逆向β氧化途徑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及使用已賦予形成逆向β氧化途徑的新用途的基因進行工程化以產(chǎn)生各種化學(xué)品的重組微生物。一般而言，通過修飾所需許多循環(huán)的各種調(diào)節(jié)點逆向表達(dá)和驅(qū)動β氧化循環(huán)，然后通過終止酶的作用來將CoA硫酯中間體轉(zhuǎn)化成有用產(chǎn)物。
【專利說明】逆向β氧化途徑
[0001]在先相關(guān)申請
[0002]本申請要求2011年2月7日提交的61/440，192的優(yōu)先權(quán)，其通過引用方式全部并入本文中。
[0003]聯(lián)邦政府贊助研究聲明
[0004]本發(fā)明是在國家科學(xué)基金會(National Science Foundation)授予的CBET-1134541和CBET-1067565的政府贊助下進行。政府對本發(fā)明具有某些權(quán)力。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005]本發(fā)明涉及使用已賦予形成逆向β氧化途徑的新用途的基因進行工程化以產(chǎn)生醇類、羧酸類、烷烴類或烯烴類的重組微生物。
[0006]一般而言，逆向驅(qū)動所需許多循環(huán)的β氧化循環(huán)，然后通過不同類型的終止酶的作用能夠?qū)oA硫酯中間體轉(zhuǎn)化成有用產(chǎn)物:i)硫酯酶、或酰基-CoA:乙?；?CoA轉(zhuǎn)移酶、或磷酸轉(zhuǎn)?；负汪人狨ゼっ?其形成羧酸類)或者ii)形成醇的輔酶-A硫酯還原酶(其制備醇類)或者iii)形成醛的CoA硫酯還原酶和醇脫氫酶(其一起形成醇類)或者iv)形成醛的CoA硫酯還原酶和醛脫羰基酶(其一起形成烷烴類或端烯烴類)或者V)形成鏈烯烴的酶(例如OleA、OleB、OleC、OleD,其一起形成內(nèi)烯烴類或端烯烴類或三烯類或者烯醇類)。
[0007]羧酸類包括不同鏈長的單羧酸類、β -酮酸類、β -羥基酸類和反式- Λ2-脂肪酸。醇類包括不同鏈長的正醇類、β -酮醇類、1，3- 二醇類和反式-Λ2-醇類。烷烴類包括不同鏈長的脂肪族烷烴類。脂肪族烯烴類(也稱為鏈烯烴類)包括端鏈烯烴類、內(nèi)鏈烯烴類、三烯類和烯醇類。
【背景技術(shù)】
[0008]近年來，對諸如乙醇的可再 生燃料的生物制備進行了許多嘗試。然而，乙醇并不是理想的燃料，有許多問題，例如高吸濕性、高蒸汽壓和低能量密度。這些質(zhì)量問題使得乙醇不能與液體運輸燃料的儲存、分配和使用中所使用的現(xiàn)有設(shè)施相容。
[0009]較長鏈(C ^ 4)醇類(例如正丁醇)、脂肪酸甲酯(FAME)和烴類(烷烴類和烯烴類)提供較乙醇多種優(yōu)勢，包括吸濕性降低、揮發(fā)性降低和更高的能量密度。這些質(zhì)量優(yōu)勢使得正丁醇和其它高級醇類與目前儲存、分配和使用的基礎(chǔ)設(shè)施更加相容。
[0010]上述長鏈染料和化學(xué)品由短鏈代謝中間體通過需要延長碳鏈的途徑來生成。然而，迄今為止生物上的成就并不令人滿意，特別是引入非天然基因來驅(qū)動較長鏈分子的合成。
[0011]因此，本領(lǐng)域需要更好的制備較長鏈(C34)燃料(例如醇類、脂肪酸甲酯、FAME和烴類)的生物方法，它比目前可獲得的方法更加有效和實惠。理想的方法也可生產(chǎn)能夠用作其它工業(yè)的原料的化學(xué)品，例如羧酸類和醇類。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0012]我們已經(jīng)開發(fā)出以產(chǎn)生諸如醇類、羧酸類、烷烴類和烯烴類的化學(xué)品的工程化微生物的替代途徑，其將β -氧化循環(huán)的功能性逆轉(zhuǎn)用作合成具有各種鏈長度和官能度的醇類和羧酸類的代謝平臺(圖1Α)。
[0013]該途徑使用輔酶-A(CoA)硫酯中間體操作以及直接使用?；溠娱L的乙酰基-CoA (而不是首先需要對丙二?；?CoA進行ATP-依賴性激活)，其特征在于能夠在最大碳和能量效率下合成產(chǎn)物。在大腸桿菌中工程化β_氧化循環(huán)的逆轉(zhuǎn)以及聯(lián)合內(nèi)源性脫氫酶和硫酯酶使用以合成正醇類、脂肪酸和3-羥基-、3-酮基-和反式-Λ 2-羧酸類。
[0014]通過在比之前所報道的更高效率下產(chǎn)生更長鏈的直鏈正醇類(C ^ 4)和細(xì)胞外長鏈脂肪酸(OlO)來證實工程化途徑的更優(yōu)的性質(zhì)。β-氧化、醛/醇脫氫酶、硫酯酶、脫羧酶的普遍存在的性質(zhì)具有使這些產(chǎn)物能夠在其它工業(yè)有機體中有效合成的潛能，例如釀酒酵母、運動發(fā)酵單胞菌、枯草桿菌等。
[0015]盡管本文中我們已經(jīng)例證正丁醇、4-C3-羥基_、3-酮基-和反式-Λ 2-羧酸類、較長鏈(CM)正醇類和長鏈(OlO)脂肪酸，我們也已經(jīng)證實通過明智使用起始材料和酶，取決于在工程化微生物中表達(dá)何種終止酶，我們也能夠制備其它羧酸類、醇類、烷烴類和烯烴類。
[0016]我們已經(jīng)工程化在大腸桿菌中制備正丁醇的氧化循環(huán)的一次逆轉(zhuǎn)，據(jù)認(rèn)為在沒有外源性基因下該生物體不能夠制備該醇。該途徑，本文稱為“內(nèi)源性”或“天然”基因途徑，并不是基于來自天然生成正丁醇的生物體的轉(zhuǎn)移途徑，而是通過途徑操作賦予天然基因和蛋白產(chǎn)生丁醇的新用途。
[0017]通常，驅(qū)動逆轉(zhuǎn)的β_氧化循環(huán)的包括以下三步驟:1)在缺乏它的天然誘導(dǎo)底物(即缺乏脂肪酸)和存在非脂肪酸碳源(例如存在葡萄糖)下功能性表達(dá)β氧化循環(huán)；2)在逆向/生物合成方向(如與它的天然分解`代謝/降解方向相反)中驅(qū)動β氧化循環(huán)；以及3)表達(dá)在β氧化循環(huán)中用作合適中間體的終止酶以制備所需產(chǎn)物。
[0018]更詳細(xì)而言，重組工程化為:
[0019]I)在缺乏天然誘導(dǎo)底物(即缺乏脂肪酸)和存在非脂肪酸碳源(例如存在葡萄糖)下表達(dá)氧化循環(huán):為了表達(dá)氧化循環(huán)，首先i)突變fadR和atoC(c)使能夠在缺乏脂肪酸下表達(dá)編碼β氧化酶的基因；ii)arcA敲除(AarcA)使能夠在厭氧/微好氧條件下表達(dá)編碼β氧化循環(huán)酶/蛋白的基因(在制備燃料和化學(xué)品中使用微好氧/厭氧條件，但導(dǎo)致通過ArcA表達(dá)β氧化基因);以及iii)使用cAMP-依賴性突變體(crp*)來替代天然環(huán)狀A(yù)MP受體蛋白(crp)在存在抑制降解產(chǎn)物的碳源，例如葡萄糖下使能夠表達(dá)編碼β氧化循環(huán)酶/蛋白的基因(葡萄糖是在發(fā)酵過程中最廣泛使用的碳源并且抑制β氧化基因)。
[0020]2)在逆向/生物合成方向(如與它的天然分解代謝/降解方向相反)中驅(qū)動β氧化循環(huán)。除了功能性表達(dá)β_氧化循環(huán)之外，我們提議以下改變方式來達(dá)到該途徑逆向操作:iv)微好氧/厭氧條件的使用通過三羧酸類(TCA)循環(huán)抑制/最小化乙酰基-CoA的代謝以及制備在逆向/生物合成方向中驅(qū)動β氧化循環(huán)可獲得的乙?；?CoA ;v)pta(或ackA或兩者)、poxB、adhE、yqhD和eutE敲除阻斷/降低乙酸鹽(Δ pta或AackA和poxB)和乙醇(Λ adhE、AyqhD和AeutE)由乙?；?CoA合成，因而制備可用于在逆向/生物合成方向中驅(qū)動β氧化循環(huán)的乙?；?CoA ；vi)硫解酶的過表達(dá)，在β氧化循環(huán)的逆轉(zhuǎn)中第一步使能夠引導(dǎo)乙?；?CoA至該途徑內(nèi)，因此在逆向方向中進行它的操作；vii) IdhA、mgsA和frdA敲除分別阻斷/減少乳酸鹽(Δ IdhA和AmgsA)和琥拍酸鹽(AfrdA)由丙酮酸鹽和磷酸烯醇丙酮酸合成，制備用于合成乙?；?CoA的更多的磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸鹽，因而制備可用于在逆向/生物合成方向中驅(qū)動β氧化循環(huán)的乙?；?CoA;viii)丙酮酸鹽:黃素氧還蛋白氧化還原酶(ydbK)和?；?CoA脫氫酶(ydiO和ydiQRST)的過表達(dá)使能夠偶聯(lián)丙酮酸鹽氧化(丙酮酸鹽一乙酰基-COA+C02+Fd,ed)和反式-Λ2-烯?；?CoA還原(反式_Δ2-烯酸基-CoA+FdMd—酸基-CoA),因此在逆向方向中驅(qū)動β氧化。
[0021]3)將CoA硫酯中間體轉(zhuǎn)化成所需終產(chǎn)物。一般而言，存在若干種從逆向氧化循環(huán)中分離反應(yīng)中間體以及生成所需終產(chǎn)物的終止酶(圖1Α):
[0022]i) CoA硫酯水解酶/硫酯酶、或酰基-CoA:乙?；?Cok轉(zhuǎn)移酶、或磷酸轉(zhuǎn)?；负陀糜隰人犷惖聂人狨ゼっ?即短、中和長鏈單羧酸類、β_酮酸類、β_羥基酸類、反式-Δ 2-脂肪酸)；
[0023]ii)用于醇類的形成醇的CoA硫酯還原酶(即短、中和長鏈正醇類、酮醇類、1，3-二醇類、反式-Λ2-醇類)；
[0024]iii)形成醛的CoA硫酯還原酶和醇脫氫酶，其一起形成醇類(即短、中和長鏈正醇類、β -酮醇類、1，3- 二醇類、反式-Λ2-醇類)。根據(jù)需要，取決于所需終產(chǎn)物，能夠過表達(dá)一種或多種這些終止酶。
[0025]iv)形成醛的CoA硫酯還原酶和醛脫羰基酶(其一起形成不同鏈長的烷烴類或端烯烴類)；以及
[0026]V)形成鏈烯烴的酶(其一起形成脂肪族內(nèi)烯烴類或端烯烴類或三烯類或者烯醇類)。
[0027]根據(jù)需要，對于特定產(chǎn)物，終止酶能夠為天然或非天然，但優(yōu)選逆向β氧化循環(huán)使用天然基因。
[0028]4.調(diào)節(jié)產(chǎn)物鏈長。硫酯中間體的鏈長決定終產(chǎn)物的長度，以及使用具有所需鏈長特異性的合適終止酶能夠控制。此外，通過降低或增加具有所需鏈長特異性的硫解酶的活性能夠抑制或促進鏈延長。這兩種方法能夠一起或單獨使用。例如:
[0029]i)fadA、fadI和paaj的敲除以避免鏈延長超出循環(huán)的1_至_2圈(取決于作為引物/起始分子的乙?；?CoA或丙酰基-CoA的使用，生成4-和6-碳中間體和產(chǎn)物，或者5-和7-碳中間體和產(chǎn)物)和短鏈硫解酶yqeF或atoB或者諸如fucO或yqhD的短鏈醇脫氫酶的過表達(dá)；
[0030]ii)fadB、fadl和paaj的過表達(dá)以促進長鏈硫解酶tesA、tesB、fadM、ybgC或yciA或長鏈醇脫氫酶(例如ucpA、ybbO、yiaY、betA、ybdH或eutG)的鏈延長和過表達(dá)；本文所使用的術(shù)語“合適的”是指對特定鏈長的給定中間體(即?；?CoA、烯酰基-CoA、羥基?；?CoA和酮基酰基-CoA)具有所需特異性的酶。請注意，通過操作硫解酶(如上所述)能夠控制硫酯中間體的鏈長，因此終止酶僅得到所需鏈長的硫酯。
[0031]
【權(quán)利要求】
1.一種工程化微生物，其包括產(chǎn)生醇類、羧酸類和烴類的逆向β氧化循環(huán)，所述微生物包括:i)在缺乏脂肪酸和存在非脂肪酸碳源下所述β-氧化循環(huán)的表達(dá)；ii)在逆向/生物合成方向中所述β-氧化循環(huán)的功能運行；iii)將逆向β氧化循環(huán)中間體轉(zhuǎn)化成所需醇、羧酸、或烴的一種或多種終止酶的過表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物,其中所述微生物產(chǎn)生醇類并且已過表達(dá)i)形成醇的輔酶-A硫酯還原酶或者ii)形成醛的CoA硫酯還原酶和醇脫氫酶，以將所述逆向β氧化循環(huán)的中間體轉(zhuǎn)化成醇類。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物，其中所述微生物產(chǎn)生羧酸類并且已過表達(dá)硫酯酶、或酰基-CoA:乙?；?CoA轉(zhuǎn)移酶、或磷酸轉(zhuǎn)?；负汪人狨ゼっ?，以將所述逆向β氧化循環(huán)的中間體轉(zhuǎn)化成羧酸類。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物，其中所述微生物產(chǎn)生烷烴類或端烯烴類并且已過表達(dá)形成醛的CoA硫酯還原酶和醛脫羰基酶，以將所述逆向β氧化循環(huán)的中間體轉(zhuǎn)化成烷烴類或端烯烴類。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物，其中所述微生物產(chǎn)生烯烴類并且已過表達(dá)一種或多種形成鏈烯烴的酶，以將所述逆向β氧化循環(huán)的中間體轉(zhuǎn)化成烯烴類。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物，其包括fadR、atoC(c)、ΔarcA、Δ crp、crp*、Δ adhE、Apta、AfrdAAldhAAmgsA0
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微生物，其進一步包括ydbK和ydiO-ydiQRST的過表達(dá)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微生物，其進一步包括ydbK、cysj以及NAD(P)H-依賴性?；?CoA脫氫酶和NAD(P)H-依賴性反式烯?；?CoA還原酶中至少一者或兩者的過表達(dá)。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微生物，其進一步包括aceEF-lpdA或厭氧活性丙酮酸脫氫酶或NAD-依賴性甲酸脫氫酶或丙酮酸-NADP氧化還原酶以及NAD (P) H-依賴性?；?Cok脫氫酶和NAD(P)H-依賴性反式烯?；?CoA還原酶中至少一者或兩者的過表達(dá)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物，其包括fadR、atoC(c)、ΔarcA> Acrp、crp*、Δ adhE> Δ pta Δ yqhD> Δ eutE、yqeF+、fucO+。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物，其包括fadR、atoC(c)、ΔarcA> Acrp、crp*、Δ adhE> Δ pta Δ yqhD> Δ eutE、atoB+、fucO+。
12.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微生物,其進一步包括以下之一:i) Δ fadD、fadBA+ ；ii)fadBA+、yiaY+ ；iii) Δ fadD、fadBA+、yiaY+ ；iv) fadBA+、eutG+ ；v) Δ fadD、fadBA+、eutG+ ；vi) fadBA+> betA+ ；vii) Δ fadD> fadBA+、betA+ ；viii) Δ fadD> fadBA+、fadM 或者 ix)ΔfadD、fadBA+、yciA+。
13.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微生物,其進一步包括fadA、fadI和paaj的敲除以及短鏈CoA硫酯水解酶或硫酯酶、或短鏈磷酸轉(zhuǎn)?；负投替滛人狨ゼっ?、或短鏈?；?CoA:乙?；?CoA轉(zhuǎn)移酶、或形成醇的短鏈CoA硫酯還原酶、或形成醛的短鏈CoA硫酯還原酶和長鏈醇脫氫酶、或形成醛的CoA硫酯還原酶和醛脫羰基酶、或形成醛的短鏈CoA硫酯還原酶和短鏈醛脫羰基酶、或形成鏈烯烴的酶中一者或多者的過表達(dá)。
14.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微生物,其進一步包括fadB、fadI和paaj的過表達(dá)以及長鏈CoA硫酯水解酶或硫酯酶、或長鏈磷酸轉(zhuǎn)酰基酶和長鏈羧酸酯激酶、或長鏈酰基-CoA:乙?；?CoA轉(zhuǎn)移酶、或形成醇的長鏈CoA硫酯還原酶、或形成醛的長鏈CoA硫酯還原酶和長鏈醇脫氫酶、或形成醛的長鏈CoA硫酯還原酶和長鏈醛脫羰基酶、或形成鏈烯烴的酶中一者或多者的過表達(dá)。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物，其選自:
16.—種制備醇類或羧酸類的方法,所述方法包括使權(quán)利要求1-15中任一項所述的微生物在含有營養(yǎng)物質(zhì)的肉湯中生長足以允許產(chǎn)生醇或羧酸或者烷烴或烯烴的時間，以及分離所述醇或羧酸或者烷烴或烯烴。
17.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中使所述微生物在30-40°C的溫度下在包含0-100 μ M FeSO4和0-5mM泛酸鈣的肉湯中在微好氧(<10%02)或厭氧條件下生長。
18.一種制備產(chǎn)物的方法，所述方法包括使微生物在30-40°C的溫度下在使用0-100 μ MFeSO4和0_5mM泛酸鈣補充的葡萄糖基本培養(yǎng)基中在微好氧(<10%02)或厭氧條件下生長足以允許產(chǎn)生產(chǎn)物的時間，以及分離所述產(chǎn)物，其中所述微生物和產(chǎn)物選自:
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其進一步包括使用丙酸鹽補所述充培養(yǎng)基以產(chǎn)生奇數(shù)鏈長產(chǎn)物。
20.一種細(xì)菌，其包括 fadR、atoC(c)、AarcA、Acrp、crp*、AadhE、Apta、Δ frdAΔIdhAΔmgsA。
21.一種埃希氏菌屬，其包括 fadR、atoC(c)、AarcA、Acrp、crp*、AadhE、Apta、Δ frdAΔIdhAΔmgsA。
【文檔編號】C12N1/21GK103492560SQ201280014706
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年2月7日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月7日
【發(fā)明者】R·岡薩雷斯, J·M·克羅姆伯格, C·德勒莫納科, E·N·米勒 申請人:威廉馬什萊斯大學(xué)