克魯維酵母屬的突變體酵母和使用了該突變體酵母的乙醇的制造方法
【專利摘要】將屬于克魯維酵母屬的酵母進(jìn)行改變以提高來(lái)自木糖的乙醇收率。減弱屬于克魯維酵母屬的酵母中的選自來(lái)源于馬克斯克魯維酵母的ADH1基因、與該ADH1基因在功能上等價(jià)的基因、來(lái)源于馬克斯克魯維酵母的ADH4基因、和與該ADH4基因在功能上等價(jià)的基因中的至少一種基因。
【專利說(shuō)明】克魯維酵母屬的突變體酵母和使用了該突變體酵母的乙醇的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及利用了克魯維酵母屬(Kluyveromyces)酵母的突變體酵母和使用了該突變體酵母的乙醇的制造方法。
【背景技術(shù)】[0002]包含木素纖維素的生物質(zhì)可以作為乙醇等有用醇和/或有機(jī)酸的原料而被有效地利用。包含木素纖維素的生物質(zhì)包括木質(zhì)系生物質(zhì)和草本系生物質(zhì)。木質(zhì)系生物質(zhì)等包含木素纖維素的生物質(zhì)主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成。為了由包含木素纖維素的生物質(zhì)制造乙醇等液體燃料，將纖維素和/或半纖維素水解(糖化)至構(gòu)成單糖，通過(guò)發(fā)酵而將單糖轉(zhuǎn)換為乙醇。纖維素由葡萄糖構(gòu)成，半纖維素主要由阿拉伯糖和木糖構(gòu)成。因此，在利用包含木素纖維素的生物質(zhì)制造乙醇時(shí)，期望不僅葡萄糖，連木糖也作為發(fā)酵的底物而被有效地利用。
[0003]另外，在由包含木素纖維素的生物質(zhì)制造乙醇時(shí)，如果能夠?qū)⑸鲜龅奶腔磻?yīng)和發(fā)酵反應(yīng)同時(shí)(不區(qū)分各反應(yīng)工序地)進(jìn)行，則可以實(shí)現(xiàn)制造成本的減低。將該方法稱為同時(shí)糖化發(fā)酵方法。同時(shí)糖化發(fā)酵中，需要具有能夠在糖化酶的反應(yīng)溫度區(qū)域(約40°C以上)發(fā)酵的耐熱性、不僅能夠利用葡萄糖還能夠利用5碳單糖木糖作為底物的微生物。
[0004]作為具有耐熱性的酵母，已知馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)等克魯維酵母屬(Kluyveromyces)酵母。該克魯維酵母屬酵母能夠利用木糖進(jìn)行乙醇發(fā)酵，但其收率不充分。例如，非專利文獻(xiàn)I和2中關(guān)于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的醇脫氫酶基因(包含多個(gè)異構(gòu)體)報(bào)告了功能分析。另外，專利文獻(xiàn)I中公開了被賦予了將木糖異構(gòu)化為木酮糖的能力的重組酵母，還記載了減少醇脫氫酶活性。但是，由這些知識(shí)不能判斷通過(guò)醇脫氫酶基因的缺失和/或破壞會(huì)對(duì)乙醇發(fā)酵能力有怎樣的影響。并且，不能判斷作為分類學(xué)上不同的種的馬克斯克魯維酵母等克魯維酵母屬酵母中的醇脫氫酶基因的功能。
[0005]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0006]專利文獻(xiàn)
[0007]專利文獻(xiàn)1:日本特表2005-514951號(hào)公報(bào)
[0008]非專利文獻(xiàn)
[0009]非專利文獻(xiàn)1:FEMS Yeast Research2, (2002) ρ.481-494
[0010]非專利文獻(xiàn)2:FEMS Yeast Research8, (2008) ρ.967-978

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]發(fā)明要解決的課題
[0012]如上所述，克魯維酵母屬酵母具有木糖同化性且具有耐熱性，因而被較大地期待作為在上述的同時(shí)糖化發(fā)酵法等中有用的微生物。但是，克魯維酵母屬酵母來(lái)自木糖的乙醇收率非常差，另外也不知曉改善該收率的手段。因此，本發(fā)明鑒于這樣的事實(shí)，目的在于提供以提高來(lái)自木糖的乙醇收率的方式進(jìn)行了改變而得的屬于克魯維酵母屬的突變體酵母、和使用了該突變體酵母的乙醇的制造方法。
[0013]用于解決課題的方法
[0014]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本
【發(fā)明者】們進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)減弱克魯維酵母屬酵母中的多個(gè)醇脫氫酶基因中的特定的基因，從而該酵母中的來(lái)自木糖的乙醇收率大幅提高，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明包含以下(I)-(6)。
[0015](I)突變體酵母，減弱了屬于克魯維酵母屬的酵母中的選自來(lái)源于馬克斯克魯維酵母的ADHl基因、與該ADHl基因在功能上等價(jià)的基因、來(lái)源于馬克斯克魯維酵母的ADH4基因、和與該ADH4基因在功能上等價(jià)的基因中的至少一種基因。
[0016](2)根據(jù)(I)所述的突變體酵母，其特征在于，所述屬于克魯維酵母屬的酵母是馬克斯克魯維酵母。
[0017](3)根據(jù)(I)所述的突變體酵母，其特征在于，所述與ADHl基因在功能上等價(jià)的基因來(lái)源于除了馬克斯克魯維酵母以外的克魯維酵母屬酵母，并編碼以下(a)-(C)的任一蛋白質(zhì)，
[0018](a)包含序列號(hào)2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，
[0019](b)包含相對(duì)于序列號(hào)2的氨基酸序列具有90%以上的序列類似性的氨基酸序列，并具有醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)，
[0020](c)包含相對(duì)于序列號(hào)2的氨基酸序列缺失、替換、添加或插入了 I-多個(gè)氨基酸的氨基酸序列，并具有醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)。
[0021](4)根據(jù)(I)所述的突變體酵母，其特征在于，所述與ADH4基因在功能上等價(jià)的基因來(lái)源于除了馬克斯克魯維酵母以外的克魯維酵母屬酵母，并編碼以下(a)-(C)的任一蛋白質(zhì)，
[0022](a)包含序列號(hào)4的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，
[0023](b)包含相對(duì)于序列號(hào)4的氨基酸序列具有90%以上的序列類似性的氨基酸序列，并具有醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)，
[0024](c)包含相對(duì)于序列號(hào)4的氨基酸序列缺失、替換、添加或插入了 I-多個(gè)氨基酸的氨基酸序列，并具有醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)。
[0025](5)乙醇的制造方法，其包括以下工序:
[0026]用含木糖的培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)(I)-(4)的任一項(xiàng)所述的突變體酵母的培養(yǎng)工序，和
[0027]然后，從培養(yǎng)基回收乙醇的回收工序。
[0028](6)根據(jù)(5)所述的乙醇的制造方法，其特征在于，將所述培養(yǎng)工序在包含所述突變體酵母、含木素纖維素的生物質(zhì)和糖化酶的反應(yīng)體系中進(jìn)行。
[0029]本說(shuō)明書包含作為本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的日本專利申請(qǐng)2011-076715號(hào)的說(shuō)明書和/或附圖所記載的內(nèi)容。
[0030]發(fā)明的效果
[0031]本發(fā)明的突變體酵母來(lái)自葡萄糖的乙醇收率幾乎不變，來(lái)自木糖的乙醇收率大幅提高。因此，本發(fā)明的突變體酵母可以在包含例如來(lái)源于木質(zhì)系生物質(zhì)等包含木素纖維素的生物質(zhì)的木糖的培養(yǎng)基中高收率地制造乙醇。[0032]本發(fā)明的乙醇的制造方法通過(guò)利用來(lái)自木糖的乙醇收率大幅提高了的突變體酵母，從而可以大幅提高乙醇制造效率。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0033]圖1是顯示用含木糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)4種ADH破壞株時(shí)的培養(yǎng)基中的木糖濃度變化的特性圖。
[0034]圖2是顯示用含木糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)4種ADH破壞株時(shí)的培養(yǎng)基中的乙醇濃度變化的特性圖。
[0035]圖3是顯示用含木糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)4種ADH破壞株時(shí)的菌體濃度變化的特性圖。
[0036]圖4是顯示用含葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)4種ADH破壞株時(shí)的培養(yǎng)基中的木糖醇濃度變化的特性圖。
[0037]圖5是顯示用含葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)4種ADH破壞株時(shí)的培養(yǎng)基中的乙醇濃度變化的特性圖。
[0038]圖6是顯示用含葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)4種ADH破壞株時(shí)的菌體濃度變化的特性圖。
[0039]圖7是顯示來(lái)源于釀酒酵母(S.cerevisiae)的ADHl與來(lái)源于馬克斯克魯維酵母(K.marxianus)的 ADHl 之間的比對(duì)(alignment)白勺圖。
[0040]圖8是顯示來(lái)源于釀酒酵母的ADHl與來(lái)源于馬克斯克魯維酵母的ADH2之間的比對(duì)的圖。
[0041]圖9是顯示來(lái)源于釀酒酵母的ADHl與來(lái)源于馬克斯克魯維酵母的ADH3之間的比對(duì)的圖。
[0042]圖10是顯示來(lái)源于釀酒酵母的ADHl與來(lái)源于馬克斯克魯維酵母的ADH4之間的比對(duì)的圖。
[0043]圖11是顯示來(lái)源于釀酒酵母的ADH2與來(lái)源于馬克斯克魯維酵母的ADHl之間的比對(duì)的圖。
[0044]圖12是顯示來(lái)源于釀酒酵母的ADH2與來(lái)源于馬克斯克魯維酵母的ADH2之間的比對(duì)的圖。
[0045]圖13是顯示來(lái)源于釀酒酵母的ADH2與來(lái)源于馬克斯克魯維酵母的ADH3之間的比對(duì)的圖。
[0046]圖14是顯示來(lái)源于釀酒酵母的ADH2與來(lái)源于馬克斯克魯維酵母的ADH4之間的比對(duì)的圖。
[0047]圖15是顯示來(lái)源于釀酒酵母的ADHl與來(lái)源于釀酒酵母的ADH2之間的比對(duì)的圖。【具體實(shí)施方式】
[0048]本發(fā)明的突變體酵母具有以下特征:減弱了克魯維酵母屬酵母中的特定醇脫氫酶基因，來(lái)自木糖的乙醇收率提高了。[0049]這里，克魯維酵母屬酵母是包含K.aestuari1、K.africanus、K.bacillisporus、K.blattae、多布克魯維酵母(K.dobzhanskii)、湖北克魯維酵母(K.hubeiensis)、乳酸克魯維酵母(K.1actis)、K.lodderae、馬克斯克魯維酵母(K.marxianus)、非發(fā)酵克魯維酵母(K.nonfermentans)、K.piceae、中國(guó)克魯維酵母(K.sinensis)、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans) > K.walti1、威克海姆克魯維酵母(K.wickerhamii)和亞羅克魯維酵母(K.yair0Wii)等酵母的含義。即，本發(fā)明的突變體酵母可以通過(guò)對(duì)這些具體的克魯維酵母屬酵母及其突變體減弱特定的醇脫氫酶基因來(lái)制作。作為克魯維酵母屬酵母，特別優(yōu)選使用作為耐熱性酵母已知的馬克斯克魯維酵母。作為馬克斯克魯維酵母，不特別限定，可以使用在保藏機(jī)構(gòu)能夠分售地保存的公知株，另外還可以使用由公知株衍生的突變株。作為馬克斯克魯維酵母的公知株，可列舉馬克斯克魯維酵母DMKU3-1042株。作為由公知株衍生的突變株，可例示例如，為了對(duì)馬克斯克魯維酵母DMKU3-1042株付與營(yíng)養(yǎng)缺陷型而破壞ura3基因和/或leu2基因而得的株。
[0050]本發(fā)明的突變體酵母中減弱了特定的醇脫氫酶基因。這里“基因的減弱”是包含降低該基因的表達(dá)量、降低由該基因編碼的酶的活性這兩方面。例如，通過(guò)使特定的醇脫氫酶基因破壞或缺失的方法、使該基因的表達(dá)控制區(qū)(啟動(dòng)子等)破壞或缺失的方法、表達(dá)針對(duì)該基因的反義RNA的方法等，可以降低該基因的表達(dá)量。另外，應(yīng)用所謂轉(zhuǎn)座子法、轉(zhuǎn)基因法、轉(zhuǎn)錄后基因沉默法、RNAi法、無(wú)義介導(dǎo)的降解(Nonsense mediated decay, NMD)法、核酶法、反義法、miRNA(微小 RNA, micro-RNA)法、siRNA(小干擾 RNA, small interferingRNA)法等，可以減低該基因的表達(dá)量。進(jìn)而，通過(guò)使醇脫氫酶的抑制劑作用的方法等，可以降低由該基因編碼的酶的活性。此外，還可以組合這些方法，來(lái)減弱特定的醇脫氫酶基因。
[0051]另外，本發(fā)明的突變體酵母具有來(lái)自木糖的乙醇收率提高了的特征。換言之，本發(fā)明的突變體酵母具有木糖代謝能力提高了的特征。這里，木糖代謝能力是指將培養(yǎng)基所含的木糖代謝而形成醇的發(fā)酵 反應(yīng)的效率。因此，木糖代謝能力的提高，與提高該發(fā)酵反應(yīng)的反應(yīng)效率成為同義。酵母的木糖代謝能力可以通過(guò)用含木糖的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)產(chǎn)生的醇進(jìn)行定量來(lái)評(píng)價(jià)。另外，酵母的木糖代謝能力可以以例如培養(yǎng)基所含的木糖的攝入速度(消耗速度)為指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)。木糖的攝入速度可以通過(guò)經(jīng)時(shí)地測(cè)定培養(yǎng)開始時(shí)已知濃度的木糖的減少量來(lái)計(jì)算。
[0052]減弱的醇脫氫酶基因是存在于克魯維酵母屬酵母中的多個(gè)醇脫氫酶基因中的特定的醇脫氫酶基因。具體地，醇脫氫酶基因在馬克斯克魯維酵母中已知4個(gè)種類(KmADHl-KmADH4)。在馬克斯克魯維酵母中減弱的醇脫氫酶基因是它們中的KmADHl基因和/或KmADH4基因。在除了馬克斯克魯維酵母以外的克魯維酵母屬酵母中減弱的醇脫氫酶基因是與KmADHl基因在功能上等價(jià)的ADH基因和/或與KmADH4基因在功能上等價(jià)的ADH基因。
[0053]在除了馬克斯克魯維酵母以外的克魯維酵母屬酵母中，與KmADHl基因在功能上等價(jià)的ADH基因和與KmADH4基因在功能上等價(jià)的ADH基因可以通過(guò)現(xiàn)有公知的方法來(lái)鑒定。例如，首先，在除了馬克斯克魯維酵母以外的克魯維酵母屬酵母中特定多個(gè)醇脫氫酶基因。而且，從由這些基因編碼的醇脫氫酶中，特定具有與由KmADHl基因編碼的醇脫氫酶的氨基酸序列序列類似性最高的氨基酸序列的醇脫氫酶。這樣特定的醇脫氫酶基因，可以特定為與馬克斯克魯維酵母中的KmADHl基因在功能上等價(jià)的基因。此外，在特定與KmADH4基因在功能上等價(jià)的基因時(shí)也是同樣的。這里，序列類似性的值是指使用安裝了 BLAST(序列局部比對(duì)查詢工具，Basic Local Alignment Search Tool)程序的計(jì)算機(jī)以默認(rèn)的設(shè)定求出的值。
[0054]這里，KmADHl基因的編碼區(qū)的堿基序列和由KmADHl基因編碼的醇脫氫酶的氨基酸序列分別不于序列號(hào)I和2。另外，KmADH4基因的編碼區(qū)的喊基序列和由KmADH4基因編碼的醇脫氫酶的氨基酸序列分別示于序列號(hào)3和4。
[0055]此外，存在于馬克斯克魯維酵母中的這些KmADHl基因和KmADH4基因不限于以上的具體的堿基序列和氨基酸序列。即，KmADHl基因和KmADH4基因只要編碼具有醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)，還包含編碼含有分別相對(duì)于序列號(hào)2和4所示的氨基酸序列具有80%以上、優(yōu)選為85%以上、更優(yōu)選為90%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為95%以上、最優(yōu)選為98%以上的序列類似性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因。這里，序列類似性的值是指使用安裝了 BLAST (BasicLocal Alignment Search Tool)程序的計(jì)算機(jī)以默認(rèn)的設(shè)定求出的值。
[0056]另外，KmADHl基因和KmADH4基因只要編碼具有醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)，還包含編碼含有分別對(duì)序列號(hào)2和4所示的氨基酸序列缺失、替換、添加或插入了 I個(gè)或多個(gè)(例如2-35個(gè)、優(yōu)選為2-30個(gè)、更優(yōu)選為2-20個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選為2-10個(gè))氨基酸的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
[0057]進(jìn)而，KmADHl基因和KmADH4基因只要編碼具有醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)，則也包含相對(duì)于分別包含序列號(hào) I和3所示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸的一部分或全部在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸。這里，嚴(yán)格條件是指具有90%左右、優(yōu)選為95%、進(jìn)一步優(yōu)選為98%的同一性的一對(duì)多核苷酸形成特異性雜交的條件(溫度條件、鹽濃度條件)。
[0058]<乙醇制造>
[0059]通過(guò)利用以上所說(shuō)明的突變體酵母，可以進(jìn)行以木糖等糖為底物的乙醇發(fā)酵。特別是，上述的本發(fā)明的突變體酵母具有優(yōu)異的木糖代謝能力，即來(lái)自木糖的乙醇收率優(yōu)異，因而適合利用了含木糖的培養(yǎng)基的乙醇發(fā)酵。含木糖的培養(yǎng)基是克魯維酵母屬酵母能夠生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，是指至少含有木糖作為成為乙醇合成的底物的糖成分的培養(yǎng)基。此外，含木糖的培養(yǎng)基還可以含有除了木糖以外的糖成分，例如葡萄糖。
[0060]對(duì)含木糖的培養(yǎng)基不特別限定，可以通過(guò)在SD培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基、YPAD培養(yǎng)基、YM培養(yǎng)基和含Yeast Nitrogen Base的各種合成培養(yǎng)基中添加木糖，或者將這些公知培養(yǎng)基所含的糖成分替換成木糖來(lái)制備。
[0061]另外，還可以從木質(zhì)系生物質(zhì)、草本系生物質(zhì)這樣的包含木素纖維素的生物質(zhì)制備含木糖的培養(yǎng)基。即，將包含木素纖維素的生物質(zhì)所含的纖維素、半纖維素進(jìn)行糖化處理，使用所得的處理物作為含木糖的培養(yǎng)基。作為糖化處理不特別限定，可以毫不限制地利用現(xiàn)有公知的方法。作為糖化方法，可列舉例如，利用稀硫酸或濃硫酸的硫酸法、利用纖維素酶、半纖維素酶的酶法等。另外，可以在糖化處理之前，對(duì)木質(zhì)系生物質(zhì)、草本系生物質(zhì)實(shí)施現(xiàn)有公知的前處理。作為前處理不特別限定，可列舉例如，將木質(zhì)素用微生物分解的處理，木質(zhì)系生物質(zhì)、草本系生物質(zhì)的粉碎處理，浸潰在離子液體、堿溶液中緩和結(jié)構(gòu)的處理，用高溫水進(jìn)行蒸煮的水熱處理，利用氨的處理等。
[0062]特別是，在由馬克斯克魯維酵母制作的突變體酵母中，耐熱性特別優(yōu)異，因而可以在例如40°C上、優(yōu)選為35-48°C、更優(yōu)選為40-42°C這樣的比較高溫度下進(jìn)行乙醇發(fā)酵。這樣的溫度區(qū)域是纖維素酶、半纖維素酶這樣的糖化酶也顯示活性的溫度區(qū)域。因此，該突變體酵母適合利用了糖化酶的所謂同時(shí)糖化發(fā)酵。這里，同時(shí)糖化發(fā)酵是指將利用糖化酶的木質(zhì)系生物質(zhì)的糖化處理、和來(lái)自木糖的乙醇發(fā)酵處理在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行的處理。更具體地，將含有木質(zhì)系生物質(zhì)、糖化酶和突變體酵母的溶液在例如40°C這樣的溫度條件進(jìn)行孵育。由此，可以進(jìn)行木質(zhì)系生物質(zhì)的糖化、和來(lái)自由糖化而得的木糖、葡萄糖的乙醇發(fā)酵，從而制造乙醇。另外，此時(shí)即可以攪拌溶液，也可以振蕩溶液。
[0063]另外，在回收由培養(yǎng)基所含的木糖等碳源發(fā)酵生產(chǎn)而得的乙醇時(shí)，不特別限定，可以應(yīng)用現(xiàn)有公知的任何方法。例如，上述的乙醇發(fā)酵結(jié)束后，通過(guò)固液分離操作而分離成含乙醇的液層、和含有突變體酵母、固體成分的固層。然后，將液層所含的乙醇通過(guò)蒸餾法分離?純化，從而可以回收純度高的乙醇。此外，乙醇的純化度可以根據(jù)乙醇的使用目的適宜調(diào)整。
[0064]實(shí)施例
[0065]以下，通過(guò)實(shí)施例更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明的技術(shù)的范圍不限于以下的實(shí)施例。
[0066]〔實(shí)施例1〕
[0067]在本實(shí)施 例中，使用馬克斯克魯維酵母作為克魯維酵母屬酵母，制作醇脫氫酶基因的破壞株，對(duì)來(lái)自木糖的乙醇收率進(jìn)行比較研究。
[0068]<株的制作>
[0069]<利用接合、孢子形成的ura3-leu2_突變株的制作>
[0070]使用作為馬克斯克魯維酵母DMKU3-1042株的ura3_株的RAK3605株(Nonklang, S.et al., Appl.Environ.Microbiol.74, p.7514-7521 (2008))作為基準(zhǔn)株。明確了來(lái)源于馬克斯克魯維酵母DMKU3-1042株的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株以低頻率成為2倍體。通過(guò)紫外線突變可以獲得多重營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株，其結(jié)果是在染色體DNA中引入突變的概率上升。為了制作更穩(wěn)定的株，通過(guò)接合和孢子形成，從而為了由2倍體簡(jiǎn)單地制作多重營(yíng)養(yǎng)缺陷型株而制作了以下的株。
[0071]首先，對(duì)RAK3605株照射紫外線照射，獲得Iys-株(RAK3896株:ura3-lys2-)、ade-株(RAK3919 株:ura3-ade2_)和 Ieu-株(RAK3966 株:ura3_leu2_)。制作在這些株中將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的URA3隨機(jī)地向染色體轉(zhuǎn)化而得的株、RAK4088 株(ura3-leu2-ScURA3)、RAK4152 株(ura3-ade2_ScURA3)、RAK4153 株(ura3-lys2-ScURA3)。將 RAK4152 和 RAK4153 株在 YPD 培養(yǎng)基(l%w/v 酵母提取物，2%w/V胨，2%葡萄糖，2%w/V瓊脂)上以混合的方式劃線，向麗培養(yǎng)基(0.17%w/V yeastnitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate (酵母氮源，不含氨基酸，不含硫酸銨)，0.5%w/v硫酸銨，2%w/V葡萄糖，2%w/V瓊脂)復(fù)制。將在麗培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的株 RAK4154 株(ura3-/ura3-ade2-/ADE2, lys2-/LYS2ScURA3/ScURA3)接菌到在釀酒酵母(S.cerevisiae)中使用的SPO培養(yǎng)基(l%w/v醋酸鉀，0.l%w/v酵母提取物，0.05%w/v葡萄糖)中使其形成孢子。
[0072]為了分離制作的孢子，獲得ura-lys-ade-的3重營(yíng)養(yǎng)缺陷型株，向-A培養(yǎng)基(MM+尿嘧啶，色氨酸，組氨酸鹽酸鹽，蛋氨酸，亮氨酸，賴氨酸鹽酸鹽)，-K培養(yǎng)基(MM+尿嘧啶，色氨酸，組氨酸鹽酸鹽，蛋氨酸，亮氨酸，腺嘌呤硫酸鹽)，-U培養(yǎng)基(MM+色氨酸，組氨酸鹽酸鹽，蛋氨酸，亮氨酸，賴氨酸鹽酸鹽，腺嘌呤硫酸鹽)復(fù)制，成功地從RAK4154株的孢子獲得了 3株在3種培養(yǎng)基中不能增殖的株。將該株命名為RAK4155株(ura3-lys2-ade2-)。通過(guò)同樣的方法使RAK4088株與RAK4155株接合，制作RAK4156株(ura3-/ura3-lys2-/LYS2ade2-/ADE21eu2-/LEU2ScURA3/ScURA3)。使該株形成孢子，制作RAK4174 株(Ieu2-ura3_)。
[0073]<Ku70破壞株的制作>
[0074]馬克斯克魯維酵母由于以高頻率發(fā)生非同源末端結(jié)合修復(fù)，因而不能像釀酒酵母(S.cerevisiae)那樣利用同源重組修復(fù)容易地進(jìn)行基因破壞(Nonklang, S.etal., Appl.Environ.Microbiol.74, p.7514-7521 (2008))。因此，通過(guò)破壞非同源末端結(jié)合修復(fù)所需的KU70基因來(lái)進(jìn)行高頻率地發(fā)生同源重組的株的制作。由RAK4174株制作破壞 7 KU70 的 RAK4736 株(leu2-ura3-Kmku70Δ::ScLEU2)(Abdel-Banat, B.M.etal., Yeast27, 29-39(2010))。
[0075]< ADHl破壞株的制作>
[0076]馬克斯克魯維酵母DMKU3-1042株的ADHl基因中的推定開放閱讀框(openreading frame)用Genetyx ver.10(株式會(huì)社七 預(yù)測(cè)。馬克斯克魯維酵母DMKU3-1042株的ADHl基因編碼由348個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。利用該堿基序列信息設(shè)計(jì)以下的一對(duì)引物。
[0077]
【權(quán)利要求】
1.突變體酵母，減弱了屬于克魯維酵母屬的酵母中的選自來(lái)源于馬克斯克魯維酵母的ADHl基因、與該ADHl基因在功能上等價(jià)的基因、來(lái)源于馬克斯克魯維酵母的ADH4基因、和與該ADH4基因在功能上等價(jià)的基因中的至少一種基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變體酵母，其特征在于，所述屬于克魯維酵母屬的酵母是馬克斯克魯維酵母。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變體酵母，其特征在于，所述與ADHl基因在功能上等價(jià)的基因來(lái)源于除了馬克斯克魯維酵母以外的克魯維酵母屬酵母，并編碼以下(a)-(C)的任一蛋白質(zhì)， (a)包含序列號(hào)2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)， (b)包含相對(duì)于序列號(hào)2的氨基酸序列具有90%以上的序列類似性的氨基酸序列，并具有醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)， (c)包含相對(duì)于序列號(hào)2的氨基酸序列缺失、替換、添加或插入了I-多個(gè)氨基酸的氨基酸序列，并具有醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利 要求1所述的突變體酵母，其特征在于，所述與ADH4基因在功能上等價(jià)的基因來(lái)源于除了馬克斯克魯維酵母以外的克魯維酵母屬酵母，并編碼以下(a)-(c)的任一蛋白質(zhì)， (a)包含序列號(hào)4的氨基酸序列的蛋白質(zhì)， (b)包含相對(duì)于序列號(hào)4的氨基酸序列具有90%以上的序列類似性的氨基酸序列，并具有醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)， (c)包含相對(duì)于序列號(hào)4的氨基酸序列缺失、替換、添加或插入了I-多個(gè)氨基酸的氨基酸序列，并具有醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)。
5.乙醇的制造方法，其包括以下工序: 用含木糖的培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)權(quán)利要求1-4的任一項(xiàng)所述的突變體酵母的培養(yǎng)工序，和 然后，從培養(yǎng)基回收乙醇的回收工序。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的乙醇的制造方法，其特征在于，將所述培養(yǎng)工序在包含所述突變體酵母、含木素纖維素的生物質(zhì)和糖化酶的反應(yīng)體系中進(jìn)行。
【文檔編號(hào)】C12N1/19GK103459588SQ201280015362
【公開日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2012年3月26日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月30日
【發(fā)明者】志佐倫子, 赤田倫治, 星田尚司, 上村毅, 牟田口梢榮, 德弘健郎, 片平悟史 申請(qǐng)人:豐田自動(dòng)車株式會(huì)社