生物體組織分析用探針及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及通過酶的分離，從生物體組織中高收率地得到具有高的生物活性的細胞或細胞群的方法及用于其的探針。具體而言，本發(fā)明涉及生物體組織的分析方法，其特征在于，對于與特定的生物體成分結(jié)合的2種以上的蛋白質(zhì)，將分別含有所述生物體成分結(jié)合域的2種以上的探針用于經(jīng)分離的生物體組織上，分析所述各探針對于生物體組織的結(jié)合量。
【專利說明】生物體組織分析用探針及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及通過酶分離由生物體組織高收率地得到具有高的生物活性的細胞或細胞群的方法，以及用于該方法的探針。
【背景技術(shù)】
[0002]來自生物體組織的細胞和細胞簇的酶分離可用于包括移植該細胞或建立細胞系等各種目的，以及治療、診斷和檢查等廣泛的用途。然而，為了解離生物體組織、分離其中含有的細胞或細胞集合體，有必要使細胞或細胞集合體游離至期望的程度，從而與細胞組織部分分離。從生物體組織分離細胞和細胞簇時，細胞間基質(zhì)被膠原酶等蛋白質(zhì)分解酶的混合物分解。
[0003]生物體組織由細胞和細胞間基質(zhì)構(gòu)成。細胞間基質(zhì)是固定細胞的物質(zhì)，有結(jié)構(gòu)物和非結(jié)構(gòu)物。前者有膠原纖維、彈性纖維、細網(wǎng)纖維等纖維，后者為填充在纖維之間的成分，為稱作底物的非溶膠的凝膠狀物質(zhì)，有糖蛋白和蛋白多糖。細胞間基質(zhì)的代表是稱為膠原(collagen)的蛋白質(zhì)，占生物體內(nèi)總蛋白質(zhì)重量的約1/3。膠原具有纖維結(jié)構(gòu)，正式地稱為膠原纖維。
[0004]組織大致分為上皮組織、支持組織、肌肉組織和神經(jīng)組織4個類別。上皮組織是覆蓋在身體表面的組織，細胞密度高，沒有穿插細胞間基質(zhì)。支持組織起著支持身體、臟器和細胞等的作用，包括結(jié)締組織、軟骨組織、骨組織、血液、淋巴。肌肉組織是以收縮運動為目的融合分化的細胞，細胞間基質(zhì)所占的比例極低。
[0005]肌肉組織由肌肉細胞、結(jié)締組織、血管和神經(jīng)構(gòu)成，但是主要的結(jié)構(gòu)物是肌肉纖維。神經(jīng)組織主要由神經(jīng)內(nèi)膜和神經(jīng)束膜構(gòu)成，任一種均含有較多的細胞間基質(zhì)(膠原)。結(jié)締組織是支持組織的一種，由脂肪組織和纖維性結(jié)締組織(以膠原纖維和彈性纖維為構(gòu)成成分)組成，大致分為疏水性結(jié)締組織和堅韌性結(jié)締組織。疏水性結(jié)締組織是膠原不規(guī)則排列的纖維性結(jié)締組織，分布于皮下組織、粘膜組織、神經(jīng)、血管外膜、小葉間組織等。
[0006]根據(jù)生物物種、年齡、性別、組織、生活環(huán)境等，細胞間基質(zhì)中膠原的含量情況不同。但是，在何種組織的何種狀態(tài)的基質(zhì)中以何種程度含有何種膠原仍不是十分明確。膠原的特征在于，構(gòu)成蛋白質(zhì)肽鏈的氨基酸具有如甘氨酸-氨基酸X-氨基酸Y”這樣甘氨酸每3個殘基重復(fù)一次的一級結(jié)構(gòu)。據(jù)報道，人類的膠原蛋白質(zhì)有30種以上，但是體內(nèi)存在最豐富的是纖維性的I型膠原，非纖維性的IV型膠原的含量也很大，涉及通過分子間二硫鍵相互連接而形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(非專利文獻I)。據(jù)報道，IV型膠原存在于胰島和內(nèi)分泌組織之間(非專利文獻2、3)。
[0007]認為特定類型的膠原是否存在于目標基質(zhì)中，理論上可通過使用針對各種類型膠原的抗體進行免疫染色來確定。然而，膠原的種類較多，且廣泛地存在于多細胞動物中，因此難以制作抗體等成為瓶頸，其實現(xiàn)是困難的。
[0008]作為組織分解用的酶，來自溶組織梭菌的各種類型的粗膠原酶除了含有2種膠原酶之外，還含有各種蛋白酶(膠原分解活性和非特異性的蛋白質(zhì)分解活性)和非蛋白酶成分(磷脂酶等)。通過這種粗膠原酶，各細胞和細胞群從生物體組織中酶法分離。
[0009]據(jù)報道，各細胞或細胞群從生物體組織上酶法分離的時候，對于所分離的細胞或細胞群的收率及其生物活性，2種膠原酶(ColG和ColH)起重要作用，其用量比例有較大的影響(非專利文獻4)。在從胰臟組織中分離胰島的情況中，也使用由溶組織梭菌(Clostridium histolyticum)產(chǎn)生的2種膠原酶(非專利文獻5、專利文獻I和2)。本發(fā)明人現(xiàn)已確認，通過使2種膠原酶的用量比例最優(yōu)化，可以分離大量的胰島。
[0010]據(jù)報道，膠原酶根據(jù)其種類而具有不同的膠原結(jié)合域(非專利文獻6)。到目前為止，制備了各種功能性蛋白質(zhì)和膠原結(jié)合域的融合蛋白質(zhì)用于靶向和藥物輸送系統(tǒng)(DDS)。例如，可以列舉在溶組織梭菌的膠原結(jié)合域中結(jié)合bFGF或EGF的膠原結(jié)合性細胞生長因子(非專利文獻7)、源自牛血管性血友病因子的膠原結(jié)合十肽和TGF-β的融合蛋白質(zhì)(非專利文獻8和9)、在纖維連接蛋白的膠原結(jié)合域中結(jié)合功能性肽的緩釋性細胞生長因子供給體(專利文獻3)。如此，可制備與膠原結(jié)合域的融合蛋白質(zhì)用于靶向和組織可視化目的，但不能用于生物體組織的分析和分離。
[0011]為了對特定的組織和細胞進行無損傷分離，必須使所述組織和細胞周圍存在的細胞間基質(zhì)分解。然而，在進行必要的細胞表面分解的同時，無損傷地僅將細胞間基質(zhì)通過酶進行分解是不容易的。特別是根據(jù)人類臟器的情況、年齡、性別、生活習(xí)慣、病史等，通過蛋白質(zhì)分解酶獲得的分解性不同，因此不得不通過經(jīng)驗確定酶的種類和酶反應(yīng)時間而進行分離。
[0012]在糖尿病患者中，移植從胰臟中分離的胰島進行治療(胰島移植)。在胰島移植中，必須分離存在于被稱為胰島的胰臟組織中的細胞團塊，必須在不損傷胰島的情況下分解胰臟組織，分離胰島。然而，細胞間基質(zhì)的狀態(tài)根據(jù)動物種類、組織部位、個體年齡或性別、生長環(huán)境等而差別較大。特別是對于膠原，由老化導(dǎo)致的物性變化顯著。盡管如此，對于不同狀態(tài)的胰臟組織，根據(jù)規(guī)則適用一定用量比例的酶，僅改變分解時間，一邊目測確認胰臟的分解程度，一邊進行酶處理。因此，所得到胰島的數(shù)量和質(zhì)量根據(jù)醫(yī)療機構(gòu)、醫(yī)療工作者、目標胰臟的狀態(tài)而變。
[0013]如果可以由待分離的細胞外基質(zhì)或臟器的蛋白質(zhì)組成來正確且簡便地知曉所使用的蛋白質(zhì)分解酶的種類和用量，則可在高活性的狀態(tài)下分離目標細胞等。
[0014]現(xiàn)有技術(shù)文獻
[0015]專利文獻
[0016]專利文獻1W096/00283
[0017]專利文獻2W098/24889
[0018]專利文獻3W002/014505
[0019]非專利文獻
[0020]非專利文獻llnoueetal.，J Cell Biol, 97，1524-1539 (1983)
[0021 ]非 專 利 文 獻 2 S J Hughes, P McShane, TransplantProceedings, 37, 3444-34445(2005)
[0022]非專利文獻3SJ Hughes, A Clark, P McShane, Transplantation, 81 (3) 423-426 (2
006)
[0023]非專利文獻4D Brandhorst et al., Transplantation Proceedings, 37 (8), 3450-3451(2005)
[0024]非專利文獻5E Linetsky et al.，Diabetes, 46，1120-1123 (1997)
[0025]非專利文獻6K Watanabe, Appl Microbiol Biotechnol, 63，520-526 (2004)
[0026]非專利文獻7NNishi, O Matsushita, K Yuube, H Miyanaka, A Okabe, F Wada, ProcNatl Acad Sci USA.;95 (12):7018-7023(1998)
[0027]非專利文獻8Tuan et al., Connective Tissue Reserch, 34 (I), 1-9 (1996)
[0028]非專利文獻9 H a n et al., Protein Expression andPurificationll, 169-178(1997)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0029]發(fā)明所要解決的問題
[0030]本發(fā)明的目的是，提供從生物體組織快速且高效地分離具有高生物活性的細胞或細胞群的方法。具體而言，在不降低生物體組織中的生理活性物質(zhì)、細胞或/和臟器的生理活性的情況下，高收率地獲得目標細胞或細胞群。
[0031]解決問題的手段
[0032]本發(fā)明人制作了生物體組成分析用的探針，該探針使用具有2種酶的底物結(jié)合域(生物體成分結(jié)合域)和可視化蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)。并且，已發(fā)現(xiàn)，通過分析這種探針的結(jié)合量、預(yù)測酶對生物體組織的作用性，可確定最合適的酶的用量比例和作用時間等，可更高效地將目標細胞或細胞群在具有高生物活性的狀態(tài)下分離。
[0033]S卩，本發(fā)明涉及生物體組織的分析方法，其特征在于，對于與特定的生物體成分結(jié)合的2種以上的蛋白質(zhì)，將分別含有所述生物體成分結(jié)合域的2種以上的探針用于經(jīng)分離的生物體組織上，并分析所述各探針對于生物體組織的結(jié)合量。
[0034]在本發(fā)明中所使用的探針被設(shè)計成可使用公知的分子成像技術(shù)可視化。S卩，通過突光分子、發(fā)光分子、正電子核素和放射性同位素等可視化分子來標記探針。
[0035]作為可視化分子，可以列舉GFP、EGFP, YFP、BFP、CFP、DsRED, tdTomato、RFP 等熒光分子和熒光素酶蛋白質(zhì)等發(fā)光分子，但不限于此。熒光素酶蛋白質(zhì)優(yōu)選具有與天然存在的野生型熒光素酶不同的峰值波長和發(fā)光強度。
[0036]熒光分子和發(fā)光分子可單獨使用，也可將熒光分子(能量接收蛋白質(zhì))和如熒光素酶的可自發(fā)光分子(能量產(chǎn)生蛋白質(zhì))結(jié)合使用。在這種情況下，二者優(yōu)選通過合適的連接基團連接。
[0037]作為探針用的生物體成分結(jié)合域，可以列舉蛋白質(zhì)分解酶的膠原結(jié)合域、或纖維連接蛋白等的生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的膠原結(jié)合域等。作為前者的具體實例，可以列舉源自梭菌屬(Clostridium)的膠原酶所具有的膠原結(jié)合域,例如,源自溶組織梭菌(Clostridiumhistryticum)的膠原酶G和膠原酶H的膠原結(jié)合域。
[0038]另外，探針用的膠原結(jié)合域在能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的目的和效果的前提下，可為該域的一部分(部分序列)，“膠原結(jié)合域”的表述也包括這種膠原結(jié)合域的一部分。
[0039]作為在本發(fā)明中使用的底物結(jié)合域的一個具體實例，所述源自溶組織梭菌的膠原酶G和膠原酶H的膠原結(jié)合域的氨基酸序列示于序列序號I和序列序號2中。
[0040]在可視化分子為蛋白質(zhì)的情況下，生物體成分結(jié)合域和可視化分子(蛋白質(zhì))可制作成融合蛋白質(zhì)。
[0041]探針包含1-100次、優(yōu)選1-20次生物體成分結(jié)合域的序列重復(fù)。
[0042]在本發(fā)明的分析方法中，可以將2種以上的探針分別作用于生物體組織上，也可同時作用于生物體組織上。此外，各探針的結(jié)合量也可分別測定，也可同時測定。優(yōu)選的是，將2種以上的探針用不同的可視化分子標記，使探針同時作用，并同時測定其結(jié)合量。
[0043]另外，本發(fā)明還提供利用本發(fā)明的分析方法從生物體組織分離細胞或細胞群的方法。本發(fā)明的分離方法的特征在于，使用所述分析方法分析生物體組織，基于其結(jié)果確定酶(源自探針中所含的底物結(jié)合域的酶)的用量比例，將該用量比例的酶作用于生物體組織，從而分離目標細胞或細胞群。
[0044]另外，本發(fā)明還提供由上述2種以上的探針組成的生物體組織分析用探針組、或包括該探針組和酶等的生物體組織分離用試劑盒。
[0045]發(fā)明效果
[0046]本發(fā)明中使用的探針含有生物體成分結(jié)合域，通過與生物體組織中存在的特定的酶結(jié)合部位等特異性結(jié)合，發(fā)出熒光或發(fā)光。通過觀察由對應(yīng)于各種酶的探針產(chǎn)生的熒光或發(fā)光等，可以分析生物體組織中的酶的親和性或作用性。具體而言，將探針與目標組織的少量冰凍切片一起培養(yǎng)、染色。由組織切片上的蛋白質(zhì)組成的色調(diào)及其熒光強度，分析與探針的結(jié)合情況，算出最適合分解的酶的用量比例和作用時間。
[0047]S卩，根據(jù)本發(fā)明，通過探針對待分離的細胞外基質(zhì)或組織蛋白質(zhì)的結(jié)合性，可正確且簡便地知曉所使用的蛋白質(zhì)分解酶的種類或用量。如此，可迅速且簡便地將目標細胞或細胞群在維持高活性的狀態(tài)下從生物體組織中分離。例如在胰島移植中，可根據(jù)目標胰臟組織的狀態(tài)處理酶，還可建立通常能實現(xiàn)大量優(yōu)質(zhì)胰島分離的胰臟組織狀態(tài)指標。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0048]圖1 (A) CoIGCBD 和(B) CoIHCBD 的組成
[0049]圖2tdTomatoColH CBD 的序列不意圖
[0050]圖3Ni_NTA 洗脫部分的 SDS-PAGE
[0051]圖4陰離子交換色譜法洗脫部分的SDS-PAGE
[0052]圖5tdTomatoColH CBD的激發(fā)、熒光光譜
[0053]圖6熒光素酶基因和CBD基因的擴增所使用的引物的示意圖
[0054]圖7熒光素酶-膠原結(jié)合域融合蛋白質(zhì)表達質(zhì)粒
[0055]圖8探針蛋白質(zhì)的表達確認(SDS-PAGE)
[0056]圖9突光素酶發(fā)光確認(發(fā)光光譜和550nm的發(fā)光強度隨時間的變化)
[0057]圖1ON1-NTA瓊脂糖柱洗脫部分的SDS-PAGE (M:蛋白質(zhì)標記物、S:PGV_ColH CBD粗品、FT:直接流過部分、50?500mM:各濃度的咪唑洗脫部分(將第一個200mM咪唑洗脫部分作為純化的酶溶液。))
[0058]圖11與胰臟組織片的結(jié)合確認試驗
[0059]圖12根據(jù)EGFP-ColGCBD探針獲得的豬胰臟切片的組成分析結(jié)果
[0060]圖13在大鼠組織切片中GFP ColG CBD和tdTomato ColH CBD的熒光亮度比(H/G:tdTomato ColH CBD相對于GFP ColG CBD 的熒光亮度比、W:Wister-Furth 大鼠，L:Lweis大鼠，SD:SD大鼠)
[0061]圖14膠原酶G和H的組成比的差異對胰島的數(shù)量和質(zhì)量的影響(A:收率、B =ATP/DNA、C:體外糖負荷測試、D:胰島素/DNA)
[0062]本說明書包括作為本申請優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的特愿2011-058080號說明書中記載的內(nèi)容。
_3] 發(fā)明的實施方式
[0064]1.生物體組織的分析方法
[0065]本發(fā)明對于與特定的生物體成分結(jié)合的2種以上的蛋白質(zhì)，通過使用分別含有所述生物體成分結(jié)合域的2種以上的探針，分析針對該探針的生物體組織的結(jié)合量(親和性)，將其結(jié)果應(yīng)用于生物體組織的分解、細胞或細胞群的分離中。
[0066]在此，“與特定的生物體成分結(jié)合的2種以上的蛋白質(zhì)”可以列舉纖維連接蛋白或整聯(lián)蛋白等的細胞間基質(zhì)蛋白質(zhì)、和蛋白質(zhì)分解酶等酶。這些蛋白質(zhì)具有與其配體或底物特異性結(jié)合的部位(域)，在本說明書中，該部位記載為“生物體成分結(jié)合域”。
[0067]在從生物體組織分離細胞或細胞群的情況中，通常較多地使用多種酶。然而，各種酶的作用性(組織的敏感性)根據(jù)適用的生物體組織的部位或狀態(tài)而差別較大。因此，為了在維持高生物活性的同時迅速且高效率地分離目標細胞或細胞群，希望能夠預(yù)先確定最適合的酶的使用量、使用比例、作用時間等。本發(fā)明的探針可簡便地確定這種最適合的酶使用量、使用比例、作用時間等。
[0068]在本發(fā)明中，作為目標的“生物體組織”沒有特別的限制，廣泛地包括哺乳類、鳥類、爬行類、魚類等的多細胞動物的組織、肝臟、胰臟、腎臟、牙周組織、肝臟、胰臟、皮膚、軟骨、骨、神經(jīng)組織。此外，不僅包括從生物體分離的物質(zhì)，還包括人工構(gòu)筑的ES細胞組織、iPS細胞材料用的成纖維細胞組織等。
[0069]在本發(fā)明中，對于與特定的生物體成分結(jié)合的2種以上的蛋白質(zhì)，使用分別含有所述生物體成分結(jié)合域(例如，不同的酶的底物結(jié)合部位)的“2種以上的探針”。用于探針的生物體成分結(jié)合域可根據(jù)分析目的進行合適的選擇。
[0070]例如，如果在生物體組織的酶消化(分解)或細胞或細胞群的分離之前分析生物體組織，則將用于這種酶消化或細胞分離的蛋白質(zhì)分解酶的底物結(jié)合域用于探針中。
[0071]作為在組織分解中所使用的蛋白質(zhì)分解酶，例如可以列舉膠原酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、中性蛋白酶、彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、菠蘿蛋白酶、植酸鈣鎂、嗜熱蛋白酶等。作為膠原酶，具體地可以列舉源自溶組織梭菌(Clostridium histryticum)的膠原酶G和膠原酶H、以及源自放線菌的膠原酶、源自產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)的膠原酶等。對這些酶的底物結(jié)合部位的一級結(jié)構(gòu)已經(jīng)進行了較多的分析，通過使用這些信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員可進行探針的設(shè)計。
[0072]與生物體組織結(jié)合的探針通過使用公知的分子成像技術(shù)而可視化，能夠在不對組織造成損傷的情況下，簡便地測定其結(jié)合量。根據(jù)所使用的成像技術(shù)，通過熒光分子、發(fā)光分子、和正電子核素等放射性同位素等適當(dāng)?shù)目梢暬肿訉μ结樳M行標記。關(guān)于探針的設(shè)計，將在下節(jié)中進行詳細描述。
[0073]2種以上的探針可分別施用于生物體組織，也可同時施用。此外，其結(jié)合量的測定也是可分別進行，也可同時進行。但是，從測定的迅速簡便的方面來看，優(yōu)選將2種以上的探針用不同的可視化分子進行標記，同時施用于生物體組織，并同時測定其結(jié)合量。
[0074]在本發(fā)明中，將所述2種以上的探針施用于經(jīng)分離的生物體組織中，分析該探針與生物體組織的結(jié)合量(親和性)，將其結(jié)果應(yīng)用于生物體組織的分解、細胞或細胞群的分離中。例如，求出2種以上的探針與生物體組織的結(jié)合量比例，由該值確定用于該生物體組織的分解、細胞或細胞群的分離的酶的最適合量。探針的結(jié)合比與所使用的酶的用量比例具有相關(guān)性，結(jié)合比越高，酶的最適合用量比例也越高。但是，各種酶各自的單元數(shù)、效價(效力單位/mg)、最適溫度、最適pH、作用時間不同，因此在這些因素和探針結(jié)合比的綜合考慮下，來最終確定所使用的酶的用量比例。如果可求出本發(fā)明的探針結(jié)合比，本領(lǐng)域技術(shù)人員即可確定這種最適合用量比例。
[0075]2.生物體組織分析用探針組
[0076]本發(fā)明的探針組由2種以上的探針組成，各探針包括各自不同的生物體成分結(jié)合域(與特定的生物體成分結(jié)合的2種以上的蛋白質(zhì)的該生物體成分結(jié)合域)、和選自包括熒光分子、發(fā)光分子、和正電子核素的放射性同位素的可視化分子。
[0077]根據(jù)分析的目的對酶的底物結(jié)合域進行合適的選擇。如果在生物體組織的酶消化(分解)或細胞或細胞群的分離之前進行生物體組織的分析，則探針中使用這種酶消化或細胞分離中使用的蛋白質(zhì)分解酶的底物結(jié)合域。
[0078]作為這種蛋白質(zhì)分解酶，例如可以列舉膠原酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、中性蛋白酶、彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、菠蘿蛋白酶、植酸鈣鎂、嗜熱蛋白酶等。作為膠原酶，特別是可以列舉源自溶組織梭菌(Clostridiumhistryticum)的膠原酶G和膠原酶H、以及源自放線菌的膠原酶、源自產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)的膠原酶等。對這些酶的底物結(jié)合部位的一級結(jié)構(gòu)已經(jīng)進行了較多的分析，通過使用這些信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員可進行探針的設(shè)計。作為一個實例，將源自溶組織梭菌(Clostridium histryticum)的膠原酶G和膠原酶H的氨基酸序列分別示于序列序號I和序列序號2中。
`[0079]在探針中，優(yōu)選包含I~100次、特別是I~20次底物結(jié)合域(例如，膠原結(jié)合域)或其一部分的重復(fù)。
[0080]作為可視化分子，可以使用用于分子成像技術(shù)中的熒光分子、發(fā)光分子和正電子核素。
[0081]作為熒光分子，例如可以使用GFP、EGFP、YFP、BFP、CFP、DsRED、tdTomato、和 RFP等突光蛋白質(zhì)、或Alexa350、二甲氨基香豆素、5/6-羧基-突光素、Alexa488、ATT0488、DY-505、5/6-羧基熒光素、Alexa488、Alexa532、Alexa546、Alexa555、ATT0488、ATT0532、四甲基若丹明、Cy3、DY-505、DY-547、Alexa635、Alexa647、ATT0600、ATT0655、DY-632、Cy5、DY-647、Cy5.5等熒光標記物作為可視化分子。
[0082]作為發(fā)光分子，可以使用熒光素酶等發(fā)光酶。熒光素酶可以列舉源自希根海螢、武裝奸科(Hoplophoridae)、發(fā)光昆蟲(螢火蟲、發(fā)光幢蟲(匕力V ^ J 3O等)、發(fā)光Φ丘蟲引、Latia、海香菇^ V ^ >)、多管水母屬(發(fā)光水母)等各種發(fā)光生物的熒光素酶，但是也可以合適地使用具有與野生型熒光素酶不同的峰值波長和發(fā)光強度的改性熒光素酶。
[0083]GFP等熒光蛋白質(zhì)為了產(chǎn)生熒光需要外部光源，但是熒光素酶可氧化熒光素而自發(fā)光。通過將這種熒光素酶與GFP結(jié)合，也可以開發(fā)在沒有外部光源的情況下使GFP發(fā)光的技術(shù)，并應(yīng)用這種技術(shù)(W02004/22600、W02004/052934)。
[0084]另外，關(guān)于可視化蛋白質(zhì)，已知曉多種技術(shù)(W001/46694、特表2006-518209號公告、特表2005-525111號公告、特開2008-283959號公告)，也可以使用這些公知的技術(shù)。
[0085]作為放射性同位素，可以使用在利用PET的成像中使用的正電子核素等。作為正電子核素，例如可以列舉150、13N、nC、18F、62Cu、68Ga、82Rb等，可以使用PET探針中通用的公知的標記物。
[0086]在使用作為可視化分子的蛋白質(zhì)分子的情況中，可以使生物體成分結(jié)合域(膠原結(jié)合域)與可視化分子形成融合蛋白質(zhì)。融合蛋白質(zhì)的制備方法在本領(lǐng)域中是公知的(上述 N Nishi, et al., Proc Natl Acad Sci USA.; 95 (12): 7018-7023 (1998)、Tuan etal., Connective Tissue Reserch, 34(I)，1-9 (1996)、Han et al., Protein Expressionand Purificationll, 169-178),本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)這些公知技術(shù),可以容易地制備融合蛋白質(zhì)。
[0087]3.從生物體組織分離細胞或細胞群的方法
[0088]本發(fā)明還提供使用所述分析方法分析生物體組織，基于其分析結(jié)果確定所使用的酶的用量比例或作用時間，從而高效率地由生物體組織分離目標細胞或細胞群的方法。
[0089]探針的結(jié)合量暗示組織對酶的親和性，因此由對各種酶的親和性，可以根據(jù)目的預(yù)測酶的用量比例和作用時間等。
[0090]4.生物體組織分離用試劑盒
[0091]本發(fā)明還提供用于上述從生物體組織分離細胞或細胞群的方法的試劑盒。
[0092]本發(fā)明的試劑盒包括選自本發(fā)明的探針組、作為生物體組織分離中所使用的酶的、其底物結(jié)合域成為探針的構(gòu)成要素的酶、緩沖液等本發(fā)明的生物體組織的分離方法所使用的試劑或儀器中的I種或2種以上作為組成要素。
實施例
[0093]以下，使用實施例更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于這些實施例。
[0094][實施例1]制備使用EGFP的探針
[0095][EGFP-CoIGCBD 探針的制備]
[0096](I) EGFP-CoIGCBD 的構(gòu)筑方法
[0097]首先，對于針對用EGFP標記的源自溶組織梭菌的膠原酶G的探針(EGFP-ColGCBD)的制備進行說明。
[0098]首先，基于FLAG 序列合成 2 個低聚 DNA: 5’ -TCGACGATTATAAAGATGATGATGATAAAT-3’(序列序號 3)和 5’ -CTAGATTTATCATCATCATCTTTATAATCG-3’(序列序號 4)。將各低聚DNA溶解于TE中以達到100 μ Μ，混合10 μ I的低聚DNA、3 μ I的10ΧΤ4多核苷酸激酶緩沖液(Nippon Gene公司制造)、0.3 μ I的0.1ΜΑΤΡ、2 μ I的Τ4多核苷酸激酶(20U，NipponGene) ,14.7μ I的H2O,在37°C下保溫I小時。從各反應(yīng)液中取出10 μ 1，進行混合。將混合的溶液在100°C下保持5分鐘后，原樣慢慢冷卻至室溫。將其作為插入溶液I。
[0099]向 10 μ I 的 pCold2 (TAKARA Bio)中加入 10 μ I 的 IOXTango 緩沖液(Fermentas公司制造)、I P I 的 Sail (Fermentas)、I μ I 的 XbaI (Fermentas)、28 μ I 的 H2O,在 37°C下反應(yīng)5小時。向反應(yīng)結(jié)束后的反應(yīng)液中加入150 μ I的TE，加入250 μ I的苯酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)溶液，充分攪拌后，在室溫下以16，OOOg離心5分鐘，回收上清液。向回收的上清液中加入20 μ 13Μ乙酸鈉溶液，加入450 μ I冷的乙醇。在冰上放置5分鐘后，以16，OOOg在4°C下離心5分鐘，回收沉淀。
[0100]將沉淀用冷的70%乙醇洗滌后、用40 μ I的H2O溶解。向其中加入5 μ I的10ΧΒΑΡ緩沖液(Τ0Υ0Β0公司制造)、5 μ I的細菌堿性磷酸酶(Τ0Υ0Β0)，在65°C下反應(yīng)I小時。將全部量反應(yīng)液用于0.8%瓊脂糖電泳中。電泳結(jié)束后，用溴乙錠溶液染色，確認條帶的位置后，將其切出。從瓊脂糖凝膠中的回收使用Viogene公司制造的凝膠/PCR純化試劑盒而進行。根據(jù)相同的方法，使用40μ I的EB進行洗脫。
[0101]將得到的洗脫液作為載體溶液I。將9 μ I的載體溶液I和I μ I的插入溶液1、10 μ I 的 Ligation convenience 溶液(Nippon gene)混合,在 16°C下保溫 30 分鐘。使用該溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α。將經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌接種到添加了通過0.22 μ m無菌過濾器滅菌的氨芐青霉素以使其在通過高壓滅菌釜滅菌的2ml的LB培養(yǎng)基中的最終濃度為100 μ g/ml的培養(yǎng)基中，在37°C下培養(yǎng)過夜后，以10，OOOg離心I分鐘，回收菌體。使用Viogene公司制造的mini plus質(zhì)粒DNA提取試劑盒從經(jīng)回收的菌體中回收質(zhì)粒。用100 μ I的EB進行洗脫。向其中的10 μ I質(zhì)粒溶液中混合2 μ I的IOXTango緩沖液、I μ I的Xbal、7 μ I的H2O,在37°C下保持3小時。將反應(yīng)液用于0.8%瓊脂糖凝膠電泳、切出出現(xiàn)于4kbp附近的單獨條帶。使用Viogene公司制造的凝膠/PCR純化試劑盒進行回收。用50 μ I的EB進行洗脫。向10 μ I的洗脫液中加入10μ I的Ligation convenience溶液,在16°C下保持30分鐘。
[0102]再次使用該溶液，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5CI。將經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌接種到添加了通過0.22 μ m無菌過濾器滅菌的氨芐青霉素以使其在通過高壓滅菌釜滅菌的2ml的LB培養(yǎng)基中的最終濃度為lOOyg/ml的培養(yǎng)基中，在37°C下培養(yǎng)過夜后，以10，OOOg離心I分鐘，回收菌體。使用Viogene公司制造的mini plus質(zhì)粒DNA提取試劑盒從經(jīng)回收的菌體中回收質(zhì)粒。用100μ I的EB進行洗脫。向其中的10μ I中混合3μ I的10ΧΚ緩沖液(TAKARABio)、I μ I 的 BamHI (TAKARA Bio)、I μ I 的 EcoRI (TAKARABio)、15 μ I 的 Η20，在 37°C下反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后，進行同等用量的苯酚/氯仿/異戊醇萃取，向得到的上層中加入3μ I的3Μ乙酸鈉，加入70 μ I冷的乙醇。在冰上放置5分鐘后，以16，OOOg在4°C下離心5分鐘，回收沉淀。將沉淀用冷的70%乙醇洗滌后，用40μ I的H2O溶解。向其中加入5μ I的10ΧΒΑΡ緩沖液(Τ0Υ0Β0)、5 μ I的細菌堿性磷酸酶(Τ0Υ0Β0)，在65°C下反應(yīng)I小時。將全部量的反應(yīng)液通過0.8%瓊脂糖電泳使用TAE緩沖液進行電泳，用溴乙錠溶液染色，確認條帶的位置后，進行切出。從瓊脂糖凝膠中的回收通過使用Viogene公司制造的凝膠/PCR純化試劑盒進行。根據(jù)相同的方法，使用30 μ I的EB進行洗脫。將該洗脫液作為載體溶液2。
[0103]另一方面，將0.5 μ I 的 100 μ Μ5’ -AAAGAACGGATCCACAACAACACCTATAACTAAAG-3’ (引物 1:序列序號 5)、和 0.5 μ I 的 100 μ Μ5’ -AAGCAGAGATGAATTCTTTATTTACCCTTAACTCATAG-3’(引物2:序列序號6)、1 μ I已經(jīng)克隆的包含編碼溶組織梭菌膠原酶G的基因全長的質(zhì)粒、8 μ I 的 dNTP 混合物(TAKARA Bio)、1.0 μ I 的 PrimeStar HS (TAKARA Bio)、20 μ I 的 5Mbetain、49 μ I 的 H2O 混合,進行 98°C、2min (第一階段)、98°C、IOsec (第二階段)、55°C、5sec(第三階段)、72°C、90sec (第四階段)，連續(xù)重復(fù)第二階段至第四階段35次。
[0104]將得到的PCR片段用Viogene公司制造的凝膠/PCR純化試劑盒進行純化。用50 μ I的EB進行洗脫。向所得的洗脫液中的10 μ I中混合3 μ I的IOXK緩沖液(TAKARABio)、l μ I 的 BamHI (TAKARA Bio)、I μ I 的 EcoRI (TAKARA Bio)、15 μ I 的 H2O,在 37°C下反應(yīng)過夜。將全部量的反應(yīng)液通過0.8%瓊脂糖電泳使用TAE緩沖液進行電泳,用溴乙錠溶液染色，確認條帶的位置后，進行切出。從瓊脂糖凝膠中的回收通過使用Viogene公司制造的凝膠/PCR純化試劑盒進行。根據(jù)相同的方法，使用30 μ I的EB進行洗脫。將該洗脫液作為插入溶液2。
[0105]向5 μ I的載體溶液2和5 μ I的插入溶液2中加入10 μ I的Ligationconvenience溶液,在16°C下反應(yīng)30分鐘。使用反應(yīng)結(jié)束后的Ligation溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci。將得到的轉(zhuǎn)化株接種到添加了通過0.22μπι無菌過濾器滅菌的氨芐青霉素以使其在通過高壓滅菌釜滅菌的2ml的LB培養(yǎng)基中的最終濃度為ΙΟΟμ g/ml的培養(yǎng)基中，在37°C下培養(yǎng)過夜后，以10，OOOg離心I分鐘，回收菌體。使用Viogene公司制造的mini plus質(zhì)粒DNA提取試劑盒從經(jīng)回收的菌體中回收質(zhì)粒。用100 μ I的EB進行洗脫。向其中的10 μ I中混合 3 μ I 的 Tango 緩沖液、I μ I 的 SacI (Fermentas)> I μ I 的 KpnI (Fermentas)、15 μ I的Η20，在37°C下反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后，進行同等用量的苯酚/氯仿/異戊醇萃取，向得到的上層中加入3 μ I的3M乙酸鈉，加入70 μ I冷的乙醇。在冰上放置5分鐘后，以16，OOOg在4°C下離心5分鐘，回收沉淀。將沉淀用冷的70%乙醇洗滌后、用40 μ I的H2O溶解。向其中加入5 μ I的10ΧΒΑΡ緩沖液(Τ0Υ0Β0)、5 μ I的細菌堿性磷酸酶(Τ0Υ0Β0)，在65。。下反應(yīng)I小時。將全部量的反應(yīng)液通過0.8%瓊脂糖電泳使用TAE緩沖液進行電泳,用溴乙錠溶液染色，確認條帶的位置后，進行其切出。從瓊脂糖凝膠中的回收通過使用Viogene公司制造的凝膠/PCR純化試劑盒進行。根據(jù)相同的方法，使用30μ I的EB進行洗脫。將該洗脫液作為載體溶液3。
[0106]將編碼EGFP 的基因作為模板，將 5’ -CGAAGGTGAGCTCATGGTGAGCAAGGGCG-3’(引物3:序列序號 7)、和 3’ -AGACTGCGGTACCGATCGATCTGAGTCCG-3’(引物 4:序列序號 8)作為引物、將20 μ I 的 5XPrimeStar 緩沖液(TAKARA Bio)、1.0 μ I 的 p ET_EGFP、0.5μ I 的 100 μ M引物 3、0.5 μ I 的 100 μ M 引物 4、8.0 μ I 的 dNTP 混合物、1.0 μ I 的 PrimeStarHS、20 μ I 的5Μ betain、49yl 的 H2O 混合，進行 98°C、2min (第一階段)、98°C、IOsec (第二階段)、55°C、5sec (第三階段)、72°C、90sec (第四階段)，連續(xù)重復(fù)第二階段至第四階段35次。
[0107]將得到的PCR片段用Viogene公司制造的凝膠/PCR純化試劑盒進行純化。用50 μ I的EB進行洗脫。向所得的洗脫液中的10 μ I中混合3 μ I的Tango緩沖液、I μ I的SacI (Fermentas)、I μ I 的 KpnI (Fermentas)、15 μ I 的 H2O,在 37°C下反應(yīng)過夜。將全部量的反應(yīng)液通過0.8%瓊脂糖電泳使用TAE緩沖液進行電泳，用溴乙錠溶液染色，確認條帶的位置后，進行切出。從瓊脂糖凝膠中的回收通過使用Viogene公司制造的凝膠/PCR純化試劑盒進行。根據(jù)相同的方法，使用30μ I的EB進行洗脫。將該洗脫液作為插入溶液3。
[0108]向5 μ I的載體溶液3和5 μ I的插入溶液3中加入10 μ I的Ligationconvenience溶液,在16°C下反應(yīng)30分鐘。使用反應(yīng)結(jié)束后的Ligation溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci。將得到的轉(zhuǎn)化株接種到添加了通過0.22μπι無菌過濾器滅菌的氨芐青霉素以使其在通過高壓滅菌釜滅菌的2ml的LB培養(yǎng)基中的最終濃度為100μ g/ml的培養(yǎng)基中，在37°C下培養(yǎng)過夜后，以10，OOOg離心I分鐘，回收菌體。使用Viogene公司制造的mini plus質(zhì)粒DNA提取試劑盒從經(jīng)回收的菌體中回收質(zhì)粒。用100μ1的EB進行洗脫。使用所得到的洗脫液轉(zhuǎn)化大腸桿菌BLR株(Novagen公司制造)。將所得到的轉(zhuǎn)化株作為E.coli BLR/pCold2-EGFP-ColGCBD 株。
[0109](2)EGFP_ColGCBD 的純化
[0110]培養(yǎng)
[0111]將通過pCold2-EGFP-ColGCBD轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BLR株接種到添加了通過0.22 μ m無菌過濾器滅菌的氨芐青霉素以使其在通過高壓滅菌釜滅菌的2ml的LB培養(yǎng)基中的最終濃度為IOOy g/ml的培養(yǎng)基中，在37°C下振蕩培養(yǎng)過夜，將其作為預(yù)培養(yǎng)液。將預(yù)培養(yǎng)液接種到在500ml容積的帶有擋板的錐形燒瓶中準備的170ml相同培養(yǎng)基中使得含量為1000分之1，在37°C下振蕩培養(yǎng)直至OD66tl為0.6?1.0左右，添加通過0.22 μ m無菌過濾器滅菌的IPTG使得最終濃度為ImM，在15°C下振蕩培養(yǎng)24小時。
[0112]回收
[0113]培養(yǎng)結(jié)束后，以10，OOOg離心5分鐘來回收菌體。將回收的菌體懸浮于與培養(yǎng)液等量的pH為8.0的含有0.3M NaCl的50mM磷酸鹽緩沖液中，再次以10，OOOg離心5分鐘來回收菌體。再重復(fù)同樣的操作兩遍,洗滌菌體。將經(jīng)洗滌的菌體懸浮于25ml同樣的緩沖液中后，在200W的輸出下在I分鐘內(nèi)，在冰上通過超聲波破碎機破碎菌體。將破碎結(jié)束后的菌體以10，OOOg在4°C下離心10分鐘，回收上清液。
[0114]純化
[0115]將經(jīng)菌體破碎的上清液用于Cosmosil His-accept (直徑2.5 X IOcm)柱層析。用pH為8.0的含有0.3M NaCl的50mM磷酸鹽緩沖液充分洗滌柱后，將pH為8.0的含有IOmM咪唑且含有0.3M NaCl的50mM磷酸鹽緩沖液等量施用至柱中。然后施用含有20mM咪唑的相同的緩沖液、含有30mM咪唑的相同的緩沖液、含有40mM咪唑的相同的緩沖液、含有50mM咪唑的相同的緩沖液、含有IOOmM咪唑的相同的緩沖液、含有500mM咪唑的相同的緩沖液，洗脫所吸附的蛋白質(zhì)。通過使用SDS-PAGE和抗His6抗體(Santa Cruz)的免疫印跡來確認各洗脫部分。其結(jié)果是，可在20-30mM咪唑洗脫部分中確認目標蛋白質(zhì)，由此將其作為EGFP-ColGCBD蛋白質(zhì)。圖1 (A)中示出ColGCBD，在序列表的序列序號9和10中示出EGFP-CoIGCBD的堿基序列和氨基酸序列。
[0116][實施例2]制備使用DsRed的探針
[0117][DsRed-ColHCBD 探針的制備]
[0118](I)DsRed-ColHCBD 的構(gòu)筑方法
[0119]以下，對于針對用DsRed標記的源自溶組織梭菌的膠原酶H的探針(DsRed-ColHCBD)的制備進行說明。
[0120]基于Ciyc 序列合成 2 個低聚 DNA:5’ -TCGACGAACAGAAACTGATTAGCGAAGAAGATCTGT-3’(序列序號 11)和 5’ -CTAGACAGATCTTCTTCGCTAATCAGTTTCTGTTCG-3’(序列序號 12)。將各低聚DNA溶解于TE中以達到100 μ Μ，混合10 μ I的低聚DNA、3 μ I的10ΧΤ4多核苷酸激酶緩沖液(Nippon Gene)、0.3 μ I的0.1M ΑΤΡ、2 μ I的Τ4多核苷酸激酶(20U，NipponGene) ,14.7μ I的Η20，在37°C下保溫I小時。從各反應(yīng)液中取出10 μ 1，進行混合。將混合的溶液在100°C下保持5分鐘后，原樣慢慢冷卻至室溫。將其作為插入溶液4。
[0121]向 10 μ I 的 pCold2 (TAKARA Bio)中加入 10 μ I 的 IOXTango 緩沖液(Fermentas公司制造)、I P I 的 Sail (Fermentas)、I μ I 的 XbaI (Fermentas)、28 μ I 的 H2O,在 37°C下反應(yīng)5小時。向反應(yīng)結(jié)束后的反應(yīng)液中加入150 μ I的TE，加入250 μ I的苯酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)溶液，充分攪拌后，在室溫下以16，OOOg離心5分鐘，回收上清液。向回收的上清液中加入20 μ 13Μ乙酸鈉溶液，加入450 μ I冷的乙醇。在冰上放置5分鐘后，以16，OOOg在4°C下離心5分鐘，回收沉淀。
[0122]將沉淀用冷的70%乙醇洗滌后、用40 μ I的H2O溶解。向其中加入5 μ I的10ΧΒΑΡ緩沖液(Τ0Υ0Β0公司制造)、5 μ I的細菌堿性磷酸酶(Τ0Υ0Β0)，在65°C下反應(yīng)I小時。將全部量的反應(yīng)液用于0.8%瓊脂糖電泳中。電泳結(jié)束后，用溴乙錠溶液染色，確認條帶的位置后，進行切出。從瓊脂糖中的回收通過使用Viogene公司制造的凝膠/PCR純化試劑盒進行。根據(jù)相同的方法，使用40 μ I的EB進行洗脫。將得到的洗脫液作為載體溶液4。將9 μ I的載體溶液4和I μ I的插入溶液4、10 μ I的Ligation convenience溶液(Nippon gene)混合，在16°C下保溫30分鐘。
[0123]使用該溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5CI。將經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌接種到添加了通過0.22 μ m無菌過濾器滅菌的氨芐青霉素以使其在通過高壓滅菌釜滅菌的2ml的LB培養(yǎng)基中的最終濃度為100μ g/ml的培養(yǎng)基中，在37°C下培養(yǎng)過夜后，以10，OOOg離心I分鐘，回收菌體。使用Viogene公司制造的mini plus質(zhì)粒DNA提取試劑盒從經(jīng)回收的菌體中回收質(zhì)粒。用100 μ I的EB進行洗脫。向其中的10 μ I質(zhì)粒溶液中混合2 μ I的10 X Tango緩沖液、I μ I的Xba1、7 μ I的H2O,在37°C下保持3小時。將反應(yīng)液用于0.8%瓊脂糖凝膠電泳、切出出現(xiàn)于4kbp附近的單獨條帶。使用Viogene公司制造的凝聚/PCR純化試劑盒進行回收。用50 μ I的EB進行洗脫。向10 μ I的洗脫液中加入10 μ I的Ligation convenience溶液，在16°C下保持30分鐘。再次使用該溶液，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci。將經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌接種到添加了通過0.22 μ m無菌過濾器滅菌的氨芐青霉素以使其在通過高壓滅菌釜滅菌的2ml的LB培養(yǎng)基中的最終濃度為lOOyg/ml的培養(yǎng)基中，在37°C下培養(yǎng)過夜后，以10，OOOg離心I分鐘，回收菌體。使用Viogene公司制造的mini plus質(zhì)粒DNA提取試劑盒從經(jīng)回收的菌體中回收質(zhì)粒。用100μ I的EB進行洗脫。向其中的10μ I中混合3μ I的10ΧΚ緩沖液(TAKARA Bio)U μ I 的 BamHI (TAKARA Bio)U μ I 的 EcoRI (TAKARA Β?ο)、15μ I 的H2O,在37°C下反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后，進行同等用量的苯酚/氯仿/異戊醇萃取，向得到的上層中加入3μ I的3Μ乙酸鈉，加入70 μ I冷的乙醇。在冰上放置5分鐘后，以16，OOOg在4°C下離心5分鐘，回收沉淀。將沉淀用冷的70%乙醇洗滌后，用40 μ I的H2O溶解。向其中加入5 μ I的10ΧΒΑΡ緩沖液(Τ0Υ0Β0)、5 μ I的細菌堿性磷酸酶(Τ0Υ0Β0)，在65°C下反應(yīng)1小時。將全部量的反應(yīng)液通過0.8%瓊脂糖電泳使用TAE緩沖液進行電泳，用溴乙錠溶液染色，確認條帶的位置后，進行切出。從瓊脂糖凝膠中的回收通過使用Viogene公司制造的凝膠/PCR純化試劑盒而進行。根據(jù)相同的方法，使用30 μ I的EB進行洗脫。將該洗脫液作為載體溶液5。
[0124]另一方面，將0.5 μ I 的 100 μ Μ5’ -GAATCTTCAGGATCCACTACTACTGCAGAAATAAAG-3’
(弓丨物 5:序列序號 13)、和 0.5 μ I 的 100 μ Μ5’ -AAGCAGAGATGAATTCTCTTCCTACTGAACCTTCTATATTAATTC-3’ (引物6:序列序號14)、1 μ I已經(jīng)克隆的包含編碼溶組織梭菌膠原酶H的基因全長的質(zhì)粒 pCold2-ColH-His、8 μ I 的 dNTP 混合物(TAKARABio)、1.0 μ I 的 PrimeStarHS (TAKARA Bio) ,20 μ I 的 5Μ betain、49y I 的 H2O 混合，進行 98°C、2min(第一階段)、98°C、IOsec (第二階段)、55°C、5sec (第三階段)、72°C、90sec (第四階段)，連續(xù)重復(fù)第二階段至第四階段35次。
[0125]將得到的PCR片段用Viogene公司制造的凝膠/PCR純化試劑盒進行純化。用50 μ I的EB進行洗脫。向所得的洗脫液中的10 μ I中混合3 μ I的IOXK緩沖液(TAKARABio)、l μ I 的 BamHI (TAKARA Bio)、I μ I 的 EcoRI (TAKARA Bio)、15 μ I 的 H2O,在 37°C下反應(yīng)過夜。將全部量的反應(yīng)液通過0.8%瓊脂糖電泳使用TAE緩沖液進行電泳,用溴乙錠溶液染色，確認條帶的位置后，進行切出。從瓊脂糖凝膠中的回收通過使用Viogene公司制造的凝膠/PCR純化試劑盒而進行。根據(jù)相同的方法，使用30μ I的EB進行洗脫。將該洗脫液作為插入溶液5。
[0126]向5 μ I的載體溶液5和5 μ I的插入溶液5中加入10 μ I的Ligationconvenience溶液,在16°C下反應(yīng)30分鐘。使用反應(yīng)結(jié)束后的Ligation溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci。將得到的轉(zhuǎn)化株接種到添加了通過0.22μπι無菌過濾器滅菌的氨芐青霉素以使其在通過高壓滅菌釜滅菌的2ml的LB培養(yǎng)基中的最終濃度為ΙΟΟμ g/ml的培養(yǎng)基中，在37°C下培養(yǎng)過夜后，以10，OOOg離心I分鐘， 回收菌體。使用Viogene公司制造的mini plus質(zhì)粒DNA提取試劑盒從經(jīng)回收的菌體中回收質(zhì)粒。用100 μ I的EB進行洗脫。向其中的10 μ I中混合 3 μ I 的 Tango 緩沖液、I μ I 的 SacI (Fermentas)、I μ I 的 KpnI (Fermentas)、15 μ I的Η20，在37°C下反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后，進行同等用量的苯酚/氯仿/異戊醇萃取，向得到的上層中加入3 μ I的3M乙酸鈉，加入70 μ I冷的乙醇。在冰上放置5分鐘后，以16，OOOg在4°C下離心5分鐘，回收沉淀。將沉淀用冷的70%乙醇洗滌后、用40 μ I的H2O溶解。向其中加入5 μ I的10ΧΒΑΡ緩沖液(Τ0Υ0Β0公司制造)、5 μ I的細菌堿性磷酸酶(Τ0Υ0Β0)，在65°C下反應(yīng)I小時。將全部量的反應(yīng)液通過0.8%瓊脂糖電泳使用TAE緩沖液進行電泳，用溴乙錠溶液染色，確認條帶的位置后，進行切出。從瓊脂糖凝膠中的回收通過使用Viogene公司制造的凝膠/PCR純化試劑盒進行。根據(jù)相同的方法，使用30μ I的EB進行洗脫。將該洗脫液作為載體溶液6。
[0127]將pDsRed-monomer (Clontech 公司制造)作為模板，將 5’ -GTACCGGTCGAGCTCATGGACAACACCGAGG-3’(引物 7:序列序號 15)、和 3’ -GTCGCGGCCGGTACCCTGGGAGCCGGAGTGGC-3’(引物8:序列序號16)作為引物、將20 μ I的5 XPrimeStar緩沖液(TAKARA Β?ο)、1.0μ I的 pDsRed-monomer (Clontech 公司制造)、0.5 μ I 的 100 μ M 引物 7、0.5 μ I 的 100 μ M 引物8、8.0 μ I 的 dNTP 混合物、1.0 μ I 的 PrimeStar HS,20 μ I 的 5Μ betain、49 μ I 的 H2O 混合，進行 98°C、2min (第一階段)、98°C、IOsec (第二階段)、55°C、5sec (第三階段)、72°C、90sec(第四階段)，連續(xù)重復(fù)第二階段至第四階段35次。
[0128]將得到的PCR片段用Viogene公司制造的凝膠/PCR純化試劑盒進行純化。用50 μ I的EB進行洗脫。向所得的洗脫液中的10 μ I中混合3 μ I的Tango緩沖液、I μ I的SacI (Fermentas)、I μ I 的 KpnI (Fermentas)、15 μ I 的 H2O,在 37°C下反應(yīng)過夜。將全部量的反應(yīng)液通過0.8%瓊脂糖電泳使用TAE緩沖液進行電泳，用溴乙錠溶液染色，確認條帶的位置后，進行切出。從瓊脂糖凝膠中的回收通過使用Viogene公司制造的凝膠/PCR純化試劑盒進行。根據(jù)相同的方法，使用30μ I的EB進行洗脫。將該洗脫液作為插入溶液6。
[0129]向5 μ I的載體溶液6和5 μ I的插入溶液6中加入10 μ I的Ligationconvenience溶液,在16°C下反應(yīng)30分鐘。使用反應(yīng)結(jié)束后的Ligation溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci。將得到的轉(zhuǎn)化株接種到添加了通過0.22μπι無菌過濾器滅菌的氨芐青霉素以使其在通過高壓滅菌釜滅菌的2ml的LB培養(yǎng)基中的最終濃度為ΙΟΟμ g/ml的培養(yǎng)基中，在37°C下培養(yǎng)過夜后，以10，OOOg離心I分鐘，回收菌體。使用Viogene公司制造的mini plus質(zhì)粒DNA提取試劑盒從經(jīng)回收的菌體中回收質(zhì)粒。用ΙΟΟμΙ的EB進行洗脫。使用所得到的洗脫液轉(zhuǎn)化大腸桿菌BLR (DE3) pLys株(Novagen公司制造)。將所得到的轉(zhuǎn)化株作為E.coli BLR/pCold2-DsRed-ColHCBD 株。
[0130](2) DsRed-ColHCBD 的純化
[0131]培養(yǎng)
[0132]將通過pCold2-DsRed-ColHCBD轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BLR株接種到添加了通過0.25 μ m無菌過濾器滅菌的氨芐青霉素以使其在通過高壓滅菌釜滅菌的2ml的LB培養(yǎng)基中的最終濃度為IOOy g/ml的培養(yǎng)基中，在37°C下振蕩培養(yǎng)過夜，將其作為預(yù)培養(yǎng)液。將預(yù)培養(yǎng)液接種到在500ml容積的帶有擋板的錐形燒瓶中準備的170ml相同培養(yǎng)基中使得含量為1000分之1，在37°C下振蕩培養(yǎng)直至OD66tl為0.6?1.0左右，添加通過0.25 μ m無菌過濾器滅菌的IPTG使得最終濃度為ImM，在15°C下振蕩培養(yǎng)24小時。
[0133]回收
[0134]培養(yǎng)結(jié)束后，以10，OOOg離心5分鐘來回收菌體。將回收的菌體懸浮于與培養(yǎng)液等量的pH為8.0的含有0.3M NaCl的50mM磷酸鹽緩沖液中，再次以10，OOOg離心5分鐘來回收菌體。再重復(fù)同樣的操作兩遍,洗滌菌體。將經(jīng)洗滌的菌體懸浮于25ml同樣的緩沖液中后，在200W的輸出下在I分鐘內(nèi)，在冰上通過超聲波破碎機破碎菌體。將破碎結(jié)束后的菌體以10，OOOg在4°C下離心10分鐘，回收上清液。
[0135]純化
[0136]將經(jīng)菌體破碎的上清液用于Cosmosil His-accept (直徑2.5 X IOcm)柱層析。用pH為8.0的含有0.3M NaCl的50mM磷酸鹽緩沖液充分洗滌柱后，將pH為8.0的含有IOmM咪唑并含有0.3M NaCl的50mM磷酸鹽緩沖液等量施用至柱中。然后施用含有20mM咪唑的相同的緩沖液、含有30mM咪唑的相同的緩沖液、含有40mM咪唑的相同的緩沖液、含有50mM咪唑的相同的緩沖液、含有IOOmM咪唑的相同的緩沖液、含有500mM咪唑的相同的緩沖液，洗脫所吸附的蛋白質(zhì)。通過使用SDS-PAGE和抗His6抗體(Santa Cruz)的免疫印跡來確認各洗脫部分。其結(jié)果是，可在20-30mM咪唑洗脫部分中確認目標蛋白質(zhì)，由此將其作為DsRed-ColHCBD蛋白質(zhì)。圖1 (B)中示出CoIHCBD構(gòu)造，序列表的序列序號17和18中示出DsRed-ColHCBD的堿基序列和氨基酸序列。
[0137][實施例3]制備使用tdTomato的探針
[0138](I) tdTomatoColH CBD DNA 的制備和表達載體 pColdll 的插入
[0139]tdTomato基因的模版DNA使用ptdTomato載體(Clontech公司)。在用于DNA擴增的PCR中，N末端的引物使用在tdTomato之前含有Nde I識別位點的序列34堿基(TomatoF)。C末端的引物使用在tdTomato之后具有代替終止密碼子的BamHI識別位點的34bp (TomatoR)的互補鏈序列。各引物的序列在以下記載。
[0140]引物序列:
[0141]TomatoF:5，-CCGGTCGCCcatATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGG-3’(序列序號 19)
[0142]TomatoR:5，-AGAGTCGCGGCGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCA-3’(序列序號 20)
[0143]然后，將插入了DsRed-ColH CBD DNA 的pCold II 用限制酶BamH I 和Xba I 處理，得到約IOOObp的Col H CBD DNA片段。
[0144]將通過PCR制備的約1500bp的tdTomato DNA用Nde I, BamHI進行處理，與ColHCBD DNA—起插入用Nde I，Xba I處理過的表達載體pCold II中。通過菌落PCR和序列分析，確認構(gòu)筑了所設(shè)計的質(zhì)粒。另外，DNA序列分析委托Operon Biotechnologies公司。當(dāng)將tdTomatoColH CBD DNA插入pCold II時，表達為在N末端具有His-tag序列的蛋白質(zhì)(圖2)。也含有這些氨基酸序列的所設(shè)計的tdTomatoColH CBD為726殘基(分子量82k)。
[0145](2)表達囷的制備和蛋白質(zhì)表達誘導(dǎo)
[0146]用通過上述方法構(gòu)筑的tdTomatoColH CBD表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BLR。轉(zhuǎn)化使用一般的熱休克法。在含有100 μ g/ml的氨芐青霉素(Amp)的LB板上劃線，在37°C下培養(yǎng)過夜。將已經(jīng)生成的菌落在LB/Amp液體培養(yǎng)基中作次培養(yǎng)，在37°C下培養(yǎng)直到0D_達到0.5-0.7。將培養(yǎng)液在冰上冷卻30分鐘后，加入異丙基-β -D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)以使?jié)舛葹?.1mM，在15°C下繼續(xù)培養(yǎng)24小時，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達。
[0147]將24小時后的大腸桿菌培養(yǎng)液離心，回收菌體。將菌體用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌兩次后，再次懸浮于PBS中，加入苯基甲烷磺酰氟(PMSF)以使?jié)舛葹?.1mM，一邊用冰冷卻一邊通過超聲波破碎菌體。將該菌體破碎液在12，OOOrpm下離心20分鐘，將沉淀與上清液分離，通過SDS-PAGE來確認在可溶性部分中目標蛋白質(zhì)的表達。向大腸桿菌的培養(yǎng)液中加入二甲基亞砜(DMSO)，使其達到8%，在-80°C下冷凍保存。將其作為tdTomatoColH CBD表達用的凍結(jié)儲用菌體。
[0148](3) tdTomatoColH CBD 的純化
[0149]向用300mM NaCl/50mM磷酸鈉緩沖液(pH8.0)平衡的N1-NTA瓊脂糖柱(Φ 2.0cmx5.0cm、柱容積15ml、QIAGEN公司)中，施用經(jīng)平衡緩沖液將菌體破碎后的可溶性部分稀釋3倍的溶液。用平衡緩沖液沖洗未吸附于載體的直接流過部分后，用含有50mM、200mM、500mM咪唑的緩沖液洗脫。進行各咪唑濃度部分的SDS-PAGE，為了確認在200mM咪唑洗脫部分中tdTomatoColH CBD被洗脫(圖3)，回收該部分，對50mM Tris-HCl (ρΗ8.0)進行透析。
[0150]將透析后的溶液施用于陰離子交換柱(HiTrap DEAE FF, C.V.=Iml, GE HealthCare公司)，通過0_400mM的線性NaCl濃度梯度進行洗脫。通過SDS-PAGE從洗脫部分中回收存在tdTomatoColH CBD的部分(圖4),使用Amicon30k (Millipore公司)通過超濾進行濃縮直至5mg/ml。將其作為純化tdTomatoColH CBD。
[0151](4)熒光光譜測量
[0152]tdTomato 具有與 DsRed 相同的激發(fā)(554nm)、突光(581nm)波長。tdTomatoColHCBD純化酶溶液的激發(fā)、熒光光譜通過使用熒光分光光度計F-2500 (日立高新技術(shù)公司)而測量(圖5)。從光譜確認，沒有發(fā)生由于表達為與CDB的融合蛋白質(zhì)而導(dǎo)致的熒光波長移位或淬滅。另外，與使用DsRed的情況相比較，確認發(fā)出更強的熒光。
[0153][實施例4]制備使用熒光素酶的探針
[0154][PGV_Col G CBD和PGV-Col H CBD (熒光素酶-膠原結(jié)合域融合蛋白質(zhì))探針的制備方法]
[0155](l)PGV_Col G CBD 的構(gòu)筑方法
[0156]I)突光素酶-膠原結(jié)合域融合蛋白質(zhì)DNA的制備、向表達載體pColdl中的插入[0157]熒光素酶基因的模版DNA使用Pica基因?qū)φ蛰d體(PGV_對照)的熒光素酶編碼區(qū)域(PGV)的序列。在用于DNA擴增的PCR中，N末端的弓I物使用在PGV之前含有Nde I識別位點(CATATG)的序列27堿基(PGVctrl_Nterm)。C末端的引物使用在PGV之后具有BamHI識別位點(GGATCC)代替終止密碼子的30bp (PGV_CF_r)的互補鏈序列。
[0158]膠原酶(Col) G、H的膠原結(jié)合域(CBD)使用Col G、H的全長DNA插入pCold III中的質(zhì)粒作為模版DNA。用于DNA擴增的PCR使用在CBD的N末端中加入BamH I識別位點的35堿基(ColG_Nterm，ColH_Nterm)的DNA作為N末端的引物。C末端的引物分別使用在ColG CBD之后依次加入Str印-tag的氨基酸序列、Xba I識別位點(TCTAGA)的序列(ColG_CtermStrep_comp)、和在Col H CBD之后依次加入FLAG-tag的氨基酸序列、Xba I識別位點的序列(ColH_CtermFLAG_comp)的互補鏈49堿基的DNA (圖6)。
[0159]將通過PCR制備的約1，700bp的PGV DNA用Nde I, BamHI進行處理，將約1，OOObp的CBD DNA用BamH I，Xba I進行處理，插入用Ndel，Xba I處理的表達載體pCold I中(圖7)。
[0160]通過菌落PCR和序列分析，確認構(gòu)筑了所設(shè)計的質(zhì)粒。另外，DNA序列分析委托Operon Biotechnologies公司完成。當(dāng)DNA插入pCold I時,表達為在N末端具有His-tag和Factor Xa的識別序列的蛋白質(zhì)。也含有這些氨基酸序列的所設(shè)計的融合蛋白質(zhì)的大小為，PGV Col G CBD 為 911 殘基(分子量 101k)，PGV Col H CBD 為 883 殘基(分子量 98k)。
[0161]2)表達囷的制備和蛋白質(zhì)表達誘導(dǎo)
[0162]用插入PGV和Col G CBD或Col H CBD的DNA的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta2(DE3)。轉(zhuǎn)化使用一般的熱休克法。通過該轉(zhuǎn)化觀察到熒光素酶-膠原結(jié)合域融合蛋白質(zhì)表達誘導(dǎo)。
[0163]在含有100 μ g/ml的氨節(jié)青霉素(Amp)和34 μ g/ml的氯霉素(Cm)的LB板上劃線，在37 °C下培養(yǎng)過夜。將已經(jīng)長成的菌落在LB/Amp/Cm液體培養(yǎng)基中作次培養(yǎng)，在37 °C下培養(yǎng)直到OD6tltl達到0.5-0.7。將培養(yǎng)液在冰上冷卻30分鐘后，加入異丙基-β -D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)以使?jié)舛葹?.1mM，在15°C下繼續(xù)培養(yǎng)48小時，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達。
[0164]將48小時后的大腸桿菌培養(yǎng)液離心，回收菌體。將菌體用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌兩次后，再次懸浮于PBS中，加入苯基甲烷磺酰氟(PMSF)達到0.1mM，由此在最大強度下、以2秒間隔脈沖、在15分鐘條件下進行超聲波破碎。將該菌體破碎液在12，OOOrpm下離心20分鐘，將沉淀與上清液分離進行SDS-PAGE，來確認蛋白質(zhì)表達。SDS-PAGE的結(jié)果是，確認了被認為是PGV_Col G CBD (IOlk)和PGV_Col H CBD (98k)的大小的蛋白質(zhì)條帶(圖8)。該條帶也可通過使用抗His-tag抗體的免疫印跡法檢測出。向可確認表達目標蛋白質(zhì)的大腸桿菌的培養(yǎng)液中加入二甲基亞砜(DMSO)達到8%，在-80°C下冷凍保存。將其作為PGV_Col G CBD或PGV_Col H CBD的凍結(jié)儲用菌體。
[0165]3)熒光素酶活性的確認
[0166]確認在轉(zhuǎn)化株的菌體破碎后的上清液(粗品)中，存在具有熒光素酶活性的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中所使用的熒光素酶顯示出在550nm處具有最大值的發(fā)光光譜。將5OmMTris-HCl (pH8.0)與粗品混合后，加入底物溶液(Tripluc熒光素酶檢測試劑，東洋紡)，立即隨時間測定550nm的發(fā)光。熒光素酶的發(fā)光在加入底物溶液之后立即顯示出最大值，其后不斷衰減。測定發(fā)光的衰減直至達到幾乎恒定的時間，其后還測定發(fā)光光譜(圖9)。在作為與CBD的融合蛋白質(zhì)表達時，也示出了與單獨的PGV相同的發(fā)光。在剛破碎后得到的粗品中，觀察到550nm強的發(fā)光。在_80°C冷凍保存的粗品中，發(fā)光漸漸變?nèi)?，但是確認與在4°C或_20°C下保存的粗品相比并沒有失活。
[0167](2)純化方法
[0168]向用300mM NaCl/50mM磷酸鈉緩沖液(pH8.0)平衡的N1-NTA瓊脂糖柱(直徑2.0cmx5.0cm、柱容積15ml、QIAGEN公司)中，施用經(jīng)平衡緩沖液將菌體破碎后的粗品稀釋10倍的溶液。用平衡緩沖液沖洗未吸附于載體的直接流過部分后，用含有50mM、200mM、500mM咪唑的緩沖液洗脫。通過SDS-PAGE確認各咪唑濃度部分，200mM咪唑洗脫部分作為純化PGV_ColG CBD 或 PGV_ColH CBD (圖 10)。
[0169][實施例5]與胰臟組織的結(jié)合確認
[0170]將懸浮于100 μ I的50mM Tris_HCl/5mM CaCl2 (pH7.5)中的豬的胰臟組織片與100 μ I純化酶溶液混合，在37°C下培養(yǎng)30分鐘后，進行離心并將沉淀與上清液(sup.1)分離。將得到的沉淀懸浮于50mM乙酸鹽緩沖液(pH5.0)中，在室溫下培養(yǎng)20分鐘后，進行離心并將沉淀與上清液(sup.2)分離。進行所得到的沉淀和上清液的SDS-PAGE，確認tdTomatoColH CBD與胰臟組織的結(jié)合(圖11)。
[0171]SDS-PAGE的結(jié)果是，在沉淀中觀察到tdTomatoColH CBD條帶，確認了與胰臟組織的結(jié)合。與胰臟組織結(jié)合的tdTomatoColH CBD分布于沉淀中，其他未結(jié)合的部分分布于sup.1中。另外,在sup.2中沒有檢測出條帶，因此確認tdTomatoColH CBD即使在酸性pH的條件下，也與膠原纖維結(jié)合。
[0172][實施例6]使用探針的生物體組織成分分析法
[0173][生物體組成成分的測定方法]
[0174]說明本發(fā)明的生物體組成成分的測定方法。
[0175](I)通過EGFP-ColGCBD和DsRED-CoIH進行的生物體組成成分的測定方法
[0176]從去血死亡后的豬上取出胰臟，將切成5mm2的胰臟片段包埋于OCT化合物(Sakura Finetek公司制造)中，用液氮冷凍。其后，在低溫恒溫器CM3050S ( 7 yS力公司制造)中，切片成厚度為8μπι，粘接于顯微鏡用標本(松浪硝子工業(yè)有限公司制造)上。浸于用不含鈣離子和鎂離子的磷酸鹽緩沖溶液(PBS (-))調(diào)整至10%的福爾馬林溶液(WAK0公司制造)中，在室溫下培養(yǎng)10分鐘，其后干燥30分鐘。向玻璃制的池中加入PBS(-)，在其中在室溫下培養(yǎng)5分鐘。將顯微鏡用標本留在潤濕箱中以便無需注意干燥，在切片上浸泡200 μ I EGFP-ColGCBD溶液，在37°C下培養(yǎng)I小時。培養(yǎng)后，在PBS(-)中洗滌5分鐘。將顯微鏡用標本用加入洗滌瓶中的PBS (-)沖洗，用VECT0RSHELD (Vector公司制造)密封。其后，用熒光顯微鏡B10LEV0 BZ9000 (々一工> 7公司制造)觀察，進行拍照。
[0177](2)測定結(jié)果
[0178]結(jié)果示于圖12中。與陰性對照相比，用EGFP-ColGCBD染色的組織良好地染色了組織存在的區(qū)域。
[0179][實施例7]組織切片的測定方法
[0180](I)觀察方法
[0181]將固定有在-80°C下保存的大鼠胰臟組織切片的顯微鏡用標本在室溫下浸泡于5mM CaCl2/TBS中10分鐘，用Mill1-Q洗滌。作為用于抑制非特異性結(jié)合的阻斷，滴加100 μ 12%肌紅蛋白(Myb)，在37 °C下預(yù)培養(yǎng)30分鐘，用Mi 11 i_Q洗滌。將40 μ I蛋白質(zhì)(GFP對照，GFP ColG CBD, tdTomato 對照，tdTomatoColH CBD)溶液和 40 μ 12%Myb 混合后，滴加在組織切片上，在37°C下培養(yǎng)30分鐘。各蛋白質(zhì)溶液的濃度調(diào)整為GFP對照10mg/ml、GFPColG CBD10mg/ml、tdTomato 對照 5mg/ml、tdTomatoColH CBD5mg/ml。
[0182]在室溫下浸于5mM CaCl2/TBS10分鐘，用Mill1-Q洗滌。重復(fù)該過程2遍后，使用熒光顯微鏡B10REV0 BZ-9000 (々一工> ^公司)以200倍倍率進行觀察，選擇幾個合適的區(qū)域、以0.5秒的曝光時間拍攝照片。
[0183]使用顯微鏡自帶軟件的測量功能，將所拍攝照片的全部亮度直方圖化。在GFP對照和GFP ColG CBD中只提取了綠色熒光的亮度，在tdTomato對照和tdTomatoColH CBD中只提取了紅色熒光的亮度。
[0184]由該直方圖，算出GFP 對照和 GFP ColG CBDadTomato 對照和 tdTomatoColH CBD的亮度平均值的差值(delta平均亮度)，對每個系統(tǒng)進行總結(jié)。已顯示出，所算出的delta平均亮度的數(shù)值越大，CBD與組織的結(jié)合越多，顯示出與對照的熒光強度的差別明顯。對該deIta平均亮度進行比較，確認了根據(jù)各系統(tǒng)、周齡，CoIG CBD和CoIH CBD對胰臟組織結(jié)合的差異。
[0185](2)大鼠胰島分離法
[0186]基于美國國家衛(wèi)生研究所發(fā)行的《實驗室動物護理和使用指南(1996年修訂版)》(“Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”)進行動物試驗。使用體重239-268g 的雄性 Lewis 大鼠(Slc>Japan)、體重 255_301g 的雄性 SD 大鼠(Slc>Japan)、體重 197_231g 的雄性 Wistar-Furth 大鼠(Sic、Japan)。
[0187]在取出胰臟前，比膽總管更中性的蛋白酶嗜熱菌蛋白酶(0.322mg)不發(fā)生變化而將重組型的高純度產(chǎn)品的Col G(5.46mg)和Col H(2.02mg)設(shè)定為酶含量標準比例(H/G比=0.37)，設(shè)定相對于其10倍的組(Col G (4.96mg),Col H (18.34mg),嗜熱菌蛋白酶(0.322mg), (Η/G 比=3.70)、1/10 倍的組(Col G (5.51mg)，Col H (0.20mg),嗜熱菌蛋白酶(0.322mg), (Η/G比=0.04)、Col G完全不含的組、Col H完全不含的組，注入冷的Hanks’平衡鹽溶液(HBSS)，使胰臟擴張。在加入IOmL的HBSS后，在37°C下通過14分鐘的溫水浴使胰臟消化。進行使用連續(xù) Histopaque-1119 (Sigma Diagnostics, St.Louis, MO, USA)和Lymphoprep?(NycomedPharma AS, Oslo, Norway)的濃度梯度離心，收集胰島存在的層。在通過胰島分離操作所得到的組織中進行二苯基硫卡巴腙(Wako，Osaka，Japan)染色，識別胰島和外分泌腺或?qū)Ч艿确且葝u組織，在顯微鏡的直接觀察下計量各自的收率。分離胰島的收率用胰島當(dāng)量(IEQ)表示(IIEQ根據(jù)國際標準定義為，相當(dāng)于I個直徑150 μ m的胰島的大小)。
[0188](3)實施結(jié)果
[0189]I)各種大鼠組織切片中GFP ColG CBD和tdTomatoColH CBD的熒光亮度測定結(jié)果
[0190]各種大鼠中ColG和ColH的2種探針的熒光亮度及其比例記載于圖13和表1中。
[0191]表1
【權(quán)利要求】
1.生物體組織的分析方法，其特征在于，對于與特定的生物體成分結(jié)合的2種以上的蛋白質(zhì)，將分別含有所述生物體成分結(jié)合域的2種以上的探針用于經(jīng)分離的生物體組織上，分析所述各探針對于生物體組織的結(jié)合量。
2.權(quán)利要求1記載的方法，其特征在于，通過選自熒光分子、發(fā)光分子、和包括正電子核素的放射性同位素的可視化分子來標記探針。
3.權(quán)利要求1或2記載的方法，其中作為可視化分子包括選自GFP、EGFP,YFP、BFP、CFP, DsRED, tdTomato、和RFP的熒光分子、和/或熒光素酶蛋白質(zhì)。
4.權(quán)利要求1-3中任一項記載的方法，其中生物體成分結(jié)合域和可視化分子構(gòu)成融合蛋白質(zhì)。
5.權(quán)利要求1-4中任一項記載的方法，其中生物體成分結(jié)合域為酶或酶的一部分。
6.權(quán)利要求1-4中任一項記載的方法，其中生物體成分結(jié)合域為蛋白質(zhì)分解酶的膠原結(jié)合域。
7.權(quán)利要求1-6中任一項記載的方法，其特征在于，2種以上的探針分別或同時地作用于生物體組織上，以及分別或同時地測定各探針的結(jié)合量。
8.權(quán)利要求1-7中任一項記載的方法，其特征在于，2種以上的探針同時地作用于生物體組織上，并同時地測定各探針的結(jié)合量。
9.一種從生物體組織分離細胞或細胞群的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求1-8中任一項記載的方法分析生物體組織，基于所述分析結(jié)果確定酶的用量比例，將該用量比例的酶施用于生物體組織，從而分離細胞或細胞群。
10.探針組，其為由對于與特定的生物體成分結(jié)合的2種以上的蛋白質(zhì)、分別含有所述生物體成分結(jié)合域的2種以上的探針組成的生物體組織分析用探針組，其特征在于，各探針含有選自各自不同的熒光分子、發(fā)光分子、和包括正電子核素的放射性同位素的可視化分子。
11.權(quán)利要求10記載的探針組，作為可視化分子包括選自GFP、EGFP,YFP、BFP、CFP、DsRED, tdTomato、和RFP的熒光蛋白質(zhì)和/或熒光素酶蛋白質(zhì)。
12.權(quán)利要求10或11記載的探針組，其中所述熒光素酶蛋白質(zhì)具有與野生型熒光素酶不同的峰值波長和發(fā)光強度。
13.權(quán)利要求10-12中任一項記載的探針組，其中生物體成分結(jié)合域和可視化分子構(gòu)成融合蛋白質(zhì)。
14.權(quán)利要求10-13中任一項記載的方法，其中生物體成分結(jié)合域為蛋白質(zhì)分解酶的膠原結(jié)合域。
15.權(quán)利要求14記載的探針組,其中膠原結(jié)合域為選自源自梭菌屬(Clostridium)的膠原酶的膠原酶的膠原結(jié)合域。
16.權(quán)利要求15記載的探針組，其中膠原結(jié)合域為源自溶組織梭菌(Clostridiumhistryticum)的膠原酶G和膠原酶H的膠原結(jié)合域。
17.權(quán)利要求16記載的探針組，其中膠原結(jié)合域為含有序列序號I所示的氨基酸序列、序列序號2所示的氨基酸序列、或其部分序列的膠原結(jié)合域。
18.權(quán)利要求10-17中任一項記載的探針組，其中熒光素酶蛋白質(zhì)與選自GFP、EGFP,YFP、BFP、CFP、DsRED, tdTomato、和RFP的熒光分子通過連接基團連接。
19.權(quán)利要求10-18中任一項記載的探針組，其中所述探針包含生物體成分結(jié)合域的1-20次重復(fù)。
20.生物體組織分離用試劑盒，包含權(quán)利要求10-19中任一項記載的探針組和酶。
【文檔編號】C12N15/09GK103562719SQ201280013612
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2012年3月15日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月16日
【發(fā)明者】山形洋平, 后藤昌史, 渡邊君子 申請人:國立大學(xué)法人東北大學(xué), 明治制果藥業(yè)株式會社