專(zhuān)利名稱(chēng)：梅毒螺旋體tmpA基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種試劑盒，尤其是涉及一種梅毒螺旋體tmpA基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
梅毒(Syphilis)是一種由梅毒螺 旋體(Treponema pallidum, TP)引起的性傳播疾病，其病原體是梅毒螺旋體，屬螺旋體科。梅毒螺旋體主要通過(guò)性接觸、輸血、創(chuàng)口或者胎盤(pán)等途徑傳播。梅毒螺旋體從感染區(qū)附近的淋巴結(jié)進(jìn)入血液播散全身，使機(jī)體幾乎所有的組織及器官受累，臨床表現(xiàn)為全身性的，可分為不同臨床階段，包括一期、二期、三期和潛伏期。世界衛(wèi)生組織(WHO)曾樂(lè)觀地預(yù)言([1]WH0. Global prevalence andincidence of selected curable sexually transmitted infections:Overview andestimates [J] · Geneva: WHO, WH0/HIV/AIDS, 2001:1-30.):“ 由于有高靈敏度檢測(cè)方法和高效的治療方案，梅毒是一種能夠通過(guò)公共衛(wèi)生措施得到成功控制的性傳播性疾病”。遺憾的是，由于至今仍然缺乏高靈敏的檢測(cè)方法和高效的治療方案，梅毒依然是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的全世界范圍的公共衛(wèi)生問(wèn)題。中國(guó)疾病控制中心的官方數(shù)據(jù)顯示2010年我國(guó)梅毒(Syphilis)的發(fā)病數(shù)為375309例，比2009年同期增長(zhǎng)24. 50%。報(bào)告發(fā)病數(shù)僅次于病毒性肝炎和肺結(jié)核居第三位，居于性傳播疾病首位(中國(guó)疾控中心http://www.chinacdc. net. cn)。近年來(lái),有關(guān)梅毒與艾滋病之間存在著互相促進(jìn)的研究結(jié)果([2]Buchacz, K. , Klausner, J. D. , Kerndt, P. R. , et al. McElroy, P. D. and Schwendemann, J. HIVincidence among men diagnosed with early syphilis in Atlanta, San Francisco, andLos Angeles, 2004to 2005[J] · Jaids-J Acq Tmm Def,2008, 47(2):234-240. [3]Ghanem, K.G. , Erbelding, E. J. , Wiener, Z. S. , et al. Serological response to syphilis treatmentin HIV-positive and HIV-negative patients attending sexually transmitteddiseases clinics [J]. Sex Transm Infect, 2007，83 (2) :97-101.),使得梅毒的控制越發(fā)困難而且重要。無(wú)疑，人們對(duì)梅毒的防控過(guò)于樂(lè)觀，對(duì)梅毒的認(rèn)識(shí)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。盡管青霉素成功應(yīng)用于治療各期梅毒已經(jīng)有50年歷史，但治療失敗可見(jiàn)于任何一種被推薦的治療方案。林麗蓉等([4]林麗蓉，楊波，潘錫濤，等.潛在的血源傳播患者梅毒血清學(xué)檢測(cè)方法的選擇[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2010，. 20(10) :1491-1494)在對(duì)健康體檢者、門(mén)診患者和潛在血源傳播患者梅毒血清學(xué)調(diào)查中均發(fā)現(xiàn)，這些人群存在一定比例的梅毒感染率，推測(cè)本地區(qū)人群梅毒的檢出率應(yīng)該在2. 59%以上。顯然，梅毒感染者已經(jīng)較廣泛地存在于普通人群中。梅毒正以過(guò)去500年任何國(guó)家和地區(qū)都未曾有過(guò)的速度在中國(guó)傳播，由于存在隱性感染以及無(wú)法統(tǒng)計(jì)的私人診所患者患病率，目前看到的梅毒發(fā)病率或許只是梅毒現(xiàn)狀的冰山一角([5]Lin, L. R. , Fu, Z. G. , Dan, B. , Jing, et al. Developmentof a colloidal gold—immunochromatography assay to detect immunoglobulin Gantibodies to Treponema pallidum with TPN17 and TPN47[J]. Diagn Micr InfecDis, 2010，68(3) : 193-200. [6]Tucker JD, C. X. , Peeling RW. Syphilis and socialupheaval in china[J]. N Engl J Med, 2010, 362(18):1658-1661. [7]Chen, Z. Q. , Zhang, G.
C., Gong, X. D. , Lin, C. , Gao, X. , Liang, G. J. , Chen, X. S. , and Cohen, M. S. Syphilis inchina:Results of a national surveillance programme[J]. Lancet, 2007, 369:132-138.[8]Li-Rong Lin,Man-Li Tong,Zuo-Gen Fu,et al. Evaluation of a colloidalgold—immunochromatography assay in the detection of Treponema Pallidm specificIgM antibody in syphilis serofast reaction patients:a serologic marker for therelapse and infection of syphilis[J]. Diagnostic Microbiology and InfectiousDisease. 2011, 70:10- 16)。實(shí)驗(yàn)室檢查是診斷梅毒必不可少的方法，也是判斷療效和復(fù)發(fā)的重要依據(jù)，包括暗視野顯微鏡檢查和血清學(xué)試驗(yàn)。梅毒螺旋體感染早期，梅毒抗體還未產(chǎn)生或含量較低時(shí)，暗視野顯微鏡查找螺旋體成為最早的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，但敏感度較低，且易受肛門(mén)周?chē)侵虏÷菪w的影響而產(chǎn)生假陽(yáng)性。梅毒螺旋體尚不能進(jìn)行體外培養(yǎng)，梅毒診斷與流行病學(xué)調(diào)查主要依賴(lài)于血清學(xué)試驗(yàn)，包括特異性抗體和反應(yīng)素檢測(cè)兩大類(lèi)型。反應(yīng)素檢測(cè)對(duì)早期梅毒檢測(cè)靈敏度不高，而且生物假陽(yáng)性率較高，是主要用于療效觀察的一項(xiàng)血清學(xué)指標(biāo)([9]林麗蓉，但冰，付左根，等.潛在血源傳播患者梅毒血清學(xué)TRUST/TPPA與IgM抗體聯(lián)合檢測(cè).中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志.2010，152(05):446-448)。梅毒特異性抗體檢測(cè)的敏感性和特異性均較反應(yīng)素高。但是，梅毒特異性抗體檢測(cè)仍然存在著靈敏度不足的缺陷，尤其是早期梅毒患者抗體滴度較低。如果能建立一種方法能靈敏、特異和快速檢測(cè)到梅毒患者各類(lèi)組織、體液中存在梅毒螺旋體，能證明梅毒螺旋體存在，那么這些棘手問(wèn)題將迎刃而解。兔睪丸是梅毒螺旋體易感器官，少量梅毒螺旋體即可導(dǎo)致兔睪丸炎，因此，兔感染試驗(yàn)被視為梅毒螺旋體檢測(cè)的最靈敏的方法。然而，兔感染試驗(yàn)操作繁瑣，觀察時(shí)間要求3個(gè)月，甚至更長(zhǎng)時(shí)間才能得到結(jié)果，臨床可操作性差。PCR擴(kuò)增技術(shù)以梅毒螺旋體特異性的基因片段做為擴(kuò)增模板，通過(guò)指數(shù)擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)了病原體的快速檢測(cè)，具有高效、靈敏和特異等優(yōu)勢(shì)。從理論上分析，通過(guò)優(yōu)化、改良PCR擴(kuò)增技術(shù)，其檢測(cè)的靈敏度和特異性可以媲美兔感染試驗(yàn)，而檢測(cè)時(shí)間僅僅需要2個(gè)小時(shí)([10]HAYP E, CLARKE JR,TAYL0R-R0BINS0N D, et al. Detection of treponemal DNA in the csf of patientswith syphilis and hiv infection using the polymerase chain reaction [J].Genitourin Med, 1990，66 (6) : 428-32)，有望成為解決這些棘手問(wèn)題的最佳方法。.盡管?chē)?guó)內(nèi)外有些企業(yè)研發(fā)出梅毒PCR檢測(cè)試劑，但尚未有進(jìn)入臨床應(yīng)用的有注冊(cè)文號(hào)PCR檢測(cè)試劑，而僅僅停留在科研應(yīng)用。更嚴(yán)重的是，目前的PCR檢測(cè)試劑在研發(fā)過(guò)程中由于未經(jīng)嚴(yán)格的比對(duì)試驗(yàn)，無(wú)一例外的存在靈敏度和特異性嚴(yán)重不足，其準(zhǔn)確性不高，是目前梅毒PCR技術(shù)在臨床中應(yīng)用的瓶頸。tmpA基因編碼梅毒螺旋體的膜蛋白，在梅毒感染免疫中具有重要作用，研究顯示該基因編碼蛋白抗體滴度與梅毒螺旋體的再感染及耐藥有關(guān)([ll]Yelton，D，Limberger,RJ, Curci, K, et al. Treponema phagedenis encodes and expresses homologsof the Treponema pallidum TmpA and TmpB proteins.Infection and immunity,1991. 59(10) :3685.)，應(yīng)用tmpA基因檢測(cè)標(biāo)本中的DNA，在梅毒早期快速診斷、療效判斷、療程選擇、神經(jīng)梅毒確診、胎傳梅毒診斷，以及獻(xiàn)血員、孕產(chǎn)婦、婚前體檢、手術(shù)患者和輸血前篩查等領(lǐng)域發(fā)揮重大作用，有著目前常用的血清學(xué)檢測(cè)不可比擬的優(yōu)勢(shì)，將逐漸替代這些方法或作為這些方法的驗(yàn)證試驗(yàn)，具有廣闊的應(yīng)用前景和重要的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
發(fā)明內(nèi)容本實(shí)用新型的目的是提供一種梅毒螺旋體tmpA基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒。本實(shí)用新型設(shè)有DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應(yīng)液瓶、標(biāo)準(zhǔn)品瓶、質(zhì)控品瓶和包裝盒；所述DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應(yīng)液瓶、標(biāo)準(zhǔn)品瓶和質(zhì)控品瓶設(shè)在包裝盒內(nèi)；所述DNA提取試劑瓶設(shè)有蛋白酶K瓶、裂解液瓶、無(wú)水乙醇瓶、抑制物去除液瓶、第I清洗緩沖液瓶、洗脫液 瓶、第2清洗緩沖液瓶和含收集管的離心柱；所述標(biāo)準(zhǔn)品瓶設(shè)有6個(gè)含tmpA基因的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒瓶；所述質(zhì)控品瓶設(shè)有陰性質(zhì)控品瓶和陽(yáng)性質(zhì)控品瓶。所述耐熱DNA聚合酶瓶可采用Tag酶瓶。所述陰性質(zhì)控品為不含梅毒螺旋體DNA的樣品，陽(yáng)性質(zhì)控品為含梅毒螺旋體DNA的樣品。所述6個(gè)含tmpA基因的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的濃度可分別為I. O X 102copies/mL、I. OX IO3Cop ies/mL、I. OX 104copies/mL、I. 0X105copies/mL、l. 0 X 106copi es/mL 和1.0X 107copies/mL,共 6 個(gè)濃度。所述PCR反應(yīng)液的成份含有PCR緩沖液、MgCl2, dNTPs和tmpA基因引物、探針組成的混合物。所述耐熱DNA聚合酶(Tag酶)具有V - DNA聚合酶活性、5 ^ — 3' DNA外切核酸酶活性和可耐受高溫的聚合酶；所述耐熱DNA聚合酶(Tag酶)最好是半衰期>45min的高溫聚合酶。以下給出本實(shí)用新型的制備方法I)靶基因篩選，具體方法如下從基因庫(kù)(GENBANK)中篩選梅毒螺旋體tmpA基因，tmpA基因探針和引物的設(shè)計(jì)采用 PCR 引物探針設(shè)計(jì)軟件 primer premier 5.0、Oligo 6· O、TM Utility vl. 3、Clustal X等設(shè)計(jì)軟件輔助完成，然后通過(guò)Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)進(jìn)行同源性比對(duì)以保證其特異性，合成的引物和探針用TE溶解，使用ND-1000UV-VIS波長(zhǎng)紫外/可見(jiàn)光掃描分光光度計(jì)進(jìn)行濃度測(cè)定后，保存，所述TE為IOmM Tri-HCl，pH5. 0,0. ImM TA ；2) tmpA基因標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的構(gòu)建，具體方法如下以硅膠膜-離心柱法提取梅毒螺旋體Nichols株DNA作為模板，采用步驟I)中的tmpA基因的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體過(guò)程如下將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)回收及純化后，在微量離心管中配制DNA溶液,后加入5 μ L等量的Solution 1,16°C反應(yīng)30min,與pMD18_T載體連接將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5 α中，冰中放置30min，42°C加熱45s后，再在冰中放置Imin，力口入LB培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)60min后，在含有X_Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落，挑選白色菌落，進(jìn)行增殖培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并對(duì)其進(jìn)行PCR，Xab I和Sal I雙酶切及測(cè)序鑒定后，將構(gòu)建好的質(zhì)粒進(jìn)行單酶切線性化處理，再用紫外分光光度計(jì)定量并_20°C保存作為FQ-PCR的標(biāo)準(zhǔn)品；3) tmpA基因檢測(cè)試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線制作，其具體方法如下包含tmpA基因的陽(yáng)性克隆大腸桿菌在含Amp LB肉湯增菌，提取質(zhì)粒，取10 μ L質(zhì)粒用雙蒸水稀釋100倍,260nm, 280nm比色，純度=A26(I/A28(I,濃度=A260X 50 X 2 X 100 X IO-6X 6. 02 X IO23/(2806 X 324. 5 X 2) copies/mL,根據(jù)質(zhì)粒濃度，進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)悦總€(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品作模板進(jìn)行熒光定量反應(yīng)，確定線性范圍；4)制備PCR反應(yīng)液，其具體方法如下采用PCR緩沖液、MgCl2, dNTPs、tmpA基因引物、探針的混合物共同組成PCR反應(yīng)液；5)制備耐熱DNA聚合酶， 其具體方法如下大腸桿菌用異丙基硫代_β-D半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)后的菌懸液IOOml 經(jīng) 5000r/min, 4°C離心 5min,以 IOml 緩沖液 I 重懸菌液，4°C，5000r/min,離心 5min,細(xì)菌沉淀再懸于5ml緩沖液I中，加入溶菌酶(Lys)使?jié)舛冗_(dá)5mg/ml，37°C水浴20min ;力口入5ml緩沖液II，75°C水浴45min,4°C, 15000r/min離心IOmin ;上清加入硫酸銨使達(dá)30%,4°C,1500r/min離心lOmin，沉淀溶于Iml緩沖液III中，并對(duì)緩沖液III在4°C條件下透析，每6h換液I次共4次，離心除去不溶物后，-20°C凍存；6)建立樣品處理方法，其具體方法如下使用梅毒螺旋體tmpA基因FQ-PCR檢測(cè)試劑檢測(cè)梅毒螺旋體的樣本，采用硅膠膜-離心柱法提取模板DNA ；7)制備質(zhì)控品，其具體方法如下制備陰性質(zhì)控品選擇經(jīng)過(guò)臨床確認(rèn)為陰性的臨床標(biāo)本；制備陽(yáng)性質(zhì)控品選擇經(jīng)過(guò)臨床確認(rèn)為陽(yáng)性的臨床標(biāo)本經(jīng)稀釋獲得陽(yáng)性質(zhì)控品；8)制備梅毒螺旋體tmpA基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒，將DNA提取試劑、耐熱DNA聚合酶、PCR反應(yīng)液、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品共同組成梅毒螺旋體tmpA基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒。在步驟I)中，所述tmpA基因探針和引物的序列如表I所不。表I
權(quán)利要求1.梅毒螺旋體tmpA基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于設(shè)有DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應(yīng)液瓶、標(biāo)準(zhǔn)品瓶、質(zhì)控品瓶和包裝盒；所述DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應(yīng)液瓶、標(biāo)準(zhǔn)品瓶和質(zhì)控品瓶設(shè)在包裝盒內(nèi)；所述DNA提取試劑瓶設(shè)有蛋白酶K瓶、裂解液瓶、無(wú)水こ醇瓶、抑制物去除液瓶、第I清洗緩沖液瓶、洗脫液瓶、第2清洗緩沖液瓶和含收集管的離心柱；所述標(biāo)準(zhǔn)品瓶設(shè)有6個(gè)含tmpA基因的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒瓶；所述質(zhì)控品瓶設(shè)有陰性質(zhì)控品瓶和陽(yáng)性質(zhì)控品瓶。
專(zhuān)利摘要梅毒螺旋體tmpA基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒，涉及一種試劑盒。試劑盒設(shè)有DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應(yīng)液瓶、標(biāo)準(zhǔn)品瓶、質(zhì)控品瓶和包裝盒；DNA提取試劑瓶設(shè)有蛋白酶K瓶、裂解液瓶、無(wú)水乙醇瓶、抑制物去除液瓶、第1清洗緩沖液瓶、洗脫液瓶、第2清洗緩沖液瓶和含收集管的離心柱；標(biāo)準(zhǔn)品瓶設(shè)有6個(gè)含tmpA基因的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒瓶；質(zhì)控品瓶設(shè)有陰性質(zhì)控品瓶和陽(yáng)性質(zhì)控品瓶。先篩選靶基因，再構(gòu)建tmpA基因標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，制作tmpA基因檢測(cè)試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線后，先后制備PCR反應(yīng)液、耐熱DNA聚合酶，建立樣品處理方法后，制備質(zhì)控品，最后完成梅毒螺旋體tmpA基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK202576437SQ20122020360
公開(kāi)日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2012年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月8日
發(fā)明者劉莉莉, 林麗蓉, 張長(zhǎng)弓, 童曼莉, 徐竟波, 楊天賜 申請(qǐng)人:廈門(mén)大學(xué)附屬中山醫(yī)院