專利名稱：黃花苜蓿延伸因子2MfEF2及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，涉及一種黃花苜蓿延伸因子2MfEF2及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
環(huán)境中的非生物脅迫，例如干旱、鹽堿、冷害和熱害等影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，造成農(nóng)作物的減產(chǎn)，也影響林木、果樹(shù)、花卉、園藝觀賞植物的正常生長(zhǎng)和品質(zhì)，培育耐逆的植物品種是種植業(yè)的主要目標(biāo)之一。然而，植物耐逆性是一個(gè)數(shù)量性狀，涉及至少幾百個(gè)基因的作用，因此從耐逆性強(qiáng)的植物中分離耐性基因是十分必要的。EF2基因所編碼的延伸因子EF2是一個(gè)依賴GTP水解的易位酶，介導(dǎo)蛋白合成時(shí)核糖體的易位，每水解一個(gè)GTP，核糖體便在mRNA上前進(jìn)3個(gè)堿基。它利用GTP水解釋放的能量，將氨酰tRNA從核糖體上的A位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到P位點(diǎn)，從而介導(dǎo)肽鏈的延伸。EF2是生物細(xì)胞蛋白質(zhì)合成所必需的，它的變化對(duì)蛋白的合成有重要影響。目前已從多種植物克隆了EF2基因，但還沒(méi)有從非常耐寒、耐旱的黃花苜蓿中克隆。Guo等(2002)發(fā)現(xiàn)，EF2的突變會(huì)阻礙擬南芥低溫信號(hào)的傳導(dǎo)，并降低其抗凍性；EF2的突變只影響植 物在低溫((TC)條件下合成蛋白質(zhì)，而對(duì)植物在室溫下合成蛋白質(zhì)無(wú)影響。證明EF2在植物冷信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用，從而調(diào)控植物抗冷性。黃花苜猜(Medicago sativasubsp.falcata)是一種非常耐寒的豆科牧草種質(zhì)，在寒冷的西伯利亞也有分布，從中克隆抗寒基因，能為轉(zhuǎn)基因育種提供更為優(yōu)良的目的基因，而且對(duì)于農(nóng)林植物抗逆分子育種尤為重要和迫切。

發(fā)明內(nèi)容
為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種黃花苜蓿延伸因子 2MfEF2。本發(fā)明的另一目的在于提供編碼所述的黃花苜蓿延伸因子2MfEF2的基因。本發(fā)明的再一目的在于提供所述的黃花苜蓿延伸因子2MfEF2的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種黃花苜蓿延伸因子2MfEF2，其氨基酸序列如下所示:MVKFTADELRRIMDYKHNIRNMSVIAHVDHGKSTLTDSLVAAAGIIAQEVAGDVRMTDTRADEAERGITIKSTGISLYYEMTDESLKRFKGERNGNEYLINLIDSPGHVDFSSEVTAALRITDGALVVVDCVEGVCVQTETVLRQALGERIRPVLTVNKMDRCFLELQVDGEEAYQTFSRVIENANVIMATYEDPLLGDVMVYPEKGTVAFSAGLHGWAFTLTNFAKMYASKFGVDESKMMERLWGENFFDPATKKWTTKNTGSASCKRGFVQFCYEPIKQIINTCMNDQKDKLWPMLTKLGVTMKSDEKDLMGKPLMKRVMQTWLPASTALLEMMIFHLPSPHTAQRYRVENLYEGPLDDQYANAIRNCDPEGPLMLYVSKMIPASDKGRFFAFGRVFAGKVSTGLKVRIMGPNFVPGEKKDLYVKSVQRTVIWMGKRQETVEDVPCGNTVALVGLDQFITKNATLTNEKEVDAHPIRAMKFSVSPVVRVAVQCKVASDLPKLVEGLKRLAKSDPMVVCTIEESGEHIVAGAGELHLEICLKDLQDDFMGGAEIIKSDPVVSFRETVLDRSIRTVMSKSPNKHNRLYMEARPLEDGLAEAIDEGTIGPRDDPKNRSKILSEQYGWDKDLAKKIWCFGPETTGPNMVVDMCKGVQYLNEIKDSVVAGFQWASKEGVLSEENMRGICFEVCDVVLHTDAIHRGGGQIIPTARRVFYASQLTAKPRLLEPVYMVEIQAPEQALGGIYSVLNQKRGHVFEEMQRPGTPLYNIKAYLPVIESFGFSSQLRAATSGQAFPQCVFDHWDTMTSDPLEAGSQAAQLVMDIRKRKGLKEQMTPLSEFEDKL編碼所述的黃花苜蓿延伸因子2MfEF2的核苷酸序列如下所示: ATGGTGAAGTTCACAGCTGATGAGTTACGTCGTATTATGGACTACAAGCACAACATTCGTAATATGTCTGTCATTGCTCATGTTGACCACGGAAAATCAACTCTAACCGACTCTCTAGTCGCTGCTGCGGGAATTATTGCCCAGGAAGTTGCAGGTGATGTCCGTATGACTGACACCCGTGCTGATGAAGCTGAGCGTGGTATTACAATCAAGTCTACCGGTATCTCACTCTACTATGAAATGACTGATGAATCTCTCAAGAGGTTCAAGGGGGAGCGTAATGGAAATGAGTATCTCATTAATCTCATTGATTCCCCTGGGCACGTCGACTTCTCATCTGAGGTTACTGCTGCACTCCGTATTACTGATGGAGCACTTGTGGTAGTTGACTGTGTGGAAGGTGTATGTGTCCAAACTGAAACTGTGCTGCGACAAGCTCTTGGAGAAAGGATTAGGCCTGTTCTTACAGTTAATAAGATGGACAGGTGCTTCCTTGAGCTCCAGGTTGATGGAGAGGAGGCATACCAGACCTTTTCAAGGGTGATTGAGAATGCTAATG TGATTATGGCTACATATGAAGATCCACTTCTTGGTGATGTTATGGTGTATCCAGAGAAAGGAACAGTTGCTTTTTCTGCTGGTTTGCATGGTTGGGCTTTTACTCTGACCAACTTTGCAAAAATGTATGCCTCAAAATTTGGCGTTGACGAGTCCAAGATGATGGAGAGGCTCTGGGGTGAAAATTTCTTTGATCCTGCCACAAAAAAATGGACCACCAAGAATACTGGTTCAGCTTCGTGCAAGCGTGGGTTTGTTCAGTTCTGTTATGAGCCTATCAAGCAGATCATCAACACTTGTATGAATGATCAGAAGGATAAGTTGTGGCCTATGCTCACAAAGCTAGGGGTCACCATGAAGTCTGATGAGAAGGACCTGATGGGTAAGCCATTGATGAAACGTGTTATGCAAACCTGGTTGCCAGCAAGTACTGCCCTACTAGAAATGATGATCTTTCATCTTCCCTCACCACATACTGCCCAGAGGTACCGTGTTGAGAATTTGTATGAGGGCCCCCTTGACGATCAATATGCAAATGCTATCAGAAACTGTGATCCTGAAGGACCTCTGATGCTTTATGTGTCAAAGATGATTCCAGCATCTGATAAAGGAAGGTTTTTTGCTTTTGGCCGTGTGTTTGCCGGTAAGGTTTCCACAGGTTTGAAGGTCAGAATTATGGGACCAAATTTTGTCCCTGGAGAGAAGAAAGATCTGTACGTGAAAAGTGTCCAGAGAACTGTTATTTGGATGGGAAAGAGACAGGAGACTGTTGAGGATGTGCCTTGTGGTAACACTGTTGCTTTGGTTGGTTTGGATCAATTTATTACAAAGAATGCTACATTGACAAATGAGAAGGAAGTTGATGCCCACCCTATCCGAGCTATGAAGTTTTCCGTCTCCCCTGTTGTGCGTGTTGCTGTTCAGTGCAAGGTTGCTTCAGATCTTCCCAAGCTTGTTGAAGGTCTCAAACGTTTGGCTAAGTCAGATCCTATGGTTGTTTGTACTATTGAGGAGTCTGGGGAACACATTGTTGCTGGTGCAGGAGAGCTTCATCTTGAGATCTGTTTGAAAGATTTGCAGGATGATTTCATGGGTGGTGCTGAGATTATTAAATCTGACCCTGTTGTGTCATTCAGGGAGACTGTTCTTGATAGATCAATCCGCACAGTGATGAGTAAATCACCCAACAAGCACAACCGGCTGTACATGGAAGCAAGACCATTGGAGGATGGACTTGCAGAGGCCATTGATGAGGGCACAATAGGACCAAGGGATGATCCCAAGAATCGTTCTAAGATCTTGTCCGAACAGTATGGTTGGGACAAGGATCTTGCCAAGAAAATTTGGTGTTTTGGCCCTGAGACCACCGGGCCCAACATGGTGGTTGATATGTGTAAGGGAGTTCAGTATTTGAATGAAATCAAGGATTCCGTGGTTGCTGGATTCCAGTGGGCATCAAAAGAAGGTGTTTTGTCGGAAGAAAACATGAGAGGCATCTGCTTTGAAGTATGTGATGTTGTCCTGCACACTGATGCTATCCACAGAGGAGGTGGTCAGATCATTCCTACTGCTAGGAGGGTCTTCTATGCCTCACAGCTCACAGCCAAACCCAGGCTTCTGGAGCCTGTTTA CATGGTGGAAATCCAAGCTCCTGAGCAAGCTCTTGGTGGTATCTACAGTGT TCTGAATCAGAAACGTGGGCACGTTTTTGAAGAAATGCAGAGGCCCGGTACCCCACTTTACAACATCAAAGCATACCTCCCTGTCATTGAGTCCTTTGGATTTTCTAGTCAGTTGAGAGCTGCAACATCTGGGCAGGCTTTCCCCCAGTGTGTCTTTGATCATTGGGACACCATGACCTCAGATCCTTTGGAGGCTGGATCACAAGCTGCACAGCTTGTTATGGACATCCGCAAGAGGAAGGGACTCAAGGAACAAATGACTCCCCTTTCTGAGTTTGAAGACAAGCTTTAA
上述黃花苜蓿延伸因子2MfEF2在提高植物抗寒性中的應(yīng)用:該應(yīng)用包括用本發(fā)明的MfEF2基因構(gòu)建植物表達(dá)載體；用構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物組織；將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成轉(zhuǎn)基因植株。所述的用本發(fā)明的MfEF2基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達(dá)載體；所述植物表達(dá)載體包括但不限于雙元農(nóng)桿菌載體以及用于單子葉基因槍轉(zhuǎn)化的載體；所述的雙元農(nóng)桿菌載體包括pBI121，pCAMBIA系列載體；所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它效應(yīng)mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段；使用所述基因構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可使用任何一種強(qiáng)啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；這些啟動(dòng)子包括但不限于花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動(dòng)子和泛素(Ubiqutin)啟動(dòng)子，它可單獨(dú)使用或與其他的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域包括但不限于ATG起始密碼子和鄰接區(qū)域。起始密碼子必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的翻譯。翻譯控制信號(hào)和起始密碼子可以使多種不同的來(lái)源，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或來(lái)自結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所使用的植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，包括加入或替換植物可選擇性標(biāo)記?？墒褂玫倪x擇性標(biāo)記包括編碼抗除草劑的酶的基因或具有抗性的抗生素標(biāo)記物；所述的除草劑包括草丁膦、草甘膦等，所述的抗生素包括卡那霉素、潮霉素、慶大霉素等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可以不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。含有MfEF2基因的表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接的DNA轉(zhuǎn)化，顯微注射、電穿孔等各種常規(guī)或特異`的遺傳轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主可以是雙子葉植物或單子葉植物。所述的MfEF2基因片段的獲得和植物表達(dá)載體的制備方法，包括以下步驟:(I)引物設(shè)計(jì)① MfEF2 擴(kuò)增上游引物 RT77:CTAGTCAAGATGGTGAAGTTCACAG ；②MfEF2 擴(kuò)增下游引物 RT78: CAGTTTTCATAACAGCCAAGTACAT ；(2) MfEF2基因片段的獲得:以黃花苜蓿(Medicago falcata)的cDNA為模板，使用引物①和引物②擴(kuò)增MfEF2基因片段，并連接進(jìn)入PGEM-T easy載體中，構(gòu)建獲得pGEM_MfEF2載體；(3)植物表達(dá)載體pBI_MfEF2的構(gòu)建對(duì)重組質(zhì)粒pGEM_MfEF2和pB 1-121表達(dá)質(zhì)粒分別用Xba I和BamH I進(jìn)行雙酶切，回收MfEF2基因片段和線性化的pB1-121載體，進(jìn)行連接構(gòu)建獲得植物表達(dá)載體pB1-MfEF2。所述的轉(zhuǎn)基因植物為轉(zhuǎn)基因煙草；所述的轉(zhuǎn)基因煙草的獲得，包括以下的步驟:(I)用電轉(zhuǎn)的方法將pBI_MfEF2導(dǎo)入根瘤農(nóng)桿菌EHA105中，獲得含表達(dá)載體pB1-MfEF2農(nóng)桿菌陽(yáng)性菌落；(2)將活化的含有表達(dá)載體pBI_MfEF2的農(nóng)桿菌EHA105浸染煙草無(wú)菌苗，經(jīng)共培養(yǎng)和抗生素篩選，獲得轉(zhuǎn)基因煙草。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:發(fā)明人已從黃花苜蓿中克隆了 EF2基因的cDNA序列MfEF2。MfEF2基因的表達(dá)受低溫脅迫誘導(dǎo)，構(gòu)建了適合于雙子葉植物的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化雙子葉模式植物煙草，轉(zhuǎn)基因植株明顯提高了抗凍性和抗冷性。



圖1是植物表達(dá)載體pBI_MfEF2的表達(dá)框示意圖。圖2本發(fā)明所述MfEF2基因開(kāi)放閱讀框序列的PCR擴(kuò)增瓊脂糖電泳圖，其中，M是標(biāo)準(zhǔn)DNA分子；I是MfEF2基因的擴(kuò)增片段。圖3是MfEF2基因的植物表達(dá)載體的PCR鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，M是標(biāo)準(zhǔn)DNA分子；1-3是3組構(gòu)建的植物表達(dá)質(zhì)粒的MfEF2基因的擴(kuò)增片段。圖4是低溫誘導(dǎo)MfEF2基因表達(dá)的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)柱狀圖。柱上方的字母a和b表示不同材料之間的差異顯著(P ( 0.05)，即數(shù)據(jù)柱上方字母相同時(shí)表示沒(méi)有顯著差異，數(shù)據(jù)柱上方字母不同時(shí)表示存在顯著差異。圖5是導(dǎo)入MfEF2基因的轉(zhuǎn)基因煙草的PCR鑒定結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，W表示野生型；P表示pB1-MfEF2載體，為陽(yáng)性對(duì)照；編號(hào)I 11表示不同的轉(zhuǎn)基因煙草。圖6是3個(gè)導(dǎo)入MfEF2基因的轉(zhuǎn)基因煙草的Southern雜交和Northern雜交鑒定，其中，W表示野生型；數(shù)字1-3表示不同的轉(zhuǎn)基因煙草；圖(a)是Southern雜交，圖(b)是Northern 雜交。圖7是導(dǎo)入MfEF2雜交基因的轉(zhuǎn)基因煙草抗凍性檢測(cè)，其中圖(a)是凍處理后的存活率，圖(b)是凍處理前后各的植株照片。柱上方的字母a和b表示不同材料之間的差異顯著(P ( 0.05)，即數(shù)據(jù)柱上方字母相同時(shí)表示沒(méi)有顯著差異，數(shù)據(jù)柱上方字母不同時(shí)表不存在顯著差異。圖8是表達(dá)MfEF2基因的轉(zhuǎn)基因煙草抗冷性的相對(duì)電導(dǎo)率檢測(cè)。其中，W表示野生型；編號(hào)I 3表示不同的轉(zhuǎn)基因煙草。柱上方的字母a和b表示不同材料之間的差異顯著(P ( 0.05)，即數(shù)據(jù)柱上方字母相同時(shí)表示沒(méi)有顯著差異，數(shù)據(jù)柱上方字母不同時(shí)表示存在顯著差異。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。黃花苜蓿種子:品種為海拉爾，中國(guó)農(nóng)科院北京畜牧獸醫(yī)研究所牧草種質(zhì)資源庫(kù)。根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105:購(gòu)自北京天恩澤基因科技有限公司。煙草或煙草(Nicotiana tabacum L.)種子:品種為中煙90,廣東省農(nóng)科院作物研究所。
pBI121表達(dá)載體:購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。大腸桿菌DHlOB:購(gòu)自上海超研生物科技有限公司。實(shí)施例1MfEF2的克隆一、黃花苜蓿cDNA模板制備將苗齡8 10周的黃花苜蓿植株放入溫度為5°C的人工氣候箱(光照強(qiáng)度為200 μ mo I HT2iT1)內(nèi)，光/暗周期為12小時(shí)，進(jìn)行低溫處理，連續(xù)處理2天。提取總的RNA:剪取成熟葉片，加入液氮快速研磨成粉末，轉(zhuǎn)移至2ml離心管中，力口入1.5ml TRE-Trizol(廣州博理生物科技公司)試劑，劇烈振蕩15秒，冰浴5分鐘。IOOOOrpm離心5min,吸取上清至2ml離心管,加入0.3ml氯仿,劇烈振蕩15秒,冰浴10分鐘。12000rpm離心15分鐘，吸取上層水相(彡0.7ml)至1.5ml離心管，依次加入0.4ml異丙醇和0.4mlBuffer A (1.2M NaCl，80mM檸檬酸鈉，用DEPC處理水配制)，立即混勻，室溫下放置10分鐘。12000rpm離心10分鐘，棄上清，用75%乙醇(DEPC處理水配制)洗滌沉淀。7500rpm離心5分鐘，棄上清，再短暫離心3秒，用槍頭吸盡上清。室溫下風(fēng)干沉淀5分鐘，加入30 35 μ I DEPC處理水，60°C溫浴5分鐘，溶解沉淀，獲得黃花苜?？俁NA。取I 3 μ I總RNA進(jìn)行甲醛變性膠電泳，檢查RNA的完整性，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)260nm與280nm的光吸收值，確定總RNA的濃度與純度。逆轉(zhuǎn)錄制得黃花苜蓿的cDNA模板:以上述得到的黃花苜?？俁NA為模板，以O(shè)ligo (dT) 18為反轉(zhuǎn)錄引物,用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Promega公司),參照說(shuō)明書(shū)的方法合成cDNA第一鏈。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為:24 8總1 嫩，14 11.(^1 Oligo (dT) 18，加入無(wú)菌的無(wú)離子水，使反應(yīng)液總體積達(dá)到1 0μ 1，混勻，70°C保溫5min后，迅速放入碎冰浴5分鐘；繼續(xù)向反應(yīng)液依次加入以下成分:5μ I M-MLV5 X Reaction Buffer, 1.25 μ 12.5mM dNTPs,0.5 μ I RNase抑制劑(25U)，I μ I M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200U)，加無(wú)菌的無(wú)離子水至終體積為25 μ I。輕彈管壁，混勻，短暫離心。于42°C保溫，反應(yīng)60分鐘，再在70°C下保溫10分鐘，使酶失活。反應(yīng)結(jié)束后，制備獲得黃花苜蓿的cDNA模板，于-20°C保存?zhèn)溆?。二、設(shè)計(jì)擴(kuò)增MfEF2基因引物根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的黃花苜蓿冷誘導(dǎo)基因cDNA消減文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的MfEF2基因cDNA片段的序列，在NCBI上進(jìn)行BLASTn比對(duì)EST序列，并下載相應(yīng)核苷酸序列一致性最高的序列，利用DNAStar軟件的Seqman工具進(jìn)行序列拼接，如此反復(fù)直到拼接得到該基因的全長(zhǎng)序列。通過(guò)DNAstar軟件分析以上全長(zhǎng)序列的開(kāi)放閱讀框，根據(jù)開(kāi)放閱讀框兩端的序列設(shè)計(jì)引物:MfEF2 擴(kuò)增上游引物 RT77:CTAGTCAAGATGGTGAAGTTCACAGMfEF2 擴(kuò)增下游引物 RT78: CAGTTTTCATAACAGCCAAGTACAT三、擴(kuò)增獲得MfEF2基因并構(gòu)建載體PCR擴(kuò)增:以步驟一得到的cDNA第一鏈為模板和步驟二設(shè)計(jì)的引物RT77和RT78進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為:KOD-Plus DNA聚合酶(Τ0Υ0Β0公司，IU/μ I) I μ 1、10Xbuffer5y 1,2.5mM dNTPs5 μ UMgSO4 (2 5mmo I.Ι^)2μ 1、10 μ M 上游引物 RT771.5 μ 1、1(^|/[下游引物1^781.5 μ 1、第一鏈cDNA2y 1、無(wú)菌的無(wú)離子水32 μ I?；靹蚝蟀聪铝谐绦蜻M(jìn)行PCR反應(yīng):94°C 3分鐘，94°C變性0.5分鐘，55°C退火I分鐘，68°C延伸1.5分鐘，35個(gè)循環(huán)后，68°C延伸1.5-2分鐘。以0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。
PCR產(chǎn)物回收與末端加A:用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收上述獲得的PCR產(chǎn)物，進(jìn)一步通過(guò)Taq酶催化的反應(yīng)進(jìn)行末端加A,反應(yīng)體系如下:2 μ IlOXbuffer, I μ 14mM dATP,Ilyg PCR回收片段，0.1μ I Taq DNA聚合酶，加入無(wú)菌的去離子水至總體積為20 μ 1，70°C反應(yīng)20分鐘，即對(duì)MfEF2基因片段進(jìn)行了末端加A。末端加A的MfEF2基因片段與T載體的連接:用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收上述獲得末端加了 A的MfEF2基因片段。用T4DNA連接酶(TaKaRa公司)將PCR回收片段與pMD20T-vector (TaKaRa公司)進(jìn)行連接，反應(yīng)體系如下:1 μ 110XT4連接酶緩沖液，回收的目的片段 60ng，ly I T4 連接酶(350υ/μ I)，2μ lpMD20T_vector 載體(10ng)，加無(wú)菌水至總體積為10μ 1，16°C連接過(guò)夜。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備:用接種環(huán)取保存于_80°C超低溫冰箱的大腸桿菌DHlOB菌液，在SOB固體培養(yǎng)基上劃板，于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜；挑取大腸桿菌DHlOB單菌落接種于Iml的SOB液體培養(yǎng)基中，在37°C恒溫?fù)u床上以200rpm振蕩培養(yǎng)約6h，接種于200ml SOB液體培養(yǎng)基中，于37°C恒溫?fù)u床上以200rpm振蕩培養(yǎng)至OD55tl = 0.6 0.8。以2500rpm離心10分鐘收集菌體，加入預(yù)冷的10%甘油洗滌，離心收集細(xì)菌。重復(fù)用10%甘油洗滌，離心收集細(xì)菌。最后將細(xì)菌分裝，于一 70°C保存?zhèn)溆?。連接產(chǎn)物電激轉(zhuǎn)化大腸桿菌:將上述MfEF2基因片段與T載體的連接產(chǎn)物在1/3的 TE (IM NaCl, IOmM Tris-HCl pH8.0, ImM EDTA)中透析 30 分鐘。取 20 μ I 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞至電極杯(孔徑1mm)，加入1μ I經(jīng)過(guò)透析的連接產(chǎn)物，用電激儀(MicroPulser,Bio-RAD公司)電激轉(zhuǎn)化。電激參數(shù)為:電阻20(^，180(^，25 4 。電激后的菌體轉(zhuǎn)入ImlSOC液體中，于37°C恒溫?fù)u床上以200rpm振蕩培養(yǎng)I小時(shí)。取100 μ I菌液涂布于含IPTG和X-gal的LB固體(含100 μ g/mL Amp)培養(yǎng)基上，于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)過(guò)夜。

重組質(zhì)粒的篩選、純化及測(cè)序:呈藍(lán)斑的菌落不含插入片段，僅挑取呈白斑的菌落，做菌落PCR檢測(cè)。挑取PCR陽(yáng)性菌落，接種于2ml含100 μ g/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C恒溫?fù)u床上以200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。吸取2ml菌液，用質(zhì)粒DNA純化試劑盒(Qiagen公司)提質(zhì)粒，4°C保存?zhèn)溆?。?duì)獲得的質(zhì)粒用Xba I /BamH I雙酶切，電泳檢測(cè)插入片段的大小，進(jìn)一步確定陽(yáng)性克隆。將純化的重組質(zhì)粒(命名為pGM-MfEF2)，測(cè)序。用0miga2.0軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，除去兩端的T載體序列，從而得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列如下:
權(quán)利要求
1.一種黃花苜蓿延伸因子2MfEF2，其特征在于其氨基酸序列如SEQ IDN0.1所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述的黃花苜蓿延伸因子2MfEF2的核苷酸序列如SEQIDN0.2所示。
3.權(quán)利要求1所述的黃花苜蓿延伸因子2MfEF2在提高植物抗寒性中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的黃花苜蓿延伸因子2MfEF2的應(yīng)用，其特征在于:該應(yīng)用包括用本發(fā)明獲得的MfEF2基因構(gòu)建植物表達(dá)載體；用構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物組織；將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成 轉(zhuǎn)基因植物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種黃花苜蓿延伸因子2MfEF2及其編碼基因和應(yīng)用，屬于植物基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)獲得MfEF2基因，并將獲得的MfEF2基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，用構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物組織，然后培育成轉(zhuǎn)基因植株。MfEF2基因受低溫的誘導(dǎo)；本發(fā)明提供了利用MfEF2基因培育耐寒植物的方法，將該基因在植物過(guò)量表達(dá)后，提高了轉(zhuǎn)基因植物的耐凍性和耐冷性。
文檔編號(hào)C12N9/12GK103173425SQ20121059391
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者郭振飛, 何思健, 何雪英 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)