專利名稱：：一種微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本實用新型涉及一種檢測試劑盒，尤其是涉及一種微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：微衛(wèi)星(microsatellites)是遍布于人類基因組中同一脫氧寡核苷酸重復(fù)串聯(lián)而成的片段，重復(fù)順序為I6bp，重復(fù)次數(shù)不超過60次，片段長度通常小于350bp，在人群中表現(xiàn)出高度的個體特異性，并且穩(wěn)定遺傳。人類基因組中包含數(shù)萬個微衛(wèi)星位點，由于它們一般處于可積累中性突變的非編碼DNA區(qū)域，在人群中呈現(xiàn)高度多態(tài)性。微衛(wèi)星多態(tài)性是微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatelliteinstability,MSI)的表現(xiàn)。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性表現(xiàn)于同一微衛(wèi)星位點在不同個體之間以及同一個體的正常組織與某些異常組織之間，微衛(wèi)星位點的重復(fù)單位的數(shù)目不同。。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的產(chǎn)生原因可能是DNA復(fù)制過程中的“鏈滑”現(xiàn)象。DNA復(fù)制過程中，當(dāng)復(fù)制復(fù)合物復(fù)制一個重復(fù)單位(repeatunit)后,子鏈與模板鏈分離，然后與下一個或下幾個重復(fù)單位重新結(jié)合，使一個或幾個重復(fù)單位形成”環(huán)凸”。正常情況下該結(jié)構(gòu)可被錯配修復(fù)系統(tǒng)(mismatchrepairsystem)所校正,但校正系統(tǒng)失常時，子鏈DNA如繼續(xù)延伸即可引起突變。公認(rèn)研究指標(biāo)(1997年美國國立癌癥學(xué)會工作組提供)顯示，直接對BAT-25、BAT-26、D5S346、D2S123及D17S250共5個位點進行檢測，若其中有2項突變則為MSI-H(HighfrequencyMSI)狀態(tài)，靈敏度及特異度均會顯著提高，同時MSI腫瘤多位于位于近端結(jié)腸，腫瘤體積大，分化差，粘液腺癌多見，常有淋巴細(xì)胞浸潤。進一步講，MSI-H常見于大部分的遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌(HNPCC)及少部分散發(fā)性大腸癌，兩者合計約占腸癌的30%[7]ο總體來講,與MSI-H相比,MSI-L(LowfrequencyMSI)MSS(microsatellitestable)腫瘤患者的預(yù)后較差，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)常見。因此，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測對于結(jié)直腸癌預(yù)后評價及化療反應(yīng)性有重要意義。而檢測MSI常用的方法有變性凝膠電泳、變性高效液相色譜分析等，但這些方法敏感性較低。而且方法不十分穩(wěn)定，難以在臨床廣泛應(yīng)用。所以探索一種檢測微衛(wèi)星不穩(wěn)定性快速可靠的方法已經(jīng)成為臨床實驗研究的熱點問題。
實用新型內(nèi)容為了解決上述技術(shù)問題，本實用新型提供一種微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測試劑盒，包括盒體I、盒蓋2、引物試劑瓶3、酶混合物試劑瓶4、去離子水管5、PCR管6和設(shè)置在盒體I上的擋板7。所述擋板用來卡住引物試劑瓶3、酶混合物試劑瓶4、去離子水管5、PCR管6，使其固定。所述引物為特異性擴增BAT-25、BAT-26、D5S346、D2S123及D17S250這5個位點的引物。擴增BAT-25位點的上游引物是5'-TCGCCTCCAAGAATGTAAGT-3'，下游引物是5'-TCTGCATTTTAACTATGGCTC-3'，引物量為Ipmol;擴增BAT-26位點的上游引物是5'-TGACTACTTTTGACTTCAGCC-3'，下游引物是5'-AACCATTCAACATTTTTAACCC-3'，引物量為Ipmol;擴增D2S123位點的上游引物是5'-AAACAGGATGCCTGCCTTTA-3/，下游引物是5/-GGACTTTCCACCTATGGGAC-3'，引物量為Ipmol;擴增D17S250上游引物是5'-GGAAGAATCAAATAGACAAT-3'，下游引物是5'-GCTGGCCATATATATATTTAAACC-3'，引物量為IOpmol;擴增D5S346上游引物是5'-ACTCACTCTAGTGATAAATCGGG-3'，下游引物是5'-AGCAGATAAGACAGTATTACTAGTT-3'，引物量為Ipmol。所述酶混合物包括濃度為O.4mmol/L的dNTPs，3mmol/L的Mg2+，2X緩沖液(2Xbuffer)，I.25U/25μI的rTaq。本實用新型與現(xiàn)有產(chǎn)品相比，具有如下積極有益的效果本試劑盒結(jié)構(gòu)簡單、設(shè)計合理、使用方便、制造容易、檢測過程不易受污染；本試劑盒在檢測微衛(wèi)星不穩(wěn)定性時具有敏感性高、特異性強、耗時短等優(yōu)點。圖I為本實用新型的整體結(jié)構(gòu)示意圖。具體實施方式以下結(jié)合附圖和實施例對本實用新型進行進一步說明。表I為本實用新型PCR反應(yīng)體系。如圖I所示，本實用新型的一個實施例為一種微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測試劑盒，包括盒體I、盒蓋2、引物試劑瓶3、酶混合物試劑瓶4、去離子水管5、PCR管6和設(shè)置在盒體I上的擋板7。所述擋板用來卡住引物試劑瓶3、酶混合物試劑瓶4、去離子水管5、PCR管6，使其固定。所述引物為特異性擴增BAT-25、BAT-26、D5S346、D2S123及D17S250這5個位點的引物。擴增BAT-25位點的上游引物是5'-TCGCCTCCAAGAATGTAAGT-3'，下游引物是5'-TCTGCATTTTAACTATGGCTC-3'，引物量為Ipmol;擴增BAT-26位點的上游引物是5'-TGACTACTTTTGACTTCAGCC-3'，下游引物是5'-AACCATTCAACATTTTTAACCC-3'，引物量為Ipmol;擴增D2S123位點的上游引物是5'-AAACAGGATGCCTGCCTTTA-3/，下游引物是5/-GGACTTTCCACCTATGGGAC-3'，引物量為Ipmol;擴增D17S250上游引物是5'-GGAAGAATCAAATAGACAAT-3'，下游引物是5'-GCTGGCCATATATATATTTAAACC-3'，引物量為IOpmol;擴增D5S346上游引物是5'-ACTCACTCTAGTGATAAATCGGG-3'，下游引物是5'-AGCAGATAAGACAGTATTACTAGTT-3'，引物量為Ipmol。所述酶混合物包括濃度為O.4mmol/L的dNTPs,3mmol/L的Mg2+,2xbuffer,I.25U/25μI的rTaqο操作方法I)取模板DNA取病人全血Iml和病灶石蠟切片，常規(guī)提取DNA，取IulDNA作為模板。2)反應(yīng)體系將各反應(yīng)物質(zhì)按照如下表I中反應(yīng)體系進行配比表I[0022]權(quán)利要求1.一種微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測試劑盒，其特征在于，包括盒體(I)、盒蓋(2)、引物試劑瓶(3)、酶混合物試劑瓶(4)、去離子水管(5)、PCR管(6)和設(shè)置在盒體(I)上的擋板(7)。專利摘要本實用新型公開一種微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測試劑盒，包括盒體1、盒蓋2、引物試劑瓶3、酶混合物試劑瓶4、去離子水管5、PCR管6、擋板7。本試劑盒結(jié)構(gòu)簡單、設(shè)計合理、使用方便、制造容易、檢測過程不易受污染；本試劑盒在檢測微衛(wèi)星不穩(wěn)定性時具有敏感性高、特異性強、耗時短等優(yōu)點。文檔編號C12M1/34GK202519251SQ20122016470公開日2012年11月7日申請日期2012年4月17日優(yōu)先權(quán)日2012年4月17日發(fā)明者井昶雯,吳建中,唐金海,曹海霞,王卓申請人:井昶雯,吳建中,唐金海,曹海霞,王卓