專利名稱：華法林個性化用藥基因測序試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種檢測基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的試劑盒，具體涉及一種華法林個性化用藥基因測序試劑盒。
背景技術(shù)：
華法林是臨床應用最廣泛的口服抗凝藥物，主要用于深靜脈血栓形成、肺栓塞、房顫、心臟瓣膜置換術(shù)后等抗凝治療。華法林個體差異大、治療窗口窄，因而調(diào)整或確定華法林劑量、避免出血等不良反應的發(fā)生一直是臨床上抗凝治療管理的重點和難點。研究發(fā)現(xiàn)，患者由于抗凝過量所導致的致命性出血的發(fā)生幾率為4. 4 9. 3%，而且隨著抗凝強度的增大由此產(chǎn)生并發(fā)癥的概率也會隨著增高。目前主要靠監(jiān)測患者的國際標準化比值(INR) 來調(diào)整用藥劑量。隨著遺傳藥理學的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)編碼華法林的靶酶VKORCl和代謝酶CYP2C9的基因遺傳多態(tài)性是影響華法林用藥劑量差異性的主要因素，而且在很大程度上解釋了華法林的個體差異和種族差異。以遺傳藥理為基礎的藥物劑量調(diào)整得到各方面的重視，美國FDA建議華法林在用藥前應做相關(guān)基因型檢測，從而可以做到個性化給藥。華法林有兩種構(gòu)象R和S。其中S -華法林的作用占60-70%，而R -華法林只有30-40%。S-華法林主要由6 ⑶代謝生成無活性的代謝產(chǎn)物。影響華法林用藥量的位點有很多，如VKORCl等，CYP2C9的基因多態(tài)性與華法林劑量間的關(guān)系早已被證實。亞洲人種常見的突變型為CYP2C9*30 CYP2C9*3突變導致CYP2C9酶活性降低，其活性僅為野生型的5%，突變均降低了酶活性，使其底物的清除率降低，血藥濃度升高，因此，需降低用藥劑量，以防止不良反應的發(fā)生。⑶可以解釋20%的華法林劑量；維生素K環(huán)氧化物還原酶(VKOR)是華法林作用的靶點，也是維生素K依賴性凝血因子生成的限速酶，目前已有一系列VKORCl的單核苷酸多態(tài)性與華法林劑量的相關(guān)性報道。VKORCl激活VKORC，隻變型的啟動子活性高，VKORC的活性變高，凝血作用高，華法林的用量變大。VK0RC13673GG劑量較高，而GA，AA劑量依次降低。VKORCl基因多態(tài)性是影響華法林用藥劑量個體差異和種族差異的主要因素。VKORCl可以解釋30%的華法林劑量。目前，基于華法林個體用藥的差異及用藥過多或是過少出現(xiàn)的的出血、血栓等危險現(xiàn)象，現(xiàn)在很多醫(yī)療機構(gòu)也開始對患者進行華法林用藥前做相關(guān)的基因檢測，以下是一些相關(guān)基因檢測試劑盒的專利，但存在或檢測位點不全面，或使用不方便等的問題。
發(fā)明內(nèi)容本實用新型所要解決的技術(shù)問題是提供一種使用方便，檢測全面準確，方便保存運輸，成本相對較低的華法林個性化用藥基因測序試劑盒。為解決上述技術(shù)問題，本實用新型所采用的技術(shù)方案為華法林個性化用藥基因測序試劑盒，包括盒體、襯墊,所述的襯墊設于盒體內(nèi)，所述襯墊上橫向或縱向排布有與檢測位點個數(shù)相應的數(shù)組樣品孔，每組樣品孔中樣品孔的個數(shù)至少為三個，分別放置封裝有與檢測位點相對應的PCR擴增正向引物、PCR擴增反向引物、測序引物的樣品管；所述的襯墊中還布設有2個樣品孔，分別放置封裝有Taq酶、PCR反應液的樣品管。按上述方案，所述襯墊上橫向或縱向布設有三組樣品孔，分別與三個檢測位點相對應，所述放置封裝有Taq酶、PCR反應液的樣品管的兩個樣品孔分別設于第一組和第二組樣品孔之間、第二組和第三組樣品孔之間。本實用新型的有益效果(I)本試劑盒通過橫向或縱向排布與檢測位點個數(shù)相對應的多組樣品孔，在各組樣品孔中間至少布設三個樣品孔，分別放置與檢測位點相對應的PCR擴增正向引物、PCR擴增反向引物、測序引物，方便使用者獲取及測定完成后進行有序相應放回，使用方便；(2)本試劑盒還另外設有設有2個樣品孔，分別封裝有Taq酶、PCR反應液的樣品管，可大大方便使用者的使用，提高檢測效率；(3)本試劑盒中的測序引物和PCR擴增引物以凍干粉的形式儲存于樣品管內(nèi)，方便保存和運輸，降低成本。

圖I為本實用新型實施例I的華法林個性化用藥基因測序試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖。圖中I盒體；2襯墊；3樣品孔組；4樣品孔。
具體實施方式
以下結(jié)合附圖和實施例對本實用新型的發(fā)明內(nèi)容進行進一步地說明。實施例I如圖I所示華法林個性化用藥基因測序試劑盒，包括盒體1，襯墊2，所述的襯墊設于盒體內(nèi)，所述襯墊上縱向排布有三組樣品孔組3，分別與三個不同的檢測位點相對應，如VKORCl、CYP2C9氺2和CYP2C9*3,每組樣品孔中樣品孔的個數(shù)為三個，分別放置封裝有與檢測位點相對應的PCR擴增正向引物、PCR擴增反向引物、測序引物的樣品管；所述第一組和第二組樣品孔之間、第二組和第三組樣品孔之間分別設有一個樣品孔4，分別放置封裝有Taq酶的樣品管、封裝有PCR反應液的樣品管。所述的測序引物和PCR擴增正向引物、PCR擴增反向引物均以凍干粉的形式儲存于樣品管內(nèi)。本試劑盒保存于-4°C，盡量減少反復凍融。華法林個性化用藥基因測序試劑盒的具體使用方法(I)第一次使用時，首先打開華法林個性化用藥基因測序試劑盒，將盒內(nèi)裝PCR擴增正向引物、PCR擴增反向引物的樣品管取出，進行短暫離心，再加純水對引物進行稀釋。為了避免反復凍融而影響引物質(zhì)量，建議先將引物稀釋到20umol/L，然后分裝到不同的離心管中，貼好標簽保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r，取出，等到完全溶解后再吸取，配制使體系中引物的終濃度達到10 100pmol/L即可使用。(2)配制 PCR 體系 50uL :模板 DNA 0. 2 I ug ；Taq 酶0. 5ul (5U/uL) ；PCR 引物(F，R)各Iul，PCR反應液9 uL，加入無菌純水，補齊至50uL，配制好以后渦旋震蕩使其混勻。(3)進行PCR程序95 V預變性5分鐘；然后94 V變性30秒，60 °〇復性I分鐘，72°C延伸I分鐘，如此30個循環(huán)；再72 V延伸7分鐘。(4 ) PCR結(jié)束，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。進行測序反應時，測序引物的稀釋同上述PCR擴增引物稀釋方法，然后進行后續(xù)測序步驟；使用者可根據(jù)自己的測序儀型號對測序反應體系中的參數(shù)設置，進行配套設置。通過對華法林用藥者的基因檢測，能夠更準確地估計華法林的劑量，降低治療 引導階段華法林過量的風險，并縮短華法林達到穩(wěn)定治療的時間。
權(quán)利要求1.華法林個性化用藥基因測序試劑盒，包括盒體、襯墊，所述的襯墊設于盒體內(nèi)，其特征在于所述襯墊上橫向或縱向排布有與檢測位點個數(shù)相應的數(shù)組樣品孔，每組樣品孔中樣品孔的個數(shù)至少為三個，分別放置封裝有測序弓丨物和與檢測位點相對應的PCR擴增正向引物、反向引物的樣品管；所述的襯墊中還布設有2個樣品孔，分別放置封裝有Taq酶、PCR反應液的樣品管。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的華法林個性化用藥基因測序試劑盒，其特征在于所述襯墊上橫向或縱向布設有三組樣品孔，分別與三個檢測位點相對應，所述放置封裝有Taq酶、PCR反應液的樣品管的兩個樣品孔分別設于第一組和第二組樣品孔之間、第二組和第三組樣品孔之間。
專利摘要本實用新型涉及一種華法林個性化用藥基因測序試劑盒。華法林個性化用藥基因測序試劑盒，包括盒體、襯墊，所述的襯墊設于盒體內(nèi)，其特征在于所述襯墊上橫向或縱向排布有與檢測位點個數(shù)相應的數(shù)組樣品孔，每組樣品孔中樣品孔的個數(shù)至少為三個，分別放置封裝有測序引物和與檢測位點相對應的PCR擴增正向引物、反向引物的樣品管；所述的襯墊中還布設有2個樣品孔，分別放置封裝有Taq酶、PCR反應液的樣品管。該華法林個性化用藥基因測序試劑盒使用方便，檢測全面準確，方便保存運輸，成本相對較低。
文檔編號C12Q1/68GK202730128SQ20122031760
公開日2013年2月13日 申請日期2012年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月3日
發(fā)明者徐謀勝, 李兵, 王珊, 袁雅燕, 王寧 申請人:湖北維達健基因技術(shù)有限公司