獲得和維持易于在體外分化成少突膠質(zhì)細胞譜系細胞的純化或富集的哺乳動物神經(jīng)干細 ...的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了分離的可擴增的人神經(jīng)干細胞或祖細胞，其中所述細胞為祖細胞或干細胞，保持了其分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的能力，保持了其在整個后續(xù)傳代中有效分化為少突膠質(zhì)細胞譜系細胞的能力，并且所述細胞至少表達細胞表面抗原CD133和CD140α。本發(fā)明還提供了一種在體外培養(yǎng)分離自哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可擴增的神經(jīng)祖細胞或干細胞的方法，以及培養(yǎng)物本身，其中所述細胞保持其分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、和少突膠質(zhì)細胞的能力以及其有效分化為少突膠質(zhì)細胞譜系細胞的能力。此外，本發(fā)明還提供了治療髓磷脂缺失或少突膠質(zhì)細胞缺失所造成病況的方法，也提供了組合物，所述組合物包含分離的可擴增的神經(jīng)干細胞或通過本發(fā)明方法培養(yǎng)的分離的可擴增的神經(jīng)干細胞。
【專利說明】獲得和維持易于在體外分化成少突膠質(zhì)細胞譜系細胞的純
化或富集的晡乳動物神經(jīng)干細胞群和/或神經(jīng)祖細胞群的
培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明一般涉及神經(jīng)干細胞和神經(jīng)祖細胞的細胞生物學領域。具體而言，本發(fā)明提供了純化的或富集的哺乳動物神經(jīng)干細胞群和/或神經(jīng)祖細胞群，該細胞群易于在體外分化成少突膠質(zhì)細胞譜系細胞(oligodendrocyte-1 ineage cells),并且該細胞群適用于生物學研究、藥物篩選和人類治療。
[0002]與相關申請的交叉引用
[0003]本申請與2011年I月12日提交的美國臨時專利申請61/431，944和2011年11月11日提交的美國臨時專利申請61/558，527相關。
[0004]關于聯(lián)邦資助的研發(fā)的說明
[0005]不適用。
【背景技術】
[0006]中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)展過程中，原始、多能神經(jīng)干細胞(NSC)增殖，產(chǎn)生瞬時分裂的祖細胞，祖細胞最終分化成組成成人大腦的各種細胞類型。成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要由神經(jīng)元和包括星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的神經(jīng)膠質(zhì)細胞構成。正在發(fā)育的腦中，(最終分化為)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的祖細胞順序地從神經(jīng)干細胞中產(chǎn)生(見圖1)。神經(jīng)元祖細胞首先形成并分化成多種類型的神經(jīng)元。然后星形膠質(zhì)細胞發(fā)展并發(fā)揮支持神經(jīng)元存活的功能。最后，少突膠質(zhì)細胞的祖細胞開始出現(xiàn)并在整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)中遷移。然后，他們分化為成熟的少突膠質(zhì)細胞，這些成熟的少突膠質(zhì)細胞產(chǎn)生正常的神經(jīng)功能所必需的髓磷脂。
[0007]由于少突膠質(zhì)細胞在支持中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，純化或富集的少突膠質(zhì)細胞群或其前體細胞(即少突膠質(zhì)細胞前祖細胞和/或少突膠質(zhì)細胞祖細胞)群可用作細胞治療和再生藥物，例如治療神經(jīng)疾病，包括先天性脫髓鞘疾病(例如，克拉貝氏(Krabbe)病或佩-梅(Pelizaeus-Merzbacher)病)、脊髓損傷和其它源于隔離神經(jīng)細胞的髓鞘的缺陷導致的疾病。這些細胞也可以用于研究和確定用于治療許多神經(jīng)疾病如多發(fā)性硬化和精神分裂癥的新藥物。
[0008]成熟的少突膠質(zhì)細胞不增殖，培養(yǎng)中也不易存活，從組織樣本中直接獲得數(shù)量上足夠用于研究或人類治療的少突膠質(zhì)細胞是非常困難的。因此，用于這些目的的少突膠質(zhì)細胞的使用受限于這些細胞的缺少。
[0009]針對這個問題 的一種解決方案是從組織中獲得神經(jīng)干細胞和/或神經(jīng)祖細胞，將細胞培養(yǎng)增殖以獲得足夠大量的后續(xù)可分化成少突膠質(zhì)細胞的細胞。分化可在體外或體內(nèi)發(fā)生，例如在移植的情況下。這種方法能夠產(chǎn)生大量的少突膠質(zhì)細胞或其祖細胞或前細胞用于研究和人類治療。
[0010]然而，研究人員一直在努力確定允許少突膠質(zhì)細胞祖細胞或前祖細胞--尤其是來自人類或非人靈長類動物的此類細胞一長期培養(yǎng)和大量擴增的培養(yǎng)條件，其中產(chǎn)生的擴增的細胞群主要由保留了分化成少突膠質(zhì)細胞能力的細胞組成。
[0011]有些科學家報道了從大鼠上獲得少突膠質(zhì)細胞祖細胞(Raff等在1983年J.Neurosci 雜志 3: 1289 ；Raff 等在 1983 年 Nature 雜志 303:390 ；Espinosa de 1sMonteros 等 1993 年在 Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.,90:50)。這些增殖性的少突膠質(zhì)細胞祖細胞由于具有在體外分化成少突膠質(zhì)細胞或2型星形膠質(zhì)細胞的能力而稱為0-2A祖細胞。其他科學家也在原代培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)了大鼠或小鼠的少突膠質(zhì)細胞前祖細胞(Gallo，Armstrong RC 在 1995 年 J.Neurosci 雜志 15:394, Grinspan, Franceschini B 在 1995 年J.Neurosc1.Res 雜志 41:540,Decker 等在 2000 年 Mol.Cell.Neurosci 雜志 16:422)。這些細胞被認為是少突膠質(zhì)細胞祖細胞的前體，由于其與少突膠質(zhì)細胞祖細胞相比具有更高的遷移能力，因此預期這些細胞在細胞治療中更加有益。不幸的是，科學家們一直無法在體外長期有效增殖這些細胞。相反的，科學家們報道了使用B104條件培養(yǎng)基或生長因子組合培養(yǎng)源于大鼠視神經(jīng)或脊髓的02A祖細胞，所述生長因子組合例如(i)血小板衍生生長因子AA (PDGF-AA)與堿性成纖維細胞生長因子(bFGF或堿性FGF)和神經(jīng)營養(yǎng)因子_3 (NT-3)，或(ii)H)GF-AA與睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)和NT-3。但是，尚未有人成功地使用這些生長因子從靈長類動物組織大量擴增這些細胞類型。
[0012]因此，從哺乳動物而非大鼠或小鼠獲得和擴增純化的或富集的少突膠質(zhì)細胞群和/或其前體細胞群仍然是很困難的。從人類和非人靈長類動物獲得和擴增這些細胞尤其困難。因此，非常需要用于產(chǎn)生純化或富集的哺乳動物神經(jīng)干細胞群或祖細胞群的方法，所述細胞群易于在體外分化成少突膠質(zhì)細胞譜系細胞。
發(fā)明概述
[0013]本發(fā)明涉及分離 的可擴增的人神經(jīng)細胞，其中所述細胞是祖細胞或干細胞，其中所述細胞保持其分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、和少突膠質(zhì)細胞的能力，其中所述細胞保持其在整個后續(xù)(多次)傳代中有效分化為少突膠質(zhì)細胞譜系細胞的能力，并且所述細胞至少表達細胞表面抗原⑶133和⑶140 α。
[0014]本發(fā)明還涉及體外培養(yǎng)可擴增的神經(jīng)細胞的方法，其中所述細胞是從哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)分離的祖細胞或干細胞，其中所述細胞保持了其分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、和少突膠質(zhì)細胞的能力以及其有效地分化成少突膠質(zhì)細胞譜系細胞的能力，其中所述方法包括從人胎兒神經(jīng)組織分離和離解(dissociating)至少一個細胞；在溫度為37°C，含有1-20%的O2和5% CO2的氣體環(huán)境下，和化學定義的(chemically defined)無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，其中所述培養(yǎng)基包含至少5ng/ml的TOGF-AA，至少0.5ng/ml的bFGF，和至少ΙΟμΜ的1-硫代甘油；以及傳代所述細胞以獲得可擴增的人神經(jīng)細胞。
[0015]本發(fā)明進一步涉及治療由髓磷脂缺失或少突膠質(zhì)細胞缺失而導致的病況的方法，包括給予受試者治療有效量的組合物，該組合物含有分離的可擴增的人神經(jīng)細胞，所述人神經(jīng)細胞能夠保持其分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、和少突膠質(zhì)細胞的能力，其中所述細胞保持其在隨后傳代期間有效地分化成少突膠質(zhì)細胞譜系細胞的能力，并且其中所述細胞至少表達細胞表面抗原⑶133和⑶140 α。
[0016]本發(fā)明還涉及體外培養(yǎng)物，其包含至少一個從哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)獲得的分離的神經(jīng)細胞，其中所述細胞浸沒在化學定義的無血清培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基具有至少5ng/mlPDGF-AA，至少5ng/ml bFGF，和至少10 μ Ml-硫代甘油。
[0017]本發(fā)明還涉及神經(jīng)干細胞藥物組合物，其包含分離的可擴增的人神經(jīng)細胞。
[0018]另外，本發(fā)明還涉及神經(jīng)干細胞藥物組合物在用于治療病況的藥物中的應用。
[0019]本發(fā)明還涉及體外培養(yǎng)和擴增從哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)分離的神經(jīng)干細胞和/或神經(jīng)祖細胞的方法，其中所述培養(yǎng)和擴增的細胞保持其分化成少突膠質(zhì)細胞譜系細胞的能力。本發(fā)明中的細胞培養(yǎng)物是貼附培養(yǎng)物。
[0020]本發(fā)明還涉及分離的純化或富集的可擴增哺乳動物神經(jīng)干細胞群和/或神經(jīng)祖細胞群，所述細胞群易于在體外分化成少突膠質(zhì)細胞譜系細胞(即，如圖7和圖15所示的蜘蛛網(wǎng)形態(tài)的04-陽性細胞)。
[0021]本發(fā)明還涉及哺乳動物少突膠質(zhì)細胞譜系細胞，所述細胞通過從哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)分離的神經(jīng)干細胞和/或神經(jīng)祖細胞的體外擴增和分化而獲得。
[0022]附圖概述
[0023]圖1顯示了神經(jīng)干細胞和神經(jīng)祖細胞發(fā)育為腦中三種主要的細胞類型-神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞；
[0024]圖2顯示了各種CNS細胞標志物的表達比較；
[0025]圖3在微縮圖(SlideS)A-F顯示了人類胚胎干細胞(克隆#2b)的相差圖象；
[0026]圖4顯示了 HFSC細`胞(克隆#2b)在不同生長因子組合中的擴增率；
[0027]圖5顯示了高劑量的roGF-AA(100ng/ml)和1-硫代甘油對HFSC細胞(克隆#2b)增殖的影響；
[0028]圖6顯示了 HFSC細胞(克隆#2b)的生長曲線；
[0029]圖7在微縮圖A-F顯示了 HFSC細胞在無血清培養(yǎng)基中的自發(fā)分化；
[0030]圖8是倒置顯微鏡拍攝的相差圖像，顯示HFSC細胞(克隆#3)在不同代的形態(tài)；
[0031]圖9顯示了 HFSC細胞(克隆#3)的生長曲線；
[0032]圖10，微縮圖A-F為倒置顯微鏡拍攝的相差圖像，顯示了 HFSC細胞(克隆4A和4B)在不同代的形態(tài)；
[0033]圖11顯示了 HFSC細胞(克隆#4A和4B)的生長曲線；
[0034]圖12微縮圖A-S顯示了未分化的HFSC細胞的免疫表型；
[0035]圖13，微縮圖A-H顯示了流式細胞儀檢測數(shù)據(jù)，說明未分化的HFSC細胞(克隆#2b，13代)的比例；
[0036]圖14顯示了分化的HFSC細胞(克隆#3，15代)的免疫表型；
[0037]圖15，微縮圖A-E顯示了 HFSC細胞(克隆#2b，15代)的分化潛能。
[0038]附圖詳述
[0039]圖1描述了神經(jīng)干細胞和神經(jīng)祖細胞發(fā)育為腦中三種主要的細胞類型-神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。帶箭頭的實線表示一種細胞類型到另一種的進展。從HFSC細胞到神經(jīng)元限制性前體細胞(NRP)的虛線表示HFSC細胞具有較低的最終變成神經(jīng)元細胞的傾向。從HFSC細胞到02A細胞的粗線表示HFSC細胞具有較大的產(chǎn)生少突膠質(zhì)細胞譜系細胞的傾向。如實施例7中所示(參見圖14)多能HFSC細胞分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。實施例2中(參見圖7)和實施例8 (參見圖15)顯示了 HFSC細胞分化成少突膠質(zhì)細胞譜系細胞的傾向。
[0040]圖2顯示了各種CNS細胞標志物的表達比較。本發(fā)明在實施例7 (參考附圖12和13)公開了 HFSC細胞的表型，并在該圖中進行了概括。如下將要討論的，HFSC細胞，與其他細胞類型都不相同，具有神經(jīng)干細胞和少突膠質(zhì)細胞2型星形膠質(zhì)細胞祖細胞(02A)兩種特點。
[0041]圖3在微縮圖A-F顯示了人類胚胎干細胞(克隆#2b)相差圖像。圖3中，微縮圖A表示倒置顯微鏡拍攝的相差圖像，顯示HFSC細胞(克隆#2b)，所述細胞在DMEM/F12和 20ng/ml PDGF-AA 和 10ng/ml bFGF 中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱保持 37 °C，5 % 02，5 % C02，DMEM/F12含有谷氨酰胺和HEPES并添加有B27添加劑(Invitrogen?)，非必需氨基酸(NEAA)(Invitrogen?), 1.5mM 的丙麗酸(Invitrogen?), 55 μ M 的 β-疏基乙醇(Invitrogen?),和ImM N-乙酰-L-半胱氨酸(Sigma)(下文將該組合稱為“HFSCM1培養(yǎng)基”)。所顯示的細胞來自O代，第7天。細胞形成球體，這些球體直接接種到聚鳥氨酸涂層培養(yǎng)板上，在I代沒有分離球體。[0042]在圖3中，微縮圖B、C為倒置顯微鏡拍攝的相差圖像，顯示了如上文圖3微縮圖A所述培養(yǎng)的HFSC細胞(克隆#2b)。所示分別細胞來自于I代，第I天和2代，第14天。直接接種到聚鳥氨酸涂層培養(yǎng)板的細胞貼附并從球體擴增開來(圖3，微縮圖B)。傳代的細胞能夠在此培養(yǎng)條件下在后續(xù)傳代中成功地擴增(圖3，微縮圖C)。
[0043]圖3中，微縮圖D-F為倒置顯微鏡拍攝的相差圖像，顯示了在具有100ng/mlPDGF-AAU0ng/ml bFGFU0ng/ml IGF-1 和 50 μ Ml-硫代甘油的 HFSCMl 培養(yǎng)基在 37 °C、5% 02和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)和多次傳代后的HFSC細胞(克隆#2b)。大多數(shù)HFSC細胞是與周圍的細胞成群的暗相細胞。從集群分離的分散細胞傾向于自發(fā)分化成帶突起的(process-bearing)多極細胞(所謂的“蜘蛛網(wǎng)狀”形態(tài))，這是前_成少突膠質(zhì)細胞和未成熟的少突膠質(zhì)細胞(如圖3微縮圖D和E的白色箭頭所示)的特點,但它們的出現(xiàn)頻率通常低于I %。圖3微縮圖D、E、和F所示的細胞分別來自8代，第8天；11代，第11天和19代，第11天。
[0044]圖4顯示了 HFSC細胞(克隆#2b)在不同的生長因子組合存在下的擴增率:(I):20ng/ml PDGF-AA+10ng/ml bFGF ； (2):20ng/ml PDGF-AA+10ng/ml bFGF+5ng/ml NT-3 ；
(3):20ng/ml PDGF-AA+10ng/ml bFGF+lOng/ml IGF-1 ； (4):20ng/ml PDGF-AA+1Ong/mlbFGF+5ng/ml NT-3+10ng/ml IGF-1.。在3代的第11天(P3D11)收集細胞，并對每種條件下的活細胞進行計數(shù)。然后，在相同細胞密度，在與3代中使用的相同條件下進行傳代。在4代第8天(P4D8)收集細胞并對每個條件中的活細胞數(shù)進行計數(shù)(在細胞因為開始形成球體而亞融合前收獲這些細胞)。在3代，條件(4)是最有效的，但在4代并非如此。在兩個代中，條件(3)都是有效的。
[0045]圖5顯示了高劑量的TOGF-AA (100ng/ml)和1-硫代甘油對HFSC細胞(克隆#2b)增殖的影響，在存在以下生長因子組合的HFSCMl培養(yǎng)基中培養(yǎng):(1):20ng/ml PDGF-AA+1Ong/ml bFGF+10ng/ml IGF-1 ； (2):20ng/mlPDGF-AA+10ng/ml bFGF+10ng/ml IGF-l+50yMl-硫代甘油；(3):100ng/ml PDGF-AA+1 Ong/ml bFGF+1 Ong/ml IGF-1 ；
(4):100ng/ml PDGF-AA+1 Ong/ml bFGF+1 Ong/ml IGF-1+50 μ Ml-硫代甘油；(5):100ng/mlPDGF-AA+lOng/ml bFGF+50 μ Ml-硫代甘油。在5代的第7天收集細胞(如4代，在細胞因為開始形成球體而分匯合前收獲這些細胞)，并對每種條件下的活細胞數(shù)進行計數(shù)。還測試了 20ng/ml PDGF-AA+1 Ong/ml bFGF的組合，但回收的細胞數(shù)太低無法評估(小于I X IO4個細胞，低于計數(shù)范圍)，從該圖中去除了這一數(shù)據(jù)。條件(I)可以在3代擴增細胞，但不能在5代擴增細胞。加入50 μ M的1-硫代甘油[條件(2)]或提高TOGF-AA濃度到IOOng/ml [條件(3)]對擴增速率的積極影響非常小。當加入50 μ M的1-硫代甘油和提高TOGF-AA濃度到100ng/ml組合時[條件(4)],細胞擴增速率顯著提高,細胞可被成功擴增。當從該條件中消除IGF-1時[條件(5)]，擴增率降低至小于1，表明IGF-1也促進了 HFSC細胞的增殖和/或存活。
[0046]圖6顯示了人HFSC細胞(克隆#2b)的生長曲線(黑線空心圓圈)。HFSC細胞(克隆#2b)在10ng/ml PDGF-AA和10ng/ml bFGF存在下開始培養(yǎng)。從第3代加入IOng/ml IGF-1。從第6代TOGF-AA的濃度從20ng/ml提高到100ng/ml。然而，它們對細胞的擴增率影響很小或無影響。從第7代加入50 μ M的1-硫代甘油。在存在100ng/ml PDGF-AA,10ng/ml bFGF，10ng/mlIGF-l和50μMl-硫代甘油下HFSC細胞(克隆#2b)開始迅速生長。第17代加入10ng/ml NT_3。NT-3略微增強了細胞生長但一代后作用消失。此圖還顯示在10代第6天(虛線空心圓圈)和11代第11天(點線空心圓圈)冷凍的人HFSC細胞(克隆#2b)的生長曲線。冷凍細胞解凍后能夠以類似速率擴增。
[0047]圖7在微縮圖A-F中顯示了在無血清培養(yǎng)基中HFSC細胞自發(fā)分化。微縮圖A和B是倒置顯微鏡拍攝的相差圖像，顯示在12代、第9天(圖7，微縮圖A和B)，經(jīng)過補充有20ng/ml PDGF-AA, 10ng/ml bFGF, 10ng/ml IGF-1 和 δΟ μ Ml-硫代甘油(圖 7，微縮圖 Α)或不具有1-硫代甘油(圖7，微縮 圖B)的HFSCMl培養(yǎng)基培養(yǎng)的HFSC細胞(克隆#2b)的形態(tài)變化。在更換培養(yǎng)基時不補充bFGF，HFSC細胞自發(fā)分化。即使在相同的條件下，如果每天補充bFGF, HFSC細胞不分化并且看起來增長緩慢。此外,使用40ng/ml或更高濃度的PDGF-AA時，HFSC分化被阻斷并形成集群。通過將I3DGF-AA濃度從100ng/ml降低到20ng/ml并且不補充bFGF，細胞可自發(fā)地分化成具有蛛網(wǎng)狀形態(tài)的帶突起的多極細胞，其表達04抗原(圖7，微縮圖C和D)和/或GalC抗原(圖7中，微縮圖E和F)，這是少突膠質(zhì)細胞譜系細胞[即，前-成少突膠質(zhì)細胞(04陽性和GalC陰性)，未成熟少突膠質(zhì)細胞(04陽性和GalC陽性)]的決定性特征。
[0048]圖8是倒置顯微鏡拍攝的相差圖像，顯示不同代的HFSC細胞(克隆#3)的形態(tài)。常規(guī)的神經(jīng)干細胞最初在bFGF和EGF存在下擴增15天(參見圖8，微縮圖A，O代，第15天)。在這之后，細胞在具有20ng/ml PDGF-AA和10ng/ml bFGF的HFSCMl培養(yǎng)基，37°C、5% O2,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從第4代，PDGF-AA濃度增加至100ng/ml并加入10ng/ml的IGF-1 (參見圖9)。從第8代加入50 μ M的1-硫代甘油(參見圖9)。在經(jīng)過若干代后形態(tài)變得與克隆#2b幾乎相同。
[0049]圖9顯示了人類HFSC細胞(克隆#3)(黑線的空心圓圈)的生長曲線。HFSC細胞(克隆#3)最初在10ng/ml的EGF和10ng/ml的bFGF存在下培養(yǎng)以擴增常規(guī)的神經(jīng)干細胞。然后，從第I代，生長因子組合變?yōu)?0ng/ml的TOGF-AA和10ng/ml的bFGF。從第2代加入10ng/ml的IGF-1和10ng/ml的NT-3。在圖4所示數(shù)據(jù)的基礎上，從第4代除去NT-3，PDGF-AA濃度從20ng/ml增加到100ng/ml。然而，如克隆#2b所示，它們對細胞擴增速率影響甚微或無影響。從第5代加入50μΜ的1-硫代甘油，和克隆#2b—樣，HFSC細胞(克隆 #3)開始在 100ng/ml PDGF-AA, I Ong/ml bFGF, I Ong/ml IGF-1 和 50 μ Ml-硫代甘油存在下迅速生長。此圖還包括在第10代第7天(第10代，第7天:虛線空心圓)冷凍的人類HFSC細胞(克隆#3)的生長曲線。冷凍細胞解凍后，能夠以類似的速度擴增。
[0050]圖10是倒置顯微鏡拍攝的相差圖像，在微縮圖A-F顯示了不同代數(shù)下的HFSC細胞(克隆4A和4B)的形態(tài)。在37°C，5% 02，5% 0)2培養(yǎng)箱中，在具有20ng/ml的PDGF-AA，20ng/ml bFGF和 20ng/ml 的 IGF-1 (克隆 #4A)或 100ng/ml PDGF-AA, 20ng/ml bFGF和 20ng/ml的IGF-1 (克隆#4B)的HFSCMl培養(yǎng)基和50 μ Ml-硫代甘油中培養(yǎng)細胞?？寺?4Α開始比克隆#4Β擴增速度低，但從第2代幾乎以相同速度增長。經(jīng)過3代后它們變?yōu)閹缀跏蔷|(zhì)的(homogeneous),它們的形態(tài)變?yōu)榕c克隆#2b或#3幾乎相同。
[0051]圖11顯示了人類HFSC細胞(克隆#4A:虛線空心正方形和#4B:黑線空心圓圈)的生長曲線。HFSC 細胞(克隆 #4A)在 20ng/ml 的 PDGF-AA，20ng/ml bFGF, 20ng/ml, IGF-1和50 μ Ml-硫代甘油存在下進行培養(yǎng)。
[0052]HFSC 細胞(克隆 #4B)在 100ng/ml 的 PDGF-AA，20ng/ml bFGF 和 20ng/mlIGF_l 以及50 μ Ml-硫代甘油存在下進行培養(yǎng)。首先兩個克隆的細胞數(shù)量急劇下降，這種下降在克隆#4Α更為突出。細胞數(shù)量最初下降后，它們開始迅速擴增。此圖還包括在第5代第6天(第5代第6天:虛線空心圓)冷凍的人類HFSC細胞(克隆#4Β)的生長曲線。
[0053]圖12在微縮圖A-S顯示了未分化的HFSC細胞的免疫表型；(克隆#2b，12-16代)在 100ng/ml PDGF-AA, I Ong/ml bFGF, I Ong/ml IGF-1，和 50 μ Ml-硫代甘油存在下培養(yǎng)，對CD133、Sox2、巢蛋白(Nestin)、01ig2、PDGF-Rα、NG2、Α2Β5、PSA-NCAM、GFAP 或波形蛋白(Vimentin)染色呈陽性。使用DAPI復染細胞的細胞核。這些圖顯示，至少90%的細胞為CD133，Sox2，巢蛋白，01ig2, PDGF-R α，NG2, Α2Β5和波形蛋白陽性，但沒有GFAP陽性的細胞。PSA-NCAM染色稍微弱，但仍有超過90%的細胞顯示PSA-NCAM陽性。
[0054]圖13，微縮圖Α-Η，顯示了流式細胞儀檢測數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)顯示未分化的HFSC細胞(克隆#2b,13代)的比例。黑線柱(histograms)代表同種型對照,灰色填充柱代表每個測試抗原。此數(shù)據(jù)表明，大部分HFSC細胞為⑶133陽性(圖13，微縮圖A)，⑶9陽性(圖13，微縮圖B)，CD140a陽性(圖13，微縮圖C)，NG2陽性(圖13，微縮圖D) ,A2B5陽性(圖13，微縮圖E)，04陽性(圖13，微縮圖F) ,PSA-NCAM陽性(圖13，微縮圖G)。進行的免疫細胞化學(數(shù)據(jù)未示出)測試，顯示CD44陰性(圖13，微縮圖H)。
[0055]圖14顯示培養(yǎng)在含有血清的培養(yǎng)基中31天的分化的HFSC細胞(克隆#3，15代)的免疫表型，并用識別神經(jīng)元(β III微管蛋白，神經(jīng)絲蛋白-L和ΜΑΡ2)、少突膠質(zhì)細胞(04，MBP)和星形膠質(zhì)細胞(GFAP)的抗體染色，然后是熒光二抗。使用DAPI復染細胞核。HFSC細胞能夠分化成對每種標志物陽性的細胞。為了評估共定位的神經(jīng)元軸突和髓磷脂，細胞與抗-β III微管蛋白抗體和抗-MBP抗體(圖14，微縮圖A-C)，抗-神經(jīng)絲蛋白-L抗體和抗-MBP抗體(圖14，微縮圖D-F)，抗-ΜΑΡ2抗體和抗-MBP抗體(圖14，微縮圖G-1)共染色。只有少數(shù)神經(jīng)元軸突和髓磷脂共定位。為了評估04抗原和MBP的共定位，細胞與04抗體和抗-MBP抗體共染色(圖14，微縮圖J-L)。大多數(shù)MBP信號與04抗原信號共定位。HFSC細胞也可以分化成GFAP抗原陽性的星形膠質(zhì)細胞(圖14，微縮圖Μ-0)。此外，許多細胞對在上皮細胞包括星形膠質(zhì)細胞和間充質(zhì)細胞表達的波形蛋白呈陽性。此外，未分化的細胞也對波形蛋白呈陽性(數(shù)據(jù)未示出)。[0056]圖15在微縮圖A-E顯示了 HFSC細胞(克隆#2b，15代)的分化潛能。細胞在DMEM/F12中分化，DMEM/F12含有谷氨酰胺和HEPES，并補充有B27添加劑，N2添加劑和50 μ M 的 1-硫代甘油與 10ng/ml 的 PDGF-AA, 100ng/ml 的 IGF-1,10ng/ml 的 BDNF 和 100 μ M的pCPT-cAMP。分化4天后，細胞用抗-GD3抗體和04抗體染色，然后用熒光二抗染色。未分化的細胞表達⑶3要強于少突膠質(zhì)細胞祖細胞，04反之(圖15的箭頭，微縮圖A，B和C顯示未分化的細胞)。大多數(shù)分化細胞呈現(xiàn)多極化形態(tài)，具有微弱的GD3信號和較強的04信號，表明其為少突膠質(zhì)細胞祖細胞或前-成少突膠質(zhì)細胞。其他細胞類型(如星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元)定義為GD3陰性和04陰性細胞。圖15，微縮圖D從分化細胞的10個不同圖像顯示每個細胞群體的比率。細胞總數(shù)的70%以上分化成少突膠質(zhì)細胞祖細胞(75.8%±2.09% )。超過總數(shù)20%的細胞仍然是未分化的細胞(23.5% ±2.03% )。其他細胞類型均少于細胞總數(shù)的1% (0.7% ±0.41%)。計算少突膠質(zhì)細胞祖細胞和其他細胞類型占分化的細胞(少突膠質(zhì)細胞祖細胞加其它細胞類型)的比例，并示于圖15，微縮圖E。少突膠質(zhì)細胞祖細胞占分化細胞的99.1% ±0.56%，而其他細胞類型占分化細胞的0.9%+ 0.56 % ο
[0057]本發(fā)明優(yōu)選實施方式詳述
[0058]本發(fā)明提供了一種方法，該方法用于培養(yǎng)和擴增從哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分離出的神經(jīng)干細胞或神經(jīng)祖細胞以產(chǎn)生純化或富集的神經(jīng)干細胞群或神經(jīng)祖細胞群，所述細胞群具有體外分化為少突膠質(zhì)細胞或少突膠質(zhì)細胞譜系細胞的能力。神經(jīng)干細胞和神經(jīng)祖細胞產(chǎn)生的后代都或為神經(jīng)元細胞(如神經(jīng)元祖細胞或成熟神經(jīng)元)或為包括星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的神經(jīng)膠質(zhì)細胞。雖然神經(jīng)干細胞是可自我再生的(即能無限增殖)，神經(jīng)祖細胞可能、但不必定，能夠自我再生。本發(fā)明的培養(yǎng)方法能夠產(chǎn)生擴增的細胞群，該細胞群可分化成占分化細胞至少70 %，80 %，90 %或95 %的少突膠質(zhì)細胞系細胞，即少突膠質(zhì)細胞祖細胞和少突膠質(zhì)細胞。
[0059]如下縮寫和定義貫穿在本申請全文:
[0060]術語“HFSC細胞”或人類胚胎脊髓源細胞，是指本發(fā)明中描述的純化或富集的細胞群，所述細胞是擴增的哺乳動物神經(jīng)干細胞和/或神經(jīng)祖細胞。
[0061]術語“HFSCM1培養(yǎng)基”是指DMEM/F12，在組合中包含谷氨酰胺和HEPES并補充有B27添加劑(Invitrogen?),非必需氨基酸(NEAA) (Invitrogen?), 1.5mM的丙酮酸(Invitrogen?), 55 μ M 的 β-巰基乙醇(Invitrogen?),和 ImM N-乙?；?L-半胱氨酸(Sigma)。
[0062]術語“神經(jīng)膠質(zhì)細胞”是指中樞神經(jīng)系統(tǒng)的非神經(jīng)元細胞，包括成熟的少突膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、和這些細胞類型的一種或兩種的定向祖細胞。
[0063]術語“專能(multipotent)祖細胞”指的神經(jīng)祖細胞，其具有產(chǎn)生多個、但數(shù)量有限的譜系的細胞的潛能。
[0064]“多能性(pluripotency)”(源自拉丁文“plurimus”或“非常多”和“潛在的”或“動力”)是指有潛力分化成三個胚層的任意層的干細胞，所述三個胚層為:內(nèi)胚層(胃內(nèi)粘膜(interior stomach lining),胃腸道,肺)，中胚層(肌肉，骨骼,血液,泌尿生殖)，或外胚層(表皮組織和神經(jīng)系統(tǒng))。神經(jīng)干細胞是專能而不是多能。胚胎干細胞是多能而不是#倉泛。[0065]定向祖細胞是定向或確定會成為特定類型成熟細胞的祖細胞。與之相反，專能或多能祖細胞具有變?yōu)閮煞N或更多種類型的成熟細胞中的一種的潛能(如基于時間和環(huán)境因素，0-2A祖細胞可以成為少突膠質(zhì)細胞或2型星形膠質(zhì)細胞)。
[0066]“少突膠質(zhì)細胞’是一種神經(jīng)膠質(zhì)細胞，其主要功能是在一些脊椎動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中隔離神經(jīng)細胞軸突。
[0067]術語“少突膠質(zhì)細胞譜系細胞”是指少突膠質(zhì)細胞，前-成少突膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞祖細胞(例如02A祖細胞)。此術語不包括神經(jīng)膠質(zhì)細胞限制性前體或神經(jīng)干細胞。
[0068]術語“少突膠質(zhì)細胞祖細胞(oligodendrocyte progenitor cells)”和“少突膠質(zhì)細胞祖細胞(oligodendrocyte progenitors) ”在整個申請中互換使用，該術語指的是相對于(形成)神經(jīng)元或非神經(jīng)組織，這種細胞優(yōu)先定向形成的祖細胞和/或后代更多的是少突膠質(zhì)細胞。除非另有規(guī)定，它們可以、但不必定，有生成其他類型的神經(jīng)膠質(zhì)細胞(如2型星形膠質(zhì)細胞)的能力。這里所用的此術語不包括少突膠質(zhì)細胞的前祖細胞或神經(jīng)膠質(zhì)細胞限制性前體(參見圖1)。
[0069]“少突膠質(zhì)細胞前祖細胞”是少突膠質(zhì)細胞祖細胞的前體細胞。
[0070]“前-成少突膠質(zhì)細胞”是有絲分裂后少突膠質(zhì)細胞的前體細胞。
[0071]通過培養(yǎng)“擴增”細胞指的是在培養(yǎng)基存在下增加細胞數(shù)量，所述培養(yǎng)基含有刺激細胞增殖的添加物。
[0072]“細胞擴增 率”是指特定日期的細胞數(shù)除以初始培養(yǎng)時的細胞數(shù)。
[0073]“擴增的”神經(jīng)前體細胞或神經(jīng)干細胞此處指的是從分離的神經(jīng)前體細胞或神經(jīng)干細胞衍生的神經(jīng)前體細胞或神經(jīng)干細胞，所述分離的神經(jīng)前體細胞或神經(jīng)干細胞是體外增殖的，所述“擴增的”神經(jīng)前體細胞或神經(jīng)干細胞產(chǎn)生擴增的細胞群。
[0074]“傳代”細胞(也稱為“繼代培養(yǎng)”或“分裂”細胞)指的是一種技術，該技術通過將細胞彼此分離(用酶，如胰蛋白酶或膠原酶)然后將一小部分數(shù)目的細胞轉移到新的培養(yǎng)容器中，而使細胞在較長的時間段內(nèi)在實驗室培養(yǎng)條件下保持存活并生長。如果以規(guī)律的時間間隔傳代，由于避免了長時間高細胞密度相關聯(lián)的早衰，細胞可以培養(yǎng)更長的時間。
[0075]生長環(huán)境是指細胞在體外增殖、分化和/或成熟的環(huán)境。環(huán)境的特點包括培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基，可能存在的生長因子或分化誘導因子，可存在的支撐結構(如在固體表面上的基板)。
[0076]通用技術
[0077]生物學、蛋白質(zhì)化學、抗體技術的一般方法可以在《蛋白質(zhì)化學的實驗操作手冊》(Current Protocols in Protein Science) (Wiley&Sons 出版，J.E.Colligan 等主編)，《細胞生物學的實驗操作手冊》(Current Protocols in Cell Biology) (Wiley&Sons出版，J.S.Bonifacino 等主編)，《免疫學的實驗操作手冊》(Current Protocols in Immunology)(ffiley&Sons出版，J.E.Colligan等主編)中得知。細胞培養(yǎng)方法在當前版本的《動物細胞培養(yǎng):基本技術手冊》(Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique)(ffily&Sons出版，R.1.Freshney等主編)，《細胞培養(yǎng)的普通技術》(General Techniquesof Cell Culture) (Cambridge Univ.Press 出版，M.A.Harrison&1.F.Rae 主編)等中記
載。組織培養(yǎng)耗材和試劑可以從Chemicon' MilUpore.'R&D Systems' Invitrogen?,Nalgene-Nunc? International, Sigma-Aldrich?,和 ScienCell 等商業(yè)廠商獲得。[0078]與本發(fā)明公開相關的專業(yè)參考書包括《神經(jīng)科學原理》(Principles ofNeuroscience),第四版，Kandel等主編，McGraw-Hill2000年出版；《中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生:基礎科學和臨床進展》(CNS Regeneration:Basic Science and Clinical Advances),Μ.H.Tuszynski& 和 J.H Kordower 編，Academic Pressl999 年出版；《神經(jīng)兀:細胞和分子生物學》(The Neuron:Cell and Molecular Biology),第三版，1.B.Levitan 和L.K.Kaczmarek編，Oxford U.Press2001年出版；《神經(jīng)膠質(zhì)細胞:它們在行為中的作用》(Glial Cells:Their Role in Behavior), PR Laming 等合編，Cambridge U.Pressl998年出版；《神經(jīng)膠質(zhì)細胞在健康與疾病中的功能角色》(The Functional Roles ofGlialCells in Health and Disease), Matsas 與 Tsacopoulos 合編，Plenum Pub.Corp, 1999 年出版:《神經(jīng)膠質(zhì)細胞發(fā)育》(Glial Cell Development)，Jessen 與 Richardson 編，OxfordU.Press2001 出版；《鋼鐵之人》(Man of Steel), Adrian Hill，1996 年。
[0079]在細胞個體發(fā)生的背景下，形容詞“分化的”是一個相對術語。分化的細胞是比正在和它比較的細胞在發(fā)育途徑上已經(jīng)發(fā)展得更遠的細胞。因此，神經(jīng)干細胞可以分化為細胞譜系限制性祖細胞。這些繼而可以分化成沿著分化途徑更遠的細胞或分化成末期分化的細胞，如成熟的神經(jīng)元或少突膠質(zhì)細胞。
[0080]本發(fā)明的分化的細胞可根據(jù)它們是否表達少突膠質(zhì)細胞特征性表型標志物來表征。取決于細胞群的成熟程度，這些細胞可能存在的典型的免疫組化標志物有以下幾種:
[0081]Sox2:多能干細胞和神經(jīng)干細胞的標志物；
[0082]巢蛋白，神經(jīng)干細胞標志物；
[0083]⑶133:神經(jīng) 干細胞的細胞表面標志物；
[0084]TOGF-受體a (PDGF-Ra):血小板衍生生長因子受體的α鏈。少突膠質(zhì)細胞和其祖細胞的標志物；
[0085]CD 140a:與I3DGF-Ra相同。CD140a抗體識別I3DGF-R a的胞外區(qū)。少突膠質(zhì)細胞和其祖細胞的表面標志物；
[0086]⑶9:細胞表面糖蛋白，已知和整聯(lián)蛋白以及其他跨膜的4個超家族蛋白復合。生殖干細胞、神經(jīng)干細胞、少突膠質(zhì)細胞、間充質(zhì)干細胞的細胞表面標志物；
[0087]PSA-NCAM:唾液酸神經(jīng)細胞黏附分子。神經(jīng)元限制性前體(NRP)、神經(jīng)元祖細胞、成神經(jīng)細胞和少突膠質(zhì)細胞前祖細胞的表面標志物。此標志物在神經(jīng)膠質(zhì)細胞限制性前體(GRP)中為陰性。
[0088]A2B5:神經(jīng)膠質(zhì)細胞限制性前體(GRP)、神經(jīng)膠質(zhì)細胞祖細胞和少突膠質(zhì)細胞祖細胞(OPC)以及2型星形膠質(zhì)細胞的細胞表面標志物。該細胞表面標志物在神經(jīng)元限制性前體(NRP)中為陰性。
[0089]NG2:硫酸軟骨素蛋白多糖。巨噬細胞和少突膠質(zhì)細胞祖細胞的細胞表面標志物。
[0090]GD3:神經(jīng)節(jié)苷脂GD3。少突膠質(zhì)細胞前祖細胞和少突膠質(zhì)細胞祖細胞的標志物。
[0091]04:少突膠質(zhì)細胞及其祖細胞的標志物。
[0092]半乳糖腦苷C(GalC):未成熟少突膠質(zhì)細胞的標志物。
[0093]髓鞘堿性蛋白(MBP):成熟的少突膠質(zhì)細胞的標志物。
[0094]⑶44:細胞表面糖蛋白，參與細胞-細胞相互作用以及細胞粘附和遷移，透明質(zhì)酸的受體。一些上皮細胞和星形膠質(zhì)細胞系細胞的細胞表面標志物。[0095]膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP):星形膠質(zhì)細胞的標志物。
[0096]β III微管蛋白:神經(jīng)祖細胞和神經(jīng)元的標志物。
[0097]神經(jīng)絲蛋白-L:成熟神經(jīng)元標志物。
[0098]微管相關蛋白2(ΜΑΡ2):成熟神經(jīng)元的標志物。
[0099]組織特異性標志物可以使用任何適當?shù)拿庖邔W技術進行檢測，如細胞表面標志物的流式免疫組化，或細胞內(nèi)或細胞表面標志物免疫組化(例如，固定的細胞或組織切片)。流式細胞儀詳細分析方法在Gallacher等，BLOOD雜志，2000年96:1740有記載。如果在標準的免疫組化或流式細胞儀測定中，任選將細胞固定以后，并任選使用標記的二抗或其他耦合物來放大標記，可檢測到大量的抗體結合于抗原，則將細胞表面抗原的表達定義為陽性。為了便于在研究或治療中使用，最大限度地提高具有少突膠質(zhì)細胞或其祖細胞的特征的細胞在細胞群中的比例常常是有利的。有可能獲得至少50 %，60 %，70 %，90 %或95 %為特定譜系細胞的細胞群，所述特定譜系的細胞鑒定為對這些細胞的特征性表型標志物是陽性的。
[0100]對于與神經(jīng)功能重建相關的治療性應用，往往希望將細胞群形成其他細胞類型尤其是未分化的干細胞和非外胚層譜系細胞的能力最小化。根據(jù)(具體)應用，將神經(jīng)元譜系細胞和其定向祖細胞、或星形膠質(zhì)細胞譜系的細胞和其定向祖細胞的比例最小化可能是有利的。根據(jù)本發(fā)明，細胞群的污染具有少于30 %，20 %，10 %或5 %這些其他類型細胞的污染。
[0101 ] 本發(fā)明的方法不能導致整個人機體的發(fā)育。
[0102]本發(fā)明的方法涉及在定義的(defined)培養(yǎng)基中培養(yǎng)來自哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分離的神經(jīng)干細胞和/或神`經(jīng)祖細胞，所述培養(yǎng)基允許所述細胞通過多次傳代而擴增。本發(fā)明培養(yǎng)方法培養(yǎng)的細胞在整個擴增中保持其分化成少突膠質(zhì)細胞譜系細胞的能力。本發(fā)明培養(yǎng)方法培養(yǎng)的細胞可以傳代多于6次，擴增超過1000倍，而保持其分化為少突膠質(zhì)譜系細胞的能力。在一些實施方式中，本發(fā)明培養(yǎng)方法得到的擴增的細胞群含有或可在無血清培養(yǎng)條件下分化成至少30 %，50 %，70 %或80 %的分化細胞為少突膠質(zhì)細胞譜系細胞的細胞群。在一優(yōu)選實施方式中，采用本發(fā)明培養(yǎng)方法得到的擴增細胞培養(yǎng)物群體在分化的細胞中包括至少90%的少突膠質(zhì)細胞譜系細胞。在優(yōu)選實施方式中，擴增的細胞是專能的。在一些實施方式中，大部分的擴增細胞在降低I3DGF-AA的培養(yǎng)基(即20ng/ml的H)GF-AA，優(yōu)選用10ng/ml bFGF,有或沒有50 μ M的1-硫代甘油，和任選至少10ng/ml的IGF-1)中培養(yǎng)、在更換培養(yǎng)基的中間不補充bFGF的情況下，能夠分化成少突膠質(zhì)細胞譜系細胞。在一些實施方式中，大部分的擴增的細胞在包含谷氨酰胺和HEPES并補充有B27添加劑、N2添加劑和50 μ Ml-硫代甘油的DMEM/F12中培養(yǎng)后能夠分化成少突膠質(zhì)細胞譜系細胞，所述 DMEM/F12 含有 10ng/ml 的 PDGF-AA，100ng/ml IGF-1,100 μ M pCPT-cAMP 和 IOng/ml BDNF。
[0103]本發(fā)明中所用的分離的哺乳動物神經(jīng)干細胞和/或神經(jīng)祖細胞，可以從哺乳動物，優(yōu)選靈長類動物，例如但不限于人類的中樞神經(jīng)系統(tǒng)獲得。少突膠質(zhì)細胞的祖細胞和前祖細胞已知存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的白質(zhì)中。因此，分離用于本發(fā)明所用細胞的適合來源包括，但不限于，視神經(jīng)，胼胝體和脊髓。此外，使用本領域中已知的方法，可從哺乳動物胎兒，優(yōu)選靈長類動物的胎兒，例如，但不限于人的胎兒來衍生分離的干細胞。在一些實施方式中，分離的干細胞從獲得自人胎兒脊柱的人胎兒脊髓組織制備。在一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明使用的分離的細胞從8-24周孕齡，優(yōu)選為12-18周孕齡的胎兒脊髓獲得。例如，通過商業(yè)公司，如先進生物科技資源公司(Advanced Bioscience Resources, Inc.)(美國，加利福尼亞州，阿拉美達)，具有IRB許可和捐贈者的知情同意后，可以得到人類胎兒脊柱?？梢詫⒓顾杞M織從脊柱分割下來，除去腦膜和外周神經(jīng)。然后分離、洗滌組織并放置在包含允許細胞增殖的生長培養(yǎng)基的培 養(yǎng)容器中。
[0104]合適的培養(yǎng)容器包括但不限于，培養(yǎng)容器的表面具有一種多氨基酸或多氨基酸組合(例如，聚賴氨酸和/或聚鳥氨酸)，用層粘連蛋白、玻連蛋白或纖維連接蛋白處理的組織培養(yǎng)塑料和表面。細胞接種的密度范圍為IO4至IO5個細胞/平方厘米，優(yōu)選密度為約3X 104-5X 104個細胞/平方厘米。根據(jù)已有的研究(Raff等，J.Neurosci雜志，3:1289，1983 ;Raff 等，Nature 雜志，303:390,1983 ;神經(jīng)細胞培養(yǎng)手冊，第三版，Humana Press, Inc出版)，聚鳥氨酸或聚賴氨酸可用于涂覆培養(yǎng)容器?？赏扛?_40μ g/ml，優(yōu)選2-20μ g/ml，更優(yōu)選為5至15 μ g/ml聚鳥氨酸到培養(yǎng)容器。細胞粘附強度可能不同，這取決于培養(yǎng)容器的提供商、表面改良、樣式(format)和具體批號。對于每個來源的培養(yǎng)容器，可使用本領域中已知的方法確定涂層材料的最佳濃度。在一些實施方式中，與10yg/ml的聚鳥氨酸或聚賴氨酸孵育兩小時來涂覆容器，容器例如來自BD Falcon公司(美國，馬里蘭州，Sparks市)。在一些實施方式中，可與聚鳥氨酸或聚賴氨酸孵育30分鐘來涂覆容器，容器例如來自Nalgen Nunc International公司(美國，紐約州，羅切斯特市)。
[0105]從哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)分離的神經(jīng)干細胞和/或神經(jīng)祖細胞在化學上確定的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基允許細胞擴增，不促進細胞分化(例如，分化為神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細胞或少突膠質(zhì)細胞)。所述培養(yǎng)基包括基礎培養(yǎng)基，例如，但不限于，Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基:營養(yǎng)混合物F-12，I: I (DMEM/F12) (Invitrogen公司)(例如，Iscove改進的Dulbecco培養(yǎng)基,RPM1-1640和Neurobasal)?；A培養(yǎng)基可補充各種成分以支持細胞健康和生存。這樣的成分可包括，但不限于，至少0.25%非必需氨基酸[NEAA(Invitrogen?) -1 %溶液，含有100 μ M L-丙氨酸，L-天冬酰胺h2o，L-天門冬氨酸，L-谷氨酸，甘氨酸，L-脯氨酸，L-絲氨酸]，至少1.0mM的谷氨酰胺，至少0.5mM的丙酮酸，至少1%的B27補充物(Invitrogen公司? ),至少0.1mM的N-乙酰半胱氨酸和/或至少10 μ M的巰基乙醇。在一些實施方式中，基礎培養(yǎng)基可以包括NS21 (Y.Chen等在J.Neurosc1.Methods.，171:239,2008公開的方法)代替B27添加劑。B27添加劑含有牛血清白蛋白，轉鐵蛋白，胰島素，孕酮，皮質(zhì)酮，三碘-L-甲狀腺原氨酸，視黃醇醋酸酯，DL-生育酚，DL-生育酚醋酸酯，生物素，亞油酸，亞麻酸，乙醇胺，亞硒酸鈉，左旋肉堿，還原型谷胱甘肽，過氧化氫酶，超氧化物歧化酶，D-半乳糖和腐胺。Invitrogen公司已披露其成分,但并未透露它們的濃度。但是，原來的配方，B18添加劑，各成分的濃度已經(jīng)公開。NS21是基于此信息開發(fā)的，并且公開了各梯度的濃度。在神經(jīng)元培養(yǎng)中，它與B27添加劑一樣好。此外，NS21可用于培養(yǎng)來自于人類胚胎干細胞的神經(jīng)干細胞和少突膠質(zhì)細胞祖細胞。因此，該添加劑被視為替代B27添加劑的良好候選物。在一優(yōu)選實施方式中，培養(yǎng)基包括DMEM/F12，添加有l(wèi)_4mM，更優(yōu)選為2.5mM的谷氨酰胺；10-25mM，更優(yōu)選為15mM的HEPES ；0.5-2.0mM,更優(yōu)選為ImM丙酮酸；1_4%，更優(yōu)選為2%的B27添加劑；0.25-3%，更優(yōu)選為1% NEAA ; 1-200 μ M，更優(yōu)選為50 μ Ml-硫代甘油；0.l-3mM,更優(yōu)選為ImM的N-乙酰半胱氨酸和/或10-100 μ M，更優(yōu)選為55μΜ的β-巰基乙醇。
[0106]此外，氧氣可促進神經(jīng)祖細胞的分化。因此，為了減少細胞分化，細胞可培養(yǎng)在1-20 % O2的生長環(huán)境。在一優(yōu)選實施方式中，將細胞培養(yǎng)在培養(yǎng)瓶中，置于提供37°C、1-10%更優(yōu)選5%的02、5% CO2的生長環(huán)境的培養(yǎng)箱中。建立HFSC細胞后，評估氧氣濃度的影響，但與擴增HFSC細胞的培養(yǎng)環(huán)境中5% O2的條件相比，20% O2條件下分化的細胞并沒有增加。HFSC細胞在5% O2條件下的增長稍微快于20% O2條件。氧氣可引起氧化應激并已知在嚙齒類細胞中誘導p53突變。為了減少突變的風險，我們保持在5% O2條件下培養(yǎng)HFSC細胞。
[0107]神經(jīng)干細胞和/或神經(jīng)祖細胞在還含有促進增殖的生長因子的培養(yǎng)基中中培養(yǎng)，以分離細胞。培養(yǎng)基中可包含至少5，10，20或40ng/ml血小板衍生生長因子-AA(TOGF-AA)，至少2.5，5或10ng/ml的堿性FGF (bFGF)，和/或至少為10，25或50 μ M的1-硫代甘油以分離細胞。在一些實施方式中，培養(yǎng)基中還包括至少1，5或10ng/ml的胰島素樣生長因子-1 (IGF-1)。在一些實施方式中，PDGF-AA 可替換為 PDGF-BB，PDGF-AB, PDGF-CC,或PDGF-DD0在一些實施方式中，bFGF可替換為成纖維細胞生長因子的其它成員(如FGF-4或FGF-9)。在一些實施方式中，IGF-1可替換為IGF-2。在一優(yōu)選實施方式中，培養(yǎng)基中包括 40-60 μ Ml-硫代甘油，40-200ng/ml 的 PDGF-AA，5-100ng/ml 的 bFGF，和 5-100ng/ml 的IGF-1以分離細胞。
[0108]分離的神經(jīng)干細胞和/或神經(jīng)祖細胞在還含有生長因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以在分離細胞后刺激增殖。培養(yǎng)基中可含有至少為1，2，或5ng/ml的血小板衍生生長因子-AA (PDGF-AA)，至少為 0.5，I 或 5ng/ml 的堿性 FGF (bFGF)和 / 或至少 10，25 或 50 μ M 的1-硫代甘油以擴增細胞。在一些實施例中，培養(yǎng)基中還包括至少為1，2或5ng/ml的胰島素樣生長因子-1 (IGF-1)。在一優(yōu)選實施方式中，培養(yǎng)基中包括40-60μΜ的1_硫代甘油，5-100ng/ml 的 PDGF- AA，l_50ng/ml 的 bFGF，和 5-100ng/ml 的 IGF-1 以在 HFSC 細胞分離后擴增細胞。
[0109]在本發(fā)明的培養(yǎng)條件下生長的分離的神經(jīng)干細胞和/或神經(jīng)祖細胞顯示出倍增時間為50-120小時。在優(yōu)選實施方式中，倍增時間為約60-100小時。細胞可以在至少8，11，14或17代中保持此增殖率。這些細胞每月可擴增至少100，250，或優(yōu)選為至少500倍。在優(yōu)選實施方式中，使用本發(fā)明的方法培養(yǎng)的細胞在多于18代中顯示擴增率> I。
實施例
[0110]實施例1-HFSC細胞培養(yǎng)和擴增；基礎培養(yǎng)基和生長因子的確定
[0111]使用來自人類12周胎兒脊髓的HFSC細胞，該脊髓在得到捐贈者知情同意后從Advanced Bioscience Resources, Inc.(美國，加利福尼亞州，阿拉美達)獲得，在初步實驗中測試幾種培養(yǎng)基和添加劑。將細胞培養(yǎng)于DMEM:F-12(1: I) (DMEM/F12)中(Invitrogen?,美國，加州，卡爾斯巴德)，最初添加有2mM谷氨酰胺(Invitrogen?), ImM的丙酮酸(Invitrogen?)和2%B27添加劑(Invitrogen?)。檢測各種生長因子是否能刺激HFSC細胞增長。最有效的生長因子是I3DGF-AA和bFGF的組合。在TOGF-AA和bFGF存在下，細胞可以生長但顯示空泡而且看起來不健康。測試若干添加劑并觀察到添加I % NEAA以及2mM谷氨酰胺、ImM丙酮酸鹽和2% B27添加劑的DMEM/F12可降低空泡和稍微增加細胞數(shù)目(數(shù)據(jù)未示出)。其他添加劑包括ImM N-乙酰半胱氨酸(Sigma-Aldrich?，美國，密蘇里州，圣路易斯)和55 μ Μβ-巰基乙醇(Invitrogen?)似乎改善細胞的狀態(tài)，但改善并不像添加NEAA那樣突出(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，補充有2mM谷氨酰胺、ImM丙酮酸、2% B27添加劑、I % NEAA, ImM的N-乙?；腚装彼岷?5 μ M β -巰基乙醇的DMEM/F12確定為最佳基礎培養(yǎng)基，并用于其后的HFSC細胞培養(yǎng)。
[0112]從脊柱分割15周人胎兒脊髓，除去腦膜和外周神經(jīng)。然后用Accutase離解組織并洗滌，從人胎兒脊髓獲得的細胞在含有以下生長培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器中培養(yǎng):DMEM/F12，含有 2.5mM 谷氨酰胺和 15mM 的 HEPES，2 % B27 添加劑(Invitrogen?)，I % NEAA, 1.5mM的丙酮酸(Invitrogen?), 55 μ Μβ -巰基乙醇(Invitrogen?), ImM N-乙酰-L-半胱氨酸(Sigma-Aldrich?), 20ng/ml PDGF-AA (R&D Systems公司，美國明尼蘇達州明尼阿波利斯)和10ng/ml bFGF(R&D Systems公司)。然后將細胞放入培養(yǎng)箱中，保持在37°C，5% O2和5%C02。每天向培養(yǎng)基中加入bFGF(10ng/ml)。在傳代中每2_3天更換培養(yǎng)基。根據(jù)這些初步實驗，在I3DGF-AA和bFGF存在下，生長的細胞并不多，許多細胞停止增殖或幾周內(nèi)死亡。這個結果似乎是合理的，因為表達TOGF-Ra的細胞通常少于細胞的5%。為了去除不響應I3DGF-AA和bFGF的細胞，將細胞培養(yǎng)在超低粘附培養(yǎng)板(Coming Inc.，美國紐約州康寧)。響應TOGF-AA和bFGF的細胞成為球形(參考圖3，微縮圖A)，不響應的細胞不形成球體。對于更換培養(yǎng)基和傳代，將球體在較低速度離心收集(300rpm收集球體，I, OOOrpm收集單個細胞)。9天后，收獲細胞并傳代到聚鳥氨酸涂層的培養(yǎng)容器。該階段之后，每7-14天傳代細胞。在這些早期階段細胞顯示異質(zhì)形態(tài)(見圖3，微縮圖B和C)，許多細胞一個月內(nèi)停止增殖。增殖率隨著時間的推移越來越慢，細胞最終沒有擴增。此外，細胞開始不健康，在其細胞質(zhì)中形成空泡。
[0113]實施例2-HSCF細胞擴增的最佳生長條件的確定
[0114]如實施例1中提到，在培養(yǎng)基中加入TOGF-AA和bFGF能支持HFSC細胞最初足夠的生長，但2次傳代后的擴散速率減慢。對NT-3 (R&D Systems公司)和IGF-1 (Sigma-Aldrich?)進行了測試以確定它們是否可以提高HFSC細胞增殖。20ng/ml的TOGF-AA和10ng/ml的bFGF不足以刺激細胞增殖率(擴增率為< I)(參見圖4)。隨后加入5ng/ml的NT-3和/或10ng/ml的IGF-1增強了增殖率(擴增率變?yōu)?gt; I)。NT-3和IGF-1的組合在第3代最有效。每個條件中獲得的細胞進一步傳代以確認其效果。提前收獲細胞，因為細胞開始形成球體。在第4代，NT-3和IGF-1的組合恢復的增殖率下降，單獨添加IGF-1在第4代最有效。NT-3和IGF-1的組合可能會導致細胞分化或形成更多的球體而在更換培養(yǎng)基時丟失。因此，添加IGF-1被確定為最有效的存活因子并用于隨后的HFSC細胞培養(yǎng)。然而，HFSC細胞的增殖率在第4代的末期再次開始減緩，與接種細胞數(shù)相比細胞數(shù)減少。因此，測試另一種添加劑，1-硫代甘油是否能夠提高HFSC細胞在第5代的增殖。
[0115]圖5顯示了 1-硫代甘油在HFSC細胞增殖上的效果。初始生長因子組合(20ng/mlPDGF-AA+1 Ong/ml bFGF)完全不能擴增細胞(圖中未示出這一數(shù)據(jù)，因為其低于可計數(shù)范圍)。從第3代開始使用的生長因子組合(20ng/ml PDGF-AA+1 Ong/ml bFGF+10ng/ml IGF-1)比這一組合(20ng/ml PDGF-AA+1 Ong/ml bFGF)更有效，但無法刺激第4代后的HFSC細胞增殖(圖4)。許多與脂肪酸和相關的長鏈烴類的生物合成和降解相關的輔因子具有硫醇。接下來在HFSC細胞上測試1-硫代甘油，因為它是一種硫醇系抗氧化劑，已有報道顯示其刺激某些細胞增殖(如小鼠胚胎皮層和海馬神經(jīng)元，小鼠骨髓肥大細胞，人B細胞系)。此外，也測試了更高劑量的TOGF-AA(100ng/ml)是否能夠彌補對生長因子反應性的下降。
[0116]在20ng/ml PDGF-AA, I Ong/ml bFGF 和 I Ong/ml IGF-1 存在下加入 50 μ Ml-硫代甘油輕微刺激了細胞增殖，但細胞數(shù)目仍然下降(擴增率< I)。此結果與1-硫代甘油不存在時，在存在10ng/ml bFGF+1 Ong/ml IGF-1的情況下I3DGF-AA濃度增大到100ng/ml結果類似。然而，當50 μ Ml-硫代甘油和提高的TOGF-AA (100ng/ml)都包含在培養(yǎng)基中(依然有10ng/ml的bFGF和10ng/ml的IGF-1)，這兩種成分似乎協(xié)同作用，顯著增加了細胞數(shù)(擴增率> I)。當IGF-1從此添加物組合中消除(即總添加物為100ng/ml的TOGF-AA+1 Ong/ml的bFGF+50 μ Ml-硫代甘油)，擴增率減少到< 1，表明IGF-1也促進HFSC細胞增殖和/或存活。但是，如果HFSC細胞在此條件下進行培養(yǎng)更長時間，HFSC細胞即使在這種狀態(tài)下也可能擴增。此數(shù)據(jù)表明，加入50μ M的1-硫代甘油和I3DGF-AA濃度增加到100ng/ml加入到10ng/ml的bFGF+1 Ong/ml的IGF-1中對細胞擴增是重要的。此外，IGF-1的添加可能不是必須的，但即使在50 μ M的1-硫代甘油和100ng/ml的TOGF-AA存在下仍然能有效增加擴增率。5(^]?1-硫代甘油和100叩/1111?06?-44的組合以及101^/1111 bFGF+1 Ong/ml IGF-1用于隨后的HFSC細胞培養(yǎng)。
[0117]在100ng/ml 的 PDGF-AA，10ng/ml bFGF, 10ng/ml IGF-1 和 50 μ M 的 1-硫代甘油存在下，HFSC細胞在第6代以后進一步擴增。傳代后在這些條件下細胞開始更迅速地增殖，在一個星期之內(nèi)擴增了 3-4倍。在這種情況下倍增時間約60-100小時。即使在8代(圖3，微縮圖D)、ll代(圖3，微縮圖E)和19代(圖3，微縮圖F)之后，HFSC細胞仍然能夠保持這種增殖狀態(tài)。因此，含有 100ng/ml PDGF-AA, I Ong/ml bFGF, I Ong/ml IGF-1 和 50 μ M的1-硫代甘油的確定的培養(yǎng)基被鑒定為神經(jīng)干細胞和/或神經(jīng)祖細胞長期擴增的最佳培養(yǎng)條件。
[0118]實施例3-HSCF細胞的自發(fā)分化技術
`[0119]測試各種培養(yǎng)條件時，觀察到當HFSC細胞培養(yǎng)時從培養(yǎng)基移除bFGF，許多細胞似乎分化為兩極或多極細胞(指示少突膠質(zhì)細胞)并很快死亡。為了避免這些細胞死亡，開發(fā)了自發(fā)分化技術。
[0120]培養(yǎng)基通常是每2天更換以擴增HFSC細胞，認為這對保持HFSC細胞在增殖狀態(tài)是非常重要的。為加強細胞分化，本實驗每3天或4天更換培養(yǎng)基。堿性FGF和高濃度的TOGF-AA被認為阻止HFSC細胞分化，但其對HFSC細胞生存也很重要。因此，在存在IOng/ml bFGF, 10ng/ml IGF-1和具有50 μ Ml-硫代甘油或不具有1-硫代甘油的情況下，PDGF-AA濃度從100減少到20ng/ml。如果移除bFGF，HFSC細胞無法很好地生存。通常情況下，每天補充bFGF以保持HFSC細胞增殖狀態(tài)。當停止補充bFGF，許多HFSC細胞從其集群分離，并形成了復雜的網(wǎng)絡狀突起(指示前-成少突膠質(zhì)細胞和/或未成熟的少突膠質(zhì)細胞)并良好存活，如圖7，微縮圖A和B所示。
[0121]如圖7的微縮圖C-F所示,這些具有蛛網(wǎng)狀形態(tài)的process-bearing細胞對04抗原和/或GalC抗原呈陽性，因此，認為這些細胞是前-成少突膠質(zhì)細胞(04陽性和GalC陰性)或未成熟的少突膠質(zhì)細胞(04陽性和GalC陽性)。即使在1-硫代甘油的存在下，HFSC細胞也可以分化，但當培養(yǎng)基中存在1-硫代甘油時過程的復雜程度看起來更簡單，如圖7中微縮圖A和B所示。此外，其它細胞類型(如星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元)很少觀察到，HFSC細胞被認為容易僅分化成少突膠質(zhì)細胞譜系細胞。這種技術使得能夠觀察到處于健康狀態(tài)的分化的少突膠質(zhì)細胞譜系細胞。
[0122]這些數(shù)據(jù)進一步表明，由于大部分的分化細胞表現(xiàn)少突膠質(zhì)細胞的特征和類似于少突膠質(zhì)細胞或前-成少突膠質(zhì)細胞，本發(fā)明的培養(yǎng)條件尤其可用于擴增容易分化成少突膠質(zhì)細胞的分離的神經(jīng)干細胞和/或神經(jīng)祖細胞。
[0123]實施例4-從常規(guī)神經(jīng)干細胞誘導HFSC細胞
[0124]如圖1所示，傳統(tǒng)的神經(jīng)干細胞被認為是HFSC細胞的前身。為確認此關系，檢測了是否如先前報道的能從常規(guī)神經(jīng)干細胞誘導HFSC細胞。源于人胎兒脊髓(11孕周)第二個組織樣本的細胞最初在10ng/ml的EGF和10ng/ml的bFGF的存在下培養(yǎng)于DMEM/F12中15天以擴增傳統(tǒng)的神經(jīng)干細胞，DMEM/F12中含有2.5mM谷氨酰胺，15mM的HEPES，2%的B27添加劑，I % NEAA, 1.5mM的丙酮酸，55 μ Μβ -巰基乙醇，ImM的N-乙酰-L-半胱氨酸。最初存在許多不同類型的細胞，但在原代培養(yǎng)末期時，得到一些可擴增的細胞群。這些結果示于圖8，微縮圖Α，0代第15天。第1次傳代之后，在與克隆#2b相同的條件下(即，含有10ng/ml bFGF, I Ong/ml IGF-1,100ng/ml PDGF-AA 和 50 μ Ml-硫代甘油的 HFSCMl 培養(yǎng)基)培養(yǎng)細胞至15代。
[0125]原代培養(yǎng)末期時獲得的可擴增細胞群中的細胞形態(tài)在約第5代變得同質(zhì)，細胞傾向于形成集群和球體，與克隆#2形成的類似(參見圖8，微縮圖B-F)。此外，該克隆可自發(fā)分化成少突膠質(zhì)細胞譜系細胞(數(shù)據(jù)未顯示)，顯示與克隆#2b相同的免疫表型(數(shù)據(jù)未示出)以及如實施例7所述通過流式細胞術檢測到顯示相同的標志物表達模式。冷凍來自于該克隆的細胞用于進一步的測試(如圖12)。該數(shù)據(jù)表明，HFSC細胞可以從傳統(tǒng)的神經(jīng)干細胞誘導，傳統(tǒng)的神經(jīng)干細胞被認為是HFSC細胞的前身。
[0126]認為TOGF-AA通過TOGF受體α起作用。已知這種受體被所有TOGF家族成員(PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC 和 PDGF-DD)激活。利用細胞克隆 #2h 和克隆 #3，使用I3DGF-BB來研究I3DGF-BB是否可以替換H)GF-AA。I3DGF-BB在除I3DGF-AA外的相同條件下可擴增兩個克隆，證明TOGF-AA可成功地被其它TOGF家族成員替換。
[0127]實施例5-最佳細胞培養(yǎng)成分的確定
[0128]當本申請發(fā)明人測試HFSC細胞(克隆#2b)建立后的不同的培養(yǎng)條件時，發(fā)明人注意到對各生長因子的劑量響應已經(jīng)變化。為了分離HFSC細胞(克隆#2b)，除了 50μΜ的1-硫代甘油外，較高濃度的roGF-AA(100ng/ml)是必要的。該克隆變?yōu)槌掷m(xù)增殖后，不再需要高濃度的I3DGF-AA(100ng/ml)來擴增克隆。擴增率在約10_20ng/ml TOGF-AA時飽和，更高濃度的TOGF-AA(100ng/ml)對克隆增長并無額外效果。這可能是因為長期培養(yǎng)或連續(xù)使用1-硫代甘油。為了建立HFSC細胞克隆#2b和克隆#3，幾代后使用1-硫代甘油。為了研究較高濃度的I3DGF-AA的效果，在1-硫代甘油的存在下，從初始培養(yǎng)建立了新的克隆。此外，對bFGF和IGF-1的響應似乎分別在20ng/ml和40ng/ml飽和。當使用較高濃度的IGF-1 (50-500ng/ml)時，可以看到更多的分化細胞(看起來1%左右)。因此，認為20ng/ml IGF-1對于擴增HFSC細胞是優(yōu)選的。使用20ng/ml的bFGF和20ng/ml的IGF-1，與使用10ng/ml的bFGF和10ng/ml的IGF-1相比，擴增率提高了 5%至10%。因此，本實驗使用了 20ng/ml 的 bFGF 和 20ng/ml 的 IGF-1。
[0129]來自第三個樣品(12孕周)的HFSC細胞進行培養(yǎng)，以研究在鑒定出的最佳培養(yǎng)基成分中是否需要較高濃度的TOGF-AA，以及它們是否能在另一批次的細胞中提供類似的生長特性。細胞在與克隆#2b和#3相同的培養(yǎng)基(即HFSCMl培養(yǎng)基和50 μ M的1-硫代甘油)中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含有20ng/ml (克隆#4A)或100ng/ml (克隆#4B) TOGF-AA以及20ng/ml的bFGF和20ng/ml的IGF-1。在第I代末期，克隆MA細胞數(shù)少于克隆#4B的三分之一(圖11,微縮圖A和B)。然而,在第I代后，克隆#4A開始以與克隆#4B類似的速度增殖，即使其I3DGF-AA濃度低于克隆#4B。在第3代細胞形態(tài)變?yōu)榫|(zhì)，細胞傾向于形成集群和球體，與克隆#2b或克隆#3形成的類似(參見圖10，微縮圖C-F)。此外，與克隆#2B和#3 —樣，這些細胞可以自發(fā)地分化成少突膠質(zhì)細胞譜系細胞。這一結果表明，對于分離HFSC細胞，較高濃度的I3DGF-AA不是必須的(mandatory)，但是優(yōu)選的，而且一旦HFSC細胞建立，較高濃度的I3DGF-AA不是必要的(necessary)。此外，這種培養(yǎng)方法可以在另一批次細胞中提供相似的生長特性，確認了此過程是可重復的。冷凍來自該克隆的細胞用于進一步的測試。
[0130]實施例6-凍融循環(huán)后擴增的HFSC細胞恢復和生長的能力
[0131]克隆#2b的細胞在10、11、12代在8% DMSO存在下冷凍保存。11代冷凍的HFSC細胞(克隆#2B)已保藏在ATCC (保藏編號PTA-12291，保藏日期:2011年11月30日，保藏單位:美國典型培養(yǎng)物保藏中心)。克隆#3的細胞在9代和10代也在8% DMSO的存在下冷凍保存?？寺?4A和#4B的細胞增長快于克隆#2b或#3，因此它們在相同狀態(tài)下在4代和5代(克隆#4A)或3代、4代和5代(克隆#4B)在8% DMSO存在下冷凍保存。用于培養(yǎng)HFSC細胞的培養(yǎng)基(HFSCM1培養(yǎng)基和50 μ M的1-硫代甘油)同樣用于冷凍HFSC細胞。其后解凍細胞并在具有IOng / ml的bFGF，IOng / ml的IGF-1，IOOng / ml的TOGF-AA或20ng / ml 的 bFGF，20ng / ml 的 IGF-1, 20ng / ml PDGF-AA 的上述無血清 HFSCMl 培養(yǎng)基和50μΜ的1-硫代甘油中培養(yǎng)細胞。觀察這些細胞發(fā)現(xiàn)以與冷凍前相似的速度增殖(圖6，圖9和圖11)。冷凍的細胞用于圖12-15中所示的接下來的實驗。
[0132]實施例7-擴增的和未分化的HFSC細胞的表征
[0133]當實施例2 的 HFSC 細胞在` 100ng/ml PDGF-AA, 10ng/ml bFGF, 10ng/ml IGF-1 和50 μ Ml-硫代甘油存在下培養(yǎng)，它們生長為集群和/或球體，如圖3，微縮圖D-F所示。從集群中分離出來的分散的細胞，具有分化成少突膠質(zhì)細胞的趨勢，如在圖3，微縮圖D和E所示。即使在單個細胞狀態(tài)下進行細胞傳代，它們最終開始聚集并再次形成集群。他們在增殖狀態(tài)的形狀與少突膠質(zhì)細胞前祖細胞類似(Ben-Hur等，J.Neurosci雜志，18:5777，1998 ；Gago等，Mol.Cell.Neurosci雜志,22:162,2003),但并不像生長成雙極形態(tài)不形成任何集群的0-2A祖細胞。雖然大鼠少突膠質(zhì)前祖細胞很久以前就被報道過，但在人類中對應的細胞尚未見報道。然而，確定擴增的細胞培養(yǎng)物中少突膠質(zhì)細胞前體細胞的精確階段是不必要的，因為不管如何它們保持了其分化成少突膠質(zhì)細胞的能力(如下所示)。
[0134]為了表征未分化HFSC細胞的免疫表型，用Accutase(創(chuàng)新細胞技術公司(Innovative Cell Technologies),美國加州圣迭戈)把11_15代的細胞離解成單細胞狀態(tài)并在聚鳥氨酸包被的24孔培養(yǎng)板生長，在存在100ng/ml PDGF-AA, 10ng/ml bFGF,10ng/ml IGF-1和50 μ Ml-硫代甘油情況下培養(yǎng)3-7天。隨后將細胞用4 %多聚甲醛固定，然后用PBS洗滌。為了染色表面抗原如CD133，PDGF-Ra，NG2, A2B5, 04，01，GalC和PSA-NCAM，細胞用含3%正常山羊(gout)血清(NGS)的PBS封閉并用抗體染色。對于染色細胞內(nèi)抗原如Sox2，巢蛋白，01ig2，髓鞘堿性蛋白(MBP)，波形蛋白，GFAP，β III微管蛋白，神經(jīng)絲蛋白-L和ΜΑΡ2，在封閉前將細胞用0.1%的Triton X-100在冰冷的PBS中通透。在含有 3% NGS 的 PBS 中，以 I: 300(CD133/1)，I: 300 (PDGF-R α )，I: 600 (NG2)，I: 1000 (PSA-NCAM)，I: 1000 (Α2Β5), I: 1000(04),I: 1000(01),I: 1000(Sox2),I: 200(巢蛋白)，1: 200(01ig2), I: 100 (GalC)，I: 50 (MBP)，I: 500(波形蛋白)，I: 1000 (GFAP)，I: 100 (β III 微管蛋白)，I: 200 (神經(jīng)絲蛋白-L)，I: 1000 (MAP2,多克隆)或1: 200(MAP2，單克隆)，使用⑶133/1小鼠IgGl單克隆抗體(克隆AC133，Miltenyi生物技術公司)，抗TOGF-Ra的兔多克隆抗體(Upstate公司)，抗NG2的兔多克隆抗體(Millipore公司)，抗PSA-NCAM小鼠IgM單克隆抗體(Millipore公司)，A2B5小鼠IgM的單克隆抗體(Millipore公司)，04小鼠IgM單克隆抗體(R&D系統(tǒng)公司)，01小鼠IgM單克隆抗體(Millipore公司)，抗_Sox2的兔多克隆抗體(Millipore公司)，抗-巢蛋白的小鼠IgGl單克隆抗體(Millipore公司)，抗_01ig2小鼠單克隆IgG2a抗體，抗GalC的單克隆IgG3抗體(Millipore公司)，抗-MBP大鼠單克隆IgG2a抗體(Millipore公司)，抗波形蛋白的小鼠IgGl單克隆抗體(Santa Cruz公司)，抗GFAP兔多克隆抗體(Millipore公司)，抗β III微管蛋白的單克隆小鼠IgGl抗體(Millipore公司),抗神經(jīng)絲蛋白-L的小鼠單克隆IgGl抗體(Cell Signaling公司)，抗MAP2的兔多克隆抗體(Millipore公司)和抗MAP2小鼠IgGl單克隆抗體(Millipore公司)。在4°C過夜培養(yǎng)后，更換含3% NGS的PBS3次以清洗孔。在一些情況下，使用對于某些細胞表面抗原(NG2，A2B5，04，01和⑶3)染色的活細胞以減少非特異性信號。在這種情況下，不封閉，在固定前將細胞用各一抗染色。在含有 0.5% BSA 的 PBS 中，以 I: 150 (NG2), I: 100 (A2B5), I: 200 (04)，I: 100(01)和1: 200 (⑶3)，使用抗NG2的兔多克隆抗體，A2B5小鼠IgM單克隆抗體，04小鼠IgM單克隆抗體，01小鼠IgM單克隆抗體，和抗-雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GD3小鼠單克隆IgG3抗體(Millipore公司)。在室溫下孵育30分鐘后，更換含有0.5% BSA的PBS3次以清洗孔。二抗，DyLight488-稱合的AffiniPure山羊抗兔IgG (Fe Y片段特異性)，DyLight488_ f禹合的AffiniPure山羊抗小鼠IgG (Fe Y片段特異性),DyLight488_稱合的AffiniPure山羊抗兔 IgG (H+L), DyLight488- f禹合的 AffiniPure 山羊抗大鼠 IgG (H+L), DyLight594_ f禹合的AffiniPure山羊抗小鼠IgG(H+L),和/或DyLight594_ i禹合的Aff iniPure山羊抗小鼠IgM(μ鏈特異性)(所有二抗均購自杰克遜免疫研究實驗室公司)以1: 500稀釋在室溫下使用I小時。然后用PBS清洗細胞2次。使用DAPI復染細胞核。然后用帶有落射熒光設備的Olympus 1X81觀察細胞。
[0135]大多數(shù)HFSC細胞為CD 133陽性(圖12，微縮圖A和B)，Sox2陽性(圖12，微縮圖C和D)和巢蛋白陽性(圖12，微縮圖E和F)，指示它們是神經(jīng)干細胞。大多數(shù)HFSC細胞為01ig2陽性(通常指示運動神經(jīng)元祖細胞和少突膠質(zhì)細胞祖細胞)(圖12，微縮圖G和H)，PDGF-Ra陽性(通常指示少突膠質(zhì)細胞譜系細胞)(圖12，微縮圖1和J)，A2B5陽性(A2B5通常不存在于神經(jīng)干細胞，通常見于神經(jīng)膠質(zhì)細胞祖細胞、少突膠質(zhì)細胞祖細胞和2型星形膠質(zhì)細胞上)(圖12，微縮圖M和N)，指示少突膠質(zhì)細胞祖細胞。大多數(shù)的HFSC細胞PSA-NCAM陽性(圖12，微縮圖O和P)，但其表達水平有變化(PSA-NCAM通常不存在于神經(jīng)干細胞，通常見于神經(jīng)元祖細胞和少突膠質(zhì)細胞的前祖細胞上)。未見到GFAP陽性細胞， 但大部分是波形蛋白陽性(參見圖12，微縮圖Q和S)。至少90%的HFSC細胞對上述除GFAP外的標志物是陽性的，但精確計數(shù)是非常困難的，因為HFSC細胞往往形成集群，在固定和染色中也可以很容易地脫離培養(yǎng)容器。為了量化其純度，進行流式細胞儀分析，結果如圖13中所示。
[0136]此外，通過免疫組化，未分化的HFSC細胞與04抗體染色較弱，該抗體是前-成少突膠質(zhì)細胞(04陽性，GalC陰性)和未成熟的少突膠質(zhì)細胞(04陽性，GalC陽性)的標志物，但很難區(qū)分弱染色和非特異性染色。在該細胞培養(yǎng)物中可以觀察到一些對04抗體呈強陽性的形態(tài)多極化的前-成少突膠質(zhì)細胞，但其出現(xiàn)頻率少于細胞總數(shù)的I %。
[0137]另外，未分化的HFSC細胞對抗-MAP2抗體弱染色，但它們的形態(tài)不像神經(jīng)元。當抗體用于在血清存在下分化的細胞時，以強烈的信號和神經(jīng)元形態(tài)鑒定到神經(jīng)元(參見圖14中的微縮圖H)。沒有在未分化的HFSC細胞中發(fā)現(xiàn)這種與MAP2的強烈信號以及神經(jīng)元形態(tài)。細胞分化后微弱信號消失，所以這種染色似乎是特異的，未分化的HFSC細胞可能不是非特異性染色。
[0138]總體上說，HFSC細胞表達神經(jīng)干細胞特異性標志物(⑶133，Sox2和巢蛋白)和少突膠質(zhì)細胞譜系細胞的特異性標志物(01ig2，NG2, A2B5，和04)。這些數(shù)據(jù)表明HFSC細胞可能是神經(jīng)干細胞和少突膠質(zhì)細胞祖細胞之間的中間細胞。另外，除上述抗原外，HFSC細胞表達PSA-NCAM，指示是大鼠少突膠質(zhì)細胞前祖細胞的人類對應物。
[0139]PSA-NCAM中的聚唾液酸(PSA)是長的、帶負電荷、細胞表面的聚糖，具有大量水合容量來調(diào)節(jié)細胞間的距離。PSA參與成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一些與可塑性相關的反應，包括晝夜和激素模式的變化，痛苦和壓力適應，以及學習和記憶方面(RutishauserNat等，Rev.Neurosci雜志，9:26，2008)。PSA在新生兒的神經(jīng)系統(tǒng)的功能之一是少突膠質(zhì)細胞祖細胞的遷移。在創(chuàng)傷模型中，當PSA從遷移中的02A祖細胞移除時，02A祖細胞的遷移被抑制(Barral-Moran 等，J.Neurosc1.Res 雜志，72 =679,2003)。PSA 另一個作用是控制細胞的分化時間。PSA在發(fā)育中的軸突 和少突膠質(zhì)細胞前體中都有表達，在這些細胞上的表達下調(diào)與髓鞘化的啟動相關。PSA也與成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)中與可塑性相關的反應有關。由于PSA能夠調(diào)節(jié)發(fā)育和成人可塑性，因此考慮到表達PSA的細胞可在由于受傷或疾病而使組織受到了損害的情況中具有治療價值。在創(chuàng)傷模型中通過疤痕觀察到PSA表達區(qū)的軸突再生(在疤痕中或在嫁接的Schwann細胞上工程化的PSA表達)。HFSC細胞是內(nèi)源性表達PSA的細胞，將對治療創(chuàng)傷如腦損傷或脊髓損傷治療具有同樣的效果。
[0140]為了進一步表征HFSC細胞(克隆#2B)，解凍在11代冷凍的細胞，在上述生長條件下培養(yǎng)，每7-9天傳代。然后將在13代培養(yǎng)9天的細胞使用以下抗體進行流式細胞術:PE耦合的抗-CD133/1小鼠IgGl單克隆抗體(克隆AC133，Miltenyi生物技術公司)，PE耦合的⑶140a小鼠IgG2a單克隆抗體(克隆a Rl，BD Pharmingen公司)，PE耦合的⑶9小鼠IgGl單克隆抗體(克隆M-L13，BD Pharmingen公司)，PE耦合的CD44小鼠IgG2b單克隆抗體(克隆G44-26，BD Pharmingen公司)，PE耦合的抗-PSA-NCAM小鼠IgM單克隆抗體(2-2B,Miltenyi生物技術公司)，PE耦合的A2B5小鼠IgM單克隆抗體(克隆105HB29,Miltenyi生物技術公司)，PEf禹合的04小鼠IgM單克隆抗體(克隆04,MiItenyi生物技術公司)，和PE耦合的抗-NG2小鼠IgGl單克隆抗體(R&D系統(tǒng)公司)。簡單地說，用Accutase離解之后，將細胞洗滌，重懸在冰冷的具有2mM EDTA和0.5% BSA的PBS中并保存在冰上。計數(shù)細胞數(shù)量后，使用冰冷的具有2mM EDTA和0.5% BSA的PBS調(diào)整細胞數(shù)為IxlO7個細胞/ml。25 μ I細胞懸浮液(250，OOO個細胞)轉移到每個1.5毫升管。然后一抗按照制造商的建議分別加入到各管中，用每個抗體的PE耦合的同種型對照來設置適當?shù)拈T。在冰上孵育20分鐘后，用冰冷的具有2mM EDTA和0.5% BSA的PBS洗滌細胞，并重新懸浮在固定緩沖液(BD Bioscience公司)。在冰上固定20分鐘后，將細胞洗滌，再懸浮在冰冷的具有2mM EDTA 和 0.5% BSA 的 PBS 中。使用 FACS Canto II (BD Bioscience 公司)測量細胞的突光，使用 Gatelogic 軟件(Inivai Technologies Pty Ltd.)分析每個數(shù)據(jù)。
[0141]如圖13所示，所有或大多數(shù)的HFSC細胞(克隆#2b)為⑶133陽性(100%的細胞)，CD9陽性(100%的細胞)，CD140a陽性(98.8%的細胞)，NG2陽性(89.8%的細胞)，A2B5陽性(99.9%的細胞)，04陽性(94.6 %的細胞)，PSA-NCAM陽性(68.9%的細胞)，⑶44陰性(0.4%的細胞呈陽性)。通過免疫組化，04信號幾乎不能和非特異性染色區(qū)別開，并且遠弱于前-成少突膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的04信號。從流式細胞儀結果可以看至lj，HFSC細胞(克隆#2b)的04信號能夠與同種型對照組分開，HFSC細胞(克隆#2b)對04抗原呈現(xiàn)弱陽性。HFSC細胞(克隆#3)通過流式細胞儀顯示出幾乎相同的表型。這些細胞為⑶133陽性(98.4%的細胞)，⑶9陽性(99.4%的細胞)，⑶140 α陽性(91.5%的細胞)，NG2陽性(63.4%的細胞)，A2B5陽性(99.8%的細胞)，04陽性(71.6%的細胞)，PSA-NCAM陽性(74.7%的細胞)，⑶44陰性(0.3%的細胞為陽性)。
[0142]實施例8-擴增的HFSC細胞在含血清培養(yǎng)基中的分化潛力
[0143]為了測試擴增的細胞的分化潛能，將HFSC細胞(克隆#3)傳代到分離/單細胞階段，并在含血清的培養(yǎng)基[少突膠質(zhì)細胞的前體細胞分化培養(yǎng)基(OPCDM)] (ScienCe 11?研究實驗室)中培養(yǎng)以刺激分化。然后細胞用抗體染色，這些抗體識別神經(jīng)元(抗_β III微管蛋白抗體，抗-神經(jīng)絲蛋白-L抗體和抗-ΜΑΡ2抗體)，少突膠質(zhì)細胞祖細胞和少突膠質(zhì)細胞[04抗體，01抗體抗-GalC抗體和抗-髓鞘堿性蛋白(MBP)抗體]，和星形膠質(zhì)細胞(抗-GFAP抗體)，然后使用熒光染料耦合的二抗(DyLight488，或DyLight594，JacksonImmunoResearch公司)。使用DAPI復染細胞核。
[0144]在經(jīng)過處理以刺激HFSC細胞分化之后，觀察到了所有三種主要的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)表型。當HFSC細胞培養(yǎng)在含血清的培養(yǎng)基時，檢測到β III微管蛋白陽性細胞、神經(jīng)絲蛋白-L陽性細胞、和ΜΑΡ-2陽性細胞(指示神經(jīng)元)。大量β III微管蛋白陽性細胞(圖14中，微縮圖B)，少量細胞是神經(jīng)絲蛋白-L(圖14中，微縮圖Ε)或ΜΑΡ2(圖14中，微縮圖H)陽性。這一結果表明，其中許多是未成熟的神經(jīng)元。HFSC細胞也可以分化成MBP-陽性細胞。MBP是髓磷脂的主要組分，只在成熟的少突膠質(zhì)細胞表達。此數(shù)據(jù)表明，HFSC細胞有能力分化為成熟的少突膠質(zhì)細胞。評價了 MBP和上述神經(jīng)元標志物的共定位，但僅可看到少數(shù)共定位(圖14中的微縮圖C，F(xiàn)，I)。這可能是由于神經(jīng)元不成熟，因為髓鞘不會被包裹在未成熟的神經(jīng)元軸突上。還評價了 MBP和04抗原的共定位(圖14，微縮圖J-L)。大多數(shù)MBP信號與04抗原信號共定位，但只有一半的04抗原信號與MBP信號共定位。這個結果是合理的，因為04抗原在少突膠質(zhì)細胞祖細胞、不成熟的少突膠質(zhì)細胞和成熟少突膠質(zhì)細胞表達，而MBP只在成熟的少突膠質(zhì)細胞表達。這些細胞對GalC抗原也為陽性(數(shù)據(jù)未示出),GalC抗原是不成熟的少突膠質(zhì)細胞的標志物。如圖14,微縮圖M-O所示,還檢測了 GFAP陽性細胞(星形膠質(zhì)細胞)和波形蛋白陽性細胞。這些數(shù)據(jù)顯示，擴增的HFSC細胞是專能的，并且，因此它們可能是神經(jīng)干細胞，因為取決于環(huán)境，它們能夠產(chǎn)生三種主要的中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞表型。HFSC細胞(克隆#2b)在相同條件下進行了測試，顯示了與HFSC細胞(克隆#3)同樣的專能性。
[0145]實施例9-擴增的HFSC細胞在無血清培養(yǎng)基中的分化潛力
[0146]如圖5所示，在不補充bFGF的情況下通過降低I3DGF-AA濃度，HFSC細胞表現(xiàn)出良好的分化成少突膠質(zhì)細胞的潛能。然而，分化的細胞少于細胞總數(shù)的一半。如果在沒有bFGF，有10ng/ml PDGF-AA和100ng/ml IGF-1的情況下，以很低的密度接種HFSC細胞(< 0.5 X IO4個細胞/平方厘米)，大多數(shù)細胞看起來都分化，但在一天之內(nèi)消失。為了檢驗它們再分化成少突膠質(zhì)細胞的潛能，認為誘導分化和長期細胞存活是非常重要的。已知環(huán)狀AMP(cAMP)誘導多種細胞類型的分化。PCPT-cAMP是一種可滲透細胞的cAMP類似物，測試了其是否能夠在HFSC細胞誘導分化。100 μ M的pCPT-cAMP能夠誘導高密度HFSC細胞(3 X IO4個細胞/平方厘米)分化，但細胞無法良好生存，即使存在100ng/ml的IGF-1。有報道顯示BDNF能夠增強少突膠質(zhì)細胞祖細胞分化和支持分化的細胞的細胞生存。當HFSC細胞在存在 10ng/ml 的 PDGF-AA，100ng/ml 的 IGF-1，100 μ M 的 pCPT-cAMP 和 10ng/ml 的BDNF的DMEM/F12中分化時，至少多于一半的HFSC細胞分化成process-bearing細胞,所述DMEM/F12含有谷氨酰胺和HEPES，并補充有B27添加劑，N2添加劑和50 μ M的1-硫代甘油。由于HFSC細胞表達幾種少突膠質(zhì)細胞標志物，如04或NG2，因此需要一種區(qū)分HFSC細胞和少突膠質(zhì)細胞譜系細胞的新方法。根據(jù)幾次試驗，發(fā)明人注意到，未分化的細胞表達GD3要強于少突膠質(zhì)細胞祖細胞，04反之(圖11，微縮圖B和微縮圖<?的箭頭)。當用⑶3和04染色細胞時，少突膠質(zhì)細胞可以通過染色模式和它們的形態(tài)而區(qū)分出來。此外，其他類型的細胞， 如神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細胞也可以被識別，因為它們不表達GD3或04抗原。圖15，微縮圖D顯示了不同細胞類型的比例。未分化細胞占總細胞的23.5% ±2.0%。少突膠質(zhì)細胞祖細胞占總細胞的75.8% ±2.1%。其他類型的細胞僅為0.9% ±0.6%。如上所述，少突膠質(zhì)細胞祖細胞相對于分化的細胞(少突膠質(zhì)細胞祖細胞加上其它細胞類型)的比率為分化的細胞的99.1% ±0.56%，而其他類型的細胞為分化細胞的0.9% ±0.56%。此數(shù)據(jù)表明，HFSC細胞具有分化成少突膠質(zhì)細胞譜系細胞的高潛能。
[0147]實施例10-通過熒光激活細胞分選(FACS)法或磁性分選法富集或選擇HFSC細胞
[0148]本發(fā)明公開了 HFSC細胞的表型為⑶133陽性，⑶140a陽性，⑶9陽性，⑶44陰性，PSA-NCAM陽性，A2B5陽性，04陽性和NG2陽性。此信息可用來選擇或富集HFSC細胞而不用培養(yǎng)。CD133是神經(jīng)干細胞標志物，在祖細胞或前體細胞中不表達。CD9也用作神經(jīng)干細胞的標志物，但已知有些少突膠質(zhì)細胞表達⑶9。PSA-NCAM和A2B5用于檢測神經(jīng)元限制性前體細胞或神經(jīng)膠質(zhì)細胞前體細胞。認為大多數(shù)神經(jīng)前體細胞和祖細胞表達PSA-NCAM和A2B5或者PSA-NCAM或A2B5，應用它們富集HFSC細胞效果不怎么好，尤其是在第一和第二個三個月(trimester)。CD140a，NG2，A2B5和04用作少突膠質(zhì)前體細胞、前-少突膠質(zhì)細胞(pro-oligodendroglia)和少突膠質(zhì)細胞的標志物。在HFSC細胞中Q)140a和NG2的表達水平比在少突膠質(zhì)前體細胞、前-成少突膠質(zhì)細胞、或少突膠質(zhì)細胞更高，而A2B5和04在HFSC細胞中的表達水平比在少突膠質(zhì)細胞前體細胞、前-成少突膠質(zhì)細胞、或少突膠質(zhì)細胞少。認為應用CD140a和NG2更適合富集HFSC細胞?；诒景l(fā)明上述所述信息和數(shù)據(jù)，每個標志物用來富集HFSC細胞的有效性為⑶140a > NG2 >⑶9 >⑶133 > A2B5 > 04，PSA-NCAM,但這個順序?qū)⒁蛟兄芏淖儭0149]然而，單一的標志物并不足以選擇HFSC細胞，兩個標志物的組合可以更特異地選擇HFSC細胞。神經(jīng)干細胞標志物(⑶133或⑶9)之一和少突膠質(zhì)細胞譜系標志物(⑶140a，NG2)之一的結合對選擇HFSC細胞是非常有效的?；谏鲜鲂畔ⅲ谶@些組合中對選擇HFSC細胞最高效的標志物組合是CD133和CD140a，但其它組合也應該比用單一標志物選擇更有效。
[0150]⑶133或⑶140a的出現(xiàn)頻率通常較低(小于5% )，⑶140a的出現(xiàn)比⑶133更晚(從大約第8孕周開始表達，到大約18孕周最大)。因此，取決于孕周，既表達CD133又表達CD140a的細胞非常少(小于總細胞的1% )。如果細胞來源于15孕周或更早期的人胎兒組織，大多數(shù)⑶133陽性細胞可能不表達⑶140a。由于⑶133陽性和⑶140a陰性的細胞將在更晚表達⑶140a，因此在⑶133陽性細胞最初富集后，當細胞在培養(yǎng)HFSC細胞的相同條件下培養(yǎng)時，可獲得HFSC 細胞。
【權利要求】
1.一種分離的可擴增的人神經(jīng)細胞，其中所述細胞為祖細胞或干細胞， 其中所述細胞保持其分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的能力，其中所述細胞保持其在整個后續(xù)傳代中有效分化為少突膠質(zhì)細胞譜系細胞的能力， 其中所述細胞至少表達細胞表面抗原⑶133和⑶140 α。
2.根據(jù)權利要求1的分離的可擴增的入神經(jīng)細胞，其特征在于所述細胞已在ATCC保藏，保藏號為ΡΤΑ-12291。
3.根據(jù)權利要求1的可擴增的人神經(jīng)細胞，其特征在于所述細胞來自于人胎兒神經(jīng)組織，所述神經(jīng)組織選自脊髓、大腦皮質(zhì)、海馬、紋狀體、基底前腦、腹側中腦、藍斑核、下丘腦、小腦、胼胝體和視神經(jīng)。
4.根據(jù)權利要求3的可擴增的人神經(jīng)細胞，其特征在于所述神經(jīng)組織從8-24孕周的人脊髓分離。
5.根據(jù)權利要求1的可擴增的人神經(jīng)細胞，其特征在于所述細胞已在有效富集可擴增的神經(jīng)細胞的條件下培養(yǎng)，所述條件包括，含有有效量的生長添加劑、兩種生長因子和一種存活因子的培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權利要求5的可擴增的人神經(jīng)細胞，其特征在于所述生長添加劑為1-硫代甘油，培養(yǎng)基中生長添加劑的有效量為至少IOyM的1-硫代甘油以分離HFSC細胞。
7.根據(jù)權利要求5的可擴增的人神經(jīng)細胞，其特征在于所述兩種生長因子是血小板衍生生長因子O3DGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，存在的濃度為至少5ng/ml的TOGF和至少2.5ng/ml的bFGF以分離HFSC細胞。
8.根據(jù)權利要求5的可擴增的人神經(jīng)細胞，其特征在于所述兩種生長因子是TOGF和bFGF, PDGF存在的濃度為約40ng/ml到約200ng/ml, bFGF存在的濃度為約5ng/ml到約40ng/ml以分離HFSC細胞。
9.根據(jù)權利要求5的可擴增的人神經(jīng)細胞，其特征在于所述兩種生長因子是TOGF和bFGF, PDGF存在的濃度為約100ng/ml，bFGF存在的濃度為約20ng/ml以分離HFSC細胞。
10.根據(jù)權利要求5的可擴增的人神經(jīng)細胞，其特征在于所述兩種生長因子是TOGF和bFGF, PDGF存在的濃度至少為lng/ml，bFGF存在的濃度至少為0.5ng/ml,以在細胞系建立后擴增HFSC細胞并維持細胞。
11.根據(jù)權利要求5的可擴增的人神經(jīng)細胞，其特征在于所述兩種生長因子是TOGF和bFGF,F1DGF存在的濃度為約5ng/ml到約100ng/ml,bFGF存在的濃度為約lng/ml到約50ng/ml,以在HFSC細胞建立后使其擴增。
12.根據(jù)權利要求5的可擴增的入神經(jīng)細胞，其特征在于所述兩種生長因子是TOGF和bFGF, PDGF存在的濃度為約20ng/ml，bFGF存在的濃度為約20ng/ml，以在HFSC細胞建立后使其擴增。
13.根據(jù)權利要求5的可擴增的人神經(jīng)細胞，其特征在于所述一種存活因子為胰島素樣生長因子(IGF)，存在濃度至少為lng/ml的IGF。
14.根據(jù)權利要求5的可擴增的人神經(jīng)細胞，其特征在于所述一種存活因子為胰島素樣生長因子IGF，存在濃度為約5ng/ml到約100ng/ml的IGF。
15.根據(jù)權利要求5的可擴增的人神經(jīng)細胞，其特征在于所述一種存活因子為IGF，存在濃度為約20ng/ml的IGF。
16.根據(jù)權利要求1的可擴增的人神經(jīng)細胞，其特征在于所述細胞可以冷凍和解凍而不失去其在整個后續(xù)傳代中分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的能力，以及其至少表達細胞表面抗原⑶133和⑶140 α的能力。
17.一種體外培養(yǎng)可擴增的神經(jīng)細胞的方法，其中所述細胞是分離自哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的祖細胞或干細胞，其中所述細胞保持其分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的能力以及其有效分化為少突膠質(zhì)細胞譜系細胞的能力，所述方法包括: a)從人胎兒神經(jīng)組織分離和離解至少一個細胞， b)在溫度為37°C，含有1-20%O2和5% CO2的氣體環(huán)境中，化學定義的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，所述培養(yǎng)基包含: -至少 5ng/ml PDGF-AA -至少 0.5ng/ml bFGF,和 -至少ΙΟμΜ的1-硫代甘油， c)從b)傳代細胞以獲得所述可擴增的人神經(jīng)細胞。
18.根據(jù)權利要求17的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基還包含至少1.0ng/ml的IGF-1。
19.根據(jù)權利要求17的方法，其特征在于所述神經(jīng)組織選自脊髓、大腦皮質(zhì)、海馬、紋狀體、基底前腦、腹側中腦、藍斑核、下丘腦、小腦、胼胝體和視神經(jīng)。
20.根據(jù)權利要求17的方法，其特征在于在步驟a)，所述神經(jīng)組織來自8-24孕周的人胎兒脊髓。
21.根據(jù)權利要求17的方法，其特征在于在步驟a)，通過使用熒光激活的細胞分選(FACS)或免疫抗體包被篩選法中的至少一種的分離方法來進行所述分離。
22.根據(jù)權利要求18的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基包含:
-40-200ng/ml PDGF-AA,
-5-100ng/ml bFGF, -10-100 μ Ml-硫代甘油，和 -5-100ng/ml IGF-10
23.根據(jù)權利要求18的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基包含:
-約 100ng/ml PDGF-AA,
-約 20ng/ml bFGF, -約50 μ Ml-硫代甘油，和 -約 20ng/ml IGF-10
24.根據(jù)權利要求18的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基包含:
-5-100ng/ml PDGF-AA,
-l-50ng/ml bFGF, -10-100 μ Ml-硫代甘油，和 -5-100ng/ml IGF-10
25.根據(jù)權利要求18的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基包含:
-約 20ng/ml PDGF-AA,
-約 20ng/ml bFGF, -約50 μ Ml-硫代甘油，和-約 20ng/ml IGF-10
26.根據(jù)權利要求18的方法，其特征在于所述培養(yǎng)步驟發(fā)生在涂有聚鳥氨酸或聚賴氨酸的培養(yǎng)容器中。
27.根據(jù)權利要求18的方法，其特征在于所述化學定義的無血清培養(yǎng)基包含DMEM/F12，所述DMEM/F12添加有非必需氨基酸、谷氨酰胺、丙酮酸、B27、N-乙酰半胱氨酸和β-巰基乙醇。
28.體外培養(yǎng)物，其包含從哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)獲得的至少一個分離的神經(jīng)細胞，其中所述分離的細胞浸沒在化學定義的無血清培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基包含:
-至少 5ng/ml 的 F1DGF-AA, -至少5ng/ml的bFGF,和 -至少10 μ M的1-硫代甘油。
29.根據(jù)權利要求28的體外培養(yǎng)物，還包含至少1.0ng/ml IGF-1。
30.根據(jù)權利要求29的體外培養(yǎng)物，其特征在于所述細胞從人胎兒脊髓獲得。
31.根據(jù)權利要求30的體外培養(yǎng)物，其特征在于所述體外培養(yǎng)物在涂有聚鳥氨酸或聚賴氨酸的培養(yǎng)容器中。
32.根據(jù)權利要求30的體外培養(yǎng)物，其特征在于所述化學定義的無血清培養(yǎng)基還包含DMEM/F12，所述DMEM/F12添加有非必需氨基酸、谷氨酰胺、丙酮酸、B27、N_乙酰半胱氨酸和β-巰基乙醇。`
33.根據(jù)權利要求30的體外培養(yǎng)物，其特征在于所述神經(jīng)細胞為CD133陽性和CD140 α 陽性。
34.治療由髓磷脂缺失或少突膠質(zhì)細胞缺失而導致的病況的方法，包括: 給予受試者治療有效量的組合物，該組合物包含權利要求1所述的分離的可擴增的人神經(jīng)細胞。
35.根據(jù)權利要求34的方法，其特征在于所述病況為脫髓鞘疾病或神經(jīng)變性疾病。
36.根據(jù)權利要求35的方法，其特征在于所述脫髓鞘疾病選自脊髓損傷(SCI)、多發(fā)性硬化(MS)、遺傳性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、橫貫性脊髓病/脊髓炎、漸進多焦點灶性白質(zhì)腦病和其他先天性脫髓鞘疾病。
37.根據(jù)權利要求35的方法，其特征在于所述神經(jīng)變性疾病選自阿爾茨海默氏病、阿爾茨海默型老年癡呆癥(SDAT)、帕金森氏病、亨廷頓氏病、肌萎縮性脊髓側索硬化癥(ALS)、局部缺血、失明和由具髓鞘神經(jīng)元損害導致的神經(jīng)變性疾病。
38.根據(jù)權利要求35的方法，其特征在于所述給藥步驟包括注射所述可擴增的入神經(jīng)細胞到受脫髓鞘疾病或神經(jīng)變性疾病影響的神經(jīng)組織或側腦室。
39.根據(jù)權利要求38的方法，其特征在于所述神經(jīng)組織選自脊髓、腦室下區(qū)、胼胝體、小腦、基底神經(jīng)節(jié)、基底核和黑質(zhì)。
40.根據(jù)權利要求35的方法，其特征在于所述給藥步驟包括通過選自經(jīng)子宮的胎兒腦室注射、腦室內(nèi)注射、腦實質(zhì)內(nèi)注射、玻璃體內(nèi)注射和靜脈給藥的方法將所述可擴增的人神經(jīng)細胞注射到所述受試者中。
41.根據(jù)權利要求35的方法，還包括在所述給藥步驟前分化可擴增的人神經(jīng)細胞的步驟。
42.神經(jīng)干細胞藥物組合物，其包含權利要求1所述的分離的可擴增的人神經(jīng)細胞。
43.神經(jīng)干細胞藥物組合物，其包含可擴增的神經(jīng)細胞，所述可擴增的神經(jīng)細胞經(jīng)權利要求17的方法在體外培養(yǎng)。
44.權利要求42或43的藥物組合物在制備藥物中的應用，所述藥物用于治療髓磷脂缺失或少突膠質(zhì)細胞 缺失所導致的病況。
【文檔編號】C12N5/0797GK103687941SQ201280004915
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年1月12日 優(yōu)先權日:2011年1月12日
【發(fā)明者】城戶常雄 申請人:城戶常雄