用于生產(chǎn)尸胺的方法和重組微生物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及包含提高尸胺或N-乙酰尸胺生產(chǎn)的失調(diào)的形式的DNA分子的重組微生物的用途，以及用于產(chǎn)生所述微生物的重組DNA分子和多肽，所述微生物包含細(xì)胞內(nèi)賴氨酸脫羧酶活性和失調(diào)的尸胺輸出活性，或包含降低的尸胺輸出活性和增強的N-乙酰尸胺形成活性。本發(fā)明也涉及使用重組微生物生產(chǎn)尸胺或N-乙酰尸胺的方法。
【專利說明】用于生產(chǎn)尸胺的方法和重組微生物
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及包含提高尸胺或N-乙酰尸胺生產(chǎn)的失調(diào)的(deregulated)形式的DNA分子的重組微生物的用途，以及用于產(chǎn)生所述微生物的重組DNA分子和多肽，所述微生物包含細(xì)胞內(nèi)賴氨酸脫羧酶活性和失調(diào)的尸胺輸出活性，或包含降低的尸胺輸出活性和增強的N-乙酰尸胺形成活性。本發(fā)明也涉及使用重組微生物生產(chǎn)尸胺或N-乙酰尸胺的方法。
現(xiàn)有技術(shù)
[0002]JP 2002223770公開了通過將賴氨酸脫羧基因和/或賴氨酸_尸胺逆向轉(zhuǎn)運體基因引入產(chǎn)賴氨酸的微生物，從而生產(chǎn)尸胺的方法。
[0003]JP 2004222569公開了通過培養(yǎng)具有L-賴氨酸脫羧酶活性和高絲氨酸營養(yǎng)缺陷型的重組棒桿菌，生產(chǎn)尸胺的方法。
[0004]WO 2007113127公開了通過培養(yǎng)具有失調(diào)的L-賴氨酸脫羧酶活性的重組棒桿菌，檢測尸胺乙?；D(zhuǎn)移酶及其提高尸胺生產(chǎn)的缺失，生產(chǎn)尸胺的方法。
[0005]US 7，435，584公開了通過培養(yǎng)具有IysE (賴氨酸輸出載體)基因高表達(dá)的棒桿菌的增強的L-賴氨酸生產(chǎn)的方法。
[0006]WO 2008092720公開了通過發(fā)酵表達(dá)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的脫羧酶的高產(chǎn)賴氨酸微生物，生產(chǎn)尸胺的方法，其中這樣的微生物可能具有降低的或消除的賴氨酸/尸胺逆向轉(zhuǎn)運體的表達(dá)。
[0007]發(fā)明概述
[0008]在一個方面，本發(fā)明提 供了具有失調(diào)的尸胺輸出活性的微生物。優(yōu)選地所述失調(diào)的尸胺輸出體活性至少部分是由于包含與SEQ ID NO:1具有至少80%同一性的氨基酸序列的一種或多種尸胺輸出體多肽的失調(diào)。在本發(fā)明的一個實施方案中，微生物具有增強的尸胺輸出體活性，而在本發(fā)明的另一個實施方案中，微生物具有降低的尸胺輸出體活性。優(yōu)選地，微生物具有增強的賴氨酸脫羧酶活性，甚至更優(yōu)選地，所述增強的賴氨酸脫羧酶活性是由于包含與SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少80%同一性的氨基酸序列的一種或多種賴氨酸脫羧酶多肽的表達(dá)。在本發(fā)明的另外的實施方案中，上述微生物還具有選自下述基因的至少一種失調(diào)的基因:天冬氨酸激酶，天冬氨酸半醛脫氫酶(aspartate semi aldehyde dehydrogenase), 二氫吡卩定二羧酸合酶，二氫吡卩定二羧酸還原酶，四氫吡唳二羧酸琥拍酰酶(tetrahydrodipicolinate succinylase),琥拍酰-氨基-酮基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶(succinyl-amino-ketopimelate transaminase),玻拍酸-二氨基 _ 庚二酸脫玻拍酸酶(succinyl-diamino-pimelate desuccinylase), 二氨基庚二酸表異構(gòu)酶，二氨基庚二酸脫氫酶，精氨酰-tRNA合成酶，二氨基庚二酸脫羧酶，丙酮酸羧化酶，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，轉(zhuǎn)酮醇酶，轉(zhuǎn)醛醇酶，6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶，果糖1，6-二磷酸酶，高絲氨酸脫氫酶，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phophoenoIpyruvatecarboxykinase),琥拍酰輔酶A合成酶，甲基丙二酰輔酶A變位酶,二胺乙?；D(zhuǎn)移酶。優(yōu)選地，上述微生物具有提高的賴氨酸輸入活性。在甚至更優(yōu)選的實施方案中，微生物具有增強的賴氨酸輸入活性，這至少部分是由于降低的賴氨酸輸出體活性或增強的賴氨酸通透酶活性或增強的賴氨酸/尸胺逆向轉(zhuǎn)運體活性或其任意組合。增強的賴氨酸輸入活性優(yōu)選地是由于包含與SEQ ID NO:5具有至少80%同一性的氨基酸序列的至少一種賴氨酸輸出體多肽的降低的活性。在本發(fā)明的另一個實施方案中，上述微生物具有增強的賴氨酸輸入活性，這至少部分是由于增強的賴氨酸通透酶活性或至少部分是由于增強的賴氨酸/尸胺逆向轉(zhuǎn)運體活性或二者的組合。
[0009]本發(fā)明還包含如上所述的微生物，其還具有失調(diào)的N-乙酰尸胺形成活性。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述具有失調(diào)的N-乙酰尸胺形成活性的微生物沒有，或具有降低的N-乙酰尸胺形成活性。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述具有失調(diào)的N-乙酰尸胺形成活性的微生物具有增強的N-乙酰尸胺形成活性和降低的尸胺輸出體活性。優(yōu)選地，上述微生物的失調(diào)的N-乙酰尸胺形成活性至少部分是由于包含與SEQ ID NO:13具有至少80%同一性的氨基酸序列的N-乙酰尸胺形成多肽的失調(diào)。優(yōu)選地，任一種上述微生物屬于真細(xì)菌進(jìn)化枝，甚至更優(yōu)選地，屬于棒桿菌屬(Corynebacterium),最優(yōu)選地上述微生物屬于谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)種。
[0010]本發(fā)明還包含使用任一種上述微生物生產(chǎn)尸胺的方法，和使用任一種上述微生物生產(chǎn)N-乙酰尸胺的方法。本發(fā)明還包含任一種上述微生物用于生產(chǎn)尸胺或N-乙酰尸胺的用途。
[0011]本發(fā)明的其他實施方案是通過發(fā)酵任一種上述微生物生產(chǎn)的尸胺的用途和使用通過發(fā)酵任一種上述微生物生產(chǎn)的尸胺生產(chǎn)的多胺。
[0012]附圖簡述
[0013]圖1:在產(chǎn)生戊二胺的谷氨酸棒桿菌DAP-3c中比賴氨酸脫羧酶活性對存在的戊二胺的依賴性。數(shù)據(jù)代表2次重復(fù)實驗的平均值。
[0014]圖2:攜帶SEQ ID NO:1的尸胺輸出體多肽(戊二胺輸出體)缺失的谷氨酸棒桿菌sdapE，和過表達(dá)在sod啟動子下的編碼SEQ ID NO:1的多肽的SEQ ID NO:2的尸胺輸出體基因的PsoddapE，及它們的親本菌株DAP-3c的生長(A)、生物量產(chǎn)量(B)、戊二胺(C)和N-乙酰戊二胺產(chǎn)量的比較。數(shù)據(jù)代表在以IOg L-1葡萄糖為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)的3次生物學(xué)重復(fù)的指數(shù)生長期的數(shù)值。
[0015]發(fā)明詳述
[0016]在以下描述中，大量使用了一些術(shù)語。此處提供定義以便于理解本發(fā)明。
[0017]術(shù)語尸胺表不I，5_ 戍二胺(I, 5-diaminopentane) (CAS 號:462_94_2)。
[0018]術(shù)語N-乙酰尸胺表示N-乙酰戊二胺(CAS號:102029-76-5)。
[0019]本發(fā)明的方法以重組微生物為特征，所述微生物優(yōu)選地包括如本文描述的載體或基因(例如，野生型和/或突變的基因)，和/或以導(dǎo)致尸胺和/或N-乙酰尸胺產(chǎn)生的方式培養(yǎng)。
[0020]術(shù)語“重組”微生物包括與其來源的天然存在的微生物相比，已被遺傳改變、修飾或改造(例如，遺傳改造)，從而使其展示改變的、修飾的或不同的基因型和/或表型(例如，當(dāng)遺傳修飾影響微生物的編碼核酸序列時)的微生物(例如，細(xì)菌、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞
[0021]啟動子。引導(dǎo)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA的DNA序列。一般啟動子位于基因的5'區(qū)，靠近結(jié)構(gòu)基因的起始密碼子。如果啟動子是誘導(dǎo)型啟動子，那么轉(zhuǎn)錄率響應(yīng)誘導(dǎo)劑而增加。相反，如果啟動子是組成型啟動子，則轉(zhuǎn)錄率不受誘導(dǎo)劑調(diào)節(jié)。
[0022]增強子。一種啟動子元件。增強子可增加特定基因轉(zhuǎn)錄為mRNA的效率，這與增強子相對轉(zhuǎn)錄起始位點的距離或方向無關(guān)。
[0023]克隆載體。一種DNA分子，如質(zhì)粒、粘粒、噬菌?；蚴删w，其具有在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的能力且其被用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞以操縱基因?？寺≥d體一般包含一個或少數(shù)限制性內(nèi)切酶識別位點(在這些位點可以可檢測的方式插入外源DNA序列而不丟失載體的基本生物學(xué)功能)，以及適用于鑒定和選擇用克隆載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的標(biāo)記物基因。標(biāo)記物基因一般包括提供四環(huán)素抗性或氨芐青霉素抗性的基因。
[0024]表達(dá)載體。包含編碼外源蛋白質(zhì)的克隆的結(jié)構(gòu)基因的DNA分子，其提供外源蛋白質(zhì)在重組宿主中的表達(dá)。一般，將克隆基因的表達(dá)置于特定調(diào)節(jié)序列(如啟動子和增強子序列)的控制之下(即，與其有效連接)。啟動子序列可為組成型或誘導(dǎo)型的。
[0025]重組宿主。重組宿主可為包含克隆載體或表達(dá)載體的任意原核或真核細(xì)胞。此術(shù)語也旨在包括已被遺傳改造從而在宿主細(xì)胞的染色體或基因組中包含克隆的基因的原核或真核細(xì)胞。有關(guān)合適的宿主的實例，見Sambrook等人，MOLECULAR CLONING:A LABORATORYMANUAL,第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)["Sambrook"]。
[0026]術(shù)語“表達(dá)”指基因產(chǎn)物(例如，在本申請中定義和描述的途徑或反應(yīng)的基因的生物合成酶)在一定水平上的表達(dá)，在此水平上產(chǎn)生的所編碼的此蛋白質(zhì)的酶活性，或此蛋白質(zhì)涉及的途徑或反應(yīng)允許代謝流通過表達(dá)此基因/途徑的生物中的此途徑或反應(yīng)?？赏ㄟ^遺傳改變用作起始生物的微生物實現(xiàn)表達(dá)。在一些實施方案中，可遺傳改變(例如，遺傳改造)微生物，從而在相對起始微生物或未被改變的可比微生物的生產(chǎn)的基因產(chǎn)物水平的提高的水平上表達(dá)基因產(chǎn)物。遺傳`改變包括，但不限于，改變或修飾與特定基因的表達(dá)相關(guān)的調(diào)節(jié)序列或位點(例如，通過添加強啟動子、誘導(dǎo)型啟動子或多個啟動子，或通過去除調(diào)節(jié)序列使得表達(dá)為組成型)，修飾特定基因的染色體位置，改變特定基因的相鄰核酸序列如核糖體結(jié)合位點或轉(zhuǎn)錄終止子，增加特定基因的拷貝數(shù)，修飾參與特定基因的轉(zhuǎn)錄和/或特定基因產(chǎn)物的翻譯的蛋白質(zhì)(例如，調(diào)節(jié)蛋白，抑制物，增強物，轉(zhuǎn)錄激活物等)，或使用本領(lǐng)域的例行操作使特定基因的表達(dá)失調(diào)的任意其他常規(guī)手段(包括但不限于使用反義核酸分子，例如，以阻斷阻抑蛋白的表達(dá))。
[0027]在一些實施方案中，可改變微生物的生理或環(huán)境，以在相對起始微生物的基因產(chǎn)物表達(dá)水平增加或降低的水平上表達(dá)基因產(chǎn)物。例如，可用已知或疑似提高特定基因的轉(zhuǎn)錄和/或特定基因產(chǎn)物的翻譯的活性劑處理微生物，或在所述活性劑的存在下培養(yǎng)微生物，從而增強或提高轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。可選地，可在選擇的提高特定基因的轉(zhuǎn)錄和/或特定基因產(chǎn)物的翻譯的溫度下培養(yǎng)微生物，從而增強或提高轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
[0028]術(shù)語“失調(diào)”指改變或修飾微生物中的至少一個基因，其中所述改變或修飾導(dǎo)致相對沒有改變和修飾的尸胺或N-乙酰尸胺生產(chǎn)，在微生物中的尸胺或N-乙酰尸胺生產(chǎn)的效率增加。在一些實施方案中，改變或修飾的基因編碼在生物合成途徑中的酶或轉(zhuǎn)運蛋白，使得在微生物中的生物合成酶的水平或活性被改變或修飾，或轉(zhuǎn)運特異性或效率被改變或修飾。在一些實施方案中，改變和修飾編碼在生物合成途徑中的酶的至少一個基因，使得所述酶的水平或活性相對未改變或野生型基因存在時的水平增強或增加。失調(diào)也包括改變一個或多個基因的編碼區(qū)以得到，例如，具有反饋抗酶或具有更高或更低比活的酶。又例如，失調(diào)還涵蓋編碼轉(zhuǎn)錄因子(例如激活物、阻抑物)的基因的遺傳改變，所述轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)編碼酶或轉(zhuǎn)運蛋白的基因的表達(dá)。
[0029]術(shù)語“過表達(dá)”指在比起始微生物的遺傳改變前存在的水平更高水平上的基因產(chǎn)物的表達(dá)，特別是增強基因產(chǎn)物(例如，賴氨酸生物合成酶，或硫酸鹽還原途徑酶，或半胱氨酸生物合成酶，或在本申請中定義和描述的基因或途徑或反應(yīng))的表達(dá)。在一些實施方案中，可將微生物遺傳改變(例如，遺傳改造)從而在相對起始微生物的生產(chǎn)的基因產(chǎn)物水平提高的水平上表達(dá)基因產(chǎn)物。遺傳改變包括，但不限于，改變或修飾與特定基因的表達(dá)相關(guān)的調(diào)節(jié)序列或位點(例如，通過添加強啟動子、誘導(dǎo)型啟動子或多個啟動子，或通過去除調(diào)節(jié)序列使得表達(dá)為組成型)，修飾特定基因的染色體位置，改變特定基因的相鄰核酸序列如核糖體結(jié)合位點或轉(zhuǎn)錄終止子，增加特定基因的拷貝數(shù)，修飾參與特定基因的轉(zhuǎn)錄和/或特定基因產(chǎn)物的翻譯的蛋白質(zhì)(例如，調(diào)節(jié)蛋白，抑制物，增強物，轉(zhuǎn)錄激活物等)，或使用本領(lǐng)域的例行操作失調(diào)特定基因的表達(dá)的任意其他常規(guī)手段(包括但不限于使用反義核酸分子，例如，以阻斷阻抑蛋白的表達(dá))。過表達(dá)基因產(chǎn)物的另一種方式是增強基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性，從而增加其壽命。在Eikmanns等人(Gene.(1991) 102,93-8)中可找到在生物(如谷氨酸棒桿菌)中過表達(dá)基因的實例。
[0030]術(shù)語“失調(diào)的”包括基因產(chǎn)物(例如，賴氨酸脫羧酶)的表達(dá)水平低于或高于操縱微生物前或未經(jīng)操縱的可比微生物中的表達(dá)。在一個實施方案中，微生物可被遺傳操縱(例如，遺傳改造)為以低于或高于操縱微生物前或未經(jīng)操縱的可比微生物中的表達(dá)水平表達(dá)基因產(chǎn)物。遺傳操縱可包括，但不限于，改變或修飾與特定基因的表達(dá)相關(guān)的調(diào)節(jié)序列或位點(例如，通過去除強啟動子、誘導(dǎo)型啟動子或多個啟動子)，修飾特定基因的染色體位置，改變特定基因的相鄰核酸序列如核糖體結(jié)合位點或轉(zhuǎn)錄終止子，減少特定基因的拷貝數(shù)，修飾參與特定基因的轉(zhuǎn)錄和/或特定基因產(chǎn)物的翻譯的蛋白質(zhì)(例如，調(diào)節(jié)蛋白，抑制物，增強物，轉(zhuǎn)錄激活物等)，或本領(lǐng)域例行操作的失調(diào)特定基因的表達(dá)的任意其他常規(guī)手段(包括但不限于使用反義核酸分子，或敲除或阻斷靶蛋白表達(dá)的其他方法)。
[0031]術(shù)語“失調(diào)的基因活性”，例如失調(diào)的賴氨酸脫羧酶，也表示將基因活性，(例如賴氨酸脫羧酶活性)引入其中以前未觀察到相應(yīng)基因活性(例如賴氨酸脫羧酶活性)的微生物中，例如通過將異源基因(例如單個或多個拷貝的賴氨酸脫羧酶基因)引入微生物，優(yōu)選地通過遺傳改造的方式。
[0032]短語“失調(diào)的途徑或反應(yīng)”指生物合成途徑或反應(yīng)，其中編碼在生物合成途徑或反應(yīng)中的酶的至少一個基因被改變或修飾，使得至少一種生物合成酶的水平或活性被改變或修飾。詞組“失調(diào)的途徑”包括生物合成途徑，其中多于一種基因已被改變或修飾，因此改變了相應(yīng)的基因產(chǎn)物/酶的水平和/或活性。有時，在微生物中“失調(diào)”途徑(例如，同時失調(diào)在給定的生物合成途徑中的多于一種基因)的能力來自微生物的特定現(xiàn)象中，其中多于一種酶(例如，2種或3種生物合成酶)由彼此相鄰出現(xiàn)在被稱為“操縱子”的遺傳物質(zhì)的連續(xù)片段上的基因編碼。在其他情況下，為了失調(diào)途徑，必須在一系列相繼的改造步驟中失調(diào)若干基因。
[0033]為了表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的失調(diào)的基因，必須將編碼酶的DNA序列與表達(dá)載體中的控制轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)節(jié)序列有效連接，然后引入原核或真核宿主細(xì)胞中。除了轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，如啟動子和增強子以外，表達(dá)載體可包括翻譯調(diào)節(jié)序列和適于選擇攜帶表達(dá)載體的細(xì)胞的標(biāo)記物基因。
[0034]用于在原核宿主中表達(dá)的合適的啟動子可為可抑制型、組成型或誘導(dǎo)型。合適的啟動子是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并包括能夠識別T4，T3，T5，Sp6和T7聚合酶的啟動子，λ曬菌體的PdP Pli啟動子,大腸桿菌的trp, recA,熱休克，lacUV5, tac, lpp-lac pr, phoA,gal，trc和IacZ啟動子，枯草芽孢桿菌(B.Subtilis)的α -淀粉酶和σ 28-特異性啟動子，芽孢桿菌噬菌體的啟動子，鏈霉菌(Sti^ptomyces)啟動子，λ噬菌體的int啟動子，pBR322的β -內(nèi)酰胺酶基因的bla啟動子，和氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶基因的CAT啟動子，以及棒桿菌的 PGRO，PSOD, PEFTU, PEFTS 和這些啟動子的組合，如在 W02005059144，W02007011939,W02007012078, W02005059093, W02008049782, W02006069711, W02007020295 中描述的。Glick, J.1nd.Microbiol.1:277(1987) ;Watson 等人，MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE,第 4 版，Benjamin Cummins (1987) ;AusubeI 等人,見上,和 Sambrook 等人,見上,綜述了原核啟動子。
[0035]用于表達(dá)大腸桿菌賴氨酸脫羧酶的優(yōu)選啟動子是在W02005059144，W02007011939,ff02007012078,ff02005059093,ff02008049782,ff02006069711,ff02007020295
中描述的谷氨酸棒桿菌的PsodA，PGRO和PEFTU啟動子。
[0036]在原核宿主中表達(dá)蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。見，例如，Williams等人，"Expression of foreign proteins in E.coli using plasmid vectors andpurification of specific polyclonal antibodies,"在 DNA CLONING 2:EXPRESSIONSYSTEMS,第 2 版，Glover 等人(編)，第 15-58 頁中(Oxford University Press 1995)。又見，Ward 等人，"Genetic Manipulation and Expression of Antibodies,"在MONOCLONAL ANTIBODIES PRINCIPLES AND APPLICATIONS，第 137-185 頁中(Wiley-Liss，Inc.1995)；和 Geor`giou, " Expression of proteins in Bacteria, "在 PROTEINENGINEERING PRINCIPLES AND PRACTICE, Cleland 等人(編)，第 101-127 頁中(Johnffiley&Sons,Inc.1996)。提高和降低基因表達(dá)和蛋白質(zhì)產(chǎn)生的其他方法可在W02008049782中找到。
[0037]可使用多種技術(shù)將表達(dá)載體引入細(xì)菌宿主細(xì)胞，包括氯化鈣轉(zhuǎn)化、電穿孔，等等。見，例如，Ausubel 等人(編)，SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，第 3 版，第 1-1 至1-24 頁(John ffiley&Sons, Inc.1995)。
[0038]如本文使用的，基本純的蛋白質(zhì)表示期望的純化的蛋白質(zhì)基本不含污染的細(xì)胞成分，這可通過在聚丙烯酰胺十二烷基硫酸鈉凝膠電泳(SDS-PAGE)后的單一條帶證明。術(shù)語"基本純的"還旨在描述在本領(lǐng)域技術(shù)人員使用的一種或多種純度或同質(zhì)性特征上同質(zhì)的分子。例如，基本純的賴氨酸脫羧酶將顯示在標(biāo)準(zhǔn)實驗偏差內(nèi)的如下參數(shù)的恒定和可重復(fù)的特征:分子量，色譜遷移，氨基酸組成，氨基酸序列，封閉的或未封閉的N-端，HPLC洗脫譜，生物學(xué)活性，和其他此類參數(shù)。然而，此術(shù)語不旨在排除賴氨酸脫羧酶和其他化合物的人工或合成的混合物。此外，此術(shù)語不旨在排除從重組宿主分離的賴氨酸脫羧酶融合蛋白。
[0039]在第一個方面，本發(fā)明提供了微生物，其具有細(xì)胞內(nèi)賴氨酸脫羧酶活性和增強的賴氨酸輸入活性，或包含細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外賴氨酸脫羧酶活性，或包含細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外賴氨酸脫羧酶活性和增強的賴氨酸輸入活性。
[0040]微生物可為任意原核或真核微生物，特別是細(xì)菌，古細(xì)菌，酵母和真菌。優(yōu)選的微生物選自棒桿菌屬，特別關(guān)注谷氨酸棒桿菌，埃希氏菌屬，特別關(guān)注大腸桿菌，芽孢桿菌屬，特別是枯草芽孢桿菌，和鏈霉菌屬。
[0041]如上所述，本發(fā)明的優(yōu)選實施方案涉及選自棒桿菌，如棒桿菌屬細(xì)菌的宿主細(xì)胞的用途。特別優(yōu)選谷氨酸棒桿菌，醋谷棒桿菌(Corynebacterium acetoglutamicum),嗜乙酉先乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum),美棒桿菌(Corynebacteriumcallunae)，產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes),熱產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium thermoaminogenes),棲糖蜜棒桿菌(Corynebacterium melassecola)和Corynebacterium effiziens種。本發(fā)明的其他優(yōu)選實施方案涉及短桿菌,特別是黃色短桿菌(Brevibacterium f Iavum),乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium Iactofermentum)和Brevibacterium divarecatum 種的用途。
[0042]在本發(fā)明的其他優(yōu)選實施方案中，宿主細(xì)胞可選自谷氨酸棒桿菌ATCC13032，醋谷棒桿菌ATCC15806，嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870，熱產(chǎn)氨棒桿菌FERMBP-1539，棲糖蜜棒桿菌 ATCC17965, Corynebacterium effiziens DSM 44547, Corynebacteriumeffiziens DSM44549，黃色短桿菌ATCC14067，乳糖發(fā)酵短桿菌ATCC13869，Brevibacteriumdivarecatum ATCC 14020，谷氨酸棒桿菌KFCC10065和谷氨酸棒桿菌ATCC21608，以及來源于其的菌株，通過例如經(jīng)典誘變和選擇或通過定向誘變。
[0043]谷氨酸棒桿菌的其他特別優(yōu)選的菌株可選自ATCC13058，ATCC13059, ATCC13060，ATCC21492, ATCC21513, ATCC21526, ATCC21543, ATCC13287, ATCC21851, ATCC21253,ATCC21514, ATCC21516, ATCC21299, ATCC21300, ATCC39684, ATCC21488, ATCC21649,ATCC21650, ATCC19223, ATCC13869, ATCC21157, ATCC21158, ATCC21159, ATCC21355,ATCC31808, ATCC21674, ATCC21562, ATCC21563, ATCC21564, ATCC21565, ATCC21566,ATCC21567, ATCC21568, ATCC21569, ATCC21570, ATCC21571, ATCC21572, ATCC21573,ATCC21579, ATCC19049, ATCC19050, ATCC19051, ATCC19052, ATCC19053, ATCC19054,ATCC19055, ATCC19056, ATCC19057, ATCC19058, ATCC19059, ATCC19060, ATCC19185,ATCC13286, ATCC21515, ATCC21527, ATCC21544, ATCC21492, NRRL B8183, NRRL W8182,B12NRRLB12416, NRRLB12417, NRRLB12418 和 NRRLB11476。
[0044]縮寫KFCC代表韓國聯(lián)邦菌種保藏中心(Korean Federation of CultureCollection), ATCC代表美國模式菌株培養(yǎng)物保藏中心(American-Type Strain CultureCollection)和縮寫DSM代表德國微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen)?？s寫NRRL代表ARS菌種保藏中心北區(qū)研究實驗室(ARS culturescollection Northern Regional Research Laboratory, Peorea, IL, USA)。
[0045]在某些實施方案中，本發(fā)明的微生物是“Campbell in”或“Campbell out”微生物(或細(xì)胞或轉(zhuǎn)化體)。如本文使用的，詞組“Campbell in”轉(zhuǎn)化體應(yīng)表示原始宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體，其中整個環(huán)狀雙鏈DNA分子(例如質(zhì)粒)已通過單個同源重組事件(cross in事件))整合進(jìn)細(xì)胞的染色體，所述同源重組事件有效導(dǎo)致線性化形式的環(huán)狀DNA分子插入與環(huán)狀DNA分子的第一 DNA序列同源的染色體的第一 DNA序列中。詞組“Campbelled in”指已整合進(jìn)“Campbell in”轉(zhuǎn)化體的染色體中的線性化DNA序列?！癈ampbeu in”轉(zhuǎn)化體包含第一同源DNA序列的副本，其包含并包圍同源重組交叉點。
[0046]“Campbell out” 指來源于“Campbell in” 轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞，其中在“Campbelledin”DNA的線性化的插入的DNA上包含的第二 DNA序列與和線性化的插入片段的第二 DNA序列同源的染色體來源的第二 DNA序列之間發(fā)生第二次同源重組事件(cross out事件)，第二次重組事件導(dǎo)致整合的DNA序列的一部分缺失(丟棄(jettisoning))，但重要的是也導(dǎo)致整合的DNA序列的一部分(這可短至單個堿基)保留在染色體中，使得相比原始宿主細(xì)胞，“Campbell out”細(xì)胞在染色體中含有一個或多個有意的改變(例如，單堿基替換，多堿基替換，插入異源基因或DNA序列，插入同源基因或修飾的同源基因的額外拷貝或多個拷貝，或插入包含多于一種上面列出的這些上述實例的DNA序列)。
[0047]“Campbell out”細(xì)胞或菌株通常,但不必須,通過針對“Campbelled in”DNA序列的一部分(期望被丟棄的部分)中包含的基因，例如枯草芽孢桿菌sacB基因(當(dāng)在存在約5%-10%蔗糖時生長的細(xì)胞中表達(dá)時，其是致死的)的反選擇得到。不管使用或不使用反選擇，可通過使用任意可篩選的表型，例如，但不限于，菌落形態(tài)、菌落顏色、存在或缺乏抗生素抗性，存在或缺乏給定的DNA序列(通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，存在或缺乏營養(yǎng)缺陷型，存在或缺乏酶，菌落核酸雜交，等等篩選期望的細(xì)胞得到或鑒定期望的“Campbell out”細(xì)胞，。
[0048]導(dǎo)致“Campbell in”或“Campbell out”的同源重組事件可在同源DNA序列內(nèi)的一定范圍的DNA堿基上發(fā)生，并且因為同源序列將在此范圍的至少部分上彼此相同，通常不可能精確地指定交叉事件發(fā)生的位置。換句話說，不可能精確地指定哪些序列來源于插入的DNA，和哪些序列來源于染色體DNA。此外,第一同源DNA序列和第二同源DNA序列通常被部分非同源區(qū)隔開，并且此非同源區(qū)保持存在于“Campbell out”細(xì)胞的染色體中。
[0049]為了實用性，在谷氨`酸棒桿菌中，一般的第一和第二同源DNA序列為至少約200堿基對的長度，并可多達(dá)數(shù)千堿基對的長度，然而，可以使操作對更短或更長的序列起作用。第一和第二同源序列的優(yōu)選長度是約500至2000堿基，并通過將第一和第二同源序列安排成大約相同的長度，優(yōu)選地具有低于200堿基對的差異，和最優(yōu)選地使二者中的較短序列為較長序列的堿基對長度的至少70%，幫助從“Campbell in”得到“Campbell out”。
[0050]賴氨酸脫羧酶活性指L-賴氨酸脫羧為尸胺，這是由賴氨酸脫羧酶催化的。此酶被歸類為E.C.4.1.1.18。例如，從具有賴氨酸脫羧酶活性的大腸桿菌中分離的酶是cadA基因產(chǎn)物(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,條目 b4131,SEQ ID NO:4)和 IdcC 基因產(chǎn)物(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,條目 JWO181, SEQ ID NO:3)。
[0051 ] 測量和比較酶促活性的方法是本領(lǐng)域已知的，并在例如“Handbook ofCorynebacetrium glutamicum 2005 Eggeling, Borth 編 CRC Press Boca Raton USA 和其中的參考)或Methods in Enzymology卷17,部分I第3-1098頁(1970)，卷17,部分2,第3-961(1971)頁，卷 41，第 3-564(1975)頁，卷 42 第 3-537 (1975)頁，卷 63，第 3-547 (1979)頁，卷 64，第 3-418 (1980)頁，卷 89，第 3-656 (1982)頁，卷 90 第 3-602 (1982)頁，卷 142，第3-732(1987)頁，卷143第3-582頁(1987)和其中的參考中描述。用于比較谷氨酸棒桿菌菌株的標(biāo)準(zhǔn)菌株是 ATCC13032 (Handbook of Corynebacetrium glutamicum 2005 Eggeling,Borth 編。CRC Press Boca Raton USA)。[0052]大腸桿菌IdcC的氨基酸序列公開在登記號SEQ ID NO:3中，大腸桿菌cadA的氨基酸序列公開在SEQ ID NO:4中。
[0053]編碼大腸桿菌賴氨酸脫羧酶基因的DNA分子可通過使用具有從SEQ ID NO:3或4的氨基酸序列逆翻譯的核苷酸序列的多核苷酸探針篩選cDNA或基因組文庫得到。
[0054]可選地，大腸桿菌賴氨酸脫羧酶基因或本文描述的任意基因可通過使用互相引發(fā)(priming)的長寡核苷酸合成DNA分子得到。見，例如，Ausubel等人,(編),CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,第 8.2.8 至 8.2.13 頁(1990) [ " Ausubel "]。又見 Wosnick 等人，Gene 60:115(1987)；和 Ausubel 等人(編)，SHORT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，第 3 版，第 8-8 至 8-9 頁(John ffiley&Sons, Inc.1995)。使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)建立的技術(shù)提供了合成至少2千堿基長的DNA分子的能力。Adang等人，PlantMolec.Biol.21:1131 (1993) ;Bambot等人，PCR Methods and Applications 2:266(1993)；Dillon 等人，"Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Constructionof Synthetic Genes, " in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，第 15 卷:PCR PROTOCOLS:CURRENT METHODS AND APPLICATIONS, White (編)，第 263-268 頁，(Humana Press,Inc.1993) ；Holowachuk 等人，PCR Methods App1.4:299(1995)。
[0055]可產(chǎn)生相比親本酶包含保守氨基酸改變的多肽(例如尸胺輸出體多肽)的變體或本文描述的任意基因的變體。即，可得到包含例如SEQ ID NO:1的一個或多個氨基酸取代的變體，其中烷基氨基酸被多肽序列中的烷基氨基酸取代，芳基氨基酸被例如尸胺輸出體多肽氨基酸序列中的芳基氨基酸取代，含硫氨基酸被例如尸胺輸出體多肽氨基酸序列中的含硫基氨基酸取代，含羥基氨基酸被例如尸胺輸出體多肽氨基酸序列中的含羥基氨基酸取代，酸性氨基酸被例如尸胺輸出體多肽 氨基酸序列中的酸性氨基酸取代，堿性氨基酸被例如尸胺輸出體多肽氨基酸序列中的堿性氨基酸取代。
[0056]在常見氨基酸中，例如，"保守的氨基酸取代"表示在以下每一組內(nèi)的取代:(I)甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，和異亮氨酸，(2)苯丙氨酸，酪氨酸，和色氨酸，(3)半胱氨酸和甲硫氨酸，(4)絲氨酸和蘇氨酸，(5)天冬氨酸和谷氨酸，(6)谷氨酰胺和天冬酰胺，和
(7)賴氨酸，精氨酸和組氨酸。
[0057]可通過用核苷酸取代在SEQ ID NO:1中列出的核苷酸引入例如尸胺輸出體多肽中的保守的氨基酸變化。這樣的"保守的氨基酸"變體可通過，例如，寡核苷酸定向的誘變，接頭掃描誘變，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的誘變等等得到。Ausubel等人，見上，第8.0.3-8.5.9頁；Ausubel 等人(編)，SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,第 3 版，第 8-10 至 8-22頁(John ffiley&Sons, Inc.1995)。一般又見，McPherson(編)，DIRECTED MUTAGENESIS:APRACTICAL APPROACH, IRL Press (1991) ?可使用用于細(xì)胞外尸胺的HPLC測定來確定尸胺輸出體多肽變體輸出尸胺的能力。
[0058]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的尸胺輸出體多肽是谷氨酸棒桿菌(dapE)的尸胺輸出體多肽及其等同基因，所述等同基因與相應(yīng)的“原始”基因廣物具有聞達(dá)80%，優(yōu)選地90%和最優(yōu)選地95%和98%的序列同一性(基于氨基酸序列)，且仍然具有尸胺輸出體多肽的生物學(xué)活性?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法通過引入核苷酸替換，缺失或插入，或通過克隆其他生物的同源基因容易地構(gòu)建這些等同基因，所述同源基因可通過本領(lǐng)域熟知的方法，例如數(shù)據(jù)庫檢索、文庫篩選、互補測定或酶促活性檢測鑒定和克隆。優(yōu)選地，優(yōu)化克隆的同源基因的核苷酸序列，用于在預(yù)期的宿主微生物中的表達(dá)，例如通過適應(yīng)谷氨酸棒桿菌或大腸桿菌的密碼子使用。
[0059]可找到與SEQ ID NO:1的序列同源的序列。下面提供實例:來自谷氨酸棒桿菌菌株 R TX = 40322 的 A4QH10_C0RGB 蛋白 SEQ ID NO 25，來自 Corynebacteriumefficiens 的 Q8FMK8_C0REF 蛋白 SEQ ID NO 26,來自馬氏棒桿菌(Corynebacteriummatruchotii)ATCC 33806 的 ZP_03711358 蛋白 SEQ ID NO:27，來自無枝菌酸棒桿菌(Corynebacterium amycolatum) SK46 的 ZP_03392764 蛋白 SEQ ID NO:28,來自溶血隱秘桿菌(Arcanobacterium haemoIyticum) DSM 20595 的 YP_003696648 蛋白 SEQ ID NO 29,來自粘金色棒桿菌(Corynebacterium aurimucosum) ATCC 700975 的 ZP_06042915 蛋白 SEQ IDNO 30,來自紋帶棒桿菌(Corynebacterium striatum)ATCC 6940 的 ZP_03936401 蛋白 SEQID NO 31,來自產(chǎn)氛棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)DSM 20306 的 ZP_06837496蛋白 SEQ ID NO 32。
[0060]因此，在優(yōu)選的實施方案中，細(xì)胞內(nèi)或尸胺輸出體活性至少部分，優(yōu)選多于30%或多于50%或多于60%或多于70%或多于75%，80%，85%，90%，95% 98%，99%是由于包含與SEQ ID NO:1具有至少80%或至少85%或至少90%或至少95%或至少98%同一性的氨基酸序列且具有尸胺輸出體活性的一種或多種多肽。
[0061]本發(fā)明的其他優(yōu)選實施方案使用谷氨酸棒桿菌的尸胺輸出體多肽(SEQ ID NO:I)，其可通過應(yīng)用計劃表達(dá)尸胺輸出體多肽的微生物(例如大腸桿菌)的密碼子使用重譯為DNA，或優(yōu)化密碼子使用用于在谷氨酸棒桿菌中表達(dá)。
[0062]本發(fā)明的優(yōu)選微生物包含細(xì)胞內(nèi)賴氨酸脫羧酶活性，優(yōu)選包含高的細(xì)胞內(nèi)脫羧酶活性。細(xì)胞內(nèi)賴氨酸脫羧酶活性可通過用一種或多種待由微生物表達(dá)的賴氨酸脫羧酶基因轉(zhuǎn)化微生物而產(chǎn)生或增強。另外或可選地，賴氨酸脫羧酶基因可被突變，以增強編碼的賴氨酸脫羧酶的表達(dá)或酶促活性。
[0063]在另一個實施方案中，細(xì)胞內(nèi)賴氨酸脫羧酶活性與細(xì)胞外賴氨酸脫羧酶活性組合。可以轉(zhuǎn)化缺乏細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外賴氨酸脫羧酶活性的微生物，以在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外表達(dá)賴氨酸脫羧酶?？赏ㄟ^突變賴氨酸脫羧酶包含用于細(xì)胞外表達(dá)的信號序列(例如分泌信號或用于分子錨的信號，所述信號在待轉(zhuǎn)化的微生物中有功能)來實現(xiàn)細(xì)胞外表達(dá)。細(xì)胞外表達(dá)的實例可在 Choi 和 Lee Appl Microbiol Biotechnol 2004 64:625-635, CurrentOpinion in Biotechnology 2005,16:538-545,Trends in Biotechnology 2007 16 73-79中找到。
[0064]如果細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外賴氨酸脫羧酶活性是由于多于一種的編碼具有賴氨酸脫羧酶活性的不同多肽的賴氨酸脫羧酶基因的表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外賴氨酸脫羧酶總活性將是這些不同賴氨酸脫羧酶活性的結(jié)果?？赏ㄟ^比較特定微生物中的不同賴氨酸脫羧酶基因的表達(dá)水平和比較這些基因表達(dá)的賴氨酸脫羧酶的比酶促活性，測量特定賴氨酸脫羧酶基因?qū)傎嚢彼崦擊让富钚缘呢暙I(xiàn)?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域熟知的方法測量不同基因的表達(dá)水平，優(yōu)選地在蛋白質(zhì)水平上測量表達(dá)水平，例如通過蛋白質(zhì)印跡或ELISA測定。測量賴氨酸脫羧酶的比酶促活性的方法也是本領(lǐng)域熟知的。在W02007113127中公開了優(yōu)選的方法。
[0065]如果內(nèi)源賴氨酸脫羧酶活性是通過至少另一種具有賴氨酸脫羧酶活性的多肽的轉(zhuǎn)基因表達(dá)增強的，則這個或這些另外的多肽的貢獻(xiàn)可通過比較轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化的微生物的總賴氨酸脫羧酶活性來測量。
[0066]在優(yōu)選的實施方案中，細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外脫羧酶活性或這兩種活性至少部分，優(yōu)選地多于30%或多于50%或多于60%或多于70%或多于75%，80%，85%，90%，95% 98%,99%是由于包含與SEQ ID NO:3具有至少80%或至少85%或至少90%或至少95%或至少98%同一性的氨基酸序列且具有賴氨酸脫羧酶活性，優(yōu)選地具有高賴氨酸脫羧酶活性的一種或多種多肽。
[0067]在一個實施方案中，細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外脫羧酶活性或這兩種活性多于98%或多于99%是由于包含與SEQ ID NO:3具有至少80%或至少85%或至少90%或至少95%或至少98%同一性的氨基酸序列且具有賴氨酸脫羧酶活性，優(yōu)選地具有高賴氨酸脫羧酶活性的一種或多種多肽 。
[0068]在一個實施方案中，細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外脫羧酶活性或這兩種活性多于98%或多于99%是由于包含與SEQ ID NO:4具有至少80%或至少85%或至少90%或至少95%或至少98%同一性的氨基酸序列且具有賴氨酸脫羧酶活性，優(yōu)選具有高的賴氨酸脫羧酶活性的一種或多種多肽。
[0069]在一個實施方案中，包含尸胺輸出體活性的微生物確實也包含增強的賴氨酸輸入能力。
[0070]可通過增加從發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)入微生物的賴氨酸流、或通過減少從微生物到發(fā)酵培養(yǎng)基的賴氨酸流的任意措施實現(xiàn)提高的賴氨酸輸入能力。
[0071]測定賴氨酸輸出和輸入活性的方法可在Bellmann, A, Vrljic, M, Patek, M,等人 MICROB10L0GY-SGM 147 第 1765-1774 頁，2001,和 Burkovski, A, Kramer, R.AppliedMicrobiology and Biotechnology 58 第 265-274 頁.2002 和其中引用的文獻(xiàn)中找到。
[0072]例如,可通過減少或消除賴氨酸輸出體活性,或增強賴氨酸通透酶活性,或增強賴氨酸/尸胺逆向轉(zhuǎn)運體活性，或其任意組合提高賴氨酸輸入能力。
[0073]賴氨酸輸出體活性可由能夠?qū)①嚢彼釓呐囵B(yǎng)基轉(zhuǎn)運到細(xì)胞的任意多肽導(dǎo)致，例如賴氨酸輸出體，同向轉(zhuǎn)運體(symporter)或逆向轉(zhuǎn)運體多肽。
[0074]如果微生物具有細(xì)胞外賴氨酸脫羧酶活性和高的賴氨酸生產(chǎn)能力，通過采取與描述的用于增強賴氨酸輸入能力的措施相反的措施增強賴氨酸輸出能力可能是有利的，例如通過增強某些基因的表達(dá)，而不是減少某些基因的表達(dá)。具有高賴氨酸生產(chǎn)能力和減少或消除的賴氨酸輸出體多肽的表達(dá)，但缺乏細(xì)胞外賴氨酸脫羧酶活性的微生物的實例可在WO 97/23597和W02005073390 (其中公開了通過培養(yǎng)具有增強的氨基酸輸出蛋白的表達(dá)或活性的微生物的增強的氨基酸生產(chǎn)的方法)和US 7，435，584(其中公開了通過培養(yǎng)具有IysE(賴氨酸輸出體載體)基因的高表達(dá)的棒桿菌的增強的L-賴氨酸生產(chǎn)的方法)中找到。
[0075]在本發(fā)明的一個實施方案中，降低至少一種賴氨酸輸出體多肽的活性，其中賴氨酸輸出體多肽包含與SEQ ID NO:5具有至少80%或至少85%或至少90%或至少95%或至少98%同一性的氨基酸序列且具有賴氨酸輸出活性，或其中賴氨酸輸出體多肽包含與SEQID NO:5具有至少80%或至少85%或至少90%或至少95%或至少98%同一性的氨基酸序列且具有賴氨酸輸出活性，或降低其中至少2種賴氨酸輸出體多肽的活性,至少一種包含與SEQ ID NO:5具有至少80%或至少85%或至少90%或至少95%或至少98%同一性的氨基酸序列且具有賴氨酸輸出活性，且至少一種包含與SEQ ID NO:5具有至少80%或至少85%或至少90%或至少95%或至少98%同一性的氨基酸序列且具有賴氨酸輸出活性。
[0076]IysE 基因已在文獻(xiàn)，Eggeling, L, Sahm, H TOURNAL OF BIOSCIENCE ANDBIOENGINEERING 92,3201-213, Eggeling, L, Sahm, H ARCHIVES OF MICROBIOLOGY 180,3155-160 2003中描述。又見德國專利申請DE 95-01048222。
[0077]YbjE基因產(chǎn)物(SEQ ID NO:6)及其突變體已在例如W02005073390中描述。
[0078]術(shù)語“降低的活性”包括基因產(chǎn)物(例如尸胺輸出體多肽，或賴氨酸輸出體多肽)的表達(dá)水平低于操縱微生物前或未經(jīng)操縱的可比微生物中的表達(dá)，優(yōu)選地將基因產(chǎn)物的表達(dá)與在相同條件下生長的特定微生物物種的熟知菌株相比較，例如在棒桿菌的情況下，將基因表達(dá)優(yōu)選地與菌株ATCC13032中的表達(dá)水平相比較。在大腸桿菌的情況下，將基因表達(dá)優(yōu)選地與在菌株保藏中心ATCC中保藏的菌株MG1665中的表達(dá)水平相比較，在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，將表達(dá)水平與在菌株保藏中心ATCC中保藏的菌株W303相比較。在一個實施方案中，可遺傳操縱(例如，遺傳改造)微生物，從而在低于操縱微生物前或未經(jīng)操縱的可比微生物中的表達(dá)的水平表達(dá)基因產(chǎn)物。遺傳操縱可包括，但不限于，改變或修飾與特定基因的表達(dá)相關(guān)的調(diào)節(jié)序列或位點(例如，通過去除強啟動子、誘導(dǎo)型啟動子或多個啟動子)，修飾特定基因的染色體位置，改變特定基因的相鄰核酸序列如核糖體結(jié)合位點或轉(zhuǎn)錄終止子，減少特定基因的拷貝數(shù)，修飾參與特定基因的轉(zhuǎn)錄和/或特定基因產(chǎn)物的翻譯的蛋白質(zhì)(例如，調(diào)節(jié)蛋白，抑制物，增強物，轉(zhuǎn)錄激活物等)，或本領(lǐng)域例行操作的降低特定基因的表達(dá)的任意其他常規(guī)手段(包括但不限于使用反義核酸分子，或敲除或阻斷靶蛋白表達(dá)的其他方法)。特別地，可操縱基因使I個或多個核苷酸從宿主生物的染色體中缺失。也可通過引入導(dǎo)致基因產(chǎn)物活性降低的一個或多個基因突變得到基因產(chǎn)物(例如賴氨酸輸出體多肽)的降低的活性。此外，也可通過影響調(diào)節(jié)所述基因產(chǎn)物的表達(dá)或活性的調(diào)節(jié)蛋白降低基因產(chǎn)物的活性，例如通過影響所述基因的轉(zhuǎn)錄。實例是轉(zhuǎn)錄阻抑物和轉(zhuǎn)錄激活物。例如IysE基因的表達(dá)受IysG基因產(chǎn)物的負(fù)面影響。IysG基因(本文中以SEQ ID NO:7公開)和LysG基因產(chǎn)物(本文中以SEQ ID NO:8公開)的序列也可見如下登記號:P94632，X96471。
[0079]在另一個實施方案中，通過增強的賴氨酸通透酶活性或通過增強的賴氨酸/尸胺逆向轉(zhuǎn)運體活性或二者的組合增強賴氨酸輸入能力。
[0080]可通過提高一種或多種內(nèi)源賴氨酸通透酶基因(例如在SEQ ID NO:9中公開的)的表達(dá)，或提高賴氨酸通透酶多肽(例如在SEQ ID N0:10中公開的)的通透酶活性增強給定微生物的賴氨酸通透酶活性，例如通過微生物的隨機誘變或通過用一種或多種賴氨酸通透酶基因轉(zhuǎn)化微生物或通過其任意組合進(jìn)行。
[0081]在一個實施方案中，通過重組表達(dá)一種或多種賴氨酸通透酶多肽增強微生物的賴氨酸通透酶活性，所述多肽包含與SEQ ID NO: 10具有至少80%或至少85%或至少90%或至少95%或至少98%同一‘丨生的氨基酸序列，并具有賴氨酸通透酶活性,例如具有賴氨酸通透酶活性的同源物或突變體。測定賴氨酸通透酶活性的方法可在Bellmann, A, Vrljic,M, Patek, M，等人 MICR0B10L0GY-SGM 147 第 1765-17742001 頁，和 Burkovski, A, Kramer,R APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTE CHNOLOGY 58 pp.265-2742002，F(xiàn)ujii, T，等人，以及BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY 66，第 1981-1984頁，2002和其中引用的參考中找到。
[0082]可例如通過一種或多種賴氨酸通透酶基因的轉(zhuǎn)化，通過使用具有更高表達(dá)活性的失調(diào)的啟動子提供內(nèi)源賴氨酸通透酶基因，或通過減少賴氨酸通透酶基因表達(dá)或基因產(chǎn)物活性的負(fù)調(diào)節(jié)物實現(xiàn)重組表達(dá)。
[0083]在另一個實施方案中，通過增強的賴氨酸/尸胺逆向轉(zhuǎn)運體活性增強賴氨酸輸入能力。賴氨酸/尸胺逆向轉(zhuǎn)運體是在跨越細(xì)胞膜的不同方向上同時轉(zhuǎn)運賴氨酸和尸胺的蛋白質(zhì)?？赏ㄟ^提高一種或多種內(nèi)源賴氨酸/尸胺逆向轉(zhuǎn)運體基因的表達(dá)，通過微生物的隨機突變，用一種或多種賴氨酸/尸胺逆向轉(zhuǎn)運體基因轉(zhuǎn)化微生物，或通過優(yōu)化賴氨酸/尸胺逆向轉(zhuǎn)運體多肽的賴氨酸/尸胺逆向轉(zhuǎn)運體活性(例如偏好賴氨酸輸入和尸胺輸出)，或通過其任意組合實現(xiàn)增強的賴氨酸/尸胺逆向轉(zhuǎn)運體活性。
[0084]在一個實施方案中，通過重組表達(dá)一種或多種賴氨酸/尸胺逆向轉(zhuǎn)運體多肽增強微生物的賴氨酸/尸胺逆向轉(zhuǎn)運體活性，所述多肽包含與SEQ ID NO:11具有至少80%或至少85%或至少90%或至少95%或至少98%同一性的氨基酸序列，并具有賴氨酸/尸胺逆向轉(zhuǎn)運體活性，例如具有賴氨酸/尸胺逆向轉(zhuǎn)運體活性的同源物或突變體。
[0085]可例如通過一種或多種賴氨酸/尸胺逆向轉(zhuǎn)運體基因的轉(zhuǎn)化，通過使用具有更高表達(dá)活性的失調(diào)的啟動子提供內(nèi)源賴氨酸/尸胺逆向轉(zhuǎn)運體基因，或通過減少賴氨酸/尸胺逆向轉(zhuǎn)運體基因表達(dá)或基因產(chǎn)物活性的負(fù)調(diào)控物實現(xiàn)重組表達(dá)。
[0086]已知cadB基因產(chǎn)物(本文以SEQ ID NO:11公開)的輸入或輸出活性依賴于細(xì)胞和發(fā)酵培養(yǎng)基中的賴氨酸和尸胺濃度。因此，可通過增加發(fā)酵培養(yǎng)基中的賴氨酸濃度，避免發(fā)酵培養(yǎng)基的低PH值，或通過插入在發(fā)酵培養(yǎng)基中的給定賴氨酸濃度或pH值下促進(jìn)賴氨酸輸入的突變，或通過其組合增強表達(dá)功能性cadB基因產(chǎn)物的某些微生物的賴氨酸輸入倉泛力(Soksawatmaekhin W.等人；Excretion and uptake of cadaverine by CadB andits physiological functio ns in Escherichia coli ；Molecular Microbiology ；2004,；卷 51,5 ;第 1401-1412 頁)。
[0087]描述了在發(fā)酵培養(yǎng)基中的給定賴氨酸濃度或pH值下促進(jìn)大腸桿菌cadB基因產(chǎn)物的賴氨酸輸入的若干突變(Soksawatmaekhin W.等人；Identification of theCadaverine Recognition Site on the Cadaverine-Lysine Antiporter CadB ；TheJournal of Biological Chemistry ;2006 ;卷 281，39 ;第 29213-29220 頁)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠鑒定在其他cadB蛋白，例如cadB的同源物或突變體中的類似突變。
[0088]因此，在一個實施方案中，賴氨酸/尸胺逆向轉(zhuǎn)運體多肽包含與SEQ ID N0:11具有至少80%或至少85%或至少90%或至少95%或至少98%同一性的氨基酸序列，并包含一種或多種以下突變:C12S, W41L, W43L, Y55L, Y57L, Y73L, Y73F, Y73W, Y89L, Y89F, Y89W,Y90L, Y90F, Y90W, Y107L, Y174L, C125S, D185N, E204Q, E204D, Y235L, Y235F, Y235W, W289L,D303N, D303E, Y310L, Y366L, Y368L, D372N, E377Q, E408Q, Y423L, Y423F 和 Y423W。上述突變根據(jù)cadB基因產(chǎn)物的氨基酸序列命名。通過使用序列比較工具，例如通過使用序列比對，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠?qū)⑦@些突變轉(zhuǎn)移到其他基因產(chǎn)物上，例如與cadB基因產(chǎn)物同源的基因產(chǎn)物。
[0089]優(yōu)選地，包含與SEQ ID NO:11具有至少80%或至少85%或至少90%或至少95%或至少98%同一性的氨基酸序列的賴氨酸/尸胺逆向轉(zhuǎn)運體多肽包含一種或多種以下突變:W41L,W43L,Y57L,Y89L,Y107L,Y174L，D185N，E204Q,Y235L,W289L,D303N, Y366L,Y368L,D372N 和 E408Q。
[0090]更優(yōu)選地，包含與SEQ ID NO: 11具有至少80%或至少85%或至少90%或至少95 %或至少98 %同一性的氨基酸序列的賴氨酸/尸胺逆向轉(zhuǎn)運體多肽包含一種或多種以下突變:W41L, W43L, Y57L, Y107L, Y174L, D185N, Y366L, Y368L 和 E408Q。
[0091]在本發(fā)明的另一個實施方案中提供了微生物，其包含細(xì)胞內(nèi)賴氨酸脫羧酶活性和增強的賴氨酸輸入活性，或包含細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外賴氨酸脫羧酶活性，或包含細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外賴氨酸脫羧酶活性和增強的賴氨酸輸入活性并具有高賴氨酸生產(chǎn)能力。具有高賴氨酸生產(chǎn)能力的微生物能夠在例如細(xì)胞內(nèi)或周圍培養(yǎng)基中富集賴氨酸，如果賴氨酸不被進(jìn)一步代謝為例如尸胺的話。
[0092]優(yōu)選地，具有高賴氨酸生產(chǎn)能力的微生物具有選自組(i)的至少一種失調(diào)的基因。組(i)是一組在賴氨酸生物合成中起關(guān)鍵作用的基因，并由天冬氨酸激酶，天冬氨酸半醛脫氫酶，二氫吡啶二羧酸合酶，二氫吡啶二羧酸還原酶，四氫吡啶二羧酸琥珀酰酶，琥珀酰-氨基-酮基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶，琥珀酰-二氨基-庚二酸脫琥珀酰酶，二氨基庚二酸表異構(gòu)酶，二氨基庚二酸脫氫酶，精氨酰-tRNA合成酶，二氨基庚二酸脫羧酶，丙酮酸羧化酶，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，轉(zhuǎn)酮醇酶，轉(zhuǎn)醛醇酶，6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶，果糖I，6- 二磷酸酶，高絲氨酸脫氫酶，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶，琥珀酰輔酶A合成酶，甲基丙二酰輔酶A變位酶，二胺乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因組成。
[0093]根據(jù)本發(fā)明的方法，組(i)的至少一個基因必須是失調(diào)的。優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的微生物中，組(i)的多于I個基因，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10個基因是失調(diào)的。
[0094]將被失調(diào)的組(i)的優(yōu)選基因是:天冬氨酸激酶，天冬氨酸半醛脫氫酶，二氫吡啶二羧酸合酶，二氫吡啶二羧酸還原酶，二氨基庚二酸脫氫酶，二氨基庚二酸脫羧酶，丙酮酸羧化酶，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，`轉(zhuǎn)酮醇酶，轉(zhuǎn)醛醇酶，6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶，果糖I，6-二磷酸酶，高絲氨酸脫氫酶，琥珀酰輔酶A合成酶，二胺乙?；D(zhuǎn)移酶。
[0095]組⑴的基因和基因產(chǎn)物是本領(lǐng)域已知的。EP 1108790公開了在高絲氨酸脫氫酶和丙酮酸羧化酶基因中的突變，所述突變對重組棒桿菌生產(chǎn)賴氨酸的生產(chǎn)力具有有利影響。WO 00/63388公開了在天冬氨酸激酶基因中的突變，所述突變對重組棒桿菌生產(chǎn)賴氨酸的生產(chǎn)力具有有利影響。關(guān)于在上述這些基因中的突變，引入EP 1108790和WO 00/63388作為參考。
[0096]在下表中對每個基因/基因產(chǎn)物描述了失調(diào)各個基因的可能方法。關(guān)于基因的失調(diào)，將表的“失調(diào)”行中引用的文獻(xiàn)和文件一同引入作為參考。在表中提及的方法是失調(diào)各個基因的優(yōu)選實施方案。
[0097]表1
[0098]
【權(quán)利要求】
1.包含失調(diào)的尸胺輸出體活性的微生物。
2.如權(quán)利要求1要求保護(hù)的微生物，其中失調(diào)的尸胺輸出體活性至少部分是由于一種或多種尸胺輸出體多肽的失調(diào)，所述多肽包含與SEQ ID NO:1具有至少80%同一性的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求1或2要求保護(hù)的微生物，其中尸胺輸出體活性增強。
4.如權(quán)利要求1至3中任一項要求保護(hù)的微生物，其中賴氨酸脫羧酶活性增強。
5.如權(quán)利要求3或4中任一項要求保護(hù)的微生物，其中賴氨酸脫羧酶活性是由于一種或多種賴氨酸脫羧酶多肽的表達(dá)，所述多肽包含與SEQ ID NO:3或4具有至少80%同一性的氨基酸序列。
6.如權(quán)利要求3或4中任一項要求保護(hù)的微生物，所述微生物具有至少一種失調(diào)的基因，所述基因選自由天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脫氫酶、二氫吡啶二羧酸合酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、四氫吡啶二羧酸琥珀酰酶、琥珀酰-氨基-酮基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶、琥珀酰-二氨基-庚二酸脫琥珀酰酶、二氨基庚二酸表異構(gòu)酶、二氨基庚二酸脫氫酶、精氨酰-tRNA合成酶、二氨基庚二酸脫羧酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、轉(zhuǎn)酮醇酶、轉(zhuǎn)醛醇酶、6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶、果糖1，6_ 二磷酸酶、高絲氨酸脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、琥珀酰輔酶A合成酶、甲基丙二酰輔酶A變位酶、二胺乙酰基轉(zhuǎn)移酶的基因組成的組。
7.如權(quán)利要求1至6中任一項要求保護(hù)的微生物，所述微生物具有增強的賴氨酸輸入活性。
8.如權(quán)利要求7要求保護(hù)的微生物，其中增強的賴氨酸輸入活性是由于降低的賴氨酸輸出體活性或增強的賴氨酸通透酶活性或增強的賴氨酸/尸胺逆向轉(zhuǎn)運體活性或其任意組合。
9.如權(quán)利要求7或8要求保護(hù)的微生物，其中增強的賴氨酸輸入活性是由于至少一種賴氨酸輸出體多肽的降低的活性，所述多肽包含與SEQ ID NO:5具有至少80%同一性的氨基酸序列。
10.如權(quán)利要求7至9中任一項要求保護(hù)的微生物，其中增強的賴氨酸輸入活性是由于增強的賴氨酸通透酶活性或由于增強的賴氨酸/尸胺逆向轉(zhuǎn)運體活性或二者的組合。
11.如權(quán)利要求1至10中任一項要求保護(hù)的微生物，其中微生物具有失調(diào)的N-乙酰尸胺形成活性。
12.如權(quán)利要求11要求保護(hù)的微生物，其中微生物沒有或具有降低的N-乙酰尸胺形成活性。
13.如權(quán)利要求11要求保護(hù)的微生物，其中微生物具有增強的N-乙酰尸胺形成活性和降低的尸胺輸出體活性。
14.如權(quán)利要求11至13中任一項要求保護(hù)的微生物，其中通過失調(diào)N-乙酰尸胺形成多肽的活性失調(diào)N-乙酰尸胺形成活性，所述N-乙酰尸胺形成多肽包含與SEQ ID NO:13具有至少80%同一性的氨基酸序列。
15.如權(quán)利要求1至14中任一項要求保護(hù)的微生物，其中微生物屬于真細(xì)菌進(jìn)化枝。
16.如權(quán)利要求1至15中任一項要求保護(hù)的微生物，其中微生物是谷氨酸棒桿菌。
17.生產(chǎn)尸胺的方法，所述方法包括發(fā)酵如權(quán)利要求1至12或15或16中任選一項要求保護(hù)的微生物。
18.生產(chǎn)乙酰尸胺的方法，所述方法包括發(fā)酵如權(quán)利要求13至16中任一項要求保護(hù)的微生物。
19.如權(quán)利要求1至12或15或16中任選一項要求保護(hù)的微生物用于生產(chǎn)尸胺的用途。
20.如權(quán)利要求13至16中任一項要求保護(hù)的微生物用于生產(chǎn)尸胺的用途。
【文檔編號】C12P13/00GK103492553SQ201280009948
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年2月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月22日
【發(fā)明者】C·維特曼, S·坎德 申請人:巴斯夫歐洲公司