專(zhuān)利名稱(chēng)：黃花苜蓿溫度誘導(dǎo)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體MfTIL及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，涉及一種黃花苜蓿溫度誘導(dǎo)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體MfTIL及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
環(huán)境中的非生物脅迫，例如干旱、鹽堿、冷害和熱害等影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，造成農(nóng)作物的減產(chǎn)，也影響林木、果樹(shù)、花卉、園藝觀賞植物的正常生長(zhǎng)和品質(zhì)，培育耐逆的植物品種是種植業(yè)的主要目標(biāo)之一。然而，植物耐逆性是一個(gè)數(shù)量性狀，涉及至少幾百個(gè)基因的作用，因此從耐逆性強(qiáng)的植物中分離耐性基因是十分必要的。脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體(Iipocalins)是一個(gè)廣泛分布于生物界蛋白家族(Akerstromet al. 2000),但這個(gè)蛋白家族成員的氨基酸序列同源性低，其功能是運(yùn)輸疏水性化合物(Flower et al. 2000)。植物脂質(zhì)運(yùn)載蛋白可分為兩大類(lèi)溫度誘導(dǎo)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體(temperature induced lipocalins, TIL)和葉綠體脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體(chloroplasticlipocalins, CHLs)(Charron et al. 2005)。植株中的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體 的研究并不多。主要在模式植物擬南芥有過(guò)研究，TIL基因受低溫和高溫誘導(dǎo)(Charron et al. 2002),具有抗溫度脅迫的功能(Charron et al. 2008 ；Chi et al. 2009)。黃花苜猜(Medicago sativa subsp. falcata)是一種非常耐寒的豆科牧草種質(zhì)，在寒冷的西伯利亞也有分布，從中克隆抗寒基因，能為轉(zhuǎn)基因育種提供更為優(yōu)良的目的基因，而且對(duì)于農(nóng)林植物抗逆分子育種尤為重要和迫切。

發(fā)明內(nèi)容
為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明的首要目的是提供一種黃花苜蓿溫度誘導(dǎo)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體MfTIL。本發(fā)明的另一目的在于提供編碼所述的黃花苜蓿溫度誘導(dǎo)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體MfTIL的基因。本發(fā)明的再一目的在于提供所述的黃花苜蓿溫度誘導(dǎo)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體MfTIL的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種黃花苜蓿溫度誘導(dǎo)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體MfTIL，其氨基酸序列如下所示MGNTVGKDKEVVKGVDLERYMGRWYEIASFPSFFQPKNGENTRATYTLNSDGTVHVLNETWNGGKRTSIEGSAYKADPKSDEAKLKVKFYVPPFLPIIPAVGDYfflLYLDQDYQYALlGGPTNKYLffILCRQPHLDEAIYNQLVEKAKEEGYDVSKLHKTPQSDPPPE ；編碼所述的黃花苜蓿溫度誘導(dǎo)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體MfTIL的核苷酸序列如下所示 ATGGGAAACACCGTAGGGAAGGACAAGGAGGTTGTGAAGGGTGTAGACTTGGAGAGGTACATGGGTAGGTGGTATGAGATAGCTTCTTTCCCTTCATTCTTCCAGCCCAAAAATGGAGAGAACACAAGAGCCACATACACTCTCAACAGTGATGGGACTGTTCATGTTCTCAACGAGACTTGGAATGGTGGTAAAAGAACCTCCATAGAAGGAAGTGCTTATAAAGCTGACCCCAAAAGTGATGAAGCCAAGCTCAAGGTTAAATTCTATGTTCCTCCATTCTTGCCAATTATTCCTGCTGTTGGAGATTACTGGATTTTGTACCTTGATCAAGATTATCAATATGCTCTCATTGGTGGGCCTACCAATAAATATCTATGGATACTATGCAGGCAACCCCATTTGGATGAAGCAATCTACAACCAGCTTGTTGAGAAAGCTAAGGAAGAAGGCTATGATGTGAGTAAATTGCACAAGACTCCACAGAGTGATCCTCCACCTGAGTAA ；上述黃花苜蓿溫度誘導(dǎo)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體MfTIL在提高植物抗寒性中的應(yīng)用該應(yīng)用包括用本發(fā)明的MfTIL基因構(gòu)建植物表達(dá)載體；用構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物組織；將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成轉(zhuǎn)基因植株。所述的用本發(fā)明的MfTIL基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達(dá)載體；所述植物表達(dá)載體包括但不限于雙元農(nóng)桿菌載體以及用于單子葉基因槍轉(zhuǎn)化的載體；所述的雙元農(nóng)桿菌載體包括pBI121，pCAMBIA系列載體；所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它效應(yīng)mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段；使用所述基因構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可使用任何一種強(qiáng)啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；這些啟動(dòng)子包括但不限于花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動(dòng)子和泛素(Ubiqutin)啟動(dòng)子，它可單獨(dú)使用或與其他的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域包括但不限于ATG起始密碼子和鄰接區(qū)域。起始密碼子必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的翻譯。翻譯控制信號(hào)和起始密碼子可以使多種不同的來(lái)源，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或來(lái)自結(jié)構(gòu)基因。

為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所使用的植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，包括加入或替換植物可選擇性標(biāo)記?？墒褂玫倪x擇性標(biāo)記包括編碼抗除草劑的酶的基因或具有抗性的抗生素標(biāo)記物；所述的除草劑包括草丁膦、草甘膦等，所述的抗生素包括卡那霉素、潮霉素、慶大霉素等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可以不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。含有MfTIL基因的表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接的DNA轉(zhuǎn)化，顯微注射、電穿孔等各種常規(guī)或特異的遺傳轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主可以是雙子葉植物或單子葉植物。所述的MfTIL基因片段的獲得和植物表達(dá)載體的制備方法，包括以下步驟(I)引物設(shè)計(jì)① MfTIL 擴(kuò)增上游引物 RTl 13 TGAAATAGAGGAAGCAATAACATC ；②MFTIL 擴(kuò)增下游引物 RTl 14 CAGGCATTTGT GTCTTGAGG ；③引入Xba I 酶切位點(diǎn)的上游引物 RT31 : TCCATCTAGATGAAATAGAGGAAGCAATAACATC；④引入BamH I 酶切位點(diǎn)的下游引物 RT32 TAGAGGATCCAGGCATTTGTGTCTTGAGG ；(2) MfTIL基因片段的獲得以黃花苜蓿(Medicago falcata)的cDNA為模板，使用引物①和引物②擴(kuò)增MfTIL基因片段，并連接進(jìn)入PGEM-T easy載體中，構(gòu)建獲得pGEM_MfTIL載體；(3)植物表達(dá)載體pB1-MfTIL的構(gòu)建以pGEM-MfTIL載體為模板，使用引物③和引物④使MfTIL基因片段引入Xba I和BamH I兩個(gè)酶切位點(diǎn)，進(jìn)而構(gòu)建獲得植物表達(dá)載體pBI_MfTIL ；所述的轉(zhuǎn)基因植物優(yōu)選為轉(zhuǎn)基因煙草；所述的轉(zhuǎn)基因煙草的獲得，包括以下的步驟(I)用電轉(zhuǎn)的方法將pB1-MfTIL導(dǎo)入根瘤農(nóng)桿菌EHA105中，獲得含表達(dá)載體pB1-MfTIL農(nóng)桿菌陽(yáng)性菌落；(2)將活化的含有表達(dá)載體pB1-MfTIL的農(nóng)桿菌EHA105浸染煙草無(wú)菌苗，經(jīng)共培養(yǎng)和抗生素篩選，獲得轉(zhuǎn)基因煙草。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果發(fā)明人已從黃花苜蓿中克隆了脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的cDNA序列MfTIL。MfTIL基因的表達(dá)受低溫和ABA誘導(dǎo)，構(gòu)建了適合于雙子葉植物的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化雙子葉模式植物煙草，轉(zhuǎn)基因植株明顯提高了抗凍和抗冷性。


圖1是植物表達(dá)載體pB1-MfTIL的表達(dá)框示意圖。圖2是本發(fā)明所述MfTIL基因開(kāi)放閱讀框序列的PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，M是標(biāo)準(zhǔn)DNA分子；1是M fTIL基因的擴(kuò)增片段。圖3是MfTIL基因的植物表達(dá)載體的PCR鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，M是標(biāo)準(zhǔn)DNA分子；1是陽(yáng)性重組子；P是陽(yáng)性對(duì)照。圖4是低溫和脫落酸(ABA)誘導(dǎo)MfTIL基因表達(dá)的特征柱狀圖，其中，圖(a)是低溫對(duì)MfTIL基因轉(zhuǎn)錄的影響，圖(b)是ABA對(duì)MfTIL基因轉(zhuǎn)錄的影響；柱上方的字母a、b、c、d和e表示不同處理之間的差異顯著(P ( 0. 05)，即數(shù)據(jù)柱上方字母相同時(shí)表示沒(méi)有顯著差異，數(shù)據(jù)柱上方字母不同時(shí)表示存在顯著差異。圖5是導(dǎo)入MfTIL基因的轉(zhuǎn)基因煙草的PCR鑒定結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，W表示野生型；P表示pB1-MfTIL載體，為陽(yáng)性對(duì)照；編號(hào)I 8表示不同的轉(zhuǎn)MfTIL基因煙草。圖6是3個(gè)導(dǎo)入MfTIL基因的轉(zhuǎn)基因煙草的Southern雜交、實(shí)時(shí)定量PCR和Western雜交鑒定，其中，W表示野生型；編號(hào)Tl、T2和T29表示不同的轉(zhuǎn)基因煙草；圖(a)是Southern雜交，圖(b)是實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，圖(c)是Western雜交；柱上方的字母a和b表示不同材料之間的差異顯著(P ( 0. 05)。圖7是導(dǎo)入MfTIL基因的轉(zhuǎn)基因煙草抗凍性存活率檢測(cè)，其中圖(a)是凍處理后的存活率，圖(b)是凍處理后各個(gè)植株的照片；柱上方的字母a、b和c表示不同材料之間的差異顯著(P ( 0. 05)。圖8是表達(dá)MfTIL基因的轉(zhuǎn)基因煙草抗冷性的相對(duì)電導(dǎo)率檢測(cè)。其中，W表示野生型；編號(hào)Tl、T2和T29表示不同的轉(zhuǎn)基因煙草；柱上方的字母a和b表示不同材料之間的差異顯著(P ( 0. 05)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。黃花苜蓿種子品種為海拉爾，中國(guó)農(nóng)科院北京畜牧獸醫(yī)研究所牧草種質(zhì)資源庫(kù)。根癌農(nóng)桿菌(Aggobacterium tumefaciens) EHA105 :購(gòu)自北京天恩澤基因科技有限公司。煙草或煙草(Nicotiana tabacum L.)種子品種為中煙90,廣東省農(nóng)科院作物研究所。pBI121表達(dá)載體購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。大腸桿菌DHlOB :購(gòu)自上海超研生物科技有限公司。實(shí)施例1MfTIL的克隆一、黃花苜蓿cDNA模板制備 將黃花苜蓿(Medicago falcata)種子用60°C熱水浸泡5分鐘，于28°C黑暗條件下催芽，當(dāng)種子露白時(shí)，點(diǎn)播于盛有泥土的塑料盆(直徑15cm)中，于溫室內(nèi)培養(yǎng)，自然光照，溫度25-28°C。將苗齡8-10周的黃花苜蓿植株放入溫度為5°C的人工氣候箱(光照強(qiáng)度為200 u mo I HT2s-1)內(nèi)，光/暗周期為12小時(shí)光照，進(jìn)行5°C低溫處理，連續(xù)處理2天。取黃化苜猜的成熟葉片，用Trizol方法提取總RNA,用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Promega公司)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板，_20°C保存?zhèn)溆?。二、設(shè)計(jì)擴(kuò)增MfTIL基因引物根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的黃花苜蓿冷誘導(dǎo)基因cDNA縮減文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的MfTIL基因cDNA片段的序列，在NCBI上進(jìn)行BLASTn比對(duì)EST序列，并下載相應(yīng)核苷酸序列一致性最高的序列，利用DNAStar軟件的Seqman工具進(jìn)行序列拼接，如此反復(fù)直到拼接得到該基因的全長(zhǎng)序列。通過(guò)DNAstar軟件分析以上全長(zhǎng)序列的開(kāi)放閱讀框，根據(jù)開(kāi)放閱讀框兩端的序列設(shè)計(jì)引物MfTIL 擴(kuò)增上游引物 RT113 : TGAAATAGAGGAAGCAATAACATC ；MfTIL 擴(kuò)增下游引物 RTl 14 CAGGCATTTGT GTCTTGAGG ；三、擴(kuò)增獲得MfTIL基因并構(gòu)建載體用上述步驟一制備的模板和步驟二設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系(50ii L) :K0D-Plus_DNA 聚合酶(T0Y0B0 公司，IU u L-1) I U I,10Xbuffer5ii 1，dNTPs (IOmmol L-1) 1，MgSO4 (25mmol L-1) 1，上游弓丨物(10 u mo I L-1)1. 5 u 1，下游引物(10 u mo I L-1)1. 5 U I,反轉(zhuǎn)錄第一鏈 cDNA2 u I, ddH20 補(bǔ)足至50u I0PCR 反應(yīng)程序=PCR 反應(yīng)程序94°C 3 分鐘；94°C 0. 5 分鐘，55°C 0. 5 分鐘，72°C 0. 5分鐘，35個(gè)循環(huán)；72°C 10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物以0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖2)。獲得與預(yù)期片段長(zhǎng)度(571bp) —致的PCR片段(圖2)。將獲得的PCR產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒(Qiagen公司)回收后進(jìn)一步通過(guò)Taq酶催化的反應(yīng)進(jìn)行末端加A,反應(yīng)體系如下2ii llOXbuffer，I ii 14mM dATP，11 ii gPCR回收片段，0.1 ii I Taq DNA聚合酶，加入無(wú)菌的去離子水總體積為20 yl，70°C反應(yīng)20分鐘。用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收上述獲得的PCR片段。用T4DNA連接酶(TaKaRa公司)將PCR回收片段與pGEM-T easy載體(Promega公司)進(jìn)行連接，反應(yīng)體系如下liillOXT4連接酶緩沖液，回收目的片段60ng，I ill T4連接酶，2 ill pGEM-T easy載體(10ng)，加無(wú)菌水至總體積為10iU，16°C連接過(guò)夜。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備用接種環(huán)取保存于_80°C超低溫冰箱的大腸桿菌DHlOB菌液，在SOB固體培養(yǎng)基上劃板，于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜；挑取大腸桿菌DHlOB單菌落接種于Iml的SOB液體培養(yǎng)基中，在37°C恒溫?fù)u床上以200rpm振蕩培養(yǎng)約6h，接種于200ml SOB液體培養(yǎng)基中，于37°C恒溫?fù)u床上以200rpm振蕩培養(yǎng)至OD550 = 0. 6-0. 8。以2500rpm離心10分鐘收集菌體，加入預(yù)冷的10%甘油洗滌，離心收集細(xì)菌。重復(fù)用10%甘油洗滌，離心收集細(xì)菌。最后將細(xì)菌分裝，于_70°C保存?zhèn)溆谩＿B接產(chǎn)物電激轉(zhuǎn)化大腸桿菌將上述的末端加A的PCR片段和pGEMT-vector連接產(chǎn)物在 1/3 的 TE (1M NaCl, IOmM Tris-HCl pH8. 0, ImM EDTA)中透析 30 分鐘。取20 Ul大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞至電極杯(孔徑1_)，加入I Ul經(jīng)過(guò)透析的連接產(chǎn)物，用電激儀(MicroPulser，Bio-RAD公司)電激轉(zhuǎn)化。電激參數(shù)為電阻200 Q，1800V, 25 U F。電激后的菌體轉(zhuǎn)入Iml SOC液體中，于37°C恒溫?fù)u床上以200rpm振蕩培養(yǎng)I小時(shí)。取100 yl菌液涂布于含IPTG和X-gal的LB固體(含100 u g/mL Amp)培養(yǎng)基上，于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)過(guò)夜。重組質(zhì)粒pGEM-MfTIL的篩選、純化及測(cè)序呈藍(lán)斑的菌落不含插入片段，僅挑取呈白斑的菌落，做菌落PCR檢測(cè)。挑取PCR陽(yáng)性菌落，接種于2ml含100 u g/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C恒溫?fù)u床上以200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。吸取2ml菌液，用質(zhì)粒DNA純化試劑盒(Qiagen公司)提質(zhì)粒，4°C保存?zhèn)溆?。?duì)獲得的質(zhì)粒用Xba I /BamH I雙酶切，電泳檢測(cè)插入片段的大小 ，進(jìn)一步確定陽(yáng)性克隆。純化的重組質(zhì)粒命名為pGEM-MfTIL，送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如下
權(quán)利要求
1.一種黃花苜蓿溫度誘導(dǎo)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體MfTIL，其特征在于其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述的黃花苜蓿溫度誘導(dǎo)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體MfTIL的核苷酸序列如SEQID NO. 2 所示。
3.權(quán)利要求1所述的黃花苜蓿溫度誘導(dǎo)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體MfTIL在提高植物抗寒性中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的黃花苜蓿溫度誘導(dǎo)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體MfTIL的應(yīng)用，其特征在于該應(yīng)用包括用本發(fā)明獲得的MfTIL基因構(gòu)建植物表達(dá)載體；用構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物組織；將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成轉(zhuǎn)基因植物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種黃花苜蓿溫度誘導(dǎo)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體MfTIL及其編碼基因及應(yīng)用，屬于植物基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)獲得MfTIL基因，并將獲得的MfTIL基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，用構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物組織，然后培育成轉(zhuǎn)基因植株。MfTIL基因受低溫和脫落酸刺激的誘導(dǎo)；本發(fā)明提供了利用MfTI基因培育耐寒植物的方法，將該基因在植物過(guò)量表達(dá)后，提高了轉(zhuǎn)基因植物的耐凍性和耐冷性。
文檔編號(hào)C12N15/29GK103059114SQ20121059394
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者郭振飛, 涂慶華, 何雪英 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)