堆積核酸及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種新的修飾的寡核苷酸單體，其可用于分子生物學(xué)技術(shù)如核酸的捕獲和/或檢測、核酸的擴(kuò)增和核酸的測序。所述修飾的寡核苷酸單體包含可以從大溝插入到反向平行雙鏈體中的嵌入劑。
【專利說明】堆積核酸及其使用方法
[0001]背景
[0002]核酸的檢測、擴(kuò)增和測序是分子生物學(xué)、研究以及臨床診斷中的關(guān)鍵方法。這樣的方法中的關(guān)鍵試劑是充當(dāng)引物和/或探針的寡核苷酸以及充當(dāng)RNA或DNA聚合酶的底物的核苷三憐酸(nucleoside triphosphate).[0003]對(duì)于用作PCR模板、引物和探針的寡核苷酸最重要的是它們的序列特異性以及它們對(duì)互補(bǔ)核酸的親和性。這些特征可以通過所述寡核苷酸內(nèi)在的因素和所述寡核苷酸外在的因素進(jìn)行調(diào)控。內(nèi)在因素例如是寡核苷酸的長度和核酸序列組成。而且，使用非天然核苷酸或主鏈修飾是內(nèi)在因素。然而，可用的非天然核苷酸和主鏈單元的數(shù)量有限。因此，對(duì)于可以在分子生物學(xué)方法中使用的具有新型修飾的寡核苷酸存在需要。
[0004]專利申請WO 2006/125447描述了式Z的三鏈形成單體單元并且證實(shí)包含三鏈形成單體單元的寡核苷酸相對(duì)于利用雙鏈核酸的三鏈形成的有利特性?；谌溞纬商匦裕笆鰧＠暾埖陌l(fā)明人提議使用所述寡核苷酸用于檢測、診斷和治療。關(guān)于這樣的用途沒有提供細(xì)節(jié)或數(shù)據(jù)。
[0005]Filichev等(Filichev VV, 2005)描述了與WO 2006/125447相同的三鏈形成單體單元并且發(fā)現(xiàn)了平行雙鏈體和平行三鏈體通過結(jié)合三鏈形成單體單元的穩(wěn)定化。此外，他們發(fā)現(xiàn)相比于天然寡核苷酸，當(dāng)三鏈形成單體單元被插入到寡核苷酸中時(shí)，Watson-Crick型RNA/DNA和DNA/DNA雙鏈體變得不穩(wěn)定。
[0006]WO 2006/125447中描述的三鏈形成單體不能適于使用聚合酶酶促結(jié)合到寡核苷酸中，因?yàn)樵搯误w不能充當(dāng)聚合酶的底物。此外，還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，WO 2006/125447中描述的三鏈形成單體不能充當(dāng)轉(zhuǎn)錄或復(fù)制中的模板。即，如果聚合酶遇到模板中的三鏈形成單體，聚合酶不能繼續(xù)RNA或DNA合成。
[0007]發(fā)明概述
[0008]在第一方面，本發(fā)明提供一種修飾的寡核苷酸單體SNA(堆積核酸)，其具有以下通式結(jié)構(gòu):
[0009]X-B-L-1
[0010]其中
[0011]X是可以結(jié)合到寡核苷酸或寡核苷酸類似物的主鏈中的主鏈單體單元，
[0012]B是核堿基、嘧啶或嘌呤類似物或含有一個(gè)或多個(gè)氮原子的雜環(huán)系統(tǒng)
[0013]L是接頭(linker)并且
[0014]I是包含至少一個(gè)基本上扁平的綴合系統(tǒng)的嵌入劑(intercalator)
[0015]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述SNA單體包含在B和L之間或L和I之間的接合體(conjugator)K:
[0016]X-B-K-L-1
[0017]X-B-L-K-1
[0018]當(dāng)SNA單體是雙鏈體中的一條鏈的一部分時(shí)，該SNA單體可以被構(gòu)建成允許嵌入劑I從大溝插入到反向平行雙鏈體中。以這種方式，所述SNA單體可以使反向平行雙鏈體形成穩(wěn)定并因此增大對(duì)互補(bǔ)序列的親和性。
[0019]所述SNA單體可用于分子生物學(xué)技術(shù)如核酸的捕獲和/或檢測、核酸的擴(kuò)增和核酸的測序。因此，本發(fā)明的其他方面涉及包含本發(fā)明的單體的寡核苷酸、適于結(jié)合的單體以及本發(fā)明的單體和寡核苷酸的用途。
[0020]附圖簡述
[0021]圖1.含有插入的功能化卩丫唳部分的pdb entry367d的結(jié)構(gòu)。
[0022]圖2.具有插入的芘單元的TTAGGG三聚體DNA雙鏈體的概觀。
[0023]圖3.含有芘單元的插入位點(diǎn)的特寫。
[0024]圖4a)-e).在利用1_5個(gè)碳的接頭在50K將IOns的MD連接至有義鏈中的胸苷之后獲得的構(gòu)象的概觀。
[0025]圖5a)-e).在利用1_5個(gè)碳的接頭在50K將IOns的MD連接至反義鏈中的胸苷之后獲得的構(gòu)象的概觀。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0026]SNA 單體
[0027]在第一方面，本發(fā)明提供一種修飾的寡核苷酸單體SNA (堆積核酸)，其具有以下通式結(jié)構(gòu):
[0028]X-B-L-1
[0029]其中
[0030]X是可以結(jié)合到寡核苷酸或寡核苷酸類似物的主鏈中的主鏈單體單元，
[0031]B是核堿基、嘧啶或嘌呤類似物或含有一個(gè)或多個(gè)氮原子的雜環(huán)系統(tǒng)
[0032]L是接頭并且
[0033]I是包含至少一個(gè)基本上扁平的綴合系統(tǒng)的嵌入劑。
[0034]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述SNA單體包含在B和L之間或L和I之間的接合體K:
[0035]X-B-K-L-1
[0036]X-B-L-K-1
[0037]當(dāng)SNA單體是雙鏈體中的一條鏈的一部分時(shí)，所述SNA單體可以被構(gòu)建成允許嵌入劑I從大溝插入到反向平行雙鏈體中。以這種方式，所述SNA單體可以使反向平行雙鏈體形成穩(wěn)定并因此增大對(duì)互補(bǔ)序列的親和性。
[0038]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其目的是提供允許SNA單體的酶促結(jié)合的SNA單體，并且其中L可以從核堿基B到達(dá)反向平行雙鏈體的大溝中。通過L的適當(dāng)設(shè)計(jì)，可以迫使L向后彎曲，允許I插入到反向平行雙鏈體中。通過將I置于反向平行雙鏈體中，使反向平行雙鏈體穩(wěn)定，但優(yōu)選地所述嵌入劑I不干擾其中放置所述SNA單體的寡核苷酸的酶促識(shí)別或者干擾所述SNA單體酶促結(jié)合到寡核苷酸中。
[0039]接頭L
[0040]接頭L優(yōu)選具有選自以下各項(xiàng)組成的組中的長度:小于30埃、小于25埃、小于20埃、小于19埃、小于18埃、小于17埃、小于16埃和小于15埃、至少3埃、至少4埃、至少5埃、至少6埃、至少7埃、至少8埃、至少9埃和至少10埃。[0041]更優(yōu)選地，所述接頭的長度為I至30埃，3至20埃，并最優(yōu)選地為5至15埃，6至15埃，7至15埃，8至15埃，9至15埃以及10至15埃。
[0042]在允許嵌入劑I插入到雙鏈體的大溝中的方面，這些長度是特別有利的。即，當(dāng)本發(fā)明的SNA單體插入到寡核苷酸中時(shí)，優(yōu)選的是該寡核苷酸對(duì)互補(bǔ)核酸的親和性和/或特異性增加。
[0043]當(dāng)所述SNA不包含接合體并且可以由X-B-L-1表示時(shí)，接頭L的優(yōu)選實(shí)施方案為:
[0044]-CH2O (CH2)n-
[0045]其中η為I至10，更優(yōu)選為2至8，3至7，并最優(yōu)選地η為5或6。
[0046]同樣，所述接頭也可以被描述為SNA單體X-B-L-1的部分，其中所述接頭為粗體:X-B - CH2O (CH2)n-1
[0047]當(dāng)所述SNA單體包含接合體并且可以由X-B-K-L-1表示時(shí)，所述接頭L的優(yōu)選實(shí)施方案為:
[0048]-(CH2)nNHCO (CH2)mCO-
[0049]其中η為I至5并且m為I至5,如其中η為I至4并且m為I至4, η為I至3并且m為I至3,并且更優(yōu)選地，η為I并且m為2。
[0050]同樣，所述接頭可以再次被描述為所述SNA單體X-B-K-L-1的部分，其中所述接頭為粗體:X-B-K- (CH2) nNHC0 (CH2) mC0-1
[0051]當(dāng)所述SNA單體包含接合體并且可以由X-B-L-K-1表示時(shí)，所述接頭L的優(yōu)選實(shí)施方案為:
[0052]-(CH2)m-0-(CH2-)n
[0053]其中m和η各自為I至20,1至10或I至5。甚至更優(yōu)選地為I并且η為I至10，I至5，并且最優(yōu)選地η為3或4。
[0054]再次，所述接頭可以被描述為所述SNA單體X-B-L-K-1的部分，其中所述接頭為粗體 43-(012),0-(012-)^1(-1
[0055]其他接頭:
[0056]其他相關(guān)接頭例如是由Ahmadian 和 Bergstrom M.(Ahmadian 和 DonaldE.Bergstrom2008, " 5-Substituted Nucleosides in Biochemistry andBiotechnology (生物化學(xué)和生物技術(shù)中的5_取代核苷)." In Modified Nucleosides inBiochemistry (生物化學(xué)中的修飾的核苷),Biotechnoloy and Medicine (生物技術(shù)和醫(yī)藥)，P.Herdewijn, ed.ffiley-VCH, Weihheim, 2008, ρρ251_276.)描述的那些，該文獻(xiàn)通過引用完整地結(jié)合于此。
[0057]L的位置
[0058]當(dāng)B是嘌呤時(shí)，接頭L優(yōu)選連接至該嘌呤的6或7位。最優(yōu)選連接至7位。
[0059]同樣，當(dāng)B是喃唳時(shí),所述接頭優(yōu)選連接至5或6位。最優(yōu)選連接至5位。
[0060]這些接頭位置是特別有利的，因?yàn)镈NA和RNA聚合酶特別耐受在這些位置的核堿基修飾。即，聚合酶通?？梢允褂迷谏鲜鑫恢帽恍揎椀暮塑账嶙鳛镈NA或RNA合成的底物。一個(gè)這樣的實(shí)例是具有綴合至嘧啶的5位的生物素(biotin)基團(tuán)的核苷三磷酸(nucleotide triphosphate)。同樣,在這些位置被修飾的SNA三磷酸在作為聚合酶的底物方面是有利的。[0061]接合體K
[0062]如提及的，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的SNA單體包含接合體K。在本
【發(fā)明內(nèi)容】
中，術(shù)語接合體是指K包含與嵌入劑或核堿基的P-軌道重疊的P-軌道。K可以選自由以下各項(xiàng)組成的組:2至12個(gè)碳的烯基，2至25個(gè)碳的炔基或重氮基或其長度不超過25個(gè)碳或/和氮原子的組合以及單環(huán)芳族環(huán)系統(tǒng)。
[0063]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，K是乙炔或重復(fù)的乙炔。
[0064]最優(yōu)選地，K是乙炔基。
[0065]K-1的優(yōu)選實(shí)施方案
[0066]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，K-1是乙炔基-芳基并且優(yōu)選地
[0067]乙炔基芳基是1-乙炔基芘。
[0068]K-L的優(yōu)選實(shí)施方案
[0069]K-L的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案為:
[0070]C = C- (CH2) nNHC0 (CH2) mC0
[0071]其中η為I至5并且m為I至5,如其中η為I至4并且m為I至4, η為I至3并且m為I至3,并且更優(yōu)選地，η為I并且m為2。
[0072]而且K-L可以被描述為SNA單體X-B-K-L-1的部分，其中K-L為粗體:X-B-C = C- (CH2)nNHCO ( CH2)mCO-1
[0073]L-K的優(yōu)選實(shí)施方案
[0074]L-K的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案為:
[0075](CH2)m-O-(CH2)n-C = C
[0076]其中m和η各自為I至20,1至10或I至5。甚至更優(yōu)選地是I并且η為I至10，I至5并且最優(yōu)選地η為3或4。
[0077]并且當(dāng)被描述為SNA單體X-B-L-K-1的部分時(shí)，L-K為粗體:
[0078]X-B- (CH2) m_0_ (CH2) n_C = C-1
[0079]B的優(yōu)選實(shí)施方案
[0080]B優(yōu)選為結(jié)構(gòu)1-20所示的嘧啶或嘌呤，其中B被顯示為SNA單體的部分:
[0081]
【權(quán)利要求】
1.一種修飾的寡核苷酸單體SNA，其具有以下通式結(jié)構(gòu):
X-B-L-1 其中 X是可以結(jié)合到寡核苷酸或寡核苷酸類似物的主鏈中的主鏈單體單元， B是核堿基、嘧啶或嘌呤類似物或含有一個(gè)或多個(gè)氮原子的雜環(huán)系統(tǒng) L是接頭并且 I是包含至少一個(gè)基本上扁平的綴合系統(tǒng)的嵌入劑并且其中接頭的長度為5至15埃。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單體，其還包含在B和L之間或L和I之間的接合體K: X-B-K-L-1
X-B-L-K-1 ο
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的X-B-L-1單體，其由下式描述:
X-B - CH2O(CH2)n-1 其中η是5或6。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的X-B-K-L-1單體，其由下式描述:
X-B-K- (CH2) nNHC0 (CH2) mC0-1， 其中η為I至3并且m為I至3。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的X-B-L-K-1單體，其由下式描述:
X-B- (CH2) m-0- (CH2-) n - K-1 其中m是I并且η是3或4。
6.根據(jù)權(quán)利要求2、4和5所述的單體，其中K是乙炔基。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的SNA單體，其中X-B是DNA或RNA單元。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的SNA單體，其適于酶促結(jié)合到寡核苷酸中。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的SNA單體，其適于使用標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸合成結(jié)合到寡核苷酸中。
10.一種寡核苷酸，所述寡核苷酸包含根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的SNA單體。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的適于酶促結(jié)合的SNA單體作為聚合酶的底物的用途。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的包含所述SNA單體的寡核苷酸作為聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中的引物或模板的用途。
13.一種方法，包括以下步驟: a.提供模板核酸 b.提供第一引物寡核苷酸 c.提供聚合酶 d.提供核苷三磷酸混合物 e.混合步驟a-d的組分并提供允許所述引物退火至所述模板的條件 f.在允許引物延伸的條件下，延伸被退火至所述模板的所述第一引物寡核苷酸 其中所述第一引物寡核苷酸包含SNA單體和/或 其中所述模板核酸包含SNA單體和/或 其中所述核苷三磷酸混合物包含適于酶促結(jié)合到寡核苷酸中的SNA單體。
14.根據(jù) 權(quán)利要求13所述的方法，所述方法還包括以下步驟:g.提供第二引物寡核苷酸，所述第二引物寡核苷酸與步驟f的第一延伸產(chǎn)物互補(bǔ) h.使所述步驟f的產(chǎn)物變性 I.在允許引物延伸的條件下，延伸被退火至所述第一延伸產(chǎn)物的所述第二引物寡核苷酸。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103502452SQ201280014992
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2012年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月28日
【發(fā)明者】烏費(fèi)·維斯特·施奈德, 戈姆·利斯比, 尼古拉·達(dá)姆·米克爾森 申請人:昆特拜克股份公司