視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層的生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供：細(xì)胞片層的生產(chǎn)方法，包括以下步驟：（1）將視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞接種到膠原凝膠上并在所述膠原凝膠上培養(yǎng)所述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞以進而形成由所述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞片層，和（2）用膠原酶降解膠原凝膠來分離由所述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞等構(gòu)成的細(xì)胞片層。
【專利說明】視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層的生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞片層的生產(chǎn)方法，包括在膠原凝膠上接種視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。本發(fā)明還涉及用于移植的細(xì)胞片層，包含由視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞形成的細(xì)胞層和基膜。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)在發(fā)達國家中是法定失明的主要成因性疾病之一，并且主要見于年齡在50歲以上的老年人中。年齡相關(guān)性黃斑變性由黃斑中的年齡相關(guān)性變化導(dǎo)致，并且主要分為滲出型和萎縮型。滲出性年齡相關(guān)性黃斑變性是與老年人黃斑中脈絡(luò)膜的新血管性血管發(fā)育相關(guān)，隨后在視網(wǎng)膜色素上皮或視網(wǎng)膜下出血并滲出性損傷，并最終形成瘢痕組織的疾病。萎縮性年齡相關(guān)性黃斑變性是伴隨黃斑區(qū)的萎縮和脈絡(luò)膜小疣積累的疾病。導(dǎo)致滲出性和萎縮性年齡相關(guān)性黃斑變性的前體損傷有時具體稱作早期年齡相關(guān)性黃斑變性，并且該損傷也被認(rèn)為是年齡相關(guān)性黃斑變性的一種病理學(xué)。
[0003]當(dāng)年齡相關(guān)性黃斑變性是輕度的滲出型時，對于其治療，可以選擇外科療法諸如光動力學(xué)療法、激光光凝固法、新血管性血管的剝除等，或者選擇通過藥物療法諸如施用參與血管發(fā)生的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的抑制劑等來旨在退化并去除新血管性血管的治療方法。然而，上述方法無法對已發(fā)展為高度萎縮或缺少視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)的滲出型或萎縮型產(chǎn)生治療有效性。在這種情況下，有效的治療方法是向視網(wǎng)膜下的缺陷部位移植視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮。
[0004]已經(jīng)嘗試了通過移植視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的多種治療方法。已報道以細(xì)胞懸液形式從人胎中獲得的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的移植顯示出移植細(xì)胞差的植入。在移植分離的還包含Bruch膜和脈絡(luò)膜的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層如來自尸體眼部的片層的情況下，發(fā)生術(shù)后排斥并且無法獲得足夠的治療效果(非專利文件I)。此外，已經(jīng)指出利用尸體眼部的方法包括了倫理問題。在另一方面，已經(jīng)報道患有年齡相關(guān)性黃斑變性的患者視力改善的情況，其中使用了包括收集患者 自身的正常視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和脈絡(luò)膜并將它們移植到黃斑下的缺陷部位的方法。然而，該方法對患者產(chǎn)生了極高的負(fù)擔(dān)以及極高的手術(shù)風(fēng)險。盡管已經(jīng)進行了嘗試來采用收集自患有年齡相關(guān)性黃斑變性患者的患者自身的虹膜色素上皮細(xì)胞用于代替視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞進行移植，但是最后視力的上限仍是低的并且還沒有獲得足夠的效果，而且，利用患者自身細(xì)胞的負(fù)擔(dān)和風(fēng)險高(非專利文件2)。因此，使用收集自尸體眼部的細(xì)胞或患者自身細(xì)胞的常規(guī)治療方法在倫理學(xué)、安全性、效果等方面上不具有實用性，并且已經(jīng)需要真正可用于移植治療的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。
[0005]作為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層的生產(chǎn)方法之一，可以提及包括用胞外基質(zhì)等包被細(xì)胞培養(yǎng)基材，并且在其上培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞來形成片層的方法。例如，可以通過在纖連蛋白包被的材料上培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞來形成細(xì)胞片層，但是沒有報道基膜的形成，并且從其中形成片層的容器中取出片層的方法根本未描述(非專利文件3)?？紤]到這些問題，多個實驗室已經(jīng)開發(fā)了通過用人工膜代替基膜預(yù)先形成視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層的方法。然而，擔(dān)心人工膜會成為對移植中植入以及身體的功能維持的病癥。盡管也已經(jīng)開發(fā)了具有更低生物應(yīng)答的人工膜，但由于它問題性地誘導(dǎo)炎癥及與之相關(guān)的排斥(其由與細(xì)胞自身產(chǎn)生的基膜在組成、特性、剛性等上的差異所導(dǎo)致)，因此它不適合于移植。而且，按慣例，具有極性的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層培養(yǎng)方法已經(jīng)是已知的。然而，它僅用于實驗?zāi)Ｐ陀猛荆渲衼碓从诨铙w生物的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和無限增殖化系在容器中形成片層并直接使用，并且它仍然無法從容器中實際回收如活體生物中的提供有基膜的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層(非專利文件4)。存在通過片狀剝落不使用胞外基質(zhì)等直接在培養(yǎng)皿上培養(yǎng)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞來獲得視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層的方法。通過片狀剝落分離細(xì)胞的此類方法無法使片層、基膜等的形狀和大小保持穩(wěn)定，導(dǎo)致由片狀剝落引起的對視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞許多損傷，并且在大部分情況下，由于片狀剝落導(dǎo)致片層形狀的瓦解和分散的細(xì)胞，因此無法產(chǎn)生可用于移植等的細(xì)胞片層(非專利文件5)。此外，盡管已經(jīng)報道了用膠原包被細(xì)胞培養(yǎng)基材并且在膠原上培養(yǎng)細(xì)胞，但是沒有使用人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。而且，為了提高凝膠強度，需要分別加入交聯(lián)劑，其使得該方法無法方便快捷(專利文件I)。由于該情況目前沒有變化，生產(chǎn)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層(其對視網(wǎng)膜疾病諸如年齡相關(guān)性黃斑變性等是治療上有效的，并且可方便且穩(wěn)定地制備)仍然是一個問題。
[0006][文件列表]
[專利文件]
專利文件 I JP-A-2005-261292 [非專利文件]
非專利文件 1:0phthalmic Surg.1991 Feb; 22(2):102-8.非專利文件 2:Tohoku J Exp Med.1999 Dec; 189(4):295-305.非專利文件 3:Nat.Protoc., 4(5)，2009, 662-673.非專利文件 4:1nvest.0phthalmol.Vis.Sc1., 47, 2006，3612-3624.非專利文件 5:1nvest.0phthalmol.Vis.Sc1., 36(2)，1995，381-390。
[0007]發(fā)明概述 本發(fā)明待解決問題
本發(fā)明的問題是開發(fā)不使用人工膜而方便且穩(wěn)定地生產(chǎn)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層的新方法，并且為患有與缺乏視網(wǎng)膜色素上皮相關(guān)的疾病諸如年齡相關(guān)性黃斑變性等的患者提供視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層用于移植，其顯示出高植入率并且功能優(yōu)異。
[0008]解決問題的方法
本發(fā)明人通過在細(xì)胞培養(yǎng)基材上形成膠原凝膠層并且在其上接種并培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞來生產(chǎn)細(xì)胞片層。通過該方法獲得的細(xì)胞片層在膠原凝膠和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層之間保有基膜，具有與體內(nèi)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞相似的細(xì)胞因子分泌能力和細(xì)胞間粘附性，并且通過用膠原酶分解膠原凝膠使所述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層從細(xì)胞培養(yǎng)基材上易于分離而同時保有基膜。此外，組成細(xì)胞片層的細(xì)胞保持視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞特異性標(biāo)記的表達。本發(fā)明人已經(jīng)進行深入研究，并且從這些發(fā)現(xiàn)中完成本發(fā)明。因此，本發(fā)明提供
[I]細(xì)胞片層的生產(chǎn)方法，其包括以下步驟
(I)在膠原凝膠上接種并培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞以形成由視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞片層，和(2)用膠原酶降解膠原凝膠來分離由視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞片層；
[2]上述[I]的細(xì)胞片層的生產(chǎn)方法，其中所述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞是通過誘導(dǎo)干細(xì)胞或祖細(xì)胞分化獲得的細(xì)胞；
[3]上述[2]的細(xì)胞片層的生產(chǎn)方法，其中所述干細(xì)胞是ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞；
[4]上述[I]的細(xì)胞片層的生產(chǎn)方法，其中膠原凝膠中膠原的濃度為0.1% - 0.5% ；
[5]上述[I]至[4]中任一項的細(xì)胞片層的生產(chǎn)方法，還包括以下步驟(3)
(3)確定基膜是否存在于分離的細(xì)胞片層和膠原凝膠之間的接觸面上；
[6]通過上述[I]至[5]中任一項的方法生產(chǎn)的細(xì)胞片層；
[7]用于移植的細(xì)胞片層，包含由通過先體內(nèi)后體外(exvivo)誘導(dǎo)干細(xì)胞或祖細(xì)胞分化獲得的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞形成的細(xì)胞片層和由所述細(xì)胞分泌的基膜；和
[8]用于篩選的細(xì)胞片層，包含由通過先體內(nèi)后體外誘導(dǎo)干細(xì)胞或祖細(xì)胞分化獲得的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞形成的細(xì)胞片層和由所述細(xì)胞分泌的基膜。
[0009]發(fā)明效果
根據(jù)本發(fā)明，可以容易且穩(wěn)定地制備具有在表面上出現(xiàn)基膜的結(jié)構(gòu)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層。由于本發(fā)明的細(xì)胞片層具有優(yōu)異的植入率和功能性，并且對于移植非常有用，因此可以生產(chǎn)由基膜和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞構(gòu)成的片層并通過移植向患有眼疾病的患者諸如患有年齡相關(guān)性黃斑變性等的患者應(yīng)用。尤其是，當(dāng)用于培養(yǎng)的細(xì)胞是來源于iPS細(xì)胞的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞時，可以通過利用患者自身細(xì)胞作為來源來避免移植中的排斥。
[0010]附圖簡述`
圖1顯示視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌能力的檢測結(jié)果。
[0011]實施方案描述 本發(fā)明在下文中詳細(xì)說明。
[0012]本發(fā)明提供細(xì)胞片層的生產(chǎn)方法，包括以下步驟:
(1)在膠原凝膠上接種并培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞以形成由視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞片層，和
(2)用膠原酶降解膠原凝膠來分離由視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞片層。
[0013]盡管在步驟(I)中待接種的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞可以是來源于任何哺乳動物的細(xì)胞，只要它來源于哺乳動物(例如人、猴、小鼠、大鼠、狗、牛、馬、豬、綿羊、山羊、貓、兔、倉鼠、豚鼠等)，但它優(yōu)選是來源于人的細(xì)胞。
[0014]接種的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞可以是直接從眼球收集的原代細(xì)胞或幾次傳代后的細(xì)胞。原代視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞可以通過已知的方法分離。例如，在眼球來源的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的情況下，將尸體眼球分離，在赤道段快速分開，將玻璃體和視網(wǎng)膜去除并必要時用膠原酶、透明質(zhì)酸酶等處理，用細(xì)胞刮棒刮擦收集細(xì)胞，或在胰蛋白酶或EDTA溶液中處理以從Bruch膜上釋放細(xì)胞，在培養(yǎng)基中靜置以誘導(dǎo)向培養(yǎng)皿上粘附和生長，并且將以所需數(shù)目生長的細(xì)胞用胰蛋白酶處理等適當(dāng)傳代，以確保細(xì)胞數(shù)目。
[0015]此外，這些細(xì)胞還可以是通過誘導(dǎo)未分化的多能干細(xì)胞諸如胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)等，干細(xì)胞包括成體干細(xì)胞諸如神經(jīng)干細(xì)胞等，或祖細(xì)胞包括神經(jīng)祖細(xì)胞和視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化而獲得的細(xì)胞。ES細(xì)胞還可以是通過體細(xì)胞核重編程產(chǎn)生的ES細(xì)胞。此外，作為干細(xì)胞，可以通過誘導(dǎo)近年來報道的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)的分化來制備目標(biāo)細(xì)胞。iPS細(xì)胞是具有與ES細(xì)胞的那些相同的特性的體細(xì)胞來源的誘導(dǎo)干細(xì)胞，其可以通過向體細(xì)胞中引入特定的核重編程物質(zhì)(核酸、蛋白、低分子量化合物等)來產(chǎn)生[Takahashi, K.和 Yamanaka, S.，Cell, 126: 663-676 (2006) ; Takahashi, K.等，Cell, 131: 861-872 (2007)]。用于上述干細(xì)胞向目標(biāo)分化細(xì)胞分化的條件和培養(yǎng)基可以按照常規(guī)已知的條件和培養(yǎng)基，或者可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員合適地確定。在本發(fā)明中，由于可以制備在合適成熟期的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，并且具體而言，可以制備相比而言未成熟的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞并且可以方便地形成細(xì)胞片層，因此通過誘導(dǎo)干細(xì)胞或祖細(xì)胞(優(yōu)選多能干細(xì)胞)分化獲得的細(xì)胞優(yōu)選用作視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞來用于細(xì)胞片層。此外，由于使用接受移植的受試者的體細(xì)胞作為iPS細(xì)胞來源獲得的細(xì)胞片層沒有針對受試者的抗原性，因此當(dāng)通過本發(fā)明產(chǎn)生的細(xì)胞片層用于移植時，優(yōu)選使用iPS細(xì)胞。當(dāng)誘導(dǎo)干細(xì)胞分化時，例如，人ES細(xì)胞或多能干細(xì)胞諸如iPS細(xì)胞等在加有Wnt拮抗物諸如Dkk-1、CK1-7等和Nodal拮抗物諸如Lefty A、SB_431542等的ES分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)給定時期時，表達Rx、Pax6和Mitf (其是視網(wǎng)膜祖細(xì)胞標(biāo)記)，并且可以通過用光學(xué)顯微鏡形態(tài)觀察，通過確定細(xì)胞具有多邊形形態(tài)和色素，來獲得人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞[NeuroscienceLetters 2009 Jul 24 458(3) 126-31，Journal of Cell Science 2009 Sep I 122 (Pt17) 3169-79]。
[0016]本發(fā)明的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞通過接種在膠原凝膠上來培養(yǎng)。用于膠原凝膠的膠原可以是任何膠原，只要它來源于哺乳動物(例如人、猴、小鼠、大鼠、狗、牛、馬、豬、綿羊、山羊、貓、兔、倉鼠、豚鼠等)并且，例如，使用人或豬來源的膠原。膠原來源的組織的實例包括腱、皮膚等。盡管膠原的種類可以是任何種類，但除構(gòu)成人基膜的膠原之外的膠原是優(yōu)選的，除IV型膠原之外的膠原是特別優(yōu)選的。其中，優(yōu)選使用I型膠原。盡管膠原凝膠可以通過例如常規(guī)已知的生產(chǎn)方法來產(chǎn)生，但在本發(fā)明中，如下文提及的實施例中描述，由膠原纖維網(wǎng)格構(gòu)成的凝膠通過誘導(dǎo)膠原的纖維發(fā)生來產(chǎn)生。由于纖維化膠原具有強度和柔性的組合，因此它易于操作，顯示出細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化的良好保持，并且優(yōu)選作為膠原凝膠用于本發(fā)明中。此外，用于本發(fā)明中的膠原對于將接種在膠原凝膠上的細(xì)胞保持在凝膠表面而不使它們沉入凝膠層中是必需的。因此，優(yōu)選其中凝膠具有對細(xì)胞增殖所必需的強度的一種作為膠原，并且，例如，優(yōu)選具 有大量分子間交聯(lián)的膠原。腱來源的膠原可以作為此類膠原而提及。
[0017]盡管上述膠原凝膠的膠原濃度可以在任何范圍內(nèi)，只要它能夠提供這樣的凝膠，其具有允許視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞植入和生長的強度，并滿足易于被膠原酶所降解的可溶性、能夠易于操作的粘度等，但它優(yōu)選0.1% (W/V) - 0.5% (W/V)，更優(yōu)選0.2% (W/V)-
0.3% (W/V)。當(dāng)膠原凝膠的膠原濃度低于0.1% (W/V)，膠原凝膠的強度變得不足，因此，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的建群率和細(xì)胞增殖率降低。當(dāng)膠原凝膠的膠原濃度超過0.5% (W/V),膠原酶處理以降解膠原凝膠的時間變長，擔(dān)心其會對細(xì)胞產(chǎn)生不利影響。
[0018]盡管用于生產(chǎn)上述膠原凝膠的膠原凝膠混合溶液的體積根據(jù)培養(yǎng)面積和用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基材的形狀而變化，但它優(yōu)選每單位面積(cm2)約100 μ 1-約250 μ 1，更優(yōu)選約150 μ 1-約200 μ I。當(dāng)膠原凝膠混合溶液的量太小時，由于應(yīng)用到凝膠表面上的表面張力的影響，會形成具有薄的中心部分的膠原凝膠層，并且由于當(dāng)培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞時細(xì)胞直接與培養(yǎng)基材接觸，因此在切出細(xì)胞片層的過程中片層容易受損。當(dāng)膠原凝膠混合溶液的量過量時，在培養(yǎng)基材上形成厚的膠原凝膠層，其相對降低了培養(yǎng)基的量，因此，保持培養(yǎng)不易進行，膠原酶處理耗費時間，并且擔(dān)心細(xì)胞片層上的損傷。
[0019]在步驟(I)中，可以通過在細(xì)胞培養(yǎng)基材的膠原凝膠上接種并培養(yǎng)上述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞來生產(chǎn)細(xì)胞片層。本發(fā)明中的細(xì)胞培養(yǎng)基材無具體限定，只要它用于細(xì)胞培養(yǎng)。其實例包括具有多孔膜的培養(yǎng)容器，諸如transwelI等、瓶、組織培養(yǎng)瓶、皿、培養(yǎng)皿、組織培養(yǎng)皿、多皿、微量培養(yǎng)板、微孔板、多板、多孔板、腔室培養(yǎng)玻片、培養(yǎng)皿、管、盤、培養(yǎng)袋和滾瓶。優(yōu)選具有多孔膜的培養(yǎng)容器，這是因為方便進行膠原酶處理和細(xì)胞片層的切割操作。例如，優(yōu)選使用商品化的transwell。本說明書中細(xì)胞培養(yǎng)基材的材料的實例包括但不限于無機材料，諸如金屬、玻璃、陶瓷、硅等，有機材料，代表是高彈體、塑料(例如聚酯樹脂、聚乙烯樹脂、聚丙烯樹脂、ABS樹脂、尼龍、丙烯酸樹脂、氟樹脂、聚碳酸酯樹脂、聚氨基甲酸酯樹月旨、甲基戊烯樹脂、酚樹脂、三聚氰胺樹脂、環(huán)氧樹脂、氯乙烯樹脂)。
[0020]接種的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的數(shù)目可以在任何范圍內(nèi)，只要它是能夠形成細(xì)胞片層的細(xì)胞密度。然而，當(dāng)細(xì)胞密度太低時，細(xì)胞形狀不好，達到匯合前的培養(yǎng)時間長，并且進一步，細(xì)胞成熟和著色所需時間長。當(dāng)細(xì)胞密度太高時，類似地，細(xì)胞增殖受到抑制，達到匯合前的培養(yǎng)時間趨于變長，并且細(xì)胞可能由于過于密集而死亡。因此，接種的細(xì)胞密度優(yōu)選約 4.5 X IO4 細(xì)胞/cm2 -約 8.5 X IO5 細(xì)胞/cm2，更優(yōu)選約 8.5 X IO4 細(xì)胞/cm2 -約 8.5 X IO5細(xì)胞/cm2,最優(yōu)選約4.5X IO5細(xì)胞/cm2。
[0021]由視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞構(gòu)成的單層細(xì)胞群(細(xì)胞片層)可以通過培養(yǎng)在培養(yǎng)基中的膠原凝膠上接種的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞來形成?？梢詿o具體限定地使用培養(yǎng)基，只要它是一般用于相關(guān)領(lǐng)域中的細(xì)胞培養(yǎng)基。例如，可以使用描述于由Asakura Shoten出版的“Japan tissue culture conference 編輯，Technique of Tissue Culture 第三版，，第581頁中的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，諸如F-1O培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基、MEM、BME培養(yǎng)基、DMEM、a MEM、IMD培養(yǎng)基、ES培養(yǎng)基、DM-160培養(yǎng)基、Fisher培養(yǎng)基、WE培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基等。此外，可以將血清(胎牛血清等)、多種生長因子(EGF、FGF、HGF、H)GF等)、抗生素、氨基酸等加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基的pH優(yōu)選 約6-約8。至于培養(yǎng)，例如，原代培養(yǎng)通常在約30 -約40°C下進行約15-約60小時，直至視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞達到匯合。隨后，繼代培養(yǎng)進行約I周一約2個月，同時更換培養(yǎng)基，其后，進行培養(yǎng)同時必要時通氣并攪拌，直至形成細(xì)胞片層。構(gòu)成經(jīng)這樣培養(yǎng)獲得的細(xì)胞片層的細(xì)胞保持為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞?？梢酝ㄟ^檢測作為特異性分化標(biāo)記的BESTl、RPE65、MERTK、CRALBP等來確定細(xì)胞保持為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。
[0022]由于在步驟(I)中形成的細(xì)胞片層粘附在膠原凝膠上，例如，當(dāng)它直接用于移植等時，擔(dān)心膠原凝膠會妨礙在移植受體中的植入。如果可以預(yù)先去除膠原凝膠，這有助于解決這一問題。在本發(fā)明的步驟(2)中，通過膠原酶降解粘附到步驟(I)中形成的細(xì)胞片層上的膠原凝膠。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以根據(jù)用于制備膠原凝膠的膠原種類選擇合適的膠原酶。盡管用于降解膠原凝膠的膠原酶并無具體限定，只要它具有消化膠原凝膠的活性，但優(yōu)選不容易降解構(gòu)成人基膜的膠原(例如IV型膠原等)的膠原酶。例如，可以使用來源于微生物從梭菌屬(溶組織梭菌(Clostridium histolyticum))或鏈霉菌屬(微小鏈霉菌(Streptomyces parvulus))中誘導(dǎo)的膠原酶,其是商業(yè)可購的、安全的并且具有高的酶活性。[0023]作為上述膠原酶的活性，重要的是相對于膠原凝膠中的膠原重量的比活，而非每單位重量膠原酶的活性和每單位體積的水性膠原酶溶液的活性。用于溶解膠原凝膠的膠原酶的比活(膠原酶活性/膠原重量)優(yōu)選不低于0.1 U/mg。當(dāng)膠原酶的比活低于0.1 U/mg時，膠原凝膠的溶解可能不優(yōu)選耗費太長時間，或者凝膠可能不優(yōu)選不充分地溶解。它更優(yōu)選在0.1 - 10,000 U/mg，還優(yōu)選1- 3,000 U/mg的范圍內(nèi)。
[0024]在本發(fā)明的細(xì)胞片層的生產(chǎn)方法中，膠原酶作用于膠原凝膠的方法并無具體限定。可以將使用具有緩沖能力的培養(yǎng)基或等滲溶液作為溶劑制備的膠原酶溶液加入到培養(yǎng)基中，或者可以將從細(xì)胞培養(yǎng)皿上分離下的結(jié)合細(xì)胞的膠原凝膠浸入到上述膠原酶溶液中。由于將transwell用作本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基材，因此可以通過回收插入物并去除插入物底部上的膜而使膠原凝膠層暴露出來，并且將暴露出的膠原凝膠優(yōu)選直接浸入到上述膠原酶溶液中。
[0025]在本發(fā)明的細(xì)胞片層的生產(chǎn)方法中，通過膠原酶溶解膠原凝膠的時間并無具體限定。當(dāng)膠原酶的作用時間太長時，細(xì)胞功能諸如粘附能力、增殖能力等可能不優(yōu)選地下降。盡管通過膠原酶的溶解時間由于膠原酶的比活、溫度、膠原凝膠的形狀、膠原酶處理方法等而發(fā)生變化，但它通常為15 min - 60 min。膠原酶處理可以是單次處理或進行多次。
[0026]由于當(dāng)活體生物體內(nèi)的溫度變得不高于10°C (在人中約30°C)時，細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)的流動性通常下降并且代謝能力下降，而當(dāng)溫度超過42°C時，蛋白會變性并且細(xì)胞功能下降，因此在本發(fā)明的細(xì)胞片層生產(chǎn)方法中，通過膠原酶的膠原凝膠處理過程中的溫度優(yōu)選設(shè)定在10 - 42°C，更優(yōu)選30 - 40°C，還優(yōu)選36 - 38°C的范圍內(nèi)，并且膠原酶的最佳溫度主要是37°C，并且低于該水平的溫度延長溶解時間。
[0027]在本發(fā)明的細(xì)胞片層生產(chǎn)方法中，當(dāng)膠原凝膠的溶解進行時，細(xì)胞片層逐步從凝膠上分離，并且最終釋放于膠原酶溶液中。為了回收細(xì)胞片層，細(xì)胞片層可以從殘留凝膠上機械分離，或者可以在凝膠完全溶解后回收。盡管機械分離縮短了至細(xì)胞片層回收的時間，但由于細(xì)胞片層可能被破壞，因此優(yōu)選在凝膠完全溶解后回收。
[0028]盡管如上文提及回收的 細(xì)胞片層可以直接用于多種應(yīng)用，但由于殘留膠原酶可以抑制細(xì)胞片層之間的粘附性或與組織的粘附性，因此它優(yōu)選用具有緩沖能力的培養(yǎng)基或等滲溶液洗滌?？梢愿鶕?jù)用膠原酶的膠原凝膠溶解處理來確定清洗過程中的溫度。為了充分去除殘留膠原酶，優(yōu)選用具有緩沖能力的培養(yǎng)基或等滲溶液洗滌所述片層一次或多次。
[0029]在通過本發(fā)明的方法獲得的細(xì)胞片層中，以具有與活體生物中的相似的極性分泌對視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞特異性的細(xì)胞因子，并且作為細(xì)胞間的緊密粘附結(jié)合指數(shù)的跨上皮電阻(TER)如活體生物中升高。因此，它具有與活體生物中的相似的細(xì)胞層屏障功能。根據(jù)本發(fā)明的方法，可以獲得具有與活體生物中的那些相似的功能的細(xì)胞片層。
[0030]在通過本發(fā)明的方法獲得的細(xì)胞片層中，緊密連接在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞之間形成，并且基膜在與膠原凝膠的接觸面上形成。在本說明書中，“基膜”是從視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞產(chǎn)生的組分形成的膜，并且表示包含至少部分基膜組分的膜(下文中稱作“視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的基膜”)?；铙w生物中視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的基膜作為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層和構(gòu)成Bruch膜的內(nèi)膠原層之間的薄膜而存在，并且是具有IV型膠原、層粘連蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(基底膜聚糖)、巢蛋白等作為代表性組分的胞外基質(zhì)。Bruch膜是在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層和脈絡(luò)膜之間的薄膜，并且具有視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的基膜、內(nèi)膠原層、彈性蛋白層、外膠原層和脈絡(luò)膜的毛細(xì)管層的基膜的5層結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的細(xì)胞片層包含Bruch膜結(jié)構(gòu)的部分(視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的基膜)。緊密連接的形成可以通過觀察六角形緊密粘附的細(xì)胞形式和通過免疫染色的細(xì)胞間閉合蛋白、ZO-1等的表達來確定。基膜的形成可以通過免疫染色觀察細(xì)胞表面上基膜標(biāo)記諸如層粘連蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(基底膜聚糖)、巢蛋白或IV型膠原等的表達，或者用掃描電鏡觀察來確定。
[0031]通常，在培養(yǎng)皿上培養(yǎng)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞產(chǎn)生基膜組分，但非常難于以從培養(yǎng)皿上分離的可用的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層的形式分離細(xì)胞(Invest.0phthalmol.Vis.Sc1., 36(2)，1995，381-390)。根據(jù)本發(fā)明的方法，從視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞產(chǎn)生的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞連同基膜可以作為片層回收而不利用人工膜。由于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞形成單層結(jié)構(gòu)，因此當(dāng)將它們單獨操作時，片層結(jié)構(gòu)會瓦解并且細(xì)胞分散成細(xì)胞單元。因此，其作為片層的移植是非常困難的。另一方面，由于本發(fā)明的細(xì)胞片層伴有基膜，并且具有足夠的剛性，因此它在回收過程中不容易起皺，其使得其操作非常容易。因此，由于放置到細(xì)胞移植設(shè)備上和移植操作可以流暢地進行，因此細(xì)胞移植可以以最小侵入來進行，并且期望效果和預(yù)后會改善。此外，由于細(xì)胞片層伴有基膜，因此它非常有利于在其中基膜同時受損的疾病中進行移植。例如，年齡相關(guān)性黃斑變性有時伴隨Bruch膜的受損。本發(fā)明的細(xì)胞片層中的基膜補償受損部分，由此可以改善細(xì)胞片層的植入率，并且可以還期望其治療效果。因此，本發(fā)明的細(xì)胞片層優(yōu)選作為用于針對患有受損基膜的疾病的移植的片層，并且可以優(yōu)選用作用于尤其針對年齡相關(guān)性黃斑變性移植的片層。
[0032]本發(fā)明的細(xì)胞片層的生產(chǎn)方法還可以包括以下步驟(3):
(3)確定基膜是否存在于分離的細(xì)胞片層和膠原凝膠之間的接觸面上。
[0033]在步驟(3)中，具有由視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和基膜構(gòu)成的細(xì)胞層的細(xì)胞片層的形成可以通過確定細(xì)胞片層的基膜是否存在來確定?；な欠翊嬖诳梢酝ㄟ^與上述確定基膜形成相似的方法來確定，例如，基`膜標(biāo)記的表達、用掃描電鏡觀察等。對于基膜的檢測，基膜標(biāo)記的表達可以在細(xì)胞的任何位置(例如，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、核膜等)處確定。優(yōu)選地，將表達在與膠原凝膠的接觸面上的標(biāo)記作為目標(biāo)。
[0034]本說明書中的基膜標(biāo)記包括特異性表達于基膜中的基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、翻譯產(chǎn)物或降解產(chǎn)物。此類基因的實例包括層粘連蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(基底膜聚糖)、巢蛋白、IV型膠原等。其中，優(yōu)選使用是基膜主要成分的層粘連蛋白、IV型膠原等。
[0035]用于“確定基膜是否存在于分離的細(xì)胞片層和膠原凝膠之間的接觸表面上”的樣品并無具體限定，只要它包含來源于步驟(2)中分離的細(xì)胞片層(或細(xì)胞)的基膜標(biāo)記(例如，其RNA、蛋白、降解產(chǎn)物等)。
[0036]當(dāng)上述樣品是RNA時，基膜標(biāo)記基因的表達可以如下檢測，通過從步驟(2)中分離的細(xì)胞片層的細(xì)胞制備RNA (例如，總RNA、mRNA)級分并檢測該級分中包含的標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，或直接檢測細(xì)胞中的標(biāo)記基因產(chǎn)物而不從細(xì)胞中提取RNA。
[0037]當(dāng)從細(xì)胞中制備RNA (例如，總RNA、mRNA)級分時，它可以使用已知方法諸如胍-CsCl超速離心方法、AGPC方法等來制備。使用商品化的RNA提取試劑盒(例如，RNeasyMini Kit ;由QIAGEN等制造)，可以快速且方便地從痕量樣品中制備具有高純度的總RNA。在RNA級分中檢測基膜標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的方法的實例包括使用雜交的方法(RNA印跡、斑點印跡、DNA芯片分析等)、使用PCR的方法(RT-PCR、競爭性PCR、實時PCR等)等。優(yōu)選定量PCR方法諸如競爭性PCR、實時PCR等，這是由于基膜標(biāo)記基因的表達變化可以快速且方便地從痕量的樣品中檢測到，并且優(yōu)選DNA芯片分析，這是由于多種標(biāo)記基因的表達變化可以共同檢測，并且定量性能還可以通過選擇檢測方法等來改善。
[0038]當(dāng)使用RNA印跡或斑點印跡雜交時，可以使用能夠與基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交的核酸(探針)來檢測基膜標(biāo)記基因。此類核酸的實例包括能夠在高嚴(yán)格性條件下與基膜標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交的核酸?！案邍?yán)格性條件”的實例包括在45°C下在6XSSC (氯化鈉/檸檬酸鈉)中雜交反應(yīng)，隨后在65°C下在0.2XSSC/0.1% SDS中洗滌一次或多次等。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以通過合適地改變雜交溶液的鹽濃度、雜交反應(yīng)的溫度、探針濃度、探針長度、錯配數(shù)、雜交反應(yīng)時間、洗滌的鹽濃度、洗滌溫度等來容易地調(diào)整至所需的嚴(yán)格性。核酸可以是DNA、RNA或DNA/RNA嵌合體，優(yōu)選DNA。
[0039]用作探針的核酸可以是雙鏈的或單鏈的。當(dāng)是雙鏈時，它可以是雙鏈DNA、雙鏈RNA或DNA:RNA雜化物。當(dāng)是單鏈時，可以使用反義鏈。盡管核酸長度并無具體限定，只要它可以特異地與目標(biāo)核酸雜交，但例如，它不少于約15個堿基，優(yōu)選不少于約30個堿基。為了能夠檢測并定量目標(biāo)核酸，核酸優(yōu)選進行標(biāo)記。標(biāo)記的實例包括放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)等。放射性同位素的實例包括[32P]、[3H]、[14C]等。作為酶，優(yōu)選具有高比活的穩(wěn)定酶，例如，半乳糖苷酶、葡萄糖苷酶、堿性磷酸酶、過氧化物酶、蘋果酸脫氫酶等。熒光物質(zhì)的實例包括熒光胺、異硫氰酸熒光素等。發(fā)光物質(zhì)的實例包括魯米諾、魯米諾衍生物、螢光素、光澤精等。此外，生物素-(鏈霉)抗生物素蛋白也可以用于結(jié)合探針和標(biāo)記。[0040]當(dāng)使用RNA雜交時，將如上文所述制備的RNA級分通過凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素、尼龍、聚偏二氟乙烯等的膜上，在上述“高嚴(yán)格性條件”下在含有如上文所述制備的標(biāo)記探針的雜交緩沖液中雜交，并且通過合適的方法對每一條帶測定結(jié)合到膜上的標(biāo)記的量，由此可以測定每一基膜標(biāo)記基因的表達水平。還在斑點印跡的情況下，將用RNA級分點樣的膜進行相似的雜交反應(yīng)(對每一標(biāo)記基因進行)，并且測定斑點上標(biāo)記的量，由此可以測定每一標(biāo)記基因的表達水平。
[0041]當(dāng)使用DNA芯片分析時,例如,從如上文所述制備的RNA級分通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成引入有合適啟動子諸如Τ7啟動子等的cDNA，使用RNA聚合酶合成cRNA (在這種情況下，通過使用用生物素等標(biāo)記的單核苷酸作為底物獲得標(biāo)記的cRNA)。將標(biāo)記的cRNA與具有固定于其上的上述探針的芯片接觸來進行雜交反應(yīng)，并且測定固相上與每一探針結(jié)合的標(biāo)記的量，由此可以測定每一基膜標(biāo)記基因的表達水平。由于檢測的差異標(biāo)記基因(因此，探針為固相化的)的數(shù)目增加，因此該方法在快速和便利方面是有利的。
[0042]另一方面，當(dāng)不從細(xì)胞中提取RNA的情況下檢測標(biāo)記基因時，可以使用原位雜交作為檢測方法。在該方法中，通過用固定劑(優(yōu)選沉淀固定劑，例如丙酮)處理細(xì)胞或?qū)⒓?xì)胞在緩沖性甲醛溶液中孵育短時間來將細(xì)胞固定化，而不是從細(xì)胞中提取RNA。固定化后，將細(xì)胞包埋入石蠟中以形成塊，并且從中切出的切片可用作樣品。良好制備的石蠟包埋樣品可以在室溫下保存多年。至于用作探針的核酸，可以使用與上述實例相似的那些。由于基膜標(biāo)記在細(xì)胞和膠原凝膠之間的接觸表面上的表達可以直接確定，因此在本發(fā)明中優(yōu)選使用原位雜父。
[0043]或者，可以通過從細(xì)胞片層(或細(xì)胞)制備蛋白級分并檢測所述級分中包含的標(biāo)記基因的翻譯產(chǎn)物(即標(biāo)記蛋白)，或通過直接檢測細(xì)胞片層(或細(xì)胞)中標(biāo)記基因的翻譯產(chǎn)物而不從細(xì)胞片層(或細(xì)胞)中提取蛋白來確定步驟(2)中分離的細(xì)胞片層中基膜標(biāo)記的表達。標(biāo)記蛋白可以通過免疫測定方法(例如，ELISA、FIA、RIA、蛋白印跡等)使用每一蛋白的抗體來檢測，并且在顯示可測定的生理活性的蛋白(諸如酶等)的情況下，它可以通過用已知方法測定每一標(biāo)記蛋白的生理活性來檢測?；蛘撸瑯?biāo)記蛋白還可以通過質(zhì)譜方法(諸如MALD1-TOFMS 等)來檢測。
[0044]每一標(biāo)記蛋白的抗體可以根據(jù)常用的多克隆抗體或單克隆抗體生產(chǎn)技術(shù)并使用標(biāo)記蛋白或蛋白、或其部分肽作為免疫抗原來獲得。
[0045]當(dāng)各種免疫測定方法用于本發(fā)明的檢測方法時，具體條件、操作等的設(shè)定不是必要的。基膜標(biāo)記蛋白的測定系統(tǒng)可以通過在每一方法的一般條件和操作方法中加入本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的一般性技術(shù)考慮來建立。至于這些一般技術(shù)方法的細(xì)節(jié)，可以參考匯編、圖書等。例如，可以參考由Hiroshi Irie編輯的“Radioimmunoassay” (Kodansha,出版于1974 年)、由 Hiroshi Irie 編輯的 “cont.Radioimmunoassay” (Kodansha,出版于 1979年)、由Eiji Ishikawa 等編輯的“Enzyme Immunoassay ^(Igaku-Sho in,出版于 1978年)、由 Eiji Ishikawa等編輯的“Enzyme Immunoassay”(第 2 版)(Igaku-Shoin,出版于 1982年)、由 Eiji Ishikawa等編輯的“Enzyme Immunoassay”(第 3版)(Igaku-Shoin,出版于1987年)、“Methods in ENZYM0L0GY，，，第 70 卷(Immunochemical Techniques (A部分))、同處，第 73 卷(Immunochemical Techniques (B 部分))、同處，第 74 卷(ImmunochemicalTechniques (C 部分))、同處，第 84 卷(Immunochemical Techniques (D 部分:SelectedImmunoassays)) > 同處，第 92 卷(Immunochemical Techniques (E 部分:MonoclonalAntibodies and General Immunoassay Methods))、同處，第 121 卷(ImmunochemicalTechniques (I 部分:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(均由Academic Press 出版)。
[0046]本發(fā)明還涉及根據(jù)上述細(xì)胞片層生產(chǎn)方法獲得的細(xì)胞片層，優(yōu)選為包含由通過先體內(nèi)后體外分化誘導(dǎo)獲得的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞形成的細(xì)胞層和基膜的用于移植的細(xì)胞片層。本發(fā)明的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層優(yōu)選作為移植材料用于患有眼疾病的患者的視網(wǎng)膜治療。眼疾病的實例包括視網(wǎng)膜退行性疾病，諸如年齡相關(guān)性黃斑變性病、色素性視網(wǎng)膜炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜脫離等。由于本發(fā)明的細(xì)胞片層包含基膜，因此它可以以高植入率對同時涉及受損的Bruch膜的疾病進行移植。此外，由于本發(fā)明的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層具有由與活體生物中的組分相似的組分制成的基膜，因此它還可以用于在上述眼疾病中的多種篩選目的，諸如效力篩選、毒性評價等。對于上述眼疾病的效力篩選，例如，根據(jù)JP-A- 2007-500509中描述的方法，本發(fā)明的細(xì)胞片層可以用于篩選對上述眼疾病具有效力的物質(zhì)。為了是特異的，將本發(fā)明的細(xì)胞片層在存在或不存在候選物質(zhì)的情況下進行培養(yǎng)，所述候選物質(zhì)在可能導(dǎo)致上述眼疾病的應(yīng)激條件下具有效力(例如，光(例如，白光、藍光；光誘導(dǎo)視網(wǎng)膜細(xì)胞尤其是光受體細(xì)胞死亡，并且可以是黃斑變性的刺激因子)、A2E [維甲酸N-亞視黃基-N-視黃基-乙醇胺](認(rèn)為A2E的積累促成視網(wǎng)膜細(xì)胞的年齡相關(guān)性神經(jīng)變性，尤其是黃斑變性的表達)、香煙煙霧聚集體(認(rèn)為吸煙是黃斑變性的風(fēng)險因素)、外部壓力(例如，液體靜壓；懷疑眼內(nèi)壓力的增加與青光眼有關(guān)))，并且可以根據(jù)表達視紫紅質(zhì)的光受體數(shù)目并通過用抗胱天蛋白酶3抗體的免疫染色來進行評價。對于毒性評價，根據(jù)JP-A- 2007-517210中描述的方法，本發(fā)明的細(xì)胞片層可以用于篩選毒性物質(zhì)。為了是特異的，本發(fā)明的細(xì)胞片層在存在或不存在毒性候選物質(zhì)的情況下并且使用JP-A- 2007-517210中描述的整聯(lián)蛋白標(biāo)記肽進行培養(yǎng)，用激光在488 nm的波長下激發(fā)，并且在520 nm處檢測熒光進行評價。此外，本發(fā)明的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層還可以用作體外模型用于評價視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的多種體內(nèi)功能，諸如與視細(xì)胞保持相關(guān)的功能，諸如光受體外節(jié)的吞噬能力、神經(jīng)保護作用等，視網(wǎng)膜血管屏障功能諸如泵作用(pumpingact ion)、緊密連接等。
[0047]本發(fā)明的用于移植的細(xì)胞片層可以用于治療人和除人之外的哺乳動物(例如猴、小鼠、大鼠、狗、牛、馬、豬、綿羊、山羊、貓、兔、倉鼠、豚鼠等)中的上述疾病。
[0048]根據(jù)施用受試者的目標(biāo)疾病、動物物種、年齡、性別、體重和癥狀等，來適當(dāng)?shù)卮_定本發(fā)明用于移植的細(xì)胞片層可以應(yīng)用的疾病區(qū)域的范圍。
[0049]本發(fā)明用于移植的細(xì)胞片層可以以一次移植或以幾部分移植。由健康護理專家根據(jù)疾病和指導(dǎo)方針來確定移植的應(yīng)用次數(shù)。例如，當(dāng)疾病是年齡相關(guān)性黃斑變性病時，根據(jù)其嚴(yán)重性，本發(fā)明用于移植的 細(xì)胞片層可以移植兩次或更多次。當(dāng)移植進行多次時，間隔時間并無具體限定，并且可以設(shè)置幾天至幾周的時期。
[0050]本發(fā)明用于移植的細(xì)胞片層由健康護理專家根據(jù)合適的移植方法按照指導(dǎo)方針移植。當(dāng)本發(fā)明用于移植的細(xì)胞片層在視網(wǎng)膜下移植時，可以使用包括將所述片層在來自穿刺注射針頭的水流中遞送至眼球視網(wǎng)膜下的移植位置上的移植方法，或者還可以使用專用于移植的治療儀器。
實施例
[0051]通過參考以下實施例對本發(fā)明進行更為詳盡的說明，其僅為示例而不以任何形式限制本發(fā)明的范圍。
[0052]生產(chǎn)實施例1.視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的制備
作為在以下實施例1中用于形成片層的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，按照NeuroscienceLetters 458 (2009) 126-131中描述的方法，使用通過誘導(dǎo)iPS細(xì)胞分化獲得的成熟視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(25361、1(11?02、59厘8、595￥2、595￥3、595￥9、463、1(2巧￥15、10巧￥3、1(1比￥9、454E2)和通過誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化獲得的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(hES、CMK6)。
[0053]<人iPS來源的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞>
253G1是通過誘導(dǎo)來源于健康人的人iPS細(xì)胞的分化而獲得的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，而K11PD2和59M8是從來源于彼此不同的色素性視網(wǎng)膜炎患者的人iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。按照Cell 131，861-872，2007中描述的方法，通過包括使用反轉(zhuǎn)錄病毒向人皮膚來源的成纖維細(xì)胞中引入0ct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc基因的方法來建立iPS細(xì)胞。
[0054]59SV2、59SV3和59SV9是通過誘導(dǎo)來源于同一色素性視網(wǎng)膜炎患者的人iPS細(xì)胞分化而獲得的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。按照Proc.Jpn.Acad., Ser.B 85 (2009) 348-362中描述的方法，通過包括使用Sendai病毒向人皮膚來源的成纖維細(xì)胞中引入0ct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc的方法來建立iPS細(xì)胞。
[0055]K21EV15、101EV3、K11EV9和454E2是通過誘導(dǎo)來源于彼此不同的色素性視網(wǎng)膜炎患者的人iPS細(xì)胞分化而獲得的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。按照Nat Methods.2011 May;8(5): 409-12)中描述的方法，通過包括使用附加型載體向人皮膚來源的成纖維細(xì)胞中引入人0ct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc和LIN28的方法來建立iPS細(xì)胞。
[0056]<猴iPS來源的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞>
46a是按照J(rèn)pn.J.Transplant.44，231-235中描述的方法通過誘導(dǎo)猴(食蟹猴)iPS細(xì)胞分化而獲得的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。
[0057]〈ES來源的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞>
hES是通過誘導(dǎo)人ES細(xì)胞系khES-Ι分化而獲得的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。CMK6是按照Neuroscience Letters 458 (2009) 126-131中描述的方法通過誘導(dǎo)猴ES細(xì)胞分化而獲得的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。
[0058]實施例1.視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層的生產(chǎn)方法 <膠原凝膠混合溶液的制備>
制備A:豬腱來源的酸可溶性I型膠原細(xì)胞基質(zhì)1-A (Nitta Gelatin, 3.0 mg/ml), B:以5倍濃度的濃縮培養(yǎng)基[將DMEM/F12 (Invitrogen, 12500-062, 3 g)溶于MilliQ水中，并且將總體積(50 ml)用濾器處理]，和C:再生緩沖液[將IN NaOH (50 mM, 5 ml)、NaHCO3 (260 mM, 2.2 g)和HEPES (200 mM, 4.77 g)溶于MilliQ水中，并且將總體積(100ml)用濾器處理]。冷卻后，將B (2體積)與A (7體積)混合(淡黃色)，不能起泡。隨后，將C (I體積)加入并混合混合物(淡粉色)來生成0.21%的膠原凝膠混合溶液。
[0059]<視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層的制備>
將0.21%的膠原凝膠混合溶液(20`0 μ I)加入到12 mm transwell插入物(0.4 μ m孔聚酯膜；Cornig，3460)的插入物中，并且將混合物在37°C下孵育30 min。隨后，將F10-10% FBS [F-10 (Sigma, N6908, 445 ml) ,FBS (50 ml)、青霉素-鏈霉素(Invitrogen,15140-122, 5 ml)] 1500 μ I加入到插入物的外部以及500 μ I加入到插入物的內(nèi)部，并將transwell在37°C下孵育24小時。隨后，用F10_10% FBS洗滌插入物的內(nèi)部和外部一次，將在生產(chǎn)實施例1中獲得的各種視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞按5 X IO5個細(xì)胞(F10-10%FBS, 500 μ I)接種到插入物內(nèi)部，并將F10-10% FBS (1500 μ I)加入插入物的外部。在F10-10% FBS中培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞直至匯合。達到匯合后，將培養(yǎng)基更換為SFRM-B27[DMEM (Sigma, D6046, 350 ml)、F12 HAM (Sigma, N6658, 150 ml)、B27 (Invitrogen,17504-044, 10 ml),200 mM L-谷氨酰胺(Sigma, G7513, 5 ml)、青霉素-鏈霉素(Invitrogen, 15140-122，5 ml)、bFGF (wako, 060-04543，10 ng/ml) ] (1500 μ I 至插入物的內(nèi)部，500 μ I至插入物的內(nèi)部，培養(yǎng)基更換為3次/周)，并且培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞直至它們顯示出合適的顏色和形狀。
[0060]〈切出〉
從培養(yǎng)起始進行6周后，去除插入物的膜，將膠原酶L(Nitta Gelatin, PBS(+):Sigma, 2600 U/ml, 100 μ I)加入到插入物下，并將插入物在37°C下孵育60 min并用PBS (+)洗滌3次。將SFRM-B27逐滴加入以使視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層不會變干，并用PALMMicroBeam (ZEISS)切成所需大小。
[0061]實施例2.視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層的生產(chǎn)方法(膠原種類)
除了在實施例1中使用253G1 (iPS-視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞)生成細(xì)胞片層的步驟中，分別用以下步驟:(A)使用豬皮膚來源的I型膠原TE (特殊訂貨產(chǎn)品:主要包含I型膠原、少量的III型膠原、Nitta Gelatin, 5 mg/ml)作為0.35%膠原混合溶液/孔，(B)使用豬腱來源的I型膠原T-1002(特殊訂貨產(chǎn)品:1型膠原、Nitta Gelatin, 5.1 mg/ml)作為0.35%膠原混合溶液/孔，(C)使用FITC標(biāo)記的膠原I (Chondrex，I mg/ml)作為0.07%膠原混合溶液/孔，(D)使用FITC標(biāo)記的膠原I (特殊訂貨，Chondrex, 3 mg/ml)作為0.21%膠原混合溶液/孔，(E)使用去端肽膠原(K0KEN，3 mg/ml)作為0.21%膠原混合溶液/孔，和(F)使用用于細(xì)胞培養(yǎng)的滲透性膠原膜(KOKEN)，來代替豬腱來源的酸可溶性I型膠原細(xì)胞基質(zhì)1-A (Nitta Gelatin, 3 mg/ml)作為0.21%膠原混合溶液/孔之外，以與實施例1中相同的方式，生成并切出細(xì)胞片層來獲得視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層。
[0062]比較實施例1的檢測結(jié)果和使用每一種上述膠原的情況，并評價以下4項[1.凝膠強度；2.細(xì)胞粘附；3.細(xì)胞生長；4.安全性]。結(jié)果是:(A) {1.差；2.相同；
3.差；4.好}，(B) {1.好(5.1 mg/ml); 2.相同；3.差；4.好}，(C) {1.差(Img/ml); 2.差；3.未知；4.未知}，(D) {1.相同(3 mg/ml); 2.相同；3.差；4.未知}，(E) {1.相同(3 mg/ml); 2.差；3.未知；4.好}，和(F) {未被膠原酶溶解，因此無法使用}。至于凝膠強度，需要某一水平的強度以保證視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的生長。從這一方面，尤其優(yōu)選的膠原種類和濃度是以上述濃度使用的實施例1的豬腱來源的酸可溶性I型膠原細(xì)胞基質(zhì)1-A和(B)豬腱來源的I型膠原T-1002。當(dāng)基材不具有某一水平強度時，視網(wǎng)膜色素上皮無法生長并且不能用于本發(fā)明。
[0063]實施例3.視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層的生產(chǎn)方法(膠原暈)
除了在實施例1的使用253G1 (iPS-視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞)生成細(xì)胞片層的步驟中，將使用的膠原凝膠混合溶液的 量從200 μ I變?yōu)?00 μ I或300 μ I之外，以與實施例1中相同的方式，生成并切出細(xì)胞片層，由此回收視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層。
[0064]與實施例1相比，當(dāng)所用的膠原凝膠混合溶液的量為100 μ I時，由于少量的膠原凝膠混合溶液所導(dǎo)致的表面張力的影響，在中心部分形成薄的膠原凝膠層，并且，當(dāng)培養(yǎng)進行時，接種的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞容易直接接觸底膜，其導(dǎo)致在切出片層的操作過程中視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層的破裂。當(dāng)所用的膠原凝膠混合溶液的量為300 μ I時，由于膠原凝膠混合溶液的量高，形成厚的膠原凝膠層，其相對降低了可以保持在插入物中的培養(yǎng)基的量，并且因此，不易進行保持培養(yǎng)，膠原酶處理耗費時間，并且擔(dān)心細(xì)胞片層上的損傷加重。當(dāng)所用的膠原凝膠混合溶液的量為100 μ I時，細(xì)胞直接與膜接觸，并且在去除膜時細(xì)胞片層從該部分處斷裂。
[0065]實施例4.視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層的生產(chǎn)方法(膠原酶的暈和處理時間)
除了在實施例1的使用253G1 (iPS-視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞)生成細(xì)胞片層的步驟中，將
1%的膠原酶L (Nitta Gelatin)或I型膠原酶(Roche)以10 μ I的量與視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層接觸10 min,以10 μ I的量接觸20 min,以10 μ I的量接觸30 min,以20 μ I的量接觸20 min,以20 μ I的量接觸60 min，和以30 μ I的量接觸50 min，來代替以30μ I的量接觸30 min之外，以與實施例1中相同的方式，生成并切出細(xì)胞片層，由此回收視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層。
[0066]結(jié)果是，當(dāng)以10 μ I的量進行膠原酶處理60 min或以20 μ I的量處理60 min時，觀察到與以30 μ I的量處理30 min時相同水平的膠原降解。[0067]實施例5.視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層的生產(chǎn)方法(接種細(xì)胞的數(shù)目)
除了在實施例1的使用253G1 (iPS-視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞)生成細(xì)胞片層的步驟中，將接種到插入物內(nèi)部的細(xì)胞數(shù)目從5X IO5細(xì)胞/500 μ?改為(A) 5Χ104細(xì)胞/500 μ 1、(B) 1Χ 105/500 μ I或(C) 1Χ 106/500 μ I之外，以與實施例1中相同的方式，生成并切出細(xì)胞片層，由此回收視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層。
[0068]與實施例1相比，由于細(xì)胞數(shù)目少，㈧和⑶需要更長時間來達到細(xì)胞匯合，并且(C)顯示出緩慢生長并且還趨于需要更長時間來達到細(xì)胞匯合。
[0069]實施例6.在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層上形成的基膜
從在實施例1中從253G1 (iPS-視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞)生成的細(xì)胞片層制作冷凍切片(冰凍切片)，并用于免疫組織化學(xué)染色。通過ZO-1的表達確定緊密結(jié)合的形成，并且通過層粘連蛋白和IV型膠原的表達確定基膜的形成。對于每一蛋白的檢測，使用由Zymed制造的兔抗Z0-1 (1:100稀釋)、由Abcam制造的兔層粘連蛋白(1:200稀釋)和由Calbiochem制造的小鼠抗人IV型膠原抗體(1:40)的各自抗體。此外,從使用由Molecular Probes制造的4’，6_ 二脒-2-苯基吲哚(DAPI; I μ g/ml)的核染色狀態(tài)來確定視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層具有單層上皮形式。
[0070]評價1.細(xì)胞片層的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞特異性基因表達概況
在實施例1中從59SV3、59SV9 (iPS-視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞)生成細(xì)胞片層的步驟中，在過去I周、4周、2個月之后(其中在細(xì)胞匯合后將培養(yǎng)基更換為SFRM-B27的日期為第O天)，通過RT-PCR確定BESTl、RPE65、MERTK、CRALBP在構(gòu)成片層的細(xì)胞中的表達。結(jié)果是，觀察到與陽性對照(人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞總RNA (由ScienCell制造，貨號6545))的表達相同水平的表達。此處，BESTl、RPE65、MERTK是特異性表達于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中的基因。CRALBP是表達于視網(wǎng)膜色素`上皮細(xì)胞和Muller細(xì)胞中的基因。
[0071]評價2.視網(wǎng)膜色素上皮片層中殘留膠原的測定
在膠原酶處理之前或之后，通過從實施例1的253G1 (iPS-視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞)生成的各個細(xì)胞片層切出來制作冷凍切片(冰凍切片)，并用于免疫組織化學(xué)染色。將細(xì)胞核用由Molecular Probes制造的4，, 6_ 二脒-2-苯基卩引哚(DAPI; I μ g/ml)染色,并且將I型膠原用由Calbiochem制造的兔抗人I型膠原抗體(1:40稀釋)染色。結(jié)果是，在膠原酶處理后的片層中未檢測到膠原，并且確定了膠原酶去除了培養(yǎng)皿上包被的膠原。另一方面，在膠原酶處理前切出的片層中檢測到膠原。
[0072]評價3.視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層的細(xì)胞因子分泌能力
在從實施例1的253G1 (iPS-視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞)和454E2 (iPS-視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞)生成的細(xì)胞片層中切出視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層的步驟之前，回收transwell的頂面?zhèn)群突鎮(zhèn)壬系呐囵B(yǎng)基，并且按照Arvydas M, 10VS.2006; 47: 3612-3624中描述的方法通過ELISA檢測VEGF和PEDF的產(chǎn)生量。結(jié)果是，確定與Arvydas M, 10VS.2006;47: 3612-3624中報道的人胚胎來源的視網(wǎng)膜色素上皮相似，VEGF主要在基面?zhèn)壬戏置冢鳳EDF主要在頂面?zhèn)壬戏置?圖1)。顯示出本發(fā)明的細(xì)胞片層具有與活體生物中的細(xì)胞片層相似的細(xì)胞因子分泌能力，并且在功能性上是優(yōu)異的。
[0073]評價4.視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層的跨上皮電阻
在細(xì)胞層的屏障功能和阻抗之間，即跨上皮/跨內(nèi)皮電阻(TER)之間觀察到緊密相關(guān)。在切出從實施例1的454E2 (iPS-視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞)生成的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層的步驟之前，按照MILLIPORE描述的方法(使用Millicell ERS-2)，將探針置于插入物內(nèi)部和外部的培養(yǎng)基中，并且用電測定TER。結(jié)果是，TER為640 Ω . cm2，并且顯示出與NatureProtocols voI 4，No 5 662-673 (2009),圖10中報道的人胚胎來源的視網(wǎng)膜色素上皮相似的高TER值。顯示出本發(fā)明的細(xì)胞片層具有與活體生物中的細(xì)胞片層相似的高屏障功倉泛。
[0074]評價5.來源于猴ES細(xì)胞的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層的移植
按照 Invest Ophthalmol Vis Sc1.1995 Feb; 36(2): 381-90 中描述的方法，將實施例I中從猴ES細(xì)胞來源的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞CMK6產(chǎn)生的猴視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層移植到猴的一個眼中。移植前，進行視網(wǎng)膜光凝固法將待移植的眼的視網(wǎng)膜損傷。在向具有其中形成視網(wǎng)膜光凝固斑的猴的一個眼中進行移植的第28天，拍攝眼的眼底照片，并且通過使用OCT (光學(xué)相干計算機斷層攝影術(shù))形成眼底切片圖像作為組織切片，根據(jù)其確定視網(wǎng)膜的狀況。結(jié)果是，通過熒光素血管造影術(shù)沒有發(fā)現(xiàn)熒光泄漏，移植物存活，并且未發(fā)現(xiàn)病癥諸如感覺視網(wǎng)膜變薄等。
[0075]評價6.來源于猴iPS細(xì)胞的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層的移植
按照 Invest Ophthalmol Vis Sc1.1995 Feb; 36(2): 381-90 中描述的方法，將實施例I中從猴iPS細(xì)胞來源的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞46a產(chǎn)生的猴視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層移植到一個眼的視網(wǎng)膜下進行自體移植以及三個眼的視網(wǎng)膜下進行交叉移植。直到移植后一年，拍攝眼底照片，并且通過使用OCT (光學(xué)相干計算機斷層攝影術(shù))形成眼底切片圖像作為組織切片，根據(jù)其觀察視網(wǎng)膜隨時間推移的狀況。在交叉移植中，發(fā)現(xiàn)了明顯的排斥反應(yīng)，諸如移植物周圍纖維性變化，通過熒光素血管造影術(shù)發(fā)現(xiàn)熒光泄漏和通過OCT發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜下高亮度損傷。另一方面，在自體移植中，未發(fā)現(xiàn)這種明顯排斥，通過熒光素血管造影術(shù)沒有發(fā)現(xiàn)熒光泄漏，移植物存活，并且未發(fā)現(xiàn)病癥諸如感覺視網(wǎng)膜變薄等。
[0076]產(chǎn)業(yè)實用性
使用本發(fā)明的方法，可以比較方便地生產(chǎn)通過移植向患有年齡相關(guān)性黃斑變性的患者應(yīng)用的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層。尤其是，當(dāng)用于培養(yǎng)的細(xì)胞是iPS細(xì)胞來源的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞時，可以利用患者自身的細(xì)胞，其可以避免移植中的排斥。此外，由于通過本發(fā)明的方法獲得的細(xì)胞片層具有由與活體生物中相同組分制成的基膜，因此可以復(fù)制更接近活體生物狀態(tài)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層，其可用于多種篩選目的。
[0077]本申請基于在日本申請的專利申請?zhí)?011-040130(申請日:2011年2月25日)，其內(nèi)容完整地并入本文。
【權(quán)利要求】
1.細(xì)胞片層的生產(chǎn)方法，其包括以下步驟 (1)在膠原凝膠上接種并培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞以形成由所述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞片層，和 (2)用膠原酶降解所述膠原凝膠來分離由所述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞片層。
2.權(quán)利要求1的細(xì)胞片層的生產(chǎn)方法，其中所述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞是通過誘導(dǎo)干細(xì)胞或祖細(xì)胞分化獲得的細(xì)胞。
3.權(quán)利要求2的細(xì)胞片層的生產(chǎn)方法，其中所述干細(xì)胞是ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1的細(xì)胞片層的生產(chǎn)方法，其中所述膠原凝膠中膠原的濃度為0.1%-0.5%。
5.權(quán)利要求1-4中任一項的細(xì)胞片層的生產(chǎn)方法，還包括以下步驟(3): (3)確認(rèn)基膜是否存在于分離的細(xì)胞片層和所述膠原凝膠之間的接觸表面上。
6.通過權(quán)利要求1-5中任一項的方法生產(chǎn)的細(xì)胞片層。
7.用于移植的細(xì)胞片層，包含由通過先體內(nèi)后體外誘導(dǎo)干細(xì)胞或祖細(xì)胞分化獲得的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞形成的細(xì)胞片層和由所述細(xì)胞分泌的基膜。
8.用于篩選的細(xì)胞片層，包含由通過先體內(nèi)后體外誘導(dǎo)干細(xì)胞或祖細(xì)胞分化獲得的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞形成的細(xì) 胞片層和由所述細(xì)胞分泌的基膜。
【文檔編號】C12N5/071GK103459593SQ201280010165
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年2月24日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月25日
【發(fā)明者】高橋政代, 岡本理志, 鐮尾浩行 申請人:獨立行政法人理化學(xué)研究所