專(zhuān)利名稱(chēng)：Nogo受體拮抗劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及神經(jīng)生物學(xué)和分子生物學(xué)。本發(fā)明更具體涉及免疫原性Nogo受體-1 (NgRl)多肽，Nogo受體-1抗體，其抗原結(jié)合片段，可溶性Nogo受體及其融合蛋白以及編碼它們的核酸。本發(fā)明進(jìn)一步涉及Nogo受體-1拮抗劑多聚核苷酸。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含該種Nogo受體抗體，其抗原結(jié)合片段,免疫原性Nogo受體-1多肽，可溶性Nogo受體及其融合蛋白，編碼它們的核酸以及拮抗劑多聚核苷酸的組合物，以及這些成分的制備和使用方法。
背景技術(shù)：
神經(jīng)元的軸突和樹(shù)突是由神經(jīng)元向外延伸的長(zhǎng)細(xì)胞突起。伸展的軸突或神經(jīng)突的尖端包含了一個(gè)專(zhuān)化的區(qū)域，該區(qū)域被稱(chēng)作生長(zhǎng)錐。生長(zhǎng)錐感受局部環(huán)境并引導(dǎo)軸突向神經(jīng)元靶細(xì)胞生長(zhǎng)。生長(zhǎng)錐可響應(yīng)表面粘性，生長(zhǎng)因子，神經(jīng)傳遞素和電場(chǎng)等多個(gè)環(huán)境線索。錐的生長(zhǎng)引導(dǎo)涉及多類(lèi)吸附分子，胞間信號(hào)以及刺激和抑制生長(zhǎng)錐的因素。生長(zhǎng)神經(jīng)突的生長(zhǎng)錐可以不同的速率生長(zhǎng)，但其速度通常為每天一至兩毫米。
生長(zhǎng)錐呈手形，具有可差異吸附至胚胎表面的扁平突起(微端絲或絲狀偽足)。絲狀偽足具有持續(xù)的活性，部分絲狀偽足可縮回生長(zhǎng)錐，而其它的絲狀偽足可持續(xù)延長(zhǎng)透過(guò)基質(zhì)。不同絲狀偽足之間的延長(zhǎng)形成了片狀偽足。
生長(zhǎng)錐通過(guò)片狀偽足和絲狀偽足探索其前方和兩側(cè)的區(qū)域。當(dāng)延長(zhǎng)物接觸到不適宜的表面時(shí)，它將縮回當(dāng)延長(zhǎng)物接觸到適宜的生長(zhǎng)表面時(shí)，它將繼續(xù)延伸并將生長(zhǎng)錐導(dǎo)向該方向。生長(zhǎng)錐可受到基質(zhì)表面屬性的細(xì)微變化所引導(dǎo)。生長(zhǎng)錐到達(dá)合適的靶細(xì)胞后將建立突觸聯(lián)系。
神經(jīng)細(xì)胞的功能受神經(jīng)元與其直接環(huán)境中的其它細(xì)胞的接觸所影響(U.Rutishauser, T.M.Jessell, Physiol.Rev.68:819 (1988))。這些細(xì)胞包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的特殊神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，少突細(xì)胞以及以髓磷脂(多層膜的隔離結(jié)構(gòu))包覆神經(jīng)元軸突的周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)(PNS)的施萬(wàn)細(xì)胞(G.Lemke, in AnIntroduction to MolecularNeurobiology, Z.Hall,Ed.(Sinauer, Sunderland, Mass.), p.281(1992))。
盡管CNS神經(jīng)元 具有在損傷后再生的能力，該種能力可由于髓磷脂中抑制蛋白的存在，或者也可能由于在其局部環(huán)境中常發(fā)現(xiàn)的其它類(lèi)型的分子的存在而受到抑制(Brittis 和 Flanagan, Neuron50:11-14 (2001) ; Jones 等人,J.Neurosc.22:2792-2803 (2002) ; Grimpe 等人，J.Neurosc1.22:3144-3160 (2002))。
在少突細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的多種髓磷脂抑制蛋白已得到鑒定，例如，NogoA(Chen等人，Nature403:434-439(2000);Grandpre 等人，Nature403:439-444(2000))，髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG, McKerracher 等人，Neuronl3:805-811 (1994);Mukhopadhyay 等人，Neuronl3:151-161 (1994))以及少突細(xì)胞糖蛋白(OM_gp, Mikol 和 Stefansson, J.Cell.Biol.106:1213-1219(1988)) ο這些蛋白各自顯示為神經(jīng)元Nogo受體-1的配體(Wang 等人，Nature417:941-944 (2002) ; Liu 等人，Sciehce297:1190-93 (2002) ; Grandpre等人,Nature403:439-444 (2000) ; Chen 等人,Nature403:434-439 (2000) ; Domeniconi 等人，Neuron35:283-90 (2002))。
Nogo受體-1是一種包含了含8個(gè)富亮氨酸重復(fù)序列的GPI錨定的膜蛋白(Foumier 等人,Nature409:341-346 (2001))。在與抑制蛋白(例如，NogoA, MAG 和 OM-gp)相互作用后，該Nogo受體-1復(fù)合物轉(zhuǎn)導(dǎo)了可導(dǎo)致生長(zhǎng)錐萎縮和神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制的信號(hào)。
對(duì)抑制Nogo受體-1與其配體結(jié)合以及減少髓磷脂-介導(dǎo)的生長(zhǎng)錐萎縮和神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制的分子存在著迫切的需求。
發(fā)明概述
本發(fā)明涉及Nogo受體-1拮抗劑在促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)，神經(jīng)元存活，以及CNS神經(jīng)元中軸突再生中的應(yīng)用。本發(fā)明的特征在于可用于抑制神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制，促進(jìn)神經(jīng)元存活，和/或促進(jìn)CNS神經(jīng)元中軸突再生的分子和方法。
本發(fā)明還涉及可溶性Nogo受體-1多肽及包含其的融合蛋白，以及針對(duì)Nogo受體-1特異性免疫原區(qū)的抗體及其抗原片段。本發(fā)明還涉及與本發(fā)明的抗體結(jié)合的免疫原性Nogo受體-1多肽。本發(fā)明還涉及可與Nogo受體-1結(jié)合的單克隆抗體結(jié)合的Nogo受體-1多肽。該種多肽可特別用作免疫原或用于篩選抗體以鑒定與本發(fā)明的抗體具有類(lèi)似特異性的抗體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及編碼本發(fā)明多肽的核酸，包含該種核酸的載體和宿主細(xì)胞以及制備該種肽的方法。本發(fā)明的抗體，可溶性受體和受體融合蛋白對(duì)抗或阻斷Nogo受體-1并可用于抑制Nogo受體-1與其配體的結(jié)合，抑制神經(jīng)元內(nèi)生長(zhǎng)錐萎縮并減少神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)突生長(zhǎng)或抽芽。
在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了選自如下組合的多肽:MAFTGLTLLEQLDLSDNAQLR(SEQ ID NO:26);LDLSDNAQLR(SEQID NO:27);LDLSDDAELR(SEQ IDNO:29);LDLASDNAQLR(SEQ IDNO:30);LDLASDDAELR(SEQ ID NO:31);LDALSDNAQLR(SEQ IDNO:32);LD ALSDDAELR(SEQ ID NO:33);LDLSSDNAQLR(SEQ ID NO:34);LDLSSDEAELR(SEQID NO:35);DNAQLRffDPTT(SEQ ID NO:36);DNAQLR(SEQ ID NO:37);ADLSDNAQLRVVDPTT(SEQID N0:41) ;ALSDNAQLR ffDPTT (SEQ ID NO:42) ;LDLSDNAALRVVDPTT (SEQ IDNO:43) ;LDLSDNAQLHVVDPTT(SEQ ID NO:44);以及 LDLSDNAQLAWDPTT(SEQ ID NO:45)。
在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明多肽的核酸。在部分實(shí)施方式中，該核酸可操作地連接至表達(dá)控制序列。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明核酸的載體。
在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明核酸或載體的宿主細(xì)胞。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法，其包括培養(yǎng)包含本發(fā)明核酸或載體的宿主細(xì)胞，然后從該宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基回收該多肽。
在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)抗體的方法，其包括以本發(fā)明的多肽或包含本發(fā)明的核酸或載體的宿主細(xì)胞對(duì)宿主免疫接種，然后回收抗體。本發(fā)明還提供了由該方法生產(chǎn)的抗體及其抗原結(jié)合片段。
在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中該抗體不是由雜交瘤細(xì)胞系HB7E11 (ATCC 編號(hào)PTA-4587-HB7E11)生產(chǎn)的單克隆抗體。
在本發(fā)明的部分實(shí)施方式中，該抗體或其抗原結(jié)合片段(a)抑制神經(jīng)元的生長(zhǎng)錐萎縮；(b)減少對(duì)神經(jīng)元神經(jīng)突生長(zhǎng)和抽芽的抑制；以及(C)抑制Nogo受體-1與配體的結(jié)合。在部分實(shí)施方式中，該神經(jīng)突生長(zhǎng)和抽芽為軸突生長(zhǎng)。在部分實(shí)施方式中，該神經(jīng)元為中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元。
在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體為單克隆抗體。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體為鼠抗體。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體選自由人源化抗體，嵌合抗體以及單鏈抗體構(gòu)成的組合。
在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了抑制Nogo受體-1與配體結(jié)合的方法，其包括將Nogo受體-1與本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段相接觸。在部分實(shí)施方式中該配體選自由NogoA, NogoB, NogoC, MAG 和 OM-gp 構(gòu)成的組合。
在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了抑制神經(jīng)元中生長(zhǎng)錐萎縮的方法，其包括將神經(jīng)元與本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段相接觸。
在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了減少神經(jīng)元中神經(jīng)突生長(zhǎng)或抽芽抑制的方法，其包括將神經(jīng)元與本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段相接觸。在部分實(shí)施方式中，該神經(jīng)突生長(zhǎng)或抽芽為軸突生長(zhǎng)。在部分實(shí)施方式中，該神經(jīng)元為中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元。
在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了包含藥學(xué)可接受載體以及本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段的組合物。在部分實(shí)施方式中，該組合物進(jìn)一步包括一種或多種附加治療劑。
在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了促進(jìn)具有死亡風(fēng)險(xiǎn)的神經(jīng)元存活的方法，其包括將該神經(jīng)元與有效量的本發(fā)明的抗-Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片段相接觸。在部分實(shí)施方式中，該神經(jīng)元處于體外。在部分實(shí)施方式中，該神經(jīng)元在哺乳動(dòng)物體內(nèi)。在部分實(shí)施方式中，該哺乳動(dòng)物顯示了多發(fā)性硬化癥，ALS,亨廷頓病，阿爾茨海默病，帕金森氏病，糖尿病神經(jīng)病變，中風(fēng)，外傷性腦損傷或脊髓損傷的信號(hào)或癥狀。
在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了在哺乳動(dòng)物中促進(jìn)具有死亡風(fēng)險(xiǎn)的神經(jīng)元存活的方法，其包括(a)提供表達(dá)本發(fā)明抗-Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片段的培養(yǎng)后的宿主細(xì)胞；以及(b)在該神經(jīng)元的位點(diǎn)或附近將該宿主細(xì)胞導(dǎo)入該哺乳動(dòng)物。
在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了促進(jìn)具有死亡風(fēng)險(xiǎn)的神經(jīng)元存活的基因治療方法，其中該神經(jīng)元處于哺乳動(dòng)物體內(nèi)，其包括在該神經(jīng)元位點(diǎn)或附近施用包含了編碼本發(fā)明抗-Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片段的核苷酸序列的病毒載體，其中該抗-Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片段的表達(dá)量足以促進(jìn)該神經(jīng)元的存活。
在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了包含除了最多三個(gè)氨基酸替換外選自如下組合的氨基酸序列的具有60個(gè)殘基或少于60個(gè)殘基的分離多肽:SEQ ID NO:49的氨基酸309-335; SEQ IDNO: 49 的氨基酸 309-336; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 309-337; SEQ IDNO: 49的氨基酸 309-338; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 309-339; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 309-340; SEQID NO:49 的氨基酸 309-341; SEQ IDNO:49 的氨基酸 309-342; SEQ ID N0:49 的氨基酸309-343; SEQ IDNO: 49 的氨基酸 309-344; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 309-345; SEQ IDNO: 49的氨基酸 309-346; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 309-347; SEQ IDNO: 49 的氨基酸 309-348; SEQID NO:49 的氨基酸 309-349; SEQ IDNO:49 的氨基酸 309-350; SEQ ID NO:49 的氨基酸300-344; SEQ IDNO: 49 的氨基酸 301-344; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 302-344; SEQ IDNO: 49的氨基酸 303-344; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 304-344; SEQ IDNO: 49 的氨基酸 305-344; SEQID NO:49 的氨基酸 306-344; SEQ IDNO:49 的氨基酸 307-344; SEQ ID NO:49 的氨基酸308-344; SEQ IDNO: 49 的氨基酸 336-344; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 335-344; SEQ IDNO: 49的氨基酸 334-344; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 333-344; SEQ IDNO: 49 的氨基酸 332-344; SEQID N0:49 的氨基酸 331-344;SEQ IDN0:49 的氨基酸 330-344; SEQ ID N0:49 的氨基酸329-344; SEQ EONO: 49 的氨基酸 328-344; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 327-344; SEQ IDNO: 49的氨基酸 326-344; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 325-344; SEQ IDNO: 49 的氨基酸 324-344; SEQID NO:49 的氨基酸 323-344; SEQ IDNO:49 的氨基酸 322-344; SEQ ID NO:49 的氨基酸321-344; SEQ IDNO: 49 的氨基酸 320-344; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 319-344; SEQ IDNO: 49的氨基酸 318-344; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 317-344; SEQ IDNO: 49 的氨基酸 316-344; SEQID N0:49 的氨基酸 315-344;SEQ IDN0:49 的氨基酸 314-344; SEQ ID N0:49 的氨基酸313-344; SEQ IDN0:49 的氨基酸 312-344; SEQ ID N0:49 的氨基酸 311-344; SEQ IDNO:49的氨基酸 310-344; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 336-344; SEQ IDNO: 49 的氨基酸 336-345; SEQID NO:49 的氨基酸 336-346; SEQ IDNO:49 的氨基酸 336-347; SEQ ID NO:49 的氨基酸336-348; SEQ IDNO: 49 的氨基酸 336-349; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 336-350;任意所述多肽片段的變體或衍生物，以及至少兩個(gè)任意所述多肽片段的組合。
在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了包含選自如下組合的氨基酸序列的具有60個(gè)殘基或少于60個(gè)殘基的分離多肽:SEQ IDNO:49的氨基酸311-344; SEQ ID N0:49的氨基酸310-348; SEQ IDNO: 49 的氨基酸 323-328; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 339-348; SEQ IDNO: 49 的氨基酸378-414; SEQ ID NO: 49 的氨基酸27-38; SEQ IDNO:49 的氨基酸39-61; SEQ ID NO:49的氨基酸 257-267; SEQ IDNO: 49 的氨基酸 280-292; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 301-323; SEQIDNO: 49 的氨基酸 335-343; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 310-335; SEQ IDNO: 49 的氨基酸326-328;任意所述多肽片段的變體或衍生物，以及至少兩個(gè)任意所述多肽片段的組合。
在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了具有60個(gè)殘基或少于60個(gè)殘基的分離多肽片段，其包含除了最多三個(gè)單獨(dú)氨基酸替換外與參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的參考氨基酸序列選自如下組合:(a) SEQ ID N0:49的氨基酸x-344，(b)SEQ IDNO:49的氨基酸309-y，以及(C)S EQ ID NO:49的氨基酸χ-y，其中x為由305至326的任意整數(shù)，而y是由328至350的任意整數(shù)；并且其中所述的多肽片段抑制Nogo-受體介導(dǎo)的神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了具有60個(gè)殘基或少于60個(gè)殘基的分離多肽片段，其包含除了最多三個(gè)單獨(dú)氨基酸替換外與參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的參考氨基酸序列選自如下組合:(a) SEQ ID NO:49的氨基酸X’-344，(b) SEQ ID N0:49的氨基酸309-y’，以及(C)SEQ ID NO:49的氨基酸x’-y’，其中X’為由300至326的任意整數(shù)，而y’是由328至360的任意整數(shù)；并且其中所述的多肽片段抑制Nogo-受體介導(dǎo)的神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了具有60個(gè)殘基或少于60個(gè)殘基的分離多肽片段，其包含除了最多三個(gè)單獨(dú)氨基酸替換外與參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的參考氨基酸序列選自如下組合:SEQ ID NO:49的氨基酸309-335; SEQ ID NO: 49的氨基酸 309-344; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 310-335; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 310-344; SEQ IDNO: 49的氨基酸309-350; SEQ ID NO: 49的氨基酸300-344;以及SEQ ID NO: 49的氨基酸315-344。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了具有60個(gè)殘基或少于60個(gè)殘基的分離多肽片段，其包含除了最多三個(gè)單獨(dú)氨基酸替換外與參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的參考氨基酸序列為SEQ ID NO:49的氨基酸309-335。
在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明所提供的多肽為環(huán)狀。在部分實(shí)施方式中，該環(huán)狀多肽進(jìn)一步包含連接在N-末端的第一分子和連接在C-末端的第二分子；其中所述的第一分子和所述的第二分子彼此連接形成所述的環(huán)狀分子。在部分實(shí)施方式中，該第一和第二分子選自如下組合:生物素分子，半胱氨酸殘基，以及乙?；腚装彼釟埢?。在部分實(shí)施方式中，該第一分子為連接至本發(fā)明多肽N-末端的生物素分子而該第二分子為連接至本發(fā)明多肽C-末端的半胱氨酸殘基。在部分實(shí)施方式中，該第一分子為連接至本發(fā)明多肽N-末端的乙?；腚装彼釟埢摰诙肿訛檫B接至本發(fā)明多肽C-末端的半胱氨酸殘基。在部分實(shí)施方式中，該第一分子為連接至本發(fā)明多肽N-末端的乙酰化半胱氨酸殘基而該第二分子為連接至本發(fā)明多肽C-末端的半胱氨酸殘基。在部分實(shí)施方式中，該C-末端半胱氨酸連接了 NH2部分。
在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分離多肽，其中所述的第一多肽片段包含了除了最多二十個(gè)單獨(dú)氨基酸替換外與第一參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第一參考氨基酸序列選自如下組合:(a)SEQ IDN0:49的氨基酸a-445，(b)SEQ ID NO: 49的氨基酸27_b，以及(c) SEQ ID NO: 49的氨基酸a_b，其中a為由25至35的任意整數(shù)，而b是由300至450的任意整數(shù)；其中所述的第二多肽片段包含了除了最多二十個(gè)單獨(dú)氨基酸替換外與第二參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第二參考氨基酸序列選自如下組合:(a) SEQ IDN0:49的氨基酸c-445，(b) SEQ IDNO: 49的氨基酸27-d，以及(c)SEQID NO: 49的氨基酸c_d，其中c為由25至35的任意整數(shù)，而d是由300至450的任意整數(shù)；并且其中所述的多肽抑制Nogo-受體介導(dǎo)的神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分離多肽，其中該第一多肽片段包含了除了最多二十個(gè)單獨(dú)氨基酸替換外與第一參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中該第一參考氨基酸序列選自如下組合:(a) SEQ ID N0:49的氨基酸27-310，以及(b)SEQ ID NO:49的氨基酸27-344。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分離多肽，其中該第二多肽片段包含了除了最多二十個(gè)單獨(dú)氨基酸替換外與第二參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中該第二參考氨基酸序列選自如下組合:(a ) SEQ ID NO:49的氨基酸27-310，以及(b) SEQ ID NO: 49的氨基酸27-344。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分離多肽，其中該第二多肽片段包含了除了最多二十個(gè)單獨(dú)氨基酸替換外與第一參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中該第一參考氨基酸序列包含SEQ ID N0:49的氨基酸27-310而該第二參考氨基酸序列包含SEQ ID N0:49的氨基酸27-310，或其中其中該第一參考氨基酸序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸27-344而該第二參考氨基酸序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸27-310，或其中該第一參考氨基酸序列包含SEQ ID NO: 49的氨基酸27-344而該第二參考氨基酸序列包含SEQ ID NO: 49的氨基酸27-344。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了該第一多肽片段位于該第二多肽片段的上游。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了在第一多肽片段和第二多肽片段之間的肽接頭。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了該肽接頭包含SEQ ID N0:65(G4S)3o在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了該肽接頭包含 SEQ ID N0:66(G4S)2。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的多肽，其中至少一個(gè)半胱氨酸殘基被外源氨基酸替換。在部分實(shí)施方式中，該至少一個(gè)半胱氨酸殘基為C266。在部分實(shí)施方式中，該至少一個(gè)半胱氨酸殘基為C309。在部分實(shí)施方式中，該至少一個(gè)半胱氨酸殘基為C335。在部分實(shí)施方式中，該至少一個(gè)半胱氨酸殘基位于C336。在部分實(shí)施方式中，該至少一個(gè)半胱氨酸殘基被選自丙氨酸，絲氨酸和蘇氨酸的氨基酸替換。在部分實(shí)施方式中，該替換氨基酸為丙氨酸。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離多肽，其包含:(a)除了參考氨基酸序列中至少一個(gè)半胱氨酸殘基被不同氨基酸替換外，與所述參考序列一致的氨基酸序列，其中所述的參考氨基酸序列選自如下組合:(i) SEQ ID N0:49的氨基酸a-445，(ii)SEQ IDNO:49的氨基酸27-b，以及(iii)SEQ ID NO:49的氨基酸a-b，其中a為由25至35的任意整數(shù)，而b是由300至450的任意整數(shù)；以及(b)外源多肽；其中所述的多肽抑制Nogo-受體介導(dǎo)的神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述的參考氨基酸序列的C266被不同氨基酸替換。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述的參考氨基酸序列的C309被不同氨基酸替換。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述的參考氨基酸序列的C335被不同氨基酸替換。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述的參考氨基酸序列的C266和C309被不同氨基酸替換。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述的參考氨基酸序列的C309和C335被不同氨基酸替換。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了該不同的氨基酸為丙氨酸。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離多肽，其包含:(a)除了最多二十個(gè)單獨(dú)氨基酸替換外與參考序列一致的氨基酸序列，其中所述的參考氨基酸序列選自如下組合:(i)SEQ ID NO: 49 的氨基酸 a-445，(ii) SEQ ID NO: 49 的氨基酸 27_b，以及(iii) SEQID NO: 49的氨基酸a-b，其中a為由25至35的任意整數(shù)，而b是由300至450的任意整數(shù)；以及(b)外源多肽；其中所述的多 肽抑制Nogo-受體介導(dǎo)的神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分離多肽，其中所述的第一多肽片段包含除了最多二十個(gè)單獨(dú)氨基酸替換外與第一參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第一參考氨基酸序列選自如下組合:(a) SEQ IDNO:60的氨基酸a-305，(b)SEQ ID NO: 60的氨基酸l_b，以及(c) SEQID NO: 60的氨基酸a_b，其中a為由I至27的任意整數(shù)，而b是由264至309的任意整數(shù)；并且其中所述的第二多肽片段包含了除了最多二十個(gè)單獨(dú)氨基酸替換外與第二參考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第二參考氨基酸序列選自如下組合:(a) SEQID N0:49的氨基酸c-332，(b) SEQ IDN0:49的氨基酸275-d，以及(c)SEQ ID NO:49的氨基酸c_d，其中c為由265至306的任意整數(shù)，而d是由308至340的任意整數(shù)；并且其中所述的多肽抑制Nogo-受體介導(dǎo)的神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制。在特定的實(shí)施方式中，該第一參考氨基酸序列選自如下組合:(a) SEQ ID NO: 49的氨基酸1-274;以及(b)SEQ ID NO:49的氨基酸1-305。在特定的實(shí)施方式中，該第二參考氨基酸序列選自如下組合:(a) SEQ ID NO:60的氨基酸275-311 ;(b) SEQ ID N0:60的氨基酸 275-332 ; (c) SEQ ID NO: 60 的氨基酸 306-311 ; (d) SEQ ID NO: 60 的氨基酸 306-308 ;以及(e)SEQID NO:60的氨基酸306-309。在一種實(shí)施方式中，該第一多肽片段序列包含SEQID NO:49的氨基酸1-274而該第二多肽片段包含SEQ ID N0:60的氨基酸275-311。在部分實(shí)施方式中，該第一多肽片段序列包含SEQ ID NO: 49的氨基酸1-274而該第二多肽片段包含SEQID NO: 60的氨基酸275-332。在部分實(shí)施方式中，該第一多肽片段序列包含SEQ IDNO:49的氨基酸1-305而該第二多肽片段包含SEQID NO:60的氨基酸306-308。在部分實(shí)施方式中，該第一多肽片段序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸1-305而該第二多肽片段包含SEQID NO:60的氨基酸306-309。在部分實(shí)施方式中，至少一個(gè)附加氨基酸被添加至第二多肽片段的C-末端。在一種實(shí)施方式中，該至少一個(gè)附加氨基酸為色氨酸。在部分實(shí)施方式中，該第一多肽片段的A269被不同的氨基酸替換。在一種實(shí)施方式中，該不同的氨基酸為色氨酸。在部分實(shí)施方式中本發(fā)明提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分離多肽，其中所述的第一多肽片段除了不超過(guò)二十個(gè)單獨(dú)氨基酸替換外由SEQ ID N0:49的氨基酸1-310組成；且其中所述的第二多肽片段除了不超過(guò)五個(gè)單獨(dú)氨基酸替換外由SEQIDNO:60的氨基酸311-318組成；并且其中所述的多肽抑制nogo-受體-介導(dǎo)的神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制。在部分實(shí)施方式中本發(fā)明進(jìn)一步提供了該外源多肽選自以下組合:(a)血清白蛋白，(b)Fc區(qū)，(C)信號(hào)肽，(d)多肽標(biāo)記，以及(e)兩種或多種所述外源多肽的組合。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了該Fe區(qū)選自如下組合:IgA Fe區(qū)；IgD Fe區(qū)；IgG Fe區(qū)；IgE Fe區(qū)以及IgM Fe區(qū)。在一種實(shí)施方式中，該Fe區(qū)為IgG Fe區(qū)。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了介于該氨基酸序列和IgG Fe區(qū)之間的肽接頭。在部分實(shí)施方式中，該肽接頭包含了 SEQ ID N0:66(G4S)2。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了該多肽標(biāo)記選自如下組合=FLAG標(biāo)記；Str印標(biāo)記 ’聚組氨酸標(biāo)記；VSV_G標(biāo)記；流感病毒血凝素(HA)標(biāo)記；以及c-Myc標(biāo)記。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了與一種或多種聚烷撐二醇部分連接的本發(fā)明多肽。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了該一種或多種聚烷撐二醇部分為聚乙二醇(PEG)部分。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了與1-5PEG部分連接的本發(fā)明多肽。在部分實(shí)施方 式中，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明多肽的分離多聚核苷酸。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了該核苷酸序列被可操作地連接至表達(dá)控制元件(例如，可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，組成型啟動(dòng)子，或分泌信號(hào))。附加的實(shí)施方式包括包含本發(fā)明分離多聚核苷酸的載體以及包含所述載體的宿主細(xì)胞。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了選自如下組合的分離多聚核苷酸:(i)反義多聚核苷酸；(ii)核酶；(iii)小干擾RNA(siRNA);以及(iv)小發(fā)夾RNA (shRNA)。在部分實(shí)施方式中，多聚核苷酸為包含了與NgRl mRNA編碼部分互補(bǔ)的至少10個(gè)堿基的反義多聚核苷酸。在部分實(shí)施方式中，該多聚核苷酸為核酶。在更進(jìn)一步的實(shí)施方式中，該多聚核苷酸為SiRNA或shRNA。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了該siRNA或shRNA抑制NgRl表達(dá)。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了該 siRNA 或 shRNA 與包含了 CUACUUCUCCCGCAGGCG 或 CCCGGACCGACGUCUUCAA或CUGACCACUGAGUCUUCCG的核苷酸序列至少有90 %的一致性。在另一實(shí)施方式中，該 siRNA 或 shRNA 核苷酸序列為 CUACUUCUCCCGCAGGCG 或 CCCGGACCGACGUCUUCAA 或CUGACCACUGAGUCUUCCG。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了該siRNA或shRNA核苷酸序列與多聚核苷酸序列 GATGAAGAGGGCGTCCGCT 或 GGGCCTGGCTGCAGAAGTT 或 GACTGGTGACTCAGAG AAGGC 生成的mRNA互補(bǔ)。本發(fā)明的附加實(shí)施方式包括藥物組合物，其包括本發(fā)明的多肽，多聚核苷酸，載體或宿主細(xì)胞并在特定的實(shí)施方式中包括藥學(xué)可接受的載體。在特定的實(shí)施方式中，該組合物包含SEQ IDNO: 7的氨基酸27-310以及抗炎劑。在另一實(shí)施方式中，該組合物包含SEQID N0:9的氨基酸27-310以及抗炎劑。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了該抗炎劑選自由留體抗炎劑和非留體抗炎劑構(gòu)成的組合。在特定的實(shí)施方式中，該留體抗炎劑選自如下組合:氫化可的松，21-醋酸基娠烯醇酮，阿氯米松，阿爾孕酮，安西奈德，丙酸倍氯米松，倍他米松，倍他米松戊酸，布地奈德，氯潑尼松，丙酸氯倍他索，丙酸氯倍他索，氯倍他松，氯倍他松丁酸鹽，氯可托龍，氯潑尼醇，皮質(zhì)酮，可的松，可的伐唑，deflazacon,地奈德，去羥米松，地塞米松，二氟拉松，二氟可龍，二氟潑尼酯，甘草次酸，氟扎可特，氟氯奈德，氟美松，新戊酸氟米松，氟尼縮松，氟輕松曲安縮松，醋酸氟輕松，氟氫松醋酸酯曲安縮松，氟可丁丁酯，氟考龍，氟考龍己酸鹽，二氟可龍戊酸鹽，氟米龍，氟培龍醋酸鹽，醋酸氟潑尼定，氟潑尼龍，氟氫縮松，氟甲酰龍，哈西奈德，齒美他松，齒潑尼松醋酸鹽，氫可他酯，氫化可的松，醋酸氫化可的松，丁酸氫化可的松，氫化可的松磷酸鹽，氫化可的松，21-琥珀酸鈉，氫化可的松叔丁乙酸鹽，馬潑尼酮，甲羥松，甲基強(qiáng)的松，甲潑尼龍，糠酸莫米松，帕拉米松，潑尼卡酯，強(qiáng)的松，強(qiáng)的松龍21-diedryaminoacetate,潑尼松龍磷酸鈉,醋酸潑尼松龍琥拍酸鈉，強(qiáng)的松龍鈉21-m-苯磺酸，強(qiáng)的松龍鈉21-硬脂酸乙醇酸酯，叔丁乙酸鹽強(qiáng)的松，強(qiáng)的松龍21-三甲基乙酸鹽，潑尼松，潑尼松龍戊酸酯，潑尼立定，潑尼立定21- 二乙氨基醋酸鹽，替可的松，曲安西龍，曲安西龍曲安縮松，苯曲安奈德和己曲安奈德。在特定的實(shí)施方式中，該甾體抗炎劑為甲潑尼龍。在另一實(shí)施方式中，該非留體抗炎劑選自如下組合:阿明洛芬，苯惡洛芬，布氯酸，卡布洛芬，芬布芬，非諾洛芬，氟洛芬，氟比洛芬，布洛芬，吲哚洛芬，酮洛芬，咪洛芬，萘普生，奧沙普秦，吡洛芬，普拉洛芬，舒洛芬，噻洛芬酸，硫惡洛芬，吲哚美辛，阿西美辛，阿氯芬酸，環(huán)氯茚酸，雙氯芬酸，芬氯酸，芬克洛酸，芬替酸，呋羅芬酸，異丁芬酸，伊索克酸，oxpinac,舒林酸，硫平酸，托美汀，齊多美辛，佐美酸，氟芬那酸，甲氯芬那酸酸，甲芬那酸，尼氟滅酸，托芬那酸，二氟尼柳，氟苯沙酸，伊索昔康，吡羅昔康，舒多昔康，替諾昔康，乙酰水楊酸，柳氮磺胺批唳，阿扎丙宗，bezpiperylon,非普拉宗,莫非布宗,輕基保泰松和苯乙丁氮酮。附加的實(shí)施方式包括組合物，其中SEQ ID NO: 7或9的氨基酸27-310被融合至外源多肽。在部分實(shí)施方式中，該外源多肽為Fe。本發(fā)明的實(shí)施方式還包括促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)的方法，其包括將神經(jīng)元與包含本發(fā)明的多肽，多聚核苷酸或組合物的藥劑相接觸，其中所述的藥劑抑制Nogo受體I介導(dǎo)的神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制。附加實(shí)施方式包括抑制NgRl信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，其包括將神經(jīng)元與有效量的包含本發(fā)明的多肽，多聚核苷酸或組合物的藥劑相接觸，其中所述的藥劑抑制NgRl信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。其它實(shí)施方式包括在哺乳動(dòng)物中治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病，素亂或損傷的方法，其包括向需要該種治療的哺乳動(dòng)物施用有效量的包含本發(fā)明的多肽，多聚核苷酸或組合物的藥劑相接觸， 其中所述的藥劑抑制Nogo受體I介導(dǎo)的神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制。在特定的實(shí)施方式中，該疾病，紊亂或損傷選自如下組合:多發(fā)性硬化癥，ALS，亨廷頓病，阿爾茨海默病，帕金森氏病，糖尿病神經(jīng)病變，中風(fēng)，外傷性腦損傷，脊髓損傷，視神經(jīng)炎，青光眼，聽(tīng)力喪失以及腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良。在部分實(shí)施方式中本發(fā)明進(jìn)一步提供了該多肽被融合至外源多肽。在部分實(shí)施方式中，該外源多肽為血清白蛋白。在部分實(shí)施方式中，該外源多肽為Fe區(qū)。在部分實(shí)施方式中，該外源多肽為信號(hào)肽。在部分實(shí)施方式中，該外源多肽為多肽標(biāo)記。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了該Fe區(qū)選自如下組合:IgA Fe區(qū)；IgD Fe區(qū)；IgG Fe區(qū)；IgE Fe區(qū)以及IgM Fe區(qū)。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了該多肽標(biāo)記選自如下組合:Flag標(biāo)記；Str印標(biāo)記；聚組氨酸標(biāo)記；VSV-G標(biāo)記；流感病毒血凝素(HA)標(biāo)記；以及c-Myc標(biāo)記。


圖1為Nogo受體-1的結(jié)構(gòu)示意圖。人sNogoR310包含SEQ ID NO: 7的殘基26-310而 sNogoR344 包含 SEQ ID NO:6 的殘基 26-344。大鼠 sNogoR310 包含 SEQ ID N0:9 的殘基27-310 而 sNogoR344 包含 SEQ ID NO:8 的殘基 27-344。圖2顯示了通過(guò)Vector Nti軟件獲得的Nogo受體-1蛋白的抗原性圖。大鼠P-617為 SEQ ID N0:10 而大鼠 P-618 為 SEQID NO: 11。人 P-617 為 SEQ ID NO:47 而人 P-618 為SEQ ID NO:48。圖3A顯示了抗-Nogo受體-1抗體7E11的結(jié)合活性。該圖顯示了 7E11濃度對(duì)Nogo66與Nogo受體-1結(jié)合的影響。圖3B顯示了抗-Nogo受體-1抗體1H2的結(jié)合活性。該圖顯示了 1H2濃度對(duì)Nogo66與sNogoR344-Fc (在此處和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)60/402，866中也稱(chēng)為Fc_sNogoR344或Ig_sNogoR344)結(jié)合的影響。Fc-MAG不與Nogo66競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合sNogoR344-Fco圖4顯示了抗No go-R-1抗體1H2，3G5和2F7的ELISA結(jié)果?？贵w在固定化抗原存在下對(duì)OD45tl的作用得到了檢測(cè)。該固定化抗原為sNogoR310-FC (在此處和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng) 60/402，866 中也稱(chēng)為 Fc_sNogoR310 或 Ig_sNogoR310)，sNogoR344_Fc，p-617, p-618,P-4, p-5和卵白蛋白以及BSA。圖5顯示了單克隆抗體7E11在不同數(shù)量的髓磷脂存在下對(duì)大鼠DRG神經(jīng)突生長(zhǎng)的作用。圖6A顯示了在如下競(jìng)爭(zhēng)者存在下sNogoR310與125I_Nogo66或125I_Nogo40的結(jié)合作用:Nogo66, Nogo40以及抗-Nogo受體-1單克隆抗體上清液。圖6B顯不了 125I_Nogo66與sNogoR310的結(jié)合活性。圖7 顯不了 sNogoR310_Fc 對(duì) 125I_Nogo40 與 sNogoR310 結(jié)合的作用。圖8 顯示了 sNogoR310_Fc 與 125I_Nogo40 的結(jié)合活性。圖9A顯示了 sNogoR310在髓磷脂存在或缺失的情況下對(duì)神經(jīng)突生長(zhǎng)/細(xì)胞的作用。圖9B顯示了 sNogoR310在髓磷脂存在或缺失的情況下對(duì)神經(jīng)突生長(zhǎng)的作用。圖1OA顯示了 sNogoR310_Fc在持續(xù)增多的髓磷脂的存在或缺失下對(duì)大鼠DRG神經(jīng)突生長(zhǎng)的作用。圖1OB顯示了在以PBS，PBS+sNogoR310-Fc，20ng髓磷脂和髓磷脂+sNogoR3IO-Fc處理后的神經(jīng)突/細(xì)胞數(shù)。
圖11顯示了單克隆抗體5B10在持續(xù)增多的髓磷脂存在下對(duì)DRG神經(jīng)突生長(zhǎng)/細(xì)胞的作用。圖12顯示了在大鼠脊髓橫切模型中直至誘導(dǎo)損傷后30日內(nèi)sNOgOR310-Fc對(duì)BBB評(píng)分的作用。圖13A和13B報(bào)導(dǎo)了 WT或轉(zhuǎn)基因小鼠品系08或品系01進(jìn)行脊髓半切后運(yùn)動(dòng)BBB評(píng)分隨時(shí)間的變化。圖13C顯示了 WT和轉(zhuǎn)基因小鼠損傷后最大容忍傾斜角度隨時(shí)間的變化。圖13D顯示了傾斜網(wǎng)格爬升過(guò)程中后肢錯(cuò)誤隨損傷后時(shí)間的變化。在所有的圖中均報(bào)導(dǎo)了每組7-9只小鼠的平均土s.e.m.。轉(zhuǎn)基因組的值與WT小鼠的值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(雙星號(hào)，P〈0.01 ;學(xué)生t檢驗(yàn))。圖14A顯示了在溶媒或sNOgOR310-Fc處理動(dòng)物進(jìn)行脊髓半切后運(yùn)動(dòng)BBB評(píng)分隨時(shí)間的變化。圖14B顯示了網(wǎng)格行走過(guò)程中后肢錯(cuò)誤隨損傷后時(shí)間的變化。圖14C顯示的足跡分析揭示了對(duì)照小鼠比未損傷或損傷+sNOgOR310-Fc大鼠具有更短的步長(zhǎng)和更大的步幅。在所有的圖中均報(bào)導(dǎo)了每組7-9只大鼠的平均土 s.e.m.。sNogoR310-Fc組的值與對(duì)照的值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖14A-B)。在圖14C中的對(duì)照值和無(wú)SCI或SCI+sNogoR310-Fc大鼠的值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(星號(hào)，P〈0.05 ;雙星號(hào)，p〈0.01 ;學(xué)生t檢驗(yàn))。圖15顯示了抗-rNgRl抗體1D9與大鼠NgRl的可溶性片段(srNgR310)的結(jié)合模型。圖16A顯示了人Nogo受體cDNA的核苷酸序列。在起始和終止密碼子下添加了下劃線。選定的RNAi靶區(qū)以斜體表示。RNA1-1和RNA1-3特異性靶向人NgR基因，所設(shè)計(jì)的RNA1-2靶向人，小鼠和大鼠NgR基因。圖16B顯示了用于將NgR RNAi構(gòu)建進(jìn)入表達(dá)載體PU6的DNA寡聚核苷酸的核苷酸序列。圖17顯示了在小鼠L細(xì)胞中RNAi阻抑的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染測(cè)試的結(jié)果。

圖18顯示了人NgR表達(dá)載體對(duì)SKN和293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。圖19顯示了人SKN細(xì)胞中RNAi阻抑的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染測(cè)試。圖20顯示了 RNAi慢病毒載體的示意圖。該RNAi表達(dá)盒可插入PacI位點(diǎn)或EcoRI位點(diǎn)。LTR-長(zhǎng)末端重復(fù)；RRE-Rev應(yīng)答元件；cPPT_中央聚嘌呤通道；CBA_雞β肌動(dòng)蛋白；WPRE-旱獺肝炎轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件；SIN LTR-自我失活型LTR。圖21顯示了以7E11抗體驗(yàn)證克隆Neuroscreen細(xì)胞中NgRl阻抑的western印跡分析。圖22顯示了以LV(克隆#3G9,1E51E91E10)，LV-NgRRNAi或原態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的克隆NeuroScreen細(xì)胞中NgR表達(dá)的概括。Western印跡中的NgR和GAPDH信號(hào)通過(guò)光密度掃
描進(jìn)行定量。圖23顯示了通過(guò)不同的NgR阻抑水平構(gòu)建的四種NeuroScreen細(xì)胞克隆。NgR表達(dá)表示為原態(tài)NeuroScreen細(xì)胞中NgR:GAPDH信號(hào)比例的百分比。圖24A-B 顯示了融合至大鼠 IgG[NgR(310) ecto-Fc]的大鼠 NgRl (27-310)胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域和甲潑尼龍(MP)在體外對(duì)髓磷脂誘導(dǎo)的雞背根神經(jīng)節(jié)(DRGs)中神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制的作用。(A)將分離胚胎13天的雞背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元在NgR(310) ecto-Fc或NgR(310)ecto-Fc存在下置于磷酸鹽緩沖液(PBS)或髓磷脂(400ng/微孔)中。(B)以PBS對(duì)照土 SEM (η-3)百分比表示的每個(gè)細(xì)胞(Π-3)神經(jīng)突生長(zhǎng)的定量。比例尺，200 μ m。與PBS對(duì)照比較P〈0.05。圖25A-E 顯示了融合至大鼠 IgG[NgR(310) ecto-Fc]的大鼠 NgRl (27-310)胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域和甲潑尼龍(MP)對(duì)脊髓損傷(SCI)后功能性恢復(fù)的作用。㈧在4周內(nèi)每周記錄BBB評(píng)分。(B) SCI后兩天MP-處理大鼠中的BBB評(píng)分。(C)對(duì)單獨(dú)動(dòng)物的BBB評(píng)分歸一化至第二日。(D) —致性腳掌行走頻率和后肢-前肢協(xié)調(diào)性，顯示了 SCI后3和4周獲得14或更高評(píng)分的各組中的大鼠比例。(E) NgR(310) ecto-Fc-和MP+NgR(310) ecto-Fc-處理組的平均步長(zhǎng)與對(duì)照的比較。圖26A-B 顯示了融合至大鼠 IgG[NgR(310) ecto-Fc]的大鼠 NgRl (27-310)胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域和甲潑尼龍(MP)處理對(duì)尾部至脊髓損傷后軸突數(shù)量的作用。圖27顯示了融合至大鼠IgG[NgR(310) ecto-Fc]的大鼠NgRl (27-310)胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域和甲潑尼龍(MP)處理對(duì)接觸腹角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的生物素葡聚糖胺(BDA)-標(biāo)記的軸突數(shù)量的作用。
發(fā)明詳述 定義及通用技術(shù)除非另行說(shuō)明，此處所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)的含義等同于本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員的普遍理解。在產(chǎn)生沖突的情況下，將受本申請(qǐng)包括定義所支配。此外，除非上下文另行指明，單數(shù)形式的術(shù)語(yǔ)可包括復(fù)數(shù)形式，而復(fù)數(shù)形式的術(shù)語(yǔ)可包括單數(shù)形式。此處涉及的所有出版物，專(zhuān)利及其它參考文獻(xiàn)均以全部目的在此全文引用作為參考。盡管其它與此處所述類(lèi)似或等同的方法和材料也可用于對(duì)本發(fā)明的實(shí)施或測(cè)試，下文描述了適用的方法和材料。該材料，方法和實(shí)施例僅作闡釋目的，并非意在限制。從具體描述和權(quán)利要求中可顯而易見(jiàn)地得到本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢(shì)。在整個(gè)說(shuō)明書(shū)和權(quán) 利要求中，術(shù)語(yǔ)“包含”及其變體應(yīng)理解為包括了任何所列舉的整體或整體組合，但排除了任何其它整體或整體組合。為進(jìn)一步明確本發(fā)明，此處提供了下列術(shù)語(yǔ)和定義。應(yīng)當(dāng)注意術(shù)語(yǔ)“一個(gè)”或“一種”實(shí)體指一個(gè)或多個(gè)該種實(shí)體；例如，“一種免疫球蛋白分子”應(yīng)理解為代表一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白分子。因此，術(shù)語(yǔ)“一個(gè)”(或“一種”)，“一個(gè)或多個(gè)”以及“至少一個(gè)”在此處可進(jìn)行互換。在整個(gè)說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中，術(shù)語(yǔ)“由…組成”及其變體指包括了任何所列舉的整體或整體組合，但該特定的方法，結(jié)構(gòu)或組合物中不可加入其它的整體或整體組合。在整個(gè)說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中，術(shù)語(yǔ)“基本由…組成”及其變體指包括了任何所列舉的整體或整體組合，且選擇性地包含了不會(huì)實(shí)質(zhì)改變特定的方法，結(jié)構(gòu)或組合物的基礎(chǔ)或新穎性能的整體或整體組合。”此處所用的“抗體”指完整的免疫球蛋白，或其抗原結(jié)合片段。本發(fā)明的抗體可屬于任何同型或類(lèi)別(例如，M，D，G，E和A)或任何亞類(lèi)(例如，Gl-4，A1-2)，并可具有kappa (K)或 lambda ( λ )輕鏈。此處所用的“Fe”指包含一種或多種重鏈恒定區(qū)CHl，CH2和CH3的免疫球蛋白重鏈部分。例如，抗體的重鏈恒定區(qū)的一部分可通過(guò)木瓜蛋白酶獲得。此處所述的“NogoR融合蛋白”指包含融合至外源多肽的可溶性Nogo受體-1部分的蛋白。
此處所用的“人源化抗體”指至少部分非人源序列被人源序列替換的抗體。如何制備人源化抗體的范例可參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利6，054, 297，5，886，152以及5，877，293。此處所用的“嵌合抗體”指包含了一個(gè)或多個(gè)來(lái)自第一抗體的區(qū)域并包含了一個(gè)或多個(gè)來(lái)自另一抗體的區(qū)域的抗體。該第一抗體和附加抗體可來(lái)自相同或不同物種。如此處和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)60/402，866所用，“Nogo受體”，“NogoR”，“NogoR-1 ”，“NgR”，“NgR-1 ”，“NgRl ” 以及 “NGR1 ” 均指 Nogo 受體-1。此處所用的術(shù)語(yǔ)“多肽”同時(shí)包括了單數(shù)和復(fù)數(shù)的“多肽”，并指由酰胺鍵(也稱(chēng)作肽鍵)線性連接的單體(氨基酸)所組成的一種分子。術(shù)語(yǔ)“多肽”指任何兩個(gè)或多個(gè)氨基酸的鏈，且不指定產(chǎn)物的具體長(zhǎng)度。因此，肽，二肽，三肽，寡肽，“蛋白”，“氨基酸鏈”或任何其它指代兩個(gè)或多個(gè)氨基酸鏈的術(shù)語(yǔ)都包含在“多肽”的定義之內(nèi)，且術(shù)語(yǔ)“多肽”可取代任何上述術(shù)語(yǔ)或與之互換。術(shù)語(yǔ)“多肽”還指多肽表達(dá)后修飾的產(chǎn)物，該種修飾包括但不限于糖基化，乙?；?，磷酸化，酰胺化，通過(guò)已知的保護(hù)/阻斷基團(tuán)進(jìn)行衍生化，蛋白水解裂解，或通過(guò)非天然存在的氨基酸進(jìn)行修飾。多肽可衍生自天然的生物來(lái)源或通過(guò)重組技術(shù)生產(chǎn)，但不一定需要翻譯自指定的核酸序列。它可通過(guò)任何方式生成，包括化學(xué)合成。本發(fā)明的多肽的大小約為3個(gè)或更多，5個(gè)或更多，10個(gè)或更多，20個(gè)或更多，25個(gè)或更多，50個(gè)或更多，75個(gè)或更多，100個(gè)或更多，200個(gè)或更多，500個(gè)或更多，1000個(gè)或更多，或者2000個(gè)或更多的氨基酸。多肽可具有一種指定的三維結(jié)構(gòu)，但并非必須具有該種結(jié)構(gòu)。具有指定三維結(jié)構(gòu)的多肽被稱(chēng)為折疊結(jié)構(gòu)，而不具有指定三維結(jié)構(gòu)，但可采用多種構(gòu)型的多肽被稱(chēng)為未折疊結(jié)構(gòu)。此處所用的術(shù)語(yǔ)糖蛋白指一種至少與一個(gè)糖部分連接的蛋白，該糖部分通過(guò)一種氨基酸殘基(例如絲氨酸殘基或天冬氨酸殘基)的含氧或含氮側(cè)鏈與蛋白連接?！胺蛛x的”多肽或其片段，變體或衍生物指一種不存在于其天然環(huán)境中的多肽。不要求達(dá)到特定的純化水平。例如，一種分離的多肽可取自其自然的或天然的環(huán)境中。在宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組生產(chǎn)的多肽和蛋白被認(rèn)為對(duì)于本發(fā)明的目的而言是分離的，因?yàn)樗鼈兪峭ㄟ^(guò)任何合適的技術(shù)分離，分割，或者部分或充分純化的天然或重組多肽。在本發(fā)明中，“多肽片段”指更大多肽的短氨基酸序列。蛋白片段可以是“獨(dú)立式的”或是包含在更大的多肽中(該片段作為其部分)。本發(fā)明的多肽片段的代表性范例包括，例如，包含約5個(gè)氨基酸，約10個(gè)氨基酸，約15個(gè)氨基酸，約20個(gè)氨基酸，約30個(gè)氨基酸，約40個(gè)氨基酸，約50個(gè)氨基酸，約60個(gè)氨基酸，約70個(gè)氨基酸，約80個(gè)氨基酸，約90個(gè)氨基酸，以及約100個(gè)氨基酸或長(zhǎng)度更長(zhǎng)的片段。術(shù)語(yǔ)“片段”，“變體”，“衍生物”及“類(lèi)似物”在指本發(fā)明的多肽時(shí)包括任何至少保留了部分生物活性的任意多肽。只要該多肽仍然能發(fā)揮功能，此處所述的多肽可不受限制地包括其片段，變體或衍生物。本發(fā)明的可溶性NgRl多肽可包括水解片段，刪除片段并特別包括傳遞至動(dòng)物時(shí)更容易到達(dá)作用位點(diǎn)的片段。多肽片段進(jìn)一步包括包含了天然多肽抗原性或免疫原性表位(包括線性和三維表位)的任意多肽部分。本發(fā)明的可溶性NgRl多肽和多肽片段包括變體區(qū)，包括如上所述的片段，以及具有由氨基酸替換，缺失或插入所得的變更氨基酸序列的多肽。變體可天然產(chǎn)生，例如等位基因變體?！暗任换颉敝刚紦?jù)了有機(jī)體的染色體上給定位點(diǎn)的基因的副本。Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, NewYork(1985). 非天然存在的變體可通過(guò)本領(lǐng)域已知的突變技術(shù)制備。本發(fā)明的NgRl多肽和多肽片段可包含保守或非保守氨基酸替換，缺失或添加。本發(fā)明的NgRl多肽和多肽片段還可包含衍生分子。變體多肽在此也可稱(chēng)為“多肽類(lèi)似物”。此處所用的多肽或多肽片段“衍生物”指具有一個(gè)或多個(gè)經(jīng)過(guò)功能性側(cè)基團(tuán)反應(yīng)化學(xué)衍生得到的殘基的主體多肽?！把苌铩边€包括包含了二十個(gè)標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的一個(gè)或多個(gè)天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如，4-羥基脯氨酸可取代脯氨酸；5_羥基賴氨酸可取代賴氨酸；3_甲基組氨酸可取代組氨酸；高絲氨酸可取代絲氨酸；以及鳥(niǎo)氨酸可取代賴氨酸。此處所用的術(shù)語(yǔ)“二硫鍵”包括了兩個(gè)硫分子間形成的共價(jià)鍵。氨基酸半胱氨酸包含了能與另一硫醇基團(tuán)形成二硫鍵或橋的硫醇基團(tuán)。此處所用的“融合蛋白”指包含了通過(guò)肽鍵可操作地連接至第二多肽的第一多肽的蛋白。該第一多肽和第二多肽可相同或不同，且它們可直接連接或通過(guò)肽接頭進(jìn)行連接(見(jiàn)下文)。術(shù)語(yǔ)“多聚核苷酸”包括了單數(shù)或復(fù)數(shù)的核酸，并指分離的核酸分子或構(gòu)建體，例如，信使RNA (mRNA)或質(zhì)粒DNA (pDNA)。多聚核苷酸和包含全長(zhǎng)cDNA序列的核苷酸序列，包括未翻譯的5’和3’序列，編碼序列。多聚核苷酸可包括常規(guī)的磷酸二酯鍵或非常規(guī)的鍵(例如，于肽核酸(PNA)等發(fā)現(xiàn)的酰胺鍵)。多聚核苷酸可由可以是未修飾RNA或DNA或是修飾后的RNA或DNA的任何多聚核糖核苷酸或多聚脫氧核苷酸組成。例如，多聚核苷酸可由單鏈和雙鏈DNA，由單鏈和雙鏈區(qū)混合得到的DNA，單鏈和雙鏈RNA，以及由單鏈和雙鏈區(qū)混合得到的RNA，包含了可能是單鏈，或者更典型為雙鏈或單鏈和雙鏈區(qū)混合物的DNA和RNA的雜交分子所組成。此外，該多聚核苷酸可由包含RNA或DNA或者同時(shí)包含RNA和DNA的三鏈區(qū)所組成。多聚核苷酸還可包含為穩(wěn)定或?yàn)槠渌康倪M(jìn)行修飾的一個(gè)或多個(gè)修飾堿基或者DNA或RNA骨架?！靶揎椀摹眽A基包括，例如，三苯甲基化堿基和異常堿基如肌苷。DNA和RNA可進(jìn)行多種修飾；因此，“多聚核苷酸”包括了化學(xué)，酶或代謝修飾的形式。術(shù)語(yǔ)“核酸”指在多聚核苷酸中存在的任何一個(gè)或多個(gè)核酸片段，例如DNA或RNA片段。“分離的”核酸或多聚核苷酸指從其天然環(huán)境中分離的核酸分子，DNA或RNA。例如，包含在載體中的一種編 碼NgR多肽或多肽片段的重組多聚核苷酸被認(rèn)為對(duì)于本發(fā)明的目的而言是分離的。分離多聚核苷酸的進(jìn)一步范例包括存在于外源宿主細(xì)胞中的重組多聚核苷酸或在溶液中(部分或完全)純化的多聚核苷酸。分離的RNA分子包括對(duì)本發(fā)明多聚核苷酸的體內(nèi)或體外RNA轉(zhuǎn)錄物。如本發(fā)明所述的分離的多聚核苷酸或核酸進(jìn)一步包括合成制備的該種分子。此外，多聚核苷酸或核酸可以是啟動(dòng)子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)或轉(zhuǎn)錄終止子等調(diào)節(jié)元件或是包含該種調(diào)節(jié)元件。此處所用的“編碼區(qū)”指由翻譯氨基酸的密碼子組成的一部分核酸。盡管“終止密碼子”(TAG，TGA，或TAA)不翻譯成氨基酸，它仍可被認(rèn)為是編碼區(qū)的一部分，但如啟動(dòng)子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄終止子等側(cè)翼序列不是編碼區(qū)的一部分。本發(fā)明的兩個(gè)或多個(gè)編碼序列可存在于一個(gè)單獨(dú)的多聚核苷酸構(gòu)建體(例如，單獨(dú)的載體)中或分離的多聚核苷酸構(gòu)建體(例如，分離的(不同)載體)中。此外，任何載體可包含一個(gè)單獨(dú)的編碼區(qū)，或包含兩個(gè)或多個(gè)編碼區(qū)，例如，一種單獨(dú)載體可分別編碼一種免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)和一種免疫球蛋白的輕鏈可變區(qū)。此外，本發(fā)明的載體，多聚核苷酸或核酸可編碼與編碼本發(fā)明NgR多肽或多肽片段的核酸融和或未融合的外源編碼區(qū)。外源編碼區(qū)包括但不限于專(zhuān)門(mén)的元件或基序，例如分泌信號(hào)肽或外源功能性區(qū)域。
在特定的實(shí)施例中，該多聚核苷酸或核酸為DNA。當(dāng)為DNA時(shí)，一種包含了編碼多肽的核酸的多聚核苷酸通常包括與一個(gè)或多個(gè)編碼區(qū)域可操作連接的一個(gè)啟動(dòng)子和/或其它轉(zhuǎn)錄或翻譯控制元件。可操作的連接指當(dāng)某種基因產(chǎn)物(例如，多肽)的編碼區(qū)域與一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)序列以一種特定方式連接時(shí)，基因產(chǎn)物的表達(dá)受到調(diào)節(jié)序列的影響或控制。如啟動(dòng)子功能的誘導(dǎo)可使mRNA的轉(zhuǎn)錄編碼目標(biāo)基因產(chǎn)物，并且如果兩個(gè)DNA片段之間的接頭的性質(zhì)不干擾表達(dá)調(diào)節(jié)序列引導(dǎo)基因產(chǎn)物表達(dá)的能力或干擾DNA模板被轉(zhuǎn)錄的能力，則兩個(gè)DNA片段(例如一個(gè)多肽編碼區(qū)域和與之連接的啟動(dòng)子)被“可操作地連接”。因此，如果一個(gè)啟動(dòng)子能夠影響一種編碼多肽的核酸的轉(zhuǎn)錄，則該啟動(dòng)子區(qū)域?qū)⒈豢刹僮鞯剡B接至該核酸。該啟動(dòng)子可以是一種僅能在預(yù)定細(xì)胞中引導(dǎo)DNA的充分轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞特異性啟動(dòng)子。除啟動(dòng)子外的其它轉(zhuǎn)錄控制元件，如增強(qiáng)子，操作子，阻遏子以及轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)可與多聚核苷酸進(jìn)行可操作連接以引導(dǎo)細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄。此處披露了合適的啟動(dòng)子和其它轉(zhuǎn)錄控制區(qū)。各種轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。其包括，但不限于，在脊椎動(dòng)物細(xì)胞中起作用的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域，例如，但不限于，來(lái)自細(xì)胞巨化病毒的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子片段(立即早期啟動(dòng)子，與內(nèi)含子-A相連接)，猿病毒40 (早期啟動(dòng)子)以及逆轉(zhuǎn)錄酶病毒(例如禽勞斯肉瘤病毒)。其它的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域包括衍生自肌動(dòng)蛋白，熱休克蛋白，牛生長(zhǎng)激素和兔球蛋白的脊椎動(dòng)物基因的區(qū)域以及其它能夠在真核細(xì)胞中控制基因表達(dá)的序列。其它合適的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域包括組織特異性啟動(dòng)子和增強(qiáng)子以及淋巴因子-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(例如，受干擾素或白介素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子)。類(lèi)似地，各種翻譯控制元件已為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知。其包括，但不限于核糖體結(jié)合位點(diǎn)，翻譯啟動(dòng)和終止密碼子以及衍生自小核糖核酸病毒的元件(特別是內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，或是IRES，也被稱(chēng)為CITE序列)。在其它的實(shí)施方式中，本發(fā)明的多聚核苷酸為RNA，例如，以信使RNA(mRNA)的形式存在。本發(fā)明的多聚核苷酸和核酸編碼區(qū)可與編碼分泌或信號(hào)肽的附加編碼區(qū)(引導(dǎo)本發(fā)明的多聚核苷酸編碼的多肽的分泌)相連接。根據(jù)信號(hào)假設(shè)，由哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌的蛋白具有一種信號(hào)肽或分泌型前導(dǎo)序列，后者在生長(zhǎng)蛋白鏈向粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的輸出被啟動(dòng)時(shí)從成熟蛋白上被裂解。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員均了解由脊椎動(dòng)物分泌的多肽通常具有融合到多肽N末端的信號(hào)肽，它從完整或“全長(zhǎng)”多肽序列裂解以生產(chǎn)分泌或“成熟”型多肽。在特定實(shí)施例中采用了如免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號(hào)肽等天然信號(hào)肽，或保留了引導(dǎo)與之可操作連接的多肽分泌能力的該序列的功能性衍生物。此外還可以使用外源哺乳動(dòng)物信號(hào)肽或其功能性衍生物。例如，野生型前導(dǎo)序列可被人組織型纖溶酶原激活劑(TPA)或小鼠β-葡萄糖醛酸酶的前導(dǎo)序列替換。此處所用的術(shù)語(yǔ)“工程改造的”包括通過(guò)人工方法(例如，通過(guò)重組技術(shù)，體外肽合成，肽的酶催化或化學(xué)偶合或是這些技術(shù)的組合)處理核酸或多肽分子。此處所用的術(shù)語(yǔ)“連接的”，“融合的”或“融合”可相互替換。這些術(shù)語(yǔ)指通過(guò)化學(xué)連接或重組技術(shù)等任何方法連接兩個(gè)或多個(gè)元件或成分?！翱騼?nèi)融合”指以能夠維持原始開(kāi)放閱讀框架(ORFs)的正確翻譯閱讀框的方式連接兩個(gè)或多個(gè)多聚核苷酸ORFs以形成一個(gè)更長(zhǎng)的連續(xù)0RF。因此， 重組融合蛋白是一種含有兩個(gè)或更多與原始ORFs所編碼的多肽相應(yīng)的片段的單獨(dú)蛋白(該片段一般在天然狀態(tài)下不進(jìn)行該種連接)。盡管該閱讀框架在融合片段中彼此連續(xù)，該片段可被框內(nèi)接頭序列等序列物理或空間分隔?！敖宇^”序列指在融合蛋白中分割兩個(gè)多肽編碼區(qū)的一種或多種氨基酸的系列。典型的接頭至少包含5個(gè)氨基酸。其它的接頭包含至少10個(gè)或至少15個(gè)氨基酸。在特定的實(shí)施方式中，可對(duì)肽接頭的氨基酸進(jìn)行選擇以使該接頭具有親水性。接頭(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3(G4S)3(SEQ ID NO:65)為一種優(yōu)選接頭，它由于可提供足夠的靈活性而廣泛應(yīng)用于多種抗體。其它接頭包括(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2(G4S)2(SEQ ID NO:66),Glu Ser GlyArgSer Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO:67), Glu Gly Lys SerSer Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr (SEQID NO:68), Glu Gly Lys Ser Ser GlySer Gly Ser Glu Ser LysSer Thr Gln(SEQ ID NO:69), Glu Gly Lys Ser Ser Gly SerGlySer Glu Ser Lys Va I Asp (SEQ ID NO: 70), Gly Ser Thr Ser GlySer Gly Lys SerSer Glu Gly Lys Gly(SEQ ID NO:71), Lys GluSer Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln LeuAla Gln Phe Arg Ser LeuAsp (SEQ ID NO: 72)以及 Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser GluGlu LeuAla Phe Arg Ser Leu Asp (SEQ ID N0:73)。更短接頭的范例包括上述接頭的片段，而更長(zhǎng)接頭的范例包括上述接頭的組合，上述接頭片段的組合，以及上述接頭與上述接頭片段的組合。在有關(guān)多肽的上下文中，“線性序列”或“序列”指多肽中的由氨基向羧基末端方向排列的氨基酸，其中序列內(nèi)彼此相鄰的殘基在多肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)內(nèi)鄰近。此處所用的術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”指通過(guò)基因生產(chǎn)RNA或多肽等生化物質(zhì)的過(guò)程。該過(guò)程包括任何該基因的功能存在的顯現(xiàn)，包括但不限于，基因阻抑以及瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)。它包括但不限于將基因轉(zhuǎn)錄為信使RNA (mRNA)，轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)，小發(fā)夾RNA (shRNA)，小干擾RNA (siRNA)或任何其它RNA產(chǎn)物，和將mRNA翻譯為多肽，以及調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄或翻譯的任何過(guò)程。如果該最終產(chǎn)物是一種生化產(chǎn)物，則表達(dá)包括了該種生化產(chǎn)物和任何前體的生成?；虻谋磉_(dá)產(chǎn)生了“基因產(chǎn)物”。此處所用的基因產(chǎn)物既可以是核酸(例如，由基因轉(zhuǎn)錄生成的信使RNA)，也可以是通過(guò)轉(zhuǎn)錄物翻譯得到的多肽。此處所述的基因產(chǎn)物進(jìn)一步包括經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄后修飾(例如，多聚腺苷酸化) 的核酸，或是經(jīng)翻譯后修飾(例如，甲基化，糖基化，以及脂質(zhì)的添加，與其它蛋白亞基的結(jié)合，蛋白水解裂解等)的多肽。術(shù)語(yǔ)“RNA干擾”或“RNAi”指通過(guò)siRNAs來(lái)沉默或減少基因表達(dá)。雙相區(qū)對(duì)沉默基因序列具有同源性的siRNA啟動(dòng)了動(dòng)物和植物的序列特異性，轉(zhuǎn)錄后基因沉默過(guò)程。該基因可以是該有機(jī)體的內(nèi)源或外源基因，整合于染色體或存在于未整合入基因組的轉(zhuǎn)染載體。該基因的表達(dá)被完全或部分抑制。也有人認(rèn)為RNAi可抑制靶RNA的功能；該靶RNA的功能可以是完全或部分的。此處所用的術(shù)語(yǔ)“治療”指治療性或預(yù)防性措施，其目的為預(yù)防或延緩(減輕)有害的生理變化或紊亂，例如多發(fā)性硬化癥的發(fā)展。有益或目標(biāo)臨床結(jié)果包括，但不限于，可測(cè)或不可測(cè)的癥狀的緩和，疾病程度的減輕，疾病狀態(tài)的穩(wěn)定(即，不惡化)，疾病進(jìn)展的延遲或減緩，疾病狀態(tài)的改善或減輕，以及(部分或完全)消除?！爸委煛边€指與未接受治療的預(yù)計(jì)存活相比更長(zhǎng)的存活時(shí)間。需要接受治療的對(duì)象包括已經(jīng)患有疾病或紊亂以及容易患該疾病或紊亂的對(duì)象或是需要預(yù)防該疾病或紊亂的對(duì)象?！皩?duì)象”或“個(gè)體”或“動(dòng)物”或“患者”或“哺乳動(dòng)物”指需要進(jìn)行診斷，預(yù)后或治療的任何對(duì)象，特別是哺乳動(dòng)物對(duì)象。哺乳動(dòng)物對(duì)象包括，但不限于，人類(lèi)，馴養(yǎng)動(dòng)物，畜牧動(dòng)物以及動(dòng)物園，運(yùn)動(dòng)，寵物動(dòng)物，例如狗，貓，豚鼠，兔子，大鼠，小鼠，馬，家畜，牛等；靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，例如猴，猿，以及黑猩猩；犬科動(dòng)物，如狗和狼；貓科動(dòng)物，如貓，獅以及虎；馬科動(dòng)物，如馬，驢以及斑馬；食用動(dòng)物，如牛，豬以及羊；有蹄動(dòng)物，如鹿和長(zhǎng)頸鹿；嚙齒動(dòng)物，如小鼠，大鼠，倉(cāng)鼠以及豚鼠等。在特定的實(shí)施方式中，該哺乳動(dòng)物為人類(lèi)對(duì)象。此處所用的“治療有效量”指在必要的劑量和時(shí)間周期下其效果足以達(dá)到所需的治療結(jié)果的數(shù)量。治療結(jié)果可以是，例如，癥狀的減輕，延長(zhǎng)存活時(shí)間，改善活動(dòng)性等等。治療結(jié)果不必要“治愈”。此處所用的“預(yù)防有效量”指在必要的劑量和時(shí)間周期下其效果足以達(dá)到所需的預(yù)防結(jié)果的數(shù)量。由于預(yù)防劑量通常在疾病發(fā)生前或疾病早期施用，預(yù)防有效量將小于治療有效量。本發(fā)明涉及促進(jìn)CNS神經(jīng)元等神經(jīng)元存活，神經(jīng)元的神經(jīng)突生長(zhǎng)和軸突再生的特定NgRl拮抗劑。例如，本發(fā)明提供了在通常軸突生長(zhǎng)被抑制的條件下刺激軸突生長(zhǎng)的NgRl多肽和多肽片段，抗體及其片段，以及多聚核苷酸。因此，本發(fā)明的NgRl拮抗劑可用于治療能夠通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)元存活，或通過(guò)刺激CNS中軸突生長(zhǎng)或再生得到緩和的損傷，疾病或紊舌L。示范性的CNS疾病，紊亂或損傷包括，但不限于，多發(fā)性硬化癥(MS)，進(jìn)行性多灶性腦白質(zhì)病(PML)，腦脊髓炎(EPL)，橋腦中央髓鞘溶解癥(CPM)，腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良，亞歷山大病以及佩-梅病(PMZ)，球形細(xì)胞腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良(克拉伯病)以及華勒氏變性，視神經(jīng)炎，橫貫性脊髓炎，肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)，亨廷頓舞蹈病，阿爾茨海默病，帕金森氏病，脊髓損傷，顱腦損傷，輻射后損傷，化療后的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，中風(fēng)，急性缺血性視神經(jīng)病變，維生素E缺乏癥,單獨(dú)的維生素E缺乏綜合癥,AR,巴康氏綜合癥,Marchiafava-Bignami綜合癥，異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良癥，三叉神經(jīng)痛和貝爾麻痹癥。MS是這些疾病中傳播最廣的一種，在全世界約有250 萬(wàn)患者。
Nogo受體-1多肽一方面，本發(fā)明涉及具有免疫原性的Nogo受體-1多肽。在本發(fā)明的部分實(shí)施方式中，該免疫原性多肽主要由選自以下組合的氨基酸序列組成:LDLSDNAQLRVVDPTT (大鼠)(SEQ ID NO:1) ;LDLSDNAQLRSVDPAT (人)(SEQ ID NO: 2) ；AVASGPFRPFQTNQLTDEELLGLPKCCQPDAADKA(大鼠)(SEQ ID NO:3) ;AVATGPYHPIWTGRATDEEPLGLPKCCQPDAADKA(人)(SEQ IDNO:4);以及 CRLGQAGSGA(小鼠)(SEQ ID NO: 5)。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及被結(jié)合Nogo受體-1的單克隆抗體結(jié)合的Nogo受體-1多肽。在部分實(shí)施方式中，該多肽被單克隆7E11抗體識(shí)別。在部分實(shí)施方式中，該多肽選自如下組合:LDLSDNAQLR(SEQ ID NO:27) ；LDLSDDAELR(SEQ ID NO:29)；LDLASDNAQLR(SEQ ID NO:30) ；LDLASDDAELR(SEQ ID NO:31) ；LDALSDNAQLR(SEQ IDNO:32) ；LDALSDDAELR(SEQ ID NO:33) ；LDLSSDNAQLR(SEQ ID NO:34) ；LDLSSDEAELR(SEQ IDNO:35) ；DNAQLRVVDPTT(SEQ ID NO:36) ；DNAQLR(SEQ ID NO:37) ；ADLSDNAQLRVVDPTT(SEQID N0:41) ；LALSDNAQLRVVDPTT(SEQ IDNO:42) ；LDLSDNAALRVVDPTT(SEQ ID NO:43)；LDLSDNAQLHVVDPTT (SEQ ID NO:44);以及 LDLSDNAQLAWDPTT (SEQ ID NO: 46)。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及編碼SEQ ID NOs: 1-5，26-27，29-37和41-45的多肽的核酸。在本發(fā)明的部分實(shí)施方式中，該核酸分子被連接至表達(dá)控制序列(例如，pCDNA ⑴)。本發(fā)明還涉及了包含編碼本發(fā)明多肽的核酸的載體。在本發(fā)明的部分實(shí)施方式中，該載體為克隆載體。在本發(fā)明的部分實(shí)施方式中，該載體為表達(dá)載體。在本發(fā)明的部分實(shí)施方式中，該載體包含至少一個(gè)選擇性標(biāo)記。本發(fā)明還涉及包含上述核酸或載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及包含培養(yǎng)宿主細(xì)胞步驟的生產(chǎn)本發(fā)明免疫原性多肽的方法。在部分實(shí)施方式中，該宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞。在部分實(shí)施方式中，該宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞。在部分實(shí)施方式中，該宿主細(xì)胞為酵母。本發(fā)明還涉及可用于，例如，促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)，促進(jìn)神經(jīng)元存活，促進(jìn)軸突存活，或抑制NgRl信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的特定Nogo受體-1多肽和多肽片段。本發(fā)明的多肽和多肽片段通常通過(guò)阻斷NgRl-介導(dǎo)的神經(jīng)元存活，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)神經(jīng)元的神經(jīng)突生長(zhǎng)或軸突再生的抑制來(lái)產(chǎn)生作用。人NgRl多肽顯示為下文的SEQ ID N0:49。全長(zhǎng)人NgRl (SEQ ID NO:49): MKRASAGGSRLLAWVLWLQAWQVAAPCPGACVCYNEPKVTTSCPQQGLQAVPVGIPAASQRIFLHGNRISH
VPAASFRACRNLTILffLHSNVLARIDAAAFTGLALLEQLDLSDNAQLRSVDPATFHGLGRLHTLHLDRCGLQELGPGLFRGLAALQYLYLQDNALQALPDDTFRDLGNLTHLFLHGNRIDSVPERAFRGLHSLDRLLLHQNRVAHVHPHAFRDLGRLMTLYLFANNLSALPTEALAPLRALQYLRLNDNPWVCDCRARPLWAWLQKFRGSSSEVPCSLPQRLAGRDLKRLAANDLQGCAVATGPYHPIWTGRATDEEPLGLPKCCQPDAADKASVLEPGRPASAGNALKGRVPP⑶SPPGNGSGPRHINDSPFGTLPGSAEPPLTAVRPEGSEPPGFPTSGPRRRPGCSRKNRTRSHCRLGQAGSGGGGIODSEGSGALPSLTCSLTPLGLALVLWTVLGPC
大鼠NgRl多肽顯示為下文的SEQ ID NO:50。全長(zhǎng)大鼠NgRl (SEQ ID NO: 50):MKRASSGGSRLLAWVLWLQAWRVATPCPGACVCYNEPKVTTScPQQGLQAVPTGIPASSQRIFLHGNRISHVPAASFQSCRNLTILffLHSNALARIDAAAFTGLTLLEQLDLSDNAQLHVVDPTTFHGLGHLHTLHLDRCGLRELGPGLFRGLAALQYLYLQDNNLQALPDNTFRDLGNLTHLFLHGNRIPSVPEHAFRGLHSLDRLLLEQNHVARVHPHAFRDLGRLMTLYLFANNLSMLPAEVLMPLRSLQYLRLNDNPWVCDCRARPLWAWLQKFRGSSSEVPcNLPQRLADRDLKRLAASDLEGCAVAsGPFRPIQTSQLTDEELLSLPKCCQPDAADKASVLEPGRPASAGNALKGRVPPGDTPPGNGSGPRHINDSPFGTLPSSAEPPLTALRPGGSEPPGLPTTGPRRRPGCSRKNRTRSHCRLGQAGSGASGTGDAEGSGALPALACSLAPLGLALVLWTVLGPC
小鼠NgRl多肽顯示為下文的SEQ ID N0:51o全長(zhǎng)小鼠NgRl (SEQ ID NO: 51):MKRASSGGSRLLAWVLWLQAWRVATPCPGACVCYNEPKVTTSCPQQGLQAVPTGIPASSQRIFLHGNRISHVPAASFQSCRNLTTLWLHSNALARIDAAAFTGLTLLEQLDLSDNAQLHVVDPTTFHGLGHLHTLHLDRCGLRELGPGLFRGLAALQYLYLQDNNLQALPDNTFRDLGNLTELFLHGNRIPSVPEHAFRGLHSLDRLLLHQNHVARVHPHAFRDLGRLMTLYLFANNLSMLPAEVLMPLRSLQYLRLNDNPWVCDCRARPLWAWLQKFRGSSSEVPCNLPQRLADRDLKRLAASDLEGCAVASGPFRPIQTSQLTDEELLSLPKCCQPDAADKASVLEPGRPASAGNALKGRVPP⑶TPPGNGSGPRHINDSPFGTLPSSAEPPLTALRPGGSEPPGLPTTGPRRRPGCSRKNRTRSHCRLGQAGSGASGTGDAEGSGALPALACSLAPLGLALVLWTVLGPC抗體本發(fā)明進(jìn)一步涉及特異性結(jié)合本發(fā)明的Nogo受體-1多肽的抗體或其抗原結(jié)合片段。在部分實(shí)施方式中該抗原或抗原結(jié)合片段與主要由選自SEQ ID NOs:1-5, 26-27, 29-37和41-45的氨基酸序列組成多肽相結(jié)合。本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段可在體內(nèi)或體外生產(chǎn)。下文討論了抗體或抗原結(jié)合片段的生產(chǎn)。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段抑制Nogo受體-1與配體(例如，NogoA, NogoB,NogoC,MAG,OM-gp)的結(jié)合并減少髓磷脂介導(dǎo)的對(duì)神經(jīng)突生長(zhǎng)和抽芽，特別是軸突生長(zhǎng)的抑制，還可減少髓磷脂介導(dǎo)的生長(zhǎng)錐萎縮。在部分實(shí)施方式中，該抗-Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片段來(lái)自鼠科動(dòng)物。在部分實(shí)施方式中，該Nogo受體-1來(lái)自大鼠。在其它實(shí)施方式中，該Nogo受體-1來(lái)自人。在部分實(shí)施方式中，該抗-Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片段為重組，工程改造，人源化和
/或嵌合。在部分實(shí)施方式中，該抗體選自組合:單克隆7E11 (ATCCk編號(hào)PTA-4587-HB7E11);單克隆 1H2 (ATCCk 編號(hào) PTA-4584-HB1H2);單克隆 2F7 (ATCCr 編號(hào)PTA-4585-HB2F7);單克隆 3G5 (ATCCr 編號(hào) PTA-4586-HB3G5);以及單克隆 5B10 (ATCX8
編號(hào)PTA-4588-HB5B10)。在部分實(shí)施方式中，該抗體為多克隆抗體46。示范性的抗原結(jié)合片段為？&13，？&13’，？(&13’)2，？^ (1，(^13，以及包含決定簇互補(bǔ)區(qū)(CDR)片段的片段，單鏈抗體(scFv)，嵌合抗體，雙價(jià)抗體以及至少包含免疫球蛋白部分的多肽，其中該部分足以使該多肽進(jìn)行特異性抗原結(jié)合(例如，免疫粘附素)。此處所用 的Fd指由Vh和Cm區(qū)組成的片段；Fv指由抗體單臂的\和Vh區(qū)組成的片段；而dAb指由Vh區(qū)組成的片段(Ward等人,Nature341:544-546 (1989))。此處所用的單鏈抗體(scFv)指'區(qū)和Vh區(qū)通過(guò)可使其形成單蛋白鏈的合成接頭配對(duì)形成單價(jià)分子的抗體(Bird 等人,Science242:423-426 (1988) and Huston 等人,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA55: 5879-5883 (1988))。此處所用的雙價(jià)抗體指雙特異性抗體，其中Vh和\區(qū)表達(dá)在單個(gè)多肽鏈上，但所采用的接頭太短以至于不能使同一鏈上的兩個(gè)區(qū)域配對(duì)，因而迫使該區(qū)域與另一條鏈上的互補(bǔ)區(qū)配對(duì)并產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(例如，參見(jiàn)Holliger, P.，等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-6448 (1993)以及 Poljak, R.J.,等人,Structure2:1121-1123(1994)。)此處所用的特異性結(jié)合目標(biāo)抗原的免疫粘附素指一種共價(jià)或非共價(jià)整合了一個(gè)或多個(gè)⑶Rs的分子。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了本發(fā)明Nogo受體-1抗體的亞基多肽，其中該亞基多肽選自如下組合:(a)重鏈或其可變區(qū)；以及(b)輕鏈或其可變區(qū)。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的Nogo受體-1抗體的亞基多肽的編碼重鏈或其可變區(qū)，或是輕鏈和其可變區(qū)的核酸。在部分實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的Nogo受體-1抗體的高變區(qū)(CDR)或編碼⑶R的核酸。
免疫本發(fā)明的抗體可通過(guò)免疫接種適當(dāng)?shù)乃拗?例如，包括人，小鼠，大鼠，綿羊，山羊，豬，牛，馬，爬行動(dòng)物，魚(yú)，兩棲動(dòng)物等脊椎動(dòng)物，以及在鳥(niǎo)，爬行動(dòng)物和魚(yú)的卵中)生成。該種抗體可以是多克隆或單克隆抗體。在部分實(shí)施方式中，該宿主通過(guò)本發(fā)明的免疫原性Nogo受體-1多肽進(jìn)行免疫接種。在其它實(shí)施方式中，該宿主以與完整或破碎細(xì)胞的細(xì)胞膜相關(guān)的Nogo受體-1進(jìn)行免疫接種且本發(fā)明的抗體通過(guò)與本發(fā)明的Nogo受體-1多肽進(jìn)行鑒定。在部分實(shí)施方式中，該Nogo受體-1抗原與佐劑施用以刺激免疫應(yīng)答。通常需要伴隨抗原施用佐劑以引發(fā)該抗原的免疫應(yīng)答。該種佐劑通常為可促進(jìn)非特異性發(fā)炎，并在免疫位點(diǎn)募集單核噬菌細(xì)胞的不溶或不可降解物質(zhì)。佐劑的范例包括，但不限于，弗氏試齊U，RIBI (胞壁酰二肽)，ISCOM(免疫刺激復(fù)合物)或其片段。對(duì)抗體制備方法的綜述可參見(jiàn)，例如，Harlow和Lane, Antibodies, A LaboratoryManual (1988) ; Yelton, D.Ε.等人，Ann.Rev.0f Biochem.50:657-80.(1981);以及 Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology (New York: John ffiley& Sons) (1989)。以本發(fā)明的免疫原性Nogo受體-1多肽對(duì)免疫反應(yīng)性的測(cè)定可通過(guò)本領(lǐng)域公知的多種方法中的任意一種進(jìn)行，包括，例如，免疫印跡測(cè)定和ELISA。
抗體生產(chǎn)及生產(chǎn)抗體的細(xì)胞系本發(fā)明的單克隆抗體可通過(guò)上文例如Harlow和Lane, Antibodies, A LaboratoryManual (1988)中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行制備。簡(jiǎn)言之，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間處死動(dòng)物，并采用例如EBV或與永生化細(xì)胞系(例如骨髓瘤細(xì)胞)的融合產(chǎn)物通過(guò)本領(lǐng)域公知的多種方法(包括但不限于轉(zhuǎn)化)中的任意一種永生化淋巴結(jié)和/或B-細(xì)胞。然后，將細(xì)胞克隆分離并測(cè)試各克隆的上清液中對(duì)本發(fā)明的免疫原性Nogo受體-1多肽具有特異性的抗體的生成。選擇，克隆和擴(kuò)增雜交瘤的方法已為本領(lǐng)公知。類(lèi)似地，鑒定免疫球蛋白基因的核苷酸和氨基酸序列的方法已為本領(lǐng)域所知。生產(chǎn)本發(fā)明抗體的其它適用技術(shù)包括在體外將淋巴細(xì)胞暴露至本發(fā)明的Nogo受體-1或免疫原性多肽， 或替代性地，在噬菌體或類(lèi)似的載體中選擇抗體庫(kù)。參見(jiàn)Huse等人，Science，246:1275-81(1989)?？捎糜诒景l(fā)明的抗體可修飾或未修飾狀態(tài)下使用?？乖?此處為本發(fā)明的Nog O受體-1或免疫原性多肽)和抗體可通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)連接能提供可測(cè)信號(hào)的物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。各種標(biāo)記和結(jié)合技術(shù)已為本領(lǐng)域所知，并可用于實(shí)施本發(fā)明。適用的標(biāo)記包括，但不限于，核素，酶，底物，輔因子，抑制劑，熒光劑，化學(xué)發(fā)光劑，磁性顆粒等。揭示該種標(biāo)記使用的專(zhuān)利包括美國(guó)專(zhuān)利3，817，837; 3, 850，752; 3, 939，35O; 3，996，345; 4，277，437; 4，275，149和4，366，241。此外還可生產(chǎn)重組免疫球蛋白(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利 4，816，567)。在本發(fā)明的部分實(shí)施方式中，抗體具有多重結(jié)合特異性，例如通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一系列技術(shù)中的任意一種制備的雙功能抗體，該種技術(shù)包括生產(chǎn)雜交雜交瘤，二硫鍵取代，化學(xué)交聯(lián)，在兩個(gè)單克隆抗體間添加肽接頭，向特定細(xì)胞系導(dǎo)入兩組免疫球蛋白重和輕鏈等等(參見(jiàn)下文更具體的討論)。本發(fā)明的抗體還可以是人單克隆抗體，例如，通過(guò)永生化人細(xì)胞，通過(guò)SCID-hu小鼠或其它能生成“人”抗體的非人動(dòng)物生產(chǎn)的抗體。
噬菌體展示庫(kù)本發(fā)明的抗-Nogo受體-1抗體可通過(guò)篩選重組組合抗體庫(kù)分離得到。示范性組合可結(jié)合本發(fā)明的免疫原性Nogo受體-1多肽，例如通過(guò)本發(fā)明的免疫原性Nogo受體-1多肽免疫化的動(dòng)物的mRNA制備的\和VhCDNAs制備的scFv噬菌體展示庫(kù)。制備和篩選該種庫(kù)的方法已為本領(lǐng)域所知。可通過(guò)商業(yè)的方法和材料生成噬菌體展示庫(kù)(例如，Pharmacia重組卩遼菌體抗體系統(tǒng)，目錄編號(hào)27-9400-01 ；Stratagene SurfZAP卩遼菌體展示試劑盒，目錄編號(hào)240612 ;以及MorphoSys的其它產(chǎn)品)。還存在其它可用于生成和篩選抗體展示庫(kù)的方法和試劑(例如，參見(jiàn)Ladner等人.美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，223，409;Kang等人.PCT
發(fā)明者丹尼爾·H·S·李, 文丁一, R·布萊克·佩平斯凱, K·簡(jiǎn)·雷爾頓, 王辛中, 阿列克謝·盧戈夫斯科伊, 沃納·邁爾, 埃倫·A·加伯, 勞拉·西爾維安, 保羅·H·魏因雷布 申請(qǐng)人:比奧根艾迪克Ma公司