(jīng)小瓶甲醇誘導(dǎo)表達(dá)72h后的蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)檢定結(jié)果。樣品順序如圖12所示。圖14顯示HPV16L1菌株發(fā)酵模式圖。圖15顯示經(jīng)過超速離心純化的HPV16L1蛋白的SDS-PAGE檢定結(jié)果。M :為低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)(北京全式金公司)；1 :為不帶外源基因的宿主細(xì)胞蛋白(陰性對照);2-12 :為超速離心后紫外吸收峰處分管收集蛋白樣品。圖16顯示HPV16Ll_f蛋白的透射電鏡照片。圖17顯示EV71病毒樣顆粒的透射電鏡照片(放大倍數(shù)97000)。
具體實施例方式以下實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆實驗室手冊》(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件進(jìn)行。實施例1表達(dá)載體PMV-05的構(gòu)建本發(fā)明的表達(dá)載體PMV-05由6部分組成啟動子(Μ0Χ-Ρ)、終止子(Μ0Χ-Τ)、復(fù)制子HARS、ura3基因、ColEl復(fù)制子、Amp抗性基因。以漢遜酵母ATCC26012基因組DNA為模板，分別以引物MOXP-F (序列見SEQ IDNO. 3), MOXP-R (見 SEQ ID NO. 4) ;M0XT_F (見 SEQ ID NO. 5), MOXT-R (見 SEQ ID NO. 6)；HARS-F (見 SEQ ID NO. 7)、HARS-R (見 SEQ ID NO. 8) ；Ura3-F (見 SEQID NO. 9)、Ura3_R(見 SEQ ID NO. 10)進(jìn)行 PCR 擴增，調(diào)取基因 MOXP、MOXT、HARS、Ura3。以 PBR-SK 質(zhì)粒(購自寶生物工程大連有限公司，貨號D3050)為模板，以引物Amp+ColEl-F (見SEQ ID NO. 11)、Amp+ColEl-R (見SEQ ID NO. 12)進(jìn)行PCR擴增，調(diào)取基因Amp+ColEl。PCR反應(yīng)體系如下:PCR 緩沖液 10μ 1，dNTPlOy 1，引物 Fly 1，引物 Rly 1，Taq DNA polymerasel μ I 蒸餾水157 μ I 總體積 200 μ I。反應(yīng)條件95°C 2min ；95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 2min ;反應(yīng) 30 個循環(huán)。將PCR擴增的DNA片段以1%瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測，PCR產(chǎn)物大小分別約為Μ0ΧΡ: 1500bp左右、M0XT:300bp 左右、HARS 500bp 左右、Ura3:1lOObp 左右、Amp+ColEl 2200bp 左右，PCR電泳結(jié)果見圖1。將以上5個基因片段用DNA片段純化試劑盒進(jìn)行純化。分別取純化好的MOXP、MOXT基因片段各I μ I作為模板，以引物MOXP-F和MOXT-R進(jìn)行PCR擴增獲得Μ0ΧΡ+Μ0ΧΤ基因片段，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同上，PCR獲得的Μ0ΧΡ+Μ0ΧΤ基因片段電泳結(jié)果如圖2所示。分別取純化好的HARS、Ura3、Amp+ColEl基因片段各I μ I作為模板，以引物HARS-R和Amp+ColEl-R進(jìn)行PCR擴增獲得HARS+Ura3+Amp+ColEl基因片段，PCR反應(yīng)體系如下PCR 緩沖液 10 μ I, dNTPlOy 1，引物 Fl μ I,引物 Rl μ I, Taq DNA polymerasel μ I 蒸餾水 155 μ I 總體積 200 μ I。反應(yīng)條件95°C 2min ；95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 4min ;反應(yīng) 30個循環(huán)。PCR獲得的HARS+Ura3+Amp+ColEl基因片段電泳結(jié)果如圖3所示。將基因片段Μ0ΧΡ+Μ0ΧΤ,HARS+Ura3+Amp+CoIEI用DNA片段純化試劑盒進(jìn)行純化。將純化好的基因片段Μ0ΧΡ+Μ0ΧΤ、HARS+Ura3+Amp+ColEl分別進(jìn)行(Sac1、Sail)雙酶切，酶切反應(yīng)如下基因片段 60 μ 1，Sac1、Sail 各 3μ 1，IOXBasal bufferlOy I, IOXBSAlOy 1，加水至 100 μ 1，于37°C進(jìn)行酶切過夜。將酶切產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分離后，切膠回收酶切基因片段，通過SolutionI連接試劑盒(購自寶生物工程(大連)有限公司)進(jìn)行連接。連接反應(yīng)體系如下HARS+Ura3+Amp+ColEl (Sac1、SalI)雙酶切純化產(chǎn)物 I μ 1，M0XP+M0XT (Sac1、Sail)雙酶切純化產(chǎn)物4 μ 1，SolutionI5y I共計10 μ I反應(yīng)體系，于16°C連接I小時。將連接后的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到100 μ I大腸桿菌(DH5a)感受態(tài)細(xì)胞中，涂LB+Amp (100μ g/mL)固體培養(yǎng)基37 °C培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化克隆篩選挑取LB+Amp固體培養(yǎng)基上的單克隆菌落做為模板，分別以引物MOXP-F, M0XP-R, Ura3_F、Ura3-R進(jìn)行PCR鑒定轉(zhuǎn)化克隆，PCR反應(yīng)體系如下PCR緩沖液2 μ 1，(1ΝΤΡ2μ 1，上游引物 0.1 μ I,下游引物 0.1 μ 1，Taq DNA polymeraseO. 1μ I 蒸餾水15. 7μ I 總體積 20 μ I。反應(yīng)條件95°C 2min ；95°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C Imin ;反應(yīng) 30 個循環(huán)。將PCR擴增的DNA片段以1%瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測，以M0XP-F、M0XP_R為引物的PCR產(chǎn)物大小約應(yīng)為1500bp左右，以Ura3-F、Ura3_R為引物的PCR產(chǎn)物大小約應(yīng)為IOOObp左右，PCR電泳結(jié)果見圖4。將PCR鑒定正確的5號轉(zhuǎn)化克隆命名為重組表達(dá)載體PMV-05，并將其接種到IOmL LB+Amp液體培養(yǎng)基于37°C搖床200rpm過夜培養(yǎng)。按照質(zhì)粒提取試劑盒(來源北京全式金生物技術(shù)有限公司)說明書進(jìn)行重組表達(dá)載體PMV-05的提取，將提取的重組表達(dá)載體進(jìn)行1%瓊 脂 糖電泳進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果見圖5。將所獲得的表達(dá)載體進(jìn)行酶切鑒定，酶切反應(yīng)體積如下質(zhì)粒5 μ 1，Sac1、Sail各1μ l，10XBasal buffer2y I,10XBSA2y 1，加水至20 μ 1，于37°C進(jìn)行酶切4小時，酶切結(jié)果電泳檢測如圖6所示。實施例2尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型漢遜酵母細(xì)胞的獲得及穩(wěn)定性分析1、尿嘧啶缺陷型漢遜酵母細(xì)胞的獲得分別從Pichia pastoris表達(dá)載體pPIC9K (購自inritrogen公司)獲得G418抗性基因序列，從Gene bank獲得Hansenula Ura3基因序列。根據(jù)Ura3及G418基因序列設(shè)計引物P1、P2、P3、P4、P5、P6，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 13 18所示。以漢遜酵母野生型宿主菌ATCC26012基因組DNA為模板，分別以引物Pl和P2進(jìn)行PCR擴增獲得Ura3的5’端基因片段，以引物P5和P6進(jìn)行PCR擴增獲得Ura3的3’端基因片段；以Pichia pastoris表達(dá)載體pPIC9K為模板，以P3和P4為引物進(jìn)行PCR擴增獲得G418基因片段。PCR反應(yīng)體系如下PCR緩沖液10 μ 1，dNTP8 μ 1，模板I μ 1，上游引物0. 5 μ I,下游引物 O. 5 μ I, Taq DNApolymeraseO. 5 μ I 蒸懼水 79. 5 μ I 總體積 100 μ I。反應(yīng)條件95°C 2min ；95°C 30s, 55 °C 30s，72°C 2min ;反應(yīng) 30 個循環(huán)。將 PCR 擴增的 DNA 片段以1%瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果如圖10所示。將三個基因片段用DNA片段純化試劑盒進(jìn)行純化。分別取純化好的Ura3的5’端基因片段、G418基因片段、Ura3的3’端基因片段個I μ I作為模板，以引物Pl和Ρ6進(jìn)行PCR擴增獲得U5’ -G418-U3’基因片段，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同上，PCR獲得的U5’-G418-U3’基因片段如圖11所示。用DNA片段純化試劑盒純化上述PCR產(chǎn)物，將純化獲得U5，-G418-U3’基因片段通過電穿孔轉(zhuǎn)化到漢遜酵母ATCC26012野生型宿主細(xì)胞中，U5’ -G418-U3’基因片段通過同源重組方式整合于漢遜酵母ATCC26012野生型宿主細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂YPD+G418固體培養(yǎng)基于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)至長出菌落。挑選100個菌落依次轉(zhuǎn)接到Y(jié)NB選擇性固體培養(yǎng)基、YNB+尿嘧啶固體培養(yǎng)基、YPD+G418固體培養(yǎng)基上置37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天。挑選在YNB+尿嘧啶固體培養(yǎng)基、YPD+G418固體培養(yǎng)基上均生長而在YNB選擇性固體培養(yǎng)基上不生長的菌落即為漢遜酵母ATCC26012尿嘧啶缺陷型宿主細(xì)胞，該尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型宿主細(xì)胞為通過同源重組的方式將乳清酸苷-5-磷酸脫羧酶(URA3)基因阻斷，具體的為在乳清酸苷-5-磷酸脫羧酶基因的第396-546位處插入G418抗性基因，從而獲得乳清酸苷-5-磷酸脫羧酶基因共計150個核苷酸缺失的尿嘧啶缺陷型漢遜酵母宿主細(xì)胞。本發(fā)明的ATCC26012尿嘧啶缺陷性宿主細(xì)胞為多型漢遜酵母AU-0501，其保藏編號為CGMCCNo. 7013，已于2012年12月18日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，簡稱CGMCC,郵編100101)保藏,分類 命名為多型漢遜酵母(Hansenula polymorpha)。2、尿嘧啶缺陷型漢遜酵母細(xì)胞遺傳穩(wěn)定性分析取凍存的尿嘧啶缺陷型漢遜酵母菌種AU-0501 —支，融化后接種到IOmL YPD液體培養(yǎng)基中置37°C搖床培養(yǎng)200rpm培養(yǎng)20小時，連續(xù)轉(zhuǎn)接8次(48世代以上)，4000rpm離心10分鐘，收集沉淀加入5mLMD培養(yǎng)基重懸洗滌菌體2次，再次離心，加入IOmLMD培養(yǎng)基重懸菌體，取IOOul用蒸餾水連續(xù)稀釋到10'10'10-6，分別取100 μ I涂布在YPD+G418、MD和MD+Ura3固體培養(yǎng)基平板上，每個稀釋度平行涂布兩個平板，置37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天。各個平板培養(yǎng)情況如下表I各平板菌落培養(yǎng)情況
權(quán)利要求
1.一株多型漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha) AU-0501,其為尿卩密唳缺陷型漢遜酵母菌，乳清酸苷-5-磷酸脫羧酶基因被阻斷，其保藏編號為CGMCC No. 7013。
2.權(quán)利要求1所述的多型漢遜酵母菌AU-0501在生產(chǎn)外源蛋白中的應(yīng)用。
3.含有權(quán)利要求1所述多型漢遜酵母菌AU-0501的漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)。
4.一種構(gòu)建尿嘧啶缺陷型漢遜酵母菌的方法，其特征在于，包括以下步驟 Cl)以漢遜酵母野生型宿主菌基因組DNA為模板，分別以引物Pl和P2進(jìn)行PCR擴增獲得Ura3的5’端基因片段，以引物P5和P6進(jìn)行PCR擴增獲得Ura3的3’端基因片段；以Pichia pas tor is表達(dá)載體pPIC9K為模板，以P3和P4為引物進(jìn)行PCR擴增獲得G418基因片段；所述引物ΡΓΡ6的核苷酸序列如SEQ ID NO. 13 18所示； (2)將上述三個基因片段進(jìn)行純化，以純化好的Ura3的5’端基因片段、G418基因片段、Ura3的3’端基因片段為模板，以引物Pl和P6進(jìn)行PCR擴增獲得U5，-G418-U3’基因片段，將純化獲得U5’ -G418-U3’基因片段通過電穿孔轉(zhuǎn)化到漢遜酵母野生型宿主細(xì)胞中，U5’ -G418-U3’基因片段通過同源重組方式整合于漢遜酵母野生型宿主細(xì)胞中； (3)將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂YPD+G418固體培養(yǎng)基于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)至長出菌落；挑選菌落依次轉(zhuǎn)接到Y(jié)NB選擇性固體培養(yǎng)基、YNB+尿嘧啶固體培養(yǎng)基、YPD+G418固體培養(yǎng)基上置37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，挑選在YNB+尿嘧啶固體培養(yǎng)基、YPD+G418固體培養(yǎng)基上均生長而在YNB選擇性固體培養(yǎng)基上不生長的菌落即為漢遜酵母尿嘧啶缺陷型宿主細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述漢遜酵母野生型宿主菌為漢遜酵母ATCC26012。
6.一種應(yīng)用于漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)啟動外源基因表達(dá)的載體，其為PMV-05，其含有啟動子MOX-P、終止子MOX-T、復(fù)制子HARS、ura3基因、ColEl復(fù)制子、Amp抗性基因。
7.如權(quán)利要求6所述的載體，其特征在于，通過如下方法制備獲得 (1)以漢遜酵母基因組DNA為模板，分別以引物MOXP-F、MOXP-R;M0XT_F、MOXT-R ；HARS-F、HARS-R (見 SEQ ID NO. 8) ;Ura3_F、Ura3_R 進(jìn)行 PCR 擴增，獲得基因 MOXP、MOXT、HARS、Ura3 ;上述引物的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 3 10所示； (2)以PBR-SK質(zhì)粒為模板，以引物Amp+ColEl-F、Amp+ColEl-R進(jìn)行PCR擴增，獲得基因Amp+ColEl，上述引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 11 12所示； (3)將以上5個基因片段純化，取純化好的Μ0ΧΡ、MOXT基因片段作為模板，以引物MOXP-F和MOXT-R進(jìn)行PCR擴增獲得Μ0ΧΡ+Μ0ΧΤ基因片段；分別取純化好的HARS、Ura3、Amp+ColEl基因片段各1μ I作為模板，以引物HARS-R和Amp+ColEl-R進(jìn)行PCR擴增獲得HARS+Ura3+Amp+ColEl 基因片段；將基因片段 M0XP+M0XT、HARS+Ura3+Amp+ColEl 進(jìn)行純化，將純化好的基因片段M0XP+M0XT、HARS+Ura3+Amp+ColEl用Sac1、SalI分別進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分離后，切膠回收酶切基因片段，連接，將連接后的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化克隆篩選得到重組表達(dá)載體PMV-05。
8.權(quán)利要求6或7所述載體在表達(dá)外源蛋白中的應(yīng)用。
9.一種漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于，包括啟動外源基因表達(dá)的載體和具有特定篩選標(biāo)記的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為尿嘧啶缺陷型漢遜酵母菌，其乳清酸苷-5-磷酸脫羧酶基因被阻斷；啟動外源基因表達(dá)的載體為PMV-05，其含有啟動子Μ0Χ-Ρ、終止子Μ0Χ-Τ、復(fù)制子HARS、ura3基因、ColEl復(fù)制子、Amp抗性基因。
10.權(quán)利要求9所述的漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)在生產(chǎn)類病毒顆粒疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，該表達(dá)系統(tǒng)含有尿嘧啶缺陷型漢遜酵母菌AU-0501，保藏編號為CGMCC No.7013。本發(fā)明提供的尿嘧啶缺陷型漢遜酵母菌具有突變位點明確、回復(fù)突變率低、遺傳穩(wěn)定性好、生物表達(dá)量高等優(yōu)勢，在基因工程疫苗的研究和生產(chǎn)中作用重大，相對于目前采用的其他真核表達(dá)系統(tǒng)具有產(chǎn)量更高、成本低的優(yōu)點。本發(fā)明還提供了應(yīng)用于該漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。本發(fā)明的表達(dá)載體可以實現(xiàn)同時共表達(dá)兩個或多個基因。兩個目的基因在漢遜酵母營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞中可以無干擾地高水平表達(dá)。
文檔編號C12N15/66GK103045492SQ20121059281
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者顧美榮, 宋琳琳, 孟凡童, 戚治國, 張凱泉, 魏文進(jìn), 劉建凱 申請人:北京民海生物科技有限公司