具有對抗玉米根蟲的活性的合成殺昆蟲蛋白的制作方法【專利摘要】傳統(tǒng)上影響昆蟲害蟲群體的主要方法是施用廣譜化學殺昆蟲劑。然而，人們越來越擔憂與合成化學殺蟲劑的生產(chǎn)和使用相關(guān)的環(huán)境危害。因此，人們有極大興趣開發(fā)替代殺蟲劑，包括使用微生物劑或另一種昆蟲對具有農(nóng)業(yè)意義的昆蟲害蟲進行生物防治。本發(fā)明提供了用于此類生物防治的組合物和方法。本發(fā)明公開了經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽、編碼此類多肽的多核苷酸和使用方法。本發(fā)明提供的經(jīng)修飾的多核苷酸可用于轉(zhuǎn)化生物體和宿主細胞，所述宿主包括植物、昆蟲和微生物。經(jīng)修飾的多肽的表達可為所述宿主提供對抗一種或多種昆蟲病原體的改善的殺昆蟲活性?！緦＠f明】具有對抗玉米根蟲的活性的合成殺昆蟲蛋白【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及植物分子生物學和植物害蟲防治領(lǐng)域。更具體地講，本發(fā)明涉及得自編碼δ-內(nèi)毒素的蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)Cry3家族基因的核酸，S-內(nèi)毒素的特征在于對昆蟲害蟲具有殺蟲活性。本發(fā)明的組合物和方法利用所公開的核酸及其編碼的經(jīng)修飾殺蟲多肽來防治害蟲?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]昆蟲害蟲是造成農(nóng)作物損失的主要因素。西方玉米根蟲(DiabroticavirgiferavirgiferaLeConte)是北美洲最具破壞性的玉米根蟲物種之一，特別是在中西部玉米種植區(qū)。相關(guān)的物種北方玉米根蟲(D.barberiSmithandLawrence)共棲于大部分范圍內(nèi)，并且在生物學方面與西方玉米根蟲相當類似。第三種玉米根蟲物種南方玉米根蟲(D.undecimpunctatahowardi)在其他區(qū)域造成重大經(jīng)濟損失。[0003]玉米根蟲幼蟲如果未經(jīng)治理可破壞相當百分比的玉米。在美國，目前估計有3千萬英畝(120，OOOkm2)的玉米(總種植面積8千萬)受到玉米根蟲侵擾，并且預計在下個20年該區(qū)域會蔓延。美國農(nóng)業(yè)部估計玉米根蟲每年造成10億美元的收入損失，這包括8億美元的產(chǎn)量損失和玉米種植戶2億美元的治理成本。[0004]玉米的大部分損害由幼蟲攝食造成。新孵化的根蟲位于土壤中的玉米根部，最初在細根毛上開始攝食并鉆入玉米植物的根尖。隨著幼蟲長大，它們在主根上攝食并掘入初生根。當大量根蟲出現(xiàn)時，幼蟲攝食以及根腐病原體對受損根的腐化可造成根縮減至莖基部。嚴重的根損傷可妨礙根輸送水和營養(yǎng)物質(zhì)進植物中的能力，從而減緩植物生長并造成谷物產(chǎn)量下降。嚴重的根損傷還可造成玉米植株倒伏，使得收獲更困難。成蟲攝食穗絲可造成穗絲縮減至穗尖，通常稱為穗絲剪斷(silkclipping)。在飼料玉米中，甲蟲群體有時會大得足以在散粉期間造成嚴重的穗絲剪斷，這可能會妨礙授粉。[0005]根螢葉甲屬(Diabrotica)(鞘翅目:葉甲科)的玉米根蟲屬于美國農(nóng)作物最重要的昆蟲害蟲。例如，南方玉米根蟲(SCRW)(DiabroticaundecimpunctatahowardiBarber)是玉米、葫蘆和花生的經(jīng)濟上重要的害蟲。南方玉米根蟲黃瓜--星葉甲(DiabroticaundecimpunctatahowardiBarber)或十一星瓜葉甲(spottedcucumberbeetle)廣泛分布于北美洲，出現(xiàn)于落基山脈東部的大部分地區(qū)、加拿大南部和墨西哥。在美國南部最為眾多并最具破壞性。這種昆蟲為多化性的并且在其分布的南部以成蟲過冬(Branson和Krysan(1981)EnvironmentalEntomology(《環(huán)境昆蟲學》)10:826-831)。南方玉米根蟲感染許多飼料作物和雜草的根部，以及花生、苜蓿且有時為葫蘆的根部。每年，有2千萬至2千5百萬英畝的玉米用土壤殺昆蟲劑處理以保護作物不被玉米根蟲幼蟲攝食損害(Fuller等人(1997)JEconEntomol(《經(jīng)濟昆蟲學雜志》)90:1332-1340)。對玉米根蟲施加的土壤殺昆蟲劑代表美國殺昆蟲劑的主要用途之一。每年與施加以防治幼蟲損害玉米根和防治成蟲損害玉米穗絲的殺昆蟲劑相關(guān)的成本，連同作物損失一起可接近10億美兀(Metcalf(1986),載于:M.Kogan[編輯],EcologicalTheoryandIntegratedPestManagementPractice(《生態(tài)學理論與害蟲綜合治理實踐》)。紐約的約翰.威利父子出版公司(JohnWiley&Sons,NewYork))。[0006]使用微生物劑如真菌、細菌或另一種昆蟲物種對農(nóng)業(yè)上重要的昆蟲害蟲進行生物防治，可提供具有環(huán)境友好性和商業(yè)吸引力的合成化學殺蟲劑替代方案。一般而言，使用生物殺蟲劑具有更低的污染和環(huán)境危害風險。與傳統(tǒng)的廣譜化學殺昆蟲劑的特征相比，生物殺蟲劑還提供更高的靶標特異性。生物殺蟲劑的生產(chǎn)成本往往較低，因此能提高眾多作物的經(jīng)濟產(chǎn)量。[0007]微生物殺昆蟲劑特別是那些從芽孢桿菌(Bacillus)菌株獲得的微生物殺昆蟲劑，在農(nóng)業(yè)上作為害蟲化學防治的替代方案已起到重要的作用。已知芽孢桿菌屬微生物的某些物種對于多種昆蟲害蟲具有殺蟲活性，這些昆蟲害蟲包括鱗翅目(L印idoptera)、雙翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、半翅目(Hemiptera)等等。蘇云金芽孢桿菌和日本金龜芽孢桿菌(Bacilluspapilliae)是至今為止發(fā)現(xiàn)的最成功的生物控制劑的代表。幼蟲芽抱桿菌(B.larvae)、緩病芽抱桿菌(B.1entimorbus)、球形芽抱桿菌(B.sphaericus)的菌株(Harwook編輯，((1989)Bacillus(《芽孢桿菌》)(普萊南出版社(PlenumPress)),306)和蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)的菌株(國際專利申請公布N0.W096/10083)也被指出具有昆蟲致病性。殺蟲活性看起來集中在伴胞晶體蛋白包涵體中，但從芽孢桿菌的營養(yǎng)生長期也分離到殺蟲蛋白。有數(shù)種編碼這些殺蟲蛋白的基因已得到分離和表征(參見例如美國專利N0.5，366，892和N0.5，840，868)。[0008]最近，農(nóng)業(yè)科學家通過對作物進行遺傳工程改造以產(chǎn)生來自芽孢桿菌的殺蟲蛋白，開發(fā)出了抗蟲性增強的作物。例如，已對玉米和棉花植物進行遺傳工程改造以產(chǎn)生從蘇云金芽孢桿菌的菌株分離的殺蟲蛋白。這些蛋白稱為δ-內(nèi)毒素或Cry毒素(參見例如，Aronson(2002)CellMol.LifeSc1.(《細胞分子生命科學》)59(3):417-425;Schn印f等人(1998)MicrobiolMolBiolRev.(《微生物分子生物學評論》)62(3):775-806)。這些經(jīng)遺傳工程改造的作物目前在美國農(nóng)業(yè)中廣泛應(yīng)用，給農(nóng)場主提供了替代傳統(tǒng)昆蟲防治方法的環(huán)境友好的方案。另外，經(jīng)遺傳工程改造而含有殺蟲Cry毒素的馬鈴薯已被出售給美國農(nóng)場主。雖然這些經(jīng)遺傳工程改造的抗昆蟲作物已證明在商業(yè)上十分成功，但它們對僅僅較窄范圍的經(jīng)濟上重要的昆蟲害蟲具有抗性。[0009]因此，仍然需要具有更廣范圍對抗昆蟲害蟲的殺昆蟲活性的新型Bt毒素，包括例如具有對抗鞘翅目的更多種類昆蟲的活性的毒素。此外，仍然需要具有對抗多種昆蟲害蟲的活性的生物殺蟲劑和具有改善的殺昆蟲活性的生物殺蟲劑。【
發(fā)明內(nèi)容】[0010]提供了保護植物免受植物害蟲侵害的組合物和方法。該組合物包含Cry3殺蟲多肽的新型核苷酸和氨基酸序列。本發(fā)明所公開的多肽展現(xiàn)出增強的對植物害蟲的殺蟲活性。還提供了包含編碼本發(fā)明的殺蟲多肽的核苷酸序列的多核苷酸。在一些實施例中，本發(fā)明的經(jīng)修飾的Cry多肽展現(xiàn)出相對于Cry3天然多肽(SEQIDNO:6)改善的殺蟲活性。[0011]本發(fā)明的組合物包含編碼經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽的序列的核酸分子、含有那些核酸分子的載體以及含有所述載體的宿主細胞。組合物還包含多肽序列。核苷酸序列可用于DNA構(gòu)建體或表達盒中，該DNA構(gòu)建體或表達盒用于在生物體(包括微生物和植物)中轉(zhuǎn)化和表達。核苷酸或氨基酸序列可以為設(shè)計用于在生物體(包括但不限于微生物或植物)中表達的合成序列。組合物還包含轉(zhuǎn)化的細菌、植物、植物細胞、植物組織和種子。[0012]具體地講，提供了具有改善活性的經(jīng)修飾的Cry3蛋白。使用計算機模擬(insilico)蛋白質(zhì)序列設(shè)計和DNA改組，鑒定了具有改善的對抗鞘翅目害蟲的殺昆蟲活性的多肽。提供了用于產(chǎn)生本發(fā)明的經(jīng)修飾的多肽和使用此類多肽防治或殺滅所關(guān)注害蟲(特別是鞘翅目害蟲)的方法。[0013]本發(fā)明的組合物和方法可用于產(chǎn)生具有殺蟲劑抗性的生物體，特別是細菌和植物。這些生物體和衍生自它們的組合物對農(nóng)業(yè)用途而言是理想的。本發(fā)明的組合物還可用于生成改變的或改善的殺蟲蛋白。[0014]本發(fā)明涵蓋以下實施例:[0015]1.一種經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽，所述多肽具有一個或多個氨基酸置換，該氨基酸置換賦予所述多肽在pH為5至9的溶液中更大的溶解度。[0016]2.實施例1的經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽，其中所述一個或多個置換位于選自如下位置的位置，所述位置對應(yīng)于SEQIDN0:6的位置12、63、97、106、117、119、140、152、158、186、206、221、222、230、232、258、292、294、340、346、384、468、472、491、496、503、557、584、589、593和610。[0017]3.一種經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽，所述多肽包含至少一個氨基酸置換，其中所述置換使所述多肽比野生型Cry3多肽的堿性更弱。[0018]4.實施例3的經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽，其中所述置換包括將堿性氨基酸替換為中性或酸性氨基酸，將中性氨基酸替換為酸性氨基酸，或它們的組合。[0019]5.實施例3的經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽，其中所述置換位于選自如下位置的位置:所述位置對應(yīng)于SEQIDN0:6的位置12、63、97、106、117、119、140、152、158、186、206、221、222、230、232、258、292、294、340、346、384、468、472、491、496、503、557、584、589、593和610。[0020]6.實施例4的經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽，其中所述堿性氨基酸殘基包括組氨酸、賴氨酸或精氨酸殘基并且所述酸性和/或中性氨基酸殘基包括谷氨酸或天冬氨酸殘基。[0021]7.實施例4的經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽，其中所述堿性氨基酸殘基包括組氨酸、賴氨酸或精氨酸殘基并且所述酸性和/或中性氨基酸殘基包括絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸或纈氨酸殘基。[0022]8.實施例1-7中任一項的經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽，其中所述多肽包含與SEQIDN0:l、2、3、8、ll或14所示的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。[0023]9.實施例8的經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:1、2、3、8、11或14所示的氨基酸序列。[0024]10.實施例1-8中任一項的經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽，其中所述多肽還包含與SEQIDN0:6的位置152或158相對應(yīng)的至少一個氨基酸置換，其中所述多肽表現(xiàn)出對蛋白酶消化的抗性。[0025]11.實施例1-10中任一項的經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽的片段或變體，其中所述片段或變體保留殺蟲活性。[0026]12.一種多核苷酸，其具有編碼實施例1-10中任一項的經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽的核苷酸序列。[0027]13.一種DNA構(gòu)建體，其包含實施例12的多核苷酸。[0028]14.實施例13的DNA構(gòu)建體，其中所述多核苷酸有效連接至驅(qū)動在微生物或植物中表達的啟動子。[0029]15.實施例14的DNA構(gòu)建體，其中所述啟動子驅(qū)動在植物中表達。[0030]16.實施例14的DNA構(gòu)建體，其中所述啟動子為根偏好的啟動子。[0031]17.一種植物，其包含實施例12的多核苷酸。[0032]18.一種植物，其包含實施例13-16中任一項的DNA構(gòu)建體。[0033]19.實施例17或18的植物，其中所述植物為單子葉植物。[0034]20.實施例17或18的植物，其中所述植物為雙子葉植物。[0035]21.實施例19的植物，其中所述單子葉植物選自玉蜀黍、甘蔗、小麥、水稻、大麥、高粱和黑麥。[0036]22.實施例21的植物，其中所述單子葉植物為玉蜀黍。[0037]23.一種轉(zhuǎn)基因植物，其表達實施例1-10中任一項的多肽。[0038]24.實施例23的植物，其中所述植物為單子葉植物。[0039]25.實施例23的植物，其中所述植物為雙子葉植物。[0040]26.實施例24的植物，其中所述單子葉植物選自玉蜀黍、甘蔗、小麥、水稻、大麥、高粱和黑麥。[0041]27.實施例26的植物，其中所述單子葉植物為玉蜀黍。[0042]28.一種轉(zhuǎn)基因種子，其由實施例17-27中任一項的植物產(chǎn)生。[0043]29.一種產(chǎn)生具有改善的殺蟲活性的植物的方法，所述方法包括將具有編碼經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽的核苷酸序列的多核苷酸引入所述植物中，所述多肽具有至少一個氨基酸置換，其中所述置換包括將堿性氨基酸殘基替換為酸性或中性氨基酸，其中所述多核苷酸序列有效連接至驅(qū)動在植物細胞中表達的啟動子序列，并且其中所述多肽具有相對于野生型Cry3多肽改善的殺蟲活性。[0044]30.實施例29的方法，其中所述經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽具有至少一個氨基酸置換，所述置換位于選自如下位置的位置，所述位置對應(yīng)于SEQIDN0:6的位置12、63、97、106、117、119、140、152、158、186、206、221、222、230、232、258、292、294、340、346、384、468、472、491、496、503、557、584、589、593和610。[0045]31.實施例29的方法，其中所述經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽包含氨基酸置換，所述置換將一個或多個組氨酸、賴氨酸或精氨酸殘基替換為谷氨酸或天冬氨酸殘基。[0046]32.實施例29的方法，其中所述經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽包含氨基酸置換，所述置換將一個或多個組氨酸、賴氨酸或精氨酸殘基替換為絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸或纈氨酸殘基。[0047]33.實施例29-32中任一項的方法，其中所述經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽包含與SEQIDN0:l、2、3、8、ll或14所示的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。[0048]34.實施例33的方法，其中所述經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽包含SEQIDNO:1、2、3、8、11或14所示的氨基酸序列。[0049]35.實施例29-33中任一項的方法，其中所述經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽包含與SEQIDN0:6的位置152或158相對應(yīng)的至少一個氨基酸置換，所述置換給所述多肽賦予對蛋白酶消化的抗性。[0050]36.實施例31或32的方法，其中所述經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽包含SEQIDNO:1、2、3、8、11或14的片段或變體，其中所述片段或變體保留殺昆蟲活性。[0051]37.一種用于防治耕作區(qū)的昆蟲害蟲的方法，其包括在所述區(qū)域種植實施例28的轉(zhuǎn)基因種子。[0052]38.一種微生物，其包含實施例12的多核苷酸或?qū)嵤├?3或14的DNA構(gòu)建體。[0053]39.一種轉(zhuǎn)基因微生物，其表達實施例1-10中任一項的經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽。[0054]40.一種殺蟲組合物，其包含實施例38或39的至少一種微生物。[0055]41.一種用于防治耕作區(qū)的昆蟲害蟲的方法，其包括向所述昆蟲害蟲的環(huán)境施加有效量的實施例40的殺蟲組合物。[0056]42.實施例41的方法，其中所述昆蟲害蟲為鞘翅目昆蟲?！緦＠綀D】【附圖說明】[0057]圖1示出了本發(fā)明的Cry3殺蟲多肽序列，其中突出顯示了替換的殘基及其位置?！揪唧w實施方式】[0058]本發(fā)明涉及用于影響昆蟲害蟲尤其是植物昆蟲害蟲的組合物和方法。提供了涉及增加Cry3內(nèi)毒素毒性的組合物和方法。本發(fā)明的組合物包括新型的經(jīng)修飾的殺蟲多肽(如，蛋白質(zhì))的核苷酸和氨基酸序列。核苷酸和氨基酸序列的修飾包括將堿性氨基酸殘基替換為酸性或中性氨基酸殘基。例如，可將堿性氨基酸(精氨酸、組氨酸和賴氨酸)的任何一者替換為酸性氨基酸(如，天冬氨酸和谷氨酸)或中性氨基酸(如，絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸和纈氨酸)。[0059]本發(fā)明的Cry3多肽可通過如下任何一者進行設(shè)計:計算機模擬蛋白質(zhì)設(shè)計、DNA序列改組和定點誘變，以將堿性氨基酸殘基更改為中性或酸性殘基。在任何修飾之后，測試所得多肽的殺昆蟲活性。提供了具有SEQIDN0:l、2、3、8、ll或14所示的氨基酸序列或其變體或片段的多肽。還提供了包含編碼SEQIDNO:1,2，3，8，11或14中所示的氨基酸序列或其變體或片段的核苷酸序列的多核苷酸，包括但不限于SEQIDN0:7、9、10、12、13和15，以及其變體和片段。[0060]天然存在的Cry3Aa蛋白不溶于中性pH處或附近的低鹽緩沖液。這些低鹽和中性PH條件模擬玉米根蟲(CRW)腸道的環(huán)境。因此，Cry3Aa對抗西方玉米根蟲(WCRW)和南方玉米根蟲(SCRW)的活性非常低。本發(fā)明的一些氨基酸置換給經(jīng)修飾的Cry3Aa多肽賦予在具有約PH5至約pH9的pH的溶液中相對于天然Cry3Aa多肽更大溶解度。本發(fā)明的氨基酸置換包括使Cry3多肽堿性變?nèi)醯哪切?。因此，氨基酸置換包括將堿性氨基酸替換為中性或酸性氨基酸，以及將中性氨基酸置換為酸性氨基酸。這些氨基酸置換可對任何Cry3多肽進行，包括天然的(如，天然存在的)、突變的或改組的序列。這些變化可增加Cry3多肽在根蟲腸道的溶解度。本發(fā)明的核酸分子和核苷酸序列可用于轉(zhuǎn)化任何生物體以產(chǎn)生所編碼的經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽。本發(fā)明提供涉及使用這種經(jīng)轉(zhuǎn)化的生物體來影響或者防治植物害蟲的方法。[0061]因此，本發(fā)明的經(jīng)修飾的Cry3多肽包括經(jīng)修飾而使多肽堿性變?nèi)醯腃ry3多肽。也就是說，本發(fā)明的經(jīng)修飾的Cry3多肽包含將堿性氨基酸替換為中性氨基酸或?qū)⒅行园被崽鎿Q為酸性氨基酸的置換。在野生型(如，天然存在的)Cry3序列，特別是SEQIDN0:6中進行置換以將堿性氨基酸替換為更弱堿性(如，中性或酸性)的氨基酸。[0062]本發(fā)明的新型殺蟲多肽和核苷酸序列可通過重組工程改造，例如通過DNA改組然后定點誘變來生成。這些改組的多肽表現(xiàn)出增加的溶解度以及增加的對抗WCRW和SCRW的殺昆蟲活性，該活性比天然存在的Cry蛋白例如Cry3Aa和Cry8Bb明顯更高。[0063]在下面的描述中，以廣義方式使用到多個術(shù)語。提供以下定義以幫助理解本發(fā)明。[0064]本文所用的術(shù)語“重組工程改造”或“工程改造的”表示基于對蛋白質(zhì)作用機制的了解和對被引入、缺失或置換的氨基酸的考慮，利用重組DNA技術(shù)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中引入(例如工程改造出)變化。[0065]本文所用的“DNA改組”是指用于同源基因體外重組的方法，其中待重組的基因被DNA酶I隨機片段化。方法是本領(lǐng)域熟知的(如，Joern(2003)MethodsinMolecularBiology(《分子生物學方法》)231:85-89)。然后通過瓊脂糖凝膠純化所得的具有所需大小的片段，并使用變性、退火和聚合酶延伸的多個循環(huán)進行重新組裝。當來自不同親本DNA鏈的片段在高序列同一性區(qū)域退火時發(fā)生重組。該重新組裝之后，將通過多輪PCR擴增產(chǎn)生的全長嵌合體克隆進合適的表達盒中。[0066]本文所用的“計算機模擬蛋白質(zhì)序列設(shè)計”是指使用計算機分子設(shè)計和蛋白質(zhì)序列分析策略修飾蛋白質(zhì)。這些方法利用對蛋白三維結(jié)構(gòu)的分析來指導選擇適當?shù)陌被嵝蛄幸员阍谒P(guān)注蛋白中產(chǎn)生所需性質(zhì)或功能。已經(jīng)開發(fā)了多種用于計算機模擬蛋白質(zhì)設(shè)計的學術(shù)軟件包，并且可用于本發(fā)明，包括但不限于3D-JIGSAW、CPHModel,GeneSilico,1-TASSER、SWISS-MODEL、SelvitaProteinModelingPlatform、Abalone、G0R和Phobius。[0067]本文所用的術(shù)語“Cry3”或“Cry3家族”是指本發(fā)明的核苷酸或氨基酸序列，其與之前描述的歸類為Cry3和/或CryIII的序列具有高度的序列同一性或相似性。在一些實施例中，本發(fā)明的序列與如下序列具有高度的序列同一性或相似性:Cry3Aal(SEQIDN0:6或16)、Cry3Aa2(SEQIDNO:17)、Cry3Aa3(SEQIDNO:18)、Cry3Aa4(SEQIDNO:19)、Cry3Aa5(SEQIDNO:20)、Cry3Aa6(SEQIDNO:21)、Cry3Aa7(SEQIDNO:22)、Cry3Aa8(SEQIDN0:23)、Cry3Aa9(SEQIDNO:24)、Cry3Aa10(SEQIDN0:25)、Cry3Aall(SEQIDNO:26)、Cry3Aal2(SEQIDNO:27)、Cry3Bal(SEQIDNO:28)、Cry3Ba2(SEQIDNO:29)、Cry3Bbl(SEQIDNO:30),Cry3Bb2(SEQIDNO:31)、Cry3Bb3(SEQIDNO:32)或Cry3Cal(SEQIDNO:33)。在一些這些實施例中，本發(fā)明的序列與Cry3Aa蛋白質(zhì)具有高度的序列同一性或相似性。[0068]本發(fā)明的序列是由天然存在的(即，存在于自然界的)Cry3序列修飾而成，因為它們具有至少一個氨基酸置換，并且本文稱為“經(jīng)修飾的(>73”序列(核苷酸或多肽)。在一些實施例中，經(jīng)修飾的Cry3序列為經(jīng)修飾的Cry3Aa序列。[0069]本發(fā)明的經(jīng)修飾的Cry3序列在低鹽溶液中在中性pH下表現(xiàn)出高溶解度。因此，本發(fā)明的序列高度可溶于CRW的腸道和具有約pH5至約pH9的pH的溶液。在一個實施例中，將暴露的堿性氨基酸殘基替換為更酸性的氨基酸殘基，從而提供負電荷。同樣，可將堿性氨基酸替換為中性氨基酸并可將中性氨基酸替換為酸性氨基酸。所謂“暴露的堿性氨基酸殘基”旨在表示毒素晶體結(jié)構(gòu)表面上的為組氨酸、賴氨酸或精氨酸的那些氨基酸。因此，經(jīng)修飾的Cry3序列在位置12、63、97、106、117、119、140、152、158、186、206、221、222、230、232、258、292、294、340、346、384、468、472、491、496、503、557、584、589、593和610處具有一個或多個氨基酸置換。這些位置是相對于SEQIDNO:6所示的野生型Cry3Aal多肽而言的。[0070]可以在上述位置處進行至少一個修飾。此類修飾包括將堿性氨基酸置換為更酸性或中性的氨基酸殘基。此類酸性氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。酸性氨基酸為極性的并且在生理pH下帶負電。此類酸性氨基酸置換的例子可包括但不限于K63E、N97D、K152E、R158E、K222S、K384E和K496E。[0071]在另一方面，本發(fā)明提供對Cry3Aa進行的一個或多個修飾，使得該蛋白質(zhì)在玉米根蟲(CRW)腸道環(huán)境中的溶解度增加(如，增大)。天然Cry3Aa蛋白不表現(xiàn)出對CRW的殺昆蟲活性，在不存在高鹽的情況下在PH5至pH9范圍中高度不溶(Li等人(1991)Nature(《自然》)353:815-821)。表現(xiàn)出高CRW活性的經(jīng)修飾的Cry3Aa序列(參見實例I中作為IP3-H列出的變體)在與CRW腸道pH相似的約pH7(即，pH5至pH9)處表現(xiàn)出高溶解度。[0072]應(yīng)認識到，可以修飾Cry3多肽中的一個或多個氨基酸。在所有情況下，可在多個位點進行改變或修飾，并測試所得毒素蛋白的活性。因此，由包含突變的核苷酸序列所編碼的多肽相對于天然(即，天然存在的)或背景序列，將包含至少一個氨基酸改變或添加，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、35、38、40、45、47、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450、500、550、600、620、630、640個或最多652個氨基酸改變。[0073]在另一個實施例中，可對與天然存在的蛋白質(zhì)(如SEQIDNO:6)的位置152和158相對應(yīng)的位置處的至少一個蛋白酶敏感殘基進行修飾以給該蛋白質(zhì)賦予對蛋白酶消化的抗性，特別是對抗胰蛋白酶的抗性。在一個實施例中，修飾包括下列置換中的至少一者:與SEQIDN0:6相對應(yīng)的K152E和R158E。這些殘基位于α3和4之間的環(huán)區(qū)(loop)?？墒顾鰵埢械闹辽僖徽咄蛔?。突變給該蛋白質(zhì)賦予對玉米根蟲(CRW)腸道中的胰蛋白酶消化的抗性。這樣，可在該位點進行改變并針對消化性測試該蛋白質(zhì)。該位點處的降低腸道消化性的任何改變均涵蓋于本文中。其他修飾可包括以下置換中的至少一者:與SEQIDN0:6相對應(yīng)的K63E、N97D、K152E、R158E、K222S、K384E和K496E。本文所用的術(shù)語“蛋白水解位點”或“切割位點”指這樣的氨基酸序列，其賦予對一類蛋白酶或某種特定蛋白酶的敏感性，使得含有該氨基酸序列的多肽被該類蛋白酶或該特定蛋白酶消化。蛋白水解位點據(jù)稱對能識別該位點的蛋白酶“敏感”。本領(lǐng)域認識到，消化的效率會不同，而消化效率的降低可導致多肽在昆蟲腸道中的穩(wěn)定性或壽命提高。因此，蛋白水解位點可賦予對不止一種蛋白酶或一類蛋白酶的敏感性，但各種蛋白酶在該位點的消化效率可不同。蛋白水解位點包括例如胰蛋白酶位點、胰凝乳蛋白酶位點和彈性蛋白酶位點。[0074]在一些實施例中，本發(fā)明所公開的殺蟲多肽或其變體或片段與衍生它們的親本多肽(如，SEQIDN0:6、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33)相比時表現(xiàn)出改善的殺蟲活性。本文所用的術(shù)語“殺蟲活性”和“殺昆蟲活性”同義地用來指某生物體或物質(zhì)(例如蛋白質(zhì))的可以通過害蟲在取食和暴露達適當時長后害蟲死亡率、害蟲體重減輕、害蟲排斥性和害蟲其他行為和身體的變化(但不限于通過這些方面)進行測量的活性。這樣，殺蟲活性可影響害蟲健康狀況的至少一個可測量參數(shù)。本文所用的“害蟲”意指干擾植物發(fā)育和/或生長或?qū)ζ溆泻Φ纳矬w。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，并非所有物質(zhì)或其混合物對所有害蟲同樣有效。本文特別關(guān)注的是用作殺昆蟲劑從而具有對抗昆蟲害蟲的生物活性的殺蟲多肽。因此，具有殺蟲活性的生物體或物質(zhì)不利地影響害蟲健康狀況的至少一個可測量參數(shù)。例如，“殺蟲蛋白”是本身顯示殺蟲活性或與其他蛋白質(zhì)組合而顯示殺蟲活性的蛋白質(zhì)。[0075]評估殺蟲活性的測定法是本領(lǐng)域公知的。參見例如美國專利N0.6，570，005和N0.6，339，144。還可參見Brooke等人(2001)Bull.Entomol.Res.(《昆蟲學研究通報》)91:265-272；Chen等人(2007)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美國國家科學院院刊》)104:13901-13906;Crespo等人(2008)Appl.Environ.Microb.(《應(yīng)用與環(huán)境微生物學》)74:130-135；Khambay等人(2003)PestManag.Sc1.(《害蟲治理科學》)59:174-182；Liu和Dean(2006)ProteinEng.Des.Sel.(《蛋白質(zhì)工程、設(shè)計與選擇》)19:107-111；Marrone等人(1985)J.Econ.Entomol.(《經(jīng)濟昆蟲學雜志》)78:290-293；Robertson等人，PesticideBioassayswithArthropods(《節(jié)肢動物的殺蟲劑生物測定》)(第2版，CRC出版社，2007)；Scott和McKibben(1976)J.Econ.Entomol.(《經(jīng)濟昆蟲學雜志》)71:343-344；Strickman(1985)Bull.Environ.Contam.Toxicol.(《環(huán)境污染與毒物學通報》)35:133-142;Verma等人(1982)WaterRes.(《水研究》)16525-529；以及美國專利N0.6，268，181。昆蟲生物測定法的例子包括但不限于害蟲在取食和暴露于殺蟲劑或殺蟲多肽達適當時長后的害蟲死亡率、害蟲體重減輕、害蟲排斥性、害蟲吸引性和害蟲其他行為和身體的變化。一般方法包括將殺蟲劑、殺蟲多肽或具有殺蟲多肽的生物體添加至封閉容器中的飲食來源。參見例如美國專利N0.6，339，144和N0.6，570，005。然后在取食和暴露適當?shù)囊欢螘r間后，通過(但不限于)死亡率變化、體重減輕、吸引、排斥和其他行為和身體的變化來測量殺蟲活性。[0076]用于測試殺蟲活性的優(yōu)選發(fā)育階段為這些上述昆蟲害蟲的幼蟲或不成熟形態(tài)?？蓪⒗ハx在完全黑暗中在約20°C至約30°C和約30%至約70%相對濕度下飼養(yǎng)?？扇缫韵挛墨I中所述進行生物測定法:Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.(《經(jīng)濟昆蟲學雜志》)83(6):2480-24850飼養(yǎng)昆蟲幼蟲和進行生物測定法的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。[0077]在本發(fā)明的一些實施例中，殺蟲基因編碼蘇云金芽孢桿菌(Bt)毒素或其變體，特別是已知Cry毒素的同源物?！癇t”或“蘇云金芽孢桿菌”毒素旨在表示在多種蘇云金芽孢桿菌菌株中存在的類別更廣泛的毒素，包括諸如植物性殺昆蟲蛋白和S-內(nèi)毒素之類的毒素。參見例如Crickmore等人(1998)Microbiol.Molec.Biol.Rev.(《微生物學與分子生物學評論》)62:807-813;和Crickmore等人(2004)發(fā)表于lifesc1.sussex.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt的BacillusThuringiensisToxinNomenclature(蘇云金芽抱桿菌毒素命名法)，所述兩篇文獻全文均以引用的方式并入本文。植物殺昆蟲蛋白(例如VIPl類、VIP2類或VIP3類的成員)是分泌性殺昆蟲蛋白，由昆蟲中腸液進行蛋白水解加工。它們對廣譜的鱗翅目昆蟲具有殺蟲活性。參見例如美國專利N0.5，877，012，其全文以引用的方式并入本文。Btδ-內(nèi)毒素對多種昆蟲害蟲(包括鱗翅目、雙翅目和鞘翅目的成員)的幼蟲有毒性。這些昆蟲毒素包括但不限于Cry毒素，包括例如Cryl、Cry3、Cry5、Cry8和Cry9。特別關(guān)注的是與已知Cry3基因同源的殺蟲基因。在某些情況下，本發(fā)明的多肽δ-內(nèi)毒素和編碼它們的核苷酸序列將與野生型(即，天然存在的)Cry3序列(如，SEQIDNO:6、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33)具有高度的序列同一性或相似性。在這些實施例的一些中，本發(fā)明的殺蟲多肽和編碼它們的核苷酸序列將與野生型Cry3Aa序列具有高度的序列同一性或相似性。[0078]Cry內(nèi)毒素最初以無活性原毒素形式產(chǎn)生，該形式通過昆蟲腸道中蛋白酶的作用而蛋白水解轉(zhuǎn)化為活性內(nèi)毒素。一旦具有活性，內(nèi)毒素就結(jié)合至腸道上皮細胞并形成陽離子選擇性通道，造成細胞溶解并隨后死亡。參見Carroll等人(1997)J.1nvertebr.Pathol.(《無脊椎動物病理學雜志》)70:41-49；Oppert(1999)Arch.1nsectBiochem.Phys.(《昆蟲生物化學與生理學文獻》)，42:1-12JPRukmini等人(2000)Biochimie(《生物化學》)82:109-116。[0079]BtCry蛋白具有五個保守序列域和三個保守結(jié)構(gòu)域(參見例如，deMaagd等人(2001)TrendsGenetics(《遺傳學趨勢》)17:193-199)。大多數(shù)氨基末端的保守結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域I)由七個α螺旋組成,其中中央疏水螺旋-α5被六個其他兩親螺旋包圍，并且參與膜插入和孔形成。第二保守結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域II)由涉及細胞結(jié)合的三個反平行的β-折疊片組成，并且大多數(shù)羧基末端的保守結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域III)由β_夾層組成。結(jié)構(gòu)域II和III中的暴露區(qū)域參與受體識別和結(jié)合，因此被認為是毒素特異性的決定因素。這些結(jié)構(gòu)域的位置和性質(zhì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。參見例如Grochulski等人(1995)JMolBiol(《分子生物學雜志》)254:447-464；Morse,Yamamoto和Stroud(2001)Structure(《結(jié)構(gòu)》)9:409-417；Li等人(1991)Nature(《自然》)353:815-821;Galitsky等人(2001)ActaCryst(《晶體學報》)D57:1101-1109;Boonserm等人(2006)JBacteriol(《細菌學雜志》)188:3391-3401；Boonserm等人(2005)JMolBiol(《分子生物學雜志》)348:363-382;以及Guo等人(2009)JStructBiol(《結(jié)構(gòu)生物學雜志》)168:259-266。[0080]具有“改善的殺蟲活性”或“改善的殺蟲活性”的多肽可指多肽與參考多肽(如，天然存在的Cry3多肽)相比表現(xiàn)出對抗單種植物害蟲的活性或?qū)箯V譜植物害蟲的活性增加。在一些實施例中，本發(fā)明所公開的殺蟲多肽或其變體或片段與天然存在的Cry3多肽(如，SEQIDN0:6、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33)相比時表現(xiàn)出改善的殺蟲活性。在某些實施例中，本發(fā)明所公開的殺蟲多肽與天然存在的多肽(如，SEQIDN0:6、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33)相比表現(xiàn)出高2倍至100倍的對抗至少一種敏感昆蟲害蟲的活性，包括但不限于約2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍和100倍。改善的或增強的殺蟲活性的發(fā)現(xiàn)，要求證明針對同一害蟲進行測定，相對于天然存在的多肽的殺蟲活性而言，對昆蟲靶標的殺蟲活性提高至少10%，或者殺蟲活性提高至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、100%、150%,200%或300%或者更高。[0081]在某些實施例中，本發(fā)明所公開的殺蟲多肽或其變體或片段與天然存在的Cry3多肽相比時表現(xiàn)出更高的對抗鞘翅目害蟲的殺蟲活性。在這些實施例的一些中，經(jīng)修飾的Cry3多肽與天然存在的Cry3多肽相比時具有更高的對抗根蟲(包括但不限于南方玉米根蟲或西方玉米根蟲)的殺蟲活性。[0082]本發(fā)明的組合物包括編碼殺蟲多肽的核酸及其片段和變體。具體地講，本發(fā)明提供編碼SEQIDN0:l、2、3、8、ll或14中所示氨基酸序列的經(jīng)修飾的核苷酸序列。還提供了具有由本文所述核酸分子編碼的氨基酸序列的經(jīng)修飾的多肽。[0083]本發(fā)明涵蓋分離的或?qū)嵸|(zhì)上純化的多核苷酸或蛋白質(zhì)組合物?！胺蛛x的”或“純化的”多核苷酸或蛋白質(zhì)或其生物活性部分，實質(zhì)上或基本上不含通常在該多核苷酸或蛋白質(zhì)的天然環(huán)境中存在的、與該多核苷酸或蛋白質(zhì)相伴隨或相互作用的成分。因此，分離的或純化的多核苷酸或蛋白質(zhì)，當通過重組技術(shù)產(chǎn)生時基本上不含其他細胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或者當通過化學法合成時基本上不含化學前體或其他化學品。最佳的是，“分離的”多核苷酸不含在衍生該多核苷酸的生物體的基因組DNA中天然位于該多核苷酸的旁側(cè)的序列(即位于該多核苷酸的5’和3’末端的序列)(最佳的是蛋白質(zhì)編碼序列)。例如，在多個實施例中，分離的多核苷酸可含有少于約5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0.5kb或0.1kb的在衍生該多核苷酸的細胞的基因組DNA中天然位于該多核苷酸的旁側(cè)的核苷酸序列。基本上不含細胞物質(zhì)的蛋白質(zhì)包括具有小于約30%、20%、10%、5%或1%(以干重計)的污染性蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的制備物。[0084]核苷酸和氨基酸序列及由其所編碼的多肽的片段和變體也為本發(fā)明所涵蓋。本文所用的術(shù)語“片段”是指本發(fā)明的多核苷酸的核苷酸序列的一部分或者多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可編碼保持天然的或相應(yīng)的全長蛋白質(zhì)的生物活性從而具有相關(guān)生物活性例如殺蟲活性的蛋白質(zhì)片段。[0085]作為經(jīng)修飾的Cry3家族核苷酸序列的片段的核酸包含至少16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、1，000,1,200,1,400,1,600,1,800或1900個核苷酸或最多至本文所公開的經(jīng)修飾的Cry3家族核苷酸序列中所存在的核苷酸數(shù)目。在特定實施例中，本發(fā)明的核酸公開了衍生自(如產(chǎn)生自)本發(fā)明核酸的片段，其中所述片段編碼經(jīng)截短修飾的表征為殺蟲活性的Cry3家族內(nèi)毒素。由本發(fā)明的多核苷酸片段編碼的截短多肽表征為這樣的殺蟲活性，該殺蟲活性相對于衍生該片段的核酸所編碼的相應(yīng)全長多肽的活性，是相當?shù)幕虻玫礁纳?。在一些實施例中，本發(fā)明的核酸片段在天然或相應(yīng)的全長編碼序列的3’末端截短。核酸片段也可同時在天然或相應(yīng)的全長編碼序列的5’和3’末端截短。[0086]此外，應(yīng)當理解本發(fā)明還涵蓋這樣的多肽，其為本發(fā)明示例性殺蟲蛋白的片段并且長度為本發(fā)明殺蟲多肽的至少約100、約200、約300、約400、約500、約600、約620、約630、約640、約641、約642、約643或約644個連續(xù)氨基酸并且保留殺蟲活性。[0087]本文所用的術(shù)語“變體”是指基本上類似的序列。變體核苷酸序列包括核苷酸序列，如那些例如通過使用定點誘變產(chǎn)生但仍編碼本發(fā)明的殺蟲蛋白的核苷酸序列。通常，通過本文別處描述的序列比對程序使用默認參數(shù)測定，本發(fā)明的特定核苷酸序列的變體將與該特定核苷酸序列具有至少約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高的序列同一性。本發(fā)明的核苷酸序列的變體可與該序列相差少至1-15個核苷酸、少至1-10個如6-10個、少至5個、少至4個、3個、2個或甚至I個核苷酸。[0088]本發(fā)明的特定核苷酸序列(即示例性的核苷酸序列)的變體,也可通過比較由變體核苷酸序列編碼的多肽與參考核苷酸序列編碼的多肽之間的序列同一性百分數(shù)來進行評價。任何兩個多肽之間的序列同一性百分數(shù)可用本文別處描述的序列比對程序使用默認參數(shù)進行計算。在任何給定的本發(fā)明多核苷酸對是通過比較它們編碼的兩個多肽所具有的序列同一性百分數(shù)進行評價的情況中，兩條編碼的多肽之間的序列同一性百分數(shù)為至少約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%或至少約98%、約99%或更高的序列同一性。本發(fā)明的蛋白質(zhì)的生物活性變體與該蛋白可相差少至1-15個氨基酸殘基，少至1-10個(如6-10個)、少至5個、少至4個、3個、2個或甚至I個氨基酸殘基。[0089]本文所用的術(shù)語“變體蛋白”涵蓋通過如下方式衍生自本發(fā)明多肽的多肽:在該天然蛋白質(zhì)的N末端和/或C末端缺失(所謂的截短)或者添加一個或者多個氨基酸；在該天然蛋白質(zhì)中的一個或者多個位點缺失或者添加一個或者多個氨基酸；或者在該天然蛋白質(zhì)中的一個或者多個位點置換一個或者多個氨基酸。因此，術(shù)語“變體蛋白”涵蓋這樣的生物活性片段，其包含足夠數(shù)目的連續(xù)氨基酸殘基以保持本發(fā)明多肽的生物活性，即具有殺蟲活性。[0090]本發(fā)明的經(jīng)修飾的Cry3家族蛋白質(zhì)可通過多種方式(包括氨基酸置換、缺失、截短和插入)進行變更。這類操縱的方法是本領(lǐng)域公知的。例如，可通過向合成的核酸(例如DNA分子)中引入突變來制備殺蟲蛋白的氨基酸序列變體。誘變和核酸變更的方法是本領(lǐng)域公知的。例如，可使用寡核苷酸介導的定點誘變技術(shù)來引入所設(shè)計的變化。參見例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美國國家科學院院刊》)82:488-492；KunkeI等人(1987)MethodsinEnzymo1.(《酶學方法》)154:367-382;美國專利N0.4，873，192；ffalker和Gaastra編輯(1983)TechniquesinMolecularBiology(《分子生物學技術(shù)》)(紐約麥克米蘭出版公司(MacMillanPublishingCompany,NewYork));以及其中引用的參考文獻。[0091]本發(fā)明的核苷酸序列可在用于影響害蟲特別是害蟲(如鞘翅目害蟲)的方法中直接使用。[0092]以下術(shù)語用于描述兩個或更多個多核苷酸或多肽之間的序列關(guān)系:(a)“參考序列”、(b)“比較窗口”、(C)“序列同一性”以及⑷“序列同一性百分數(shù)”。[0093](a)本文所用的“參考序列”是用作序列比較的基礎(chǔ)的確定的序列。參考序列可以是指定序列的子集或全部；例如，為全長cDNA或者基因序列的區(qū)段或者完整的cDNA或者基因序列。[0094](b)本文所用的“比較窗口”是指多核苷酸序列的連續(xù)和指定的區(qū)段，其中該比較窗口中的該多核苷酸序列相比于參考序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，以便兩個多核苷酸的最佳比對。通常，比較窗口長度為至少20個連續(xù)的核苷酸，任選可為30、40、50、100個或者更長。本領(lǐng)域技術(shù)人員認識到，為避免由于在多核苷酸序列中加入空位所致的與參考序列的高度相似性，通常引入空位罰分并從匹配數(shù)扣除空位罰分。[0095]將序列進行比對以作比較的方法是本領(lǐng)域公知的。因此，對任何兩個序列之間的序列同一性百分數(shù)的確定，可使用數(shù)學算法來完成。此類數(shù)學算法的非限制性例子是Myers和Miller(1988)CABIOS(《計算機在生物科學中的應(yīng)用》)4:11-17的算法；Smith等人(1981)Adv.Appl.Math.(《應(yīng)用數(shù)學進展》)2:482的局部比對算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.(《分子生物學雜志》)48:443-453的全局比對算法；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sc1.(《美國國家科學院院刊》)85:2444-2448的搜索局部比對方法；Karlin和Altschul(1990)Proc..Natl.Acad.Sc1.USA(《美國國家科學院院刊》)872264的算法，其在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美國國家科學院院刊》)90:5873-5877中作了修正。[0096]可利用這些數(shù)學算法的計算機執(zhí)行進行序列的比較，從而確定序列同一性。此類程序包括但不限于:PC/Gene程序(可獲自美國加利福尼亞州山景城Intelligenetics公司(Intelligenetics,MountainView,California))中的CLUSTAL；GCGffisconsinGeneticsSoftwarePackage1''版本10(可得自美國加利福尼亞州圣地亞哥斯克蘭頓路9685號的Accelrys有限公司(AccelrysInc.,9685ScrantonRoad,SanDiego,California,USA))中的ALIGN程序(版本2.0)和GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。使用這些程序的序列比對可用默認參數(shù)來進行。以下文獻對CLUSTAL程序進行了詳細描述=Higgins等人(1988)Gene(《基因》)73:237-244(1988);Higgins等人(1989)，CABIOS(《計算機在生物科學中的應(yīng)用》)5:151-153;Corpet等人(1988)NucleicAcidsRes.(《核酸研究》)16:10881-90；Huang等人(1992)，CABIOS(《計算機在生物科學中的應(yīng)用》)8:155-65;以及Pearson等人(1994)Meth.Mol.Biol.(《分子生物學方法》)24:307-331。ALIGN程序是基于Myers和Miller(1988)(出處同上)的算法。當比較氨基酸序列時，ALIGN程序可使用PAM120加權(quán)殘基表(weightresiduetable)、空位長度罰分12和空位罰分4。Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.(《分子生物學雜志》)215:403的BLAST程序是基于Karlin和Altschul(1990)(出處同上)的算法。BLAST核苷酸搜索可用BLASTN程序、得分=100、字長=12來進行，以獲得與編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質(zhì)搜索可用BLASTX程序、得分=50、字長=3來進行，以獲得與本發(fā)明蛋白質(zhì)或多肽同源的氨基酸序列。為出于比較目的獲得帶空位的比對，可如Altschul等人(1997)NucleicAcidsRes.(《核酸研究》)25:3389中所描述采用GappedBLAST(在BLAST2.0中)?；蛘撸墒褂肞S1-BLAST(在BLAST2.0中)來進行迭代搜索，該搜索可檢測分子之間的遠源關(guān)系。參見Altschul等人(1997)，出處同上。當采用BLAST、GappedBLAST、PS1-BLAST時，可使用各個程序的默認參數(shù)(例如BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白質(zhì))。參見美國國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的互聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)站www.ncb1.him.nih.gov。還可以以手動方式通過檢查來進行比對。[0097]除非另外指明，否則本文提供的序列同一性/相似性值指使用采用如下參數(shù)的GAP版本10或其任何等同程序獲得的值:核苷酸序列的％同一性和％相似性采用GAP權(quán)重50和長度權(quán)重3以及nwsgapdna.cmp打分矩陣；氨基酸序列的％同一'I"生和％相似性采用GAP權(quán)重8和長度權(quán)重2以及BL0SUM62打分矩陣；或其任何等同程序。本文所用術(shù)語的“等同程序”指任何這樣的序列比較程序，其對于任何兩個所考慮的序列，相比于GAP版本10所產(chǎn)生的相應(yīng)比對，能產(chǎn)生出具有相同的核苷酸或氨基酸殘基匹配和相同的序列同一性百分數(shù)的比對。[0098]GAP利用Needleman和Wunsch(1970)(出處同上)的算法來尋找兩個完整序列的能使匹配數(shù)最大而使空位數(shù)最小的比對。GAP會考慮所有可能的比對和空位位置，并產(chǎn)生具有最大數(shù)目的匹配堿基和最少的空位的比對。其允許提供以匹配堿基數(shù)為單位的空位產(chǎn)生罰分和空位延伸罰分。GAP對于其插入的每個空位，都必須利用匹配的空位產(chǎn)生罰分數(shù)。如果選擇大于零的空位延伸罰分，GAP對于每個插入的空位必須另外利用空位長度乘以空位延伸罰分。對于蛋白質(zhì)序列，GCGWisconsinGeneticsSoftwarePackage的版本10中的默認空位產(chǎn)生罰分值和空位延伸罰分值分別為8和2。對于核苷酸序列，默認空位產(chǎn)生罰分為50，而默認空位延伸罰分為3。空位產(chǎn)生罰分和空位延伸罰分可以以選自0-200的整數(shù)來表示。因此，例如，空位產(chǎn)生罰分和空位延伸罰分可為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。[0099]GAP給出具有最好的比對的家族中的一個成員。這個家族可能存在許多成員，但其他成員沒有更好的品質(zhì)。GAP顯示用于比對的四個優(yōu)值因子:品質(zhì)、比率、同一性和相似性。品質(zhì)是為了比對序列而被最大化的指標(metric)。比率是品質(zhì)除以較短區(qū)段中的堿基數(shù)。同一性百分數(shù)是實際匹配的符號的百分數(shù)。相似性百分數(shù)是相似的符號的百分數(shù)。將對應(yīng)于空位的符號忽略。當一對符號的打分矩陣值大于或等于0.50(相似性閾值)時，對相似性打分。GCGWisconsinGeneticsSoftwarePackage的版本10中使用的記分矩陣為BL0SUM62(參見Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美國國家科學院院刊》)89:10915)。[0100](C)在兩個多核苷酸或多肽序列的情形中，本文所用的“序列同一性”或“同一性”是指當在指定的比較窗口上進行比對以獲得最大對應(yīng)時兩個序列中相同的殘基。當序列同一性百分數(shù)針對蛋白質(zhì)使用時，應(yīng)認識到，不相同的殘基位置往往差別在于保守氨基酸置換，其中氨基酸殘基被其他具有相似的化學性質(zhì)(例如電荷或疏水性)的氨基酸殘基置換，因此不會改變分子的功能性質(zhì)。當序列差別在于保守置換，則可上調(diào)百分比序列同一性以校正置換的保守性質(zhì)。差異在于這種保守置換的序列被稱為具有“序列相似性”或“相似性”。作出這個調(diào)整的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。通常，這涉及將保守置換打分為部分錯配而不是完全錯配，從而提高序列同一性百分數(shù)。因而，例如，如果相同的氨基酸給予I分，非保守置換給予O分，則保守置換給予O至I之間的分數(shù)。保守置換的打分是例如如在程序PC/GENE(美國加利福尼亞州山景城Intelligenetics公司(Intelligenetics,MountainView,California))中所執(zhí)行那樣進行計算。[0101](d)本文所用的“序列同一性百分數(shù)”意指通過在比較窗口上比較兩個最佳比對的序列所確定的數(shù)值，其中多核苷酸序列在比較窗口中的部分與參考序列(不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即空位)，以便兩個序列的最佳比對。該百分數(shù)是這樣計算的:確定在兩個序列中出現(xiàn)相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)目以得到匹配的位置的數(shù)目，將匹配的位置的數(shù)目除以比較窗口中的位置的總數(shù)目，然后將結(jié)果乘以100以得到序列同一性百分數(shù)。[0102]如本文所用，經(jīng)修飾的Cry3多肽的在與天然存在的Cry3(如，SEQIDN0:6)的特定氨基酸殘基相應(yīng)的位置處的氨基酸殘基是指經(jīng)經(jīng)修飾的Cry3多肽內(nèi)的氨基酸殘基，當使用比對程序例如本領(lǐng)域已知的程序或本文所述的程序?qū)⒔?jīng)修飾的Cry3序列與天然存在的Cry3序列(如SEQIDN0:6)比對達到最大同源性時，該氨基酸殘基看起來與天然存在的Cry3序列中的特定位置處的氨基酸殘基相對。[0103]本發(fā)明的經(jīng)修飾的Cry3家族序列在表達盒中提供，以便在所關(guān)注生物體中表達。表達盒將包括有效連接至本發(fā)明的經(jīng)修飾的Cry3家族序列的5’和3’調(diào)控序列。本文所用的術(shù)語“有效連接”是指啟動子與第二序列之間的功能性連接，其中啟動子序列引發(fā)并介導與第二序列對應(yīng)的DNA序列的轉(zhuǎn)錄。一般來講，有效連接意指被連接的核酸序列是連續(xù)的，并且如果有必要連接兩個蛋白質(zhì)編碼區(qū)的話，是連續(xù)的且在相同的閱讀框內(nèi)。表達盒可另外含有至少一個待共轉(zhuǎn)化進該生物體中的額外基因?；蛘?，可在多個表達盒上提供額外的基因。[0104]這種表達盒提供有多個限制位點，以使該經(jīng)修飾的Cry3家族序列的插入處于調(diào)節(jié)區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)之下。表達盒可另外含有可選標記基因。[0105]該表達盒將在5’至3’轉(zhuǎn)錄方向上包括:轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)(即啟動子)、本發(fā)明的經(jīng)修飾的Cry3家族DNA序列和在充當宿主的生物體中具有功能的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)(即終止區(qū))。轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(即啟動子)相對于宿主生物體和/或相對于本發(fā)明的經(jīng)修飾的Cry3家族序列可以是天然的、類似的、外來的或異源的。另外，啟動子可以是天然序列或備選地是合成序列。本文所用的術(shù)語“外來的”表示啟動子在引入該啟動子的天然生物體中不存在。當啟動子相對于本發(fā)明的Cry3家族序列為“外來的”或“異源的”時，其意指啟動子對于本發(fā)明的有效連接的經(jīng)修飾的Cry3家族序列而言,不是天然的或天然存在的啟動子。本文所用的嵌合基因包含與轉(zhuǎn)錄起始區(qū)有效連接的編碼序列，該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)對于該編碼序列是異源的。如果啟動子是天然或自然的序列，則所有效連接的序列的表達相比野生型表達被變更，這導致表型變更。[0106]終止區(qū)可以是對于轉(zhuǎn)錄起始區(qū)而言是天然的，可以對于有效連接的所關(guān)注DNA序列而言是天然的，可以對于植物宿主而言是天然的，或者可以衍生自另一來源(即對于該啟動子、所關(guān)注的Cry3家族序列、植物宿主或者它們的任何組合而言是外來的或異源的)。[0107]便利的終止區(qū)可獲自根瘤農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)的Ti質(zhì)粒,如章魚氨酸合酶和胭脂氨酸合酶終止區(qū)。另參見Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet.(《分子遺傳學與普通遺傳學》)262:141-144；Proudfoot(1991)Cell(《細胞》)64:671-674;Sanfacon等人(1991)GenesDev.(《基因和發(fā)育》)5:141-149;Mogen等人(1990)PlantCell(《植物細胞》)2:1261-1272;Munroe等人(1990)Gene(《基因》)91:151-158;Ballas等人(1989)NucleicAcidsRes.(《核酸研究》)17:7891-7903;以及Joshi等人(1987)NucleicAcidRes.(《核酸研究》)15:9627-9639。[0108]如適當，可將核酸進行優(yōu)化以提高在宿主生物體中的表達。因此，如果宿主生物體是植物，則可用植物偏好的密碼子合成出合成的核酸以改進表達。有關(guān)宿主偏好的密碼子用法的討論，參見例如Campbell和Gowri(1990)PlantPhysiol.(《植物生理學》)92:1-11。例如，盡管本發(fā)明的核酸序列在單子葉植物物種和雙子葉植物物種中都可表達，但可對序列進行修飾以解決單子葉植物或雙子葉植物的特定密碼子偏好性和GC含量偏好性，因為這些偏好性已被證實不同(Murray等人(1989)NucleicAcidsRes.(《核酸研究》)17:477-498)。因此，特定氨基酸的玉蜀黍偏好密碼子可由來自玉蜀黍的已知基因序列得出。關(guān)于來自玉蜀黍植物的28個基因的玉蜀黍密碼子使用在Murray等人(出處同上)的表4中列出。本領(lǐng)域有用來合成植物偏好的基因的方法。參見例如，美國專利N0.5，380，831和N0.5，436，391,以及Murray等人(1989)NucleicAcidsRes.(《核酸研究》)17:477-498,以引用方式并入本文。[0109]已知有另外的序列修飾可增強在細胞宿主中的基因表達。這些包括消除以下序列:編碼假多聚腺苷酸化信號、外顯子-內(nèi)含子剪接位點信號的序列、轉(zhuǎn)座子樣重復序列以及其他得到充分表征的可能對基因表達有害的序列?？蓪⑿蛄械腉C含量調(diào)整至給定細胞宿主的平均水平，這通過參考在宿主細胞中表達的已知基因計算得到。本文所用的術(shù)語“宿主細胞”指含有載體并支持該表達載體的復制和/或表達的細胞。宿主細胞可以是原核細胞如大腸桿菌或者真核細胞如酵母、昆蟲、兩棲動物或者哺乳動物細胞，或者單子葉或者雙子葉植物細胞。單子葉植物宿主細胞的一個例子是玉蜀黍宿主細胞。當可能時，對序列進行修飾以避免出現(xiàn)預測的發(fā)夾二級mRNA結(jié)構(gòu)。[0110]表達盒可另外含有5’前導序列。此類前導序列可起到增強翻譯的作用。翻譯前導序列是本領(lǐng)域已知的并且包括:微小RNA病毒前導序列，例如EMCV前導序列(腦心肌炎病毒5’非編碼區(qū))(Elroy-Stein等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美國國家科學院院刊》)86:6126-6130);馬鈴薯Y病毒前導序列，例如TEV前導序列(煙草蝕紋病毒)(Gallie等人(1995)Gene(《基因》)165(2):233-238);MDMV前導序列(玉米矮花葉病毒)；人免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BiP)(Macejak等人(1991)Nature(《自然》)353:90-94);來自苜?；ㄈ~病毒的外殼蛋白mRNA(AMVRNA4)的非翻譯前導序列(Jobling等人(1987)Nature(《自然》)325:622-625;煙草花葉病毒前導序列(TMV)(Gallie等人(1989)，載于:MolecularBiologyofRNA(《RNA的分子生物學》),Cech編輯(紐約Liss出版社(Liss,NewYork)),第237-256頁)；以及玉蜀黍枯黃斑點病毒前導序列(MCMV)(Lommel等人(1991)Virology(《病毒學》)81:382_385)。另參見Della-Cioppa等人(1987)PlantPhysiol.(《植物生理學》)84:965-968。[0111]在制備表達盒時，可對多個DNA片段進行操縱，以提供處于正確取向的DNA序列，且適當時提供處于正確的閱讀框的DNA序列。為此目的，可應(yīng)用銜接子或接頭將DNA片段連接在一起，或者可涉及其他的操縱以提供便利的限制位點、去除多余的DNA、去除限制位點等。出于這個目的，可涉及到體外誘變、引物修復、限制性酶切、退火、再置換(例如轉(zhuǎn)換和易位)。[0112]多種啟動子可用于本發(fā)明的實踐中。啟動子可基于所需的結(jié)果來選擇?？蓪⒑怂崤c組成型啟動子、組織偏好型啟動子、誘導型啟動子或其他啟動子進行組合，以在宿主生物體中表達。適用于植物宿主細胞的組成型啟動子包括例如W099/43838和美國專利N0.6，072，050中公開的Rsyn7啟動子和其他組成型啟動子的核心啟動子；核心CaMV35S啟動子(Odell等人(1985)Nature(《自然》)313:810-812);水稻肌動蛋白(McElroy等人(1990)PlantCell(《植物細胞》)2:163-171);遍在蛋白(Christensen等人(1989)PlantMol.Biol.(《植物分子生物學》)12:619-632以及Christensen等人(1992)PlantMol.Biol.(《植物分子生物學》)18:675-689);pEMU(Last等人(1991)Theor.Appl.Genet.(《理論與應(yīng)用遺傳學》)81:581-588);MAS(Velten等人(1984)EMB0J.(《歐洲分子生物學組織雜志》)3:2723-2730)；ALS啟動子(美國專利N0.5，659，026)，等等。其他的組成型啟動子包括例如以下各個美國專利中論述的那些:N0.5，608，149、N0.5,608,144、N0.5，604，121、N0.5，569，597、N0.5，466，785、N0.5，399，680、N0.5，268，463、N0.5，608，142、和N0.6，177，611。[0113]取決于所需的結(jié)果，可能有利的是從誘導型啟動子表達基因。對于調(diào)節(jié)本發(fā)明的核苷酸序列在植物中的表達特別有意義的是損傷誘導啟動子。這種損傷誘導啟動子可響應(yīng)昆蟲取食所引起的損害，包括馬鈴薯蛋白酶抑制劑(PinII)基因(Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopath.(《植物病理學年鑒》)28:425-449);Duan等人(1996),NatureBiotechnology(((自然生物技術(shù)》)，14:494-498)；wunl和wun2,美國專利N0.5,428,148；winl和win2(Stanford等人(1989)，Mol.Gen.Genet.(《分子遺傳學與普通遺傳學》)215:200-208)；系統(tǒng)素(McGurl等人(1992)，Science(《科學》)，225:1570-1573);WIP1(Rohmeier等人(1993),PlantMol.Biol.(《植物分子生物學》)22:783-792;Eckelkamp等人(1993),FEBSLetters(《歐洲生化學會聯(lián)合會快報》)323:73-76);MPI基因(Corderok等人(1994),PlantJ.(《植物雜志》)6(2):141-150);等等，將這些文獻以引用方式并入本文。[0114]另外，病原體誘導型啟動子可在本發(fā)明的方法和核苷酸構(gòu)建體中使用。這種病原體誘導型啟動子包括那些來自致病相關(guān)蛋白(PR蛋白)的在病原體感染后被誘導的啟動子；例如PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶等。參見例如Redolfi等人(1983)Neth.J.PlantPathol.(《荷蘭植物病理學雜志》)89:245-254;Uknes等人(1992),PlantCell(《植物細胞》)4:645-656;以及VanLoon(1985)，PlantMol.Virol.(《植物分子病毒學》)4:111-116。另參見W099/43819，將該文獻以引用方式并入本文。[0115]在病原體感染位點處或附近局部表達的啟動子值得關(guān)注。參見例如,Marineau等人(1987)PlantMol.Biol.(《植物分子生物學》)9:335-342;Matton等人(1989)MolecularPlant-MicrobeInteractions(《分子植物-微生物相互作用》)2:325-331;Somsisch等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美國國家科學院院刊》)83:2427-2430；Somsisch人(1988)Mol.Gen.Genet.(《分子遺傳學與普通遺傳學》)2:93-98;以及Yang(1996)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美國國家科學院院刊》)93:14972-14977。另參見Chen等人(1996)PlantJ.(《植物雜志》)10:955-966；Zhang等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美國國家科學院院刊》)91:2507-2511;Warner等人(1993)PlantJ.(《植物雜志》)3:191-201；Siebertz等人(1989)PlantCell(《植物細胞》)1:961-968;美國專利N0.5，750，386(線蟲誘導型)；以及其中引用的參考文獻。特別值得關(guān)注的是玉蜀黍PRms基因的誘導型啟動子，其表達由病原體串珠鐮刀菌(FusariummoniIiforme)誘導(參見例如，Cordero等人(1992)Physiol.Mol.PlantPath.(《生理與分子植物病理學》)41:189-200)。[0116]組織偏好的啟動子可用來使增強的殺蟲蛋白表達靶向于特定的植物組織內(nèi)。組織偏好的啟動子包括以下文獻中描述的那些啟動子:Yamamoto等人(1997)PlantJ.(《植物雜志》)12(2)255-265;Kawamata等人(1997)PlantCellPhysiol.(《植物細胞生理學》)38(7):792-803；Hansen等人(1997)Mol.GenGenet.(《分子遺傳學與普通遺傳學》)254(3):337-343;Russell等人(1997)TransgenicRes.(《轉(zhuǎn)基因研究》)6(2):157-168;Rinehart等人(1996)PlantPhysiol.(《植物生理學》)112(3):1331-1341；VanCamp等人(1996)PlantPhysiol.(《植物生理學》)112(2):525-535；Canevascini等人(1996)PlantPhysiol.(《植物生理學》)，112(2):513-524;Yamamoto等人(1994)PlantCellPhysiol.(《植物細胞生理學》)35(5):773-778;Lam(1994)ResultsProbl.CellDiffer.(《細胞分化的結(jié)果與問題》)20:181-196;0rozco等人(1993)PlantMolBiol.(《植物分子生物學》)23(6):1129-1138;Matsuoka等人(1993)ProcNatl.Acad.Sc1.USA(《美國國家科學院院刊》)90(20):9586-9590；以及Guevara-Garcia等人(1993)PlantJ.(《植物雜志》)4(3):495-505。如有必要，可對這種啟動子進行修飾以用于弱表達。[0117]根偏好啟動子或者根特異性啟動子是已知的，可選自許多可從文獻得到的啟動子，或者從各種相容的物種從頭分離。參見例如，Hire等人(1992)PlantMol.Biol.(《植物分子生物學》)20(2):207-218(大豆根特異性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner(1991)PlantCell(《植物細胞》)3(10):1051-1061(法國菜豆的GRP1.8基因中的根特異性控制元件)；Sanger等人(1990)PlantMol.Biol.(《植物分子生物學》)14(3):433-443(根瘤農(nóng)桿菌的甘露氨酸合酶(MAS)基因的根特異性啟動子)；以及Miao等人(1991)PlantCell(《植物細胞》)3(I):11-22(編碼細胞溶膠谷氨酰胺合成酶(GS)的全長cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表達)。另參見Bogusz等人(1990)PlantCell(《植物細胞》)2(7):633-641,其中描述了從來自固氮非豆科植物榆科山黃麻(Parasponiaandersonii)和相關(guān)的非固氮非豆科植物雞屎藤山麻黃(Trematomentosa)的血紅蛋白基因分離的兩個根特異性啟動子。將這些基因的啟動子連接至葡糖醛酸酶報道基因并引入進非豆科植物煙草(Nicotianatabacum)和豆科植物百脈根(Lotuscorniculatus)二者中，在這兩種情況中根特異性啟動子活性得以保持。Leach和Aoyagi(1991)描述了他們對毛根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)的高表達rolC和rolD根誘導基因的分析(參見PlantScience(《植物科學》)(Limerick)，79(I):69_76)。他們得出結(jié)論認為，增強子和組織偏好的DNA決定子在那些啟動子中是分離的。Teeri等人(1989)使用與IacZ的基因融合，表明編碼章魚氨酸合酶的農(nóng)桿菌T-DNA基因在根尖的表皮中特別活躍，且TR2’基因在完整植物中是根特異性的并且通過葉組織中的創(chuàng)傷刺激，這是用于殺昆蟲或殺幼蟲基因的特別理想的特性組合(參見EMBOJ.(《歐洲分子生物學組織雜志》)，8(2):343-350).與nptll(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II)融合的TR1’基因顯示了相似的特性。另外的根偏好啟動子包括WEN0D-GRP3基因啟動子(Kuster等人(1995)PlantMol.Biol.(《植物分子生物學》)，29(4):759-772);以及rolB啟動子(Capana等人(1994)PlantMol.Biol.(《植物分子生物學》)，25(4):681-691)。另參見以下美國專利:N0.5，837，876、N0.5，750，386、N0.5，633，363、N0.5，459，252、N0.5，401，836、N0.5，110，732和N0.5，023，179。[0118]一般而言，表達盒將包含用于選擇轉(zhuǎn)化細胞的可選標記基因?？蛇x標記基因被用于選擇轉(zhuǎn)化的細胞或組織?？蛇x標記基因包括編碼抗生素抗性的基因，如編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(NEO)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)的那些基因，以及賦予對除草化合物的抗性的基因，所述除草化合物為例如草銨膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)。合適的可選標記基因的另外例子包括但不限于:編碼對氯霉素的抗性的基因(HerreraEstrella等人(1983)EMBOJ.(《歐洲分子生物學組織雜志》)2:987-992);甲氨喋呤(HerreraEstrella等人(1983)Nature(《自然》)303:209-213;以及Meijer等人(1991)PlantMol.Biol.(《植物分子生物學》)16:807-820);鏈霉素(Jones等人(1987)Μο1.Gen.Genet.(《分子遺傳學與普通遺傳學》)210:86-91);壯觀霉素(Bretagne-Sagnard等人(1996)TransgenicRes.(《轉(zhuǎn)基因研究》)5:131-137);博來霉素(Hille等人(1990)PlantMol.Biol.(《植物分子生物學》)7:171-176);磺酰胺(Guerineau等人(1990)PlantMol.Biol.(《植物分子生物學》)15:127-136);溴苯腈(Stalker等人(1988)Science(《科學》)242:419-423);草甘膦(Shaw等人(1986)Science(《科學》)233:478-481;以及美國專利申請N0.10/004，357和N0.10/427，692);草胺膦(DeBlock等人(1987)EMBOJ.(《歐洲分子生物學組織雜志》)6:2513-2518)。主要參見:Yarranton(1992)Curr.0pin.Biotech.(《生物技術(shù)新觀點》)，3:506-511;Christopherson等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美國國家科學院院刊》)89:6314-6318；Yao等人(1992)Cell(《細胞》)71:63-72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.(《分子微生物學》)6:2419-2422;Barkley等人(1980),載于TheOperon(《操縱子》)，第177-220頁；Hu等人(1987)Cell(《細胞》)48:555-566；Brown等人(1987)Cell(《細胞》)49:603-612;Figge等人(1988)Cell(《細胞》)52:713-722;Deuschle等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美國國家科學院院刊》)86:5400-5404;Fuerst等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美國國家科學院院刊》)86:2549-2553；Deuschle等人(1990)Science(《科學》)248:480-483；Gossen,(1993)，海德爾堡大學博士論文；Reines等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美國國家科學院院刊》)90:1917-1921;Labow等人(1990)Mol.Cell.Biol.(《分子細胞生物學》)10:3343-3356；Zambretti等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美國國家科學院院刊》)89:3952-3956;Baim等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美國國家科學院院刊》)88:5072-5076；ffyborski等人(1991)NucleicAcidsRes.(《核酸研究》)19:4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)TopicsMol.Struc.Biol.(《分子結(jié)構(gòu)生物學主題》)10:143-162;Degenkolb等人(1991)Antimicrob.AgentsChemother.(《抗微生物劑化學療法》)35:1591-1595;Kleinschnidt等人(1988),Biochemistry(《生物化學》)27:1094-1104；Bonin,(1993),海德爾堡大學博士論文；Gossen等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美國國家科學院院刊》)89:5547-5551;01iva等人(1992)Antimicrob.AgentsChemother.(《抗微生物劑化學療法》)36:913-919;Hlavka等人(1985)HandbookofExperimentalPharmacology(《實驗藥理學手冊》)，第78卷(柏林施普林格出版社(Springer-Verlag,Berlin));以及Gill等人(1988)Nature(《自然》)334:721-724。將這些公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。[0119]上面關(guān)于可選標記基因的列表無意于限制。任何可選標記基因均可用于本發(fā)明。[0120]本發(fā)明的方法涉及將多肽或多核苷酸引入進植物中。“引入”旨在意指以使得多核苷酸或多肽得以進入植物細胞的內(nèi)部的方式將這些序列呈送給植物。本發(fā)明的方法不依賴于將多核苷酸或多肽引入植物中的具體方法，只要該多核苷酸或多肽可進入植物的至少一個細胞的內(nèi)部即可。將多核苷酸或多肽引入植物中的方法是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法、瞬時轉(zhuǎn)化方法和病毒介導的方法。[0121]本發(fā)明的核酸和核苷酸序列可用于轉(zhuǎn)化任何生物體以產(chǎn)生所編碼的殺蟲蛋白。本發(fā)明提供涉及使用這種轉(zhuǎn)化的生物體來影響或防治植物害蟲的方法。本發(fā)明的核苷酸序列也可用于轉(zhuǎn)化細胞器如葉綠體(McBride等人(1995)Biotechnology(《生物技術(shù)》)13:362-365；以及Kota等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美國國家科學院院刊》)96:1840-1845)。因而本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)化有這些新多核苷酸的植物和微生物，以及涉及將這種核酸、殺蟲組合物、轉(zhuǎn)化的生物體及其產(chǎn)物用于影響昆蟲害蟲的方法。[0122]本文所用的術(shù)語“影響昆蟲害蟲”指在昆蟲發(fā)育的任何階段引起昆蟲取食、生長和/或行為方面的變化，包括但不限于:殺死昆蟲；遲滯生長；阻礙繁殖能力；拒食活性等等。[0123]本文特別關(guān)注的是昆蟲害蟲。本文所用的“昆蟲害蟲”意指妨礙或有害植物發(fā)育和/或生長的節(jié)肢動物門的生物體，更具體地講是指昆蟲綱的生物體。昆蟲綱可劃分為兩個群(歷史上稱作亞綱):(1)無翅昆蟲，稱為無翅亞綱；和(2)有翅昆蟲，稱為有翅亞綱。害蟲的例子包括但不限于鞘翅目、雙翅目、半翅目、同翅目、膜翅目、等翅目、鱗翅目、食毛目、直翅目、纓翅目、革翅目、等翅目、虱目、蚤目、毛翅目和纓尾目，特別是鞘翅目和鱗翅目。雖然嚴格意義上并非昆蟲，節(jié)肢動物如蛛形綱，特別是蜱螨亞綱，也包括在“昆蟲害蟲”中。昆蟲害蟲包括經(jīng)濟上重要的農(nóng)藝害蟲、森林害蟲、溫室害蟲、苗圃害蟲、觀賞植物害蟲、食物和纖維害蟲、公共健康和動物健康害蟲、家庭和商業(yè)設(shè)施害蟲、居室害蟲和倉儲害蟲。[0124]特別關(guān)注的是鞘翅目的幼蟲和成體，其包括來自長角象科(Anthribidae)、豆象科(Bruchidae)和象甲科(Curculionidae)的象鼻蟲，包括但不限于:AnthonomusgrandisBoheman(棉桿象鼻蟲)；CylindrocopturusadspersusLeConte(向日葵莖象鼻蟲)；DiaprepesabbreviatusLinnaeus(鹿根象鼻蟲)；HyperapunctataFabricius(三葉草葉象)；LissorhoptrusoryzophilusKuschel(稻水象鼻蟲)；MetamasiushemipterushemipterusLinnaeus(西印度鹿象鼻蟲)；Μ.hemipterussericeusOlivier(絲鹿象鼻蟲)；SitophilusgranariusLinnaeus(谷象鼻蟲)；S.0ryzaeLinnaeus(米象鼻蟲)；SmicronyxfulvusLeConte(紅向日葵桿象鼻蟲);S.sordidusLeConte(灰色葵花桿象甲)；SphenophorusmaidisChittenden(玉米象蟲);S.1ivisVaurie(甘鹿象蟲);RhabdoscelusobscurusBoisduval(新幾內(nèi)亞鹿象甲)；葉甲科(Chrysomelidae)的跳甲、黃瓜葉甲、根蟲、葉甲、馬鈴薯葉甲以及潛葉蟲，包括但不限于:ChaetocnemaectypaHorn(沙漠玉米跳甲)；C.pulicariaMelsheimer(玉米跳甲)；ColaspisbrunneaFabricius(葡萄肖葉甲);DiabroticabarberiSmith&Lawrence(北方玉米根蟲)；D.undecimpunctatahowardiBarber(南方玉米根蟲);D.virgiferavirgiferaLeConte(西方玉米根蟲);LeptinotarsadecemlineataSay(科羅拉多馬鈴薯甲蟲)；OuIemamelanopusLinnaeus(谷物葉甲蟲)；PhyllotretacruciferaeGoeze(玉米跳甲)；ZygogrammaexclamationisFabricius(向日葵甲蟲)；來自瓢甲科(Coccinellidae)的甲蟲，包括但不限于:EpilachnavarivestisMulsant(墨西哥豆甲蟲)；來自金龜科(Scarabaeidae)的金龜子和其他甲蟲，包括但不限于:AntitrogusparvulusBritton(Childers鹿階贈)；CyclocephalaborealisArrow(北方隱金龜子，白階贈)；C.1mmaculataOlivier(南方隱金龜子，白階贈)；DermolepidaalbohirtumWaterhouse(灰背鹿甲蟲)；EuetheolahumilisrugicepsLeConte(甘鹿甲蟲)；LepidiotafrenchiBlackburn(法國鹿階贈)；TomarusgibbosusDeGeer(胡蘿卜甲蟲)；T.subtropicusBlatchley(甘鹿階贈)；PhyllophagacrinitaBurmeister(白擠贈)；Ρ.latifronsLeConte(六月甲蟲)；PopilliajaponicaNewman(日本甲蟲);RhizotrogusmajalisRazoumowsky(歐洲金龜子)；來自皮蠹科(Dermestidae)的地薇圓皮蠹(carpetbeetle);來自以下各科屬的線蟲:叩頭蟲科(Elateridae)、偽金針蟲屬(Eleodesspp.)，紋叩甲屬(Melanotusspp.)，包括M.communisGyllenhal(線蟲);寬胸叩頭蟲屬(Conoderusspp.);丘胸叩甲屬(Limoniusspp.);細胸叩甲屬(Agriotesspp.)；Cteniceraspp.；Aeolusspp.;來自小蠹科(Scolytidae)的小蠹(barkbeetle);來自擬步甲科(Tenebrionidae)的甲蟲；來自天?？?Cerambycidae)科的甲蟲，例如但不限于MigdolusfryanusWestwood(長角甲蟲);和來自吉丁蟲科(Buprestidae)的甲蟲，包括但不限于AphanisticuscochinchinaeseminulumObenberger(潛葉吉丁蟲)?[0125]本發(fā)明還涵蓋包含至少一種本發(fā)明核苷酸序列的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)基因植物。在一些實施例中，該植物穩(wěn)定轉(zhuǎn)化有核苷酸構(gòu)建體，該核苷酸構(gòu)建體包含有效連接至可驅(qū)動在植物細胞中表達的啟動子的至少一種本發(fā)明核苷酸序列。本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化植物”和“轉(zhuǎn)基因植物”是指在其基因組中包含異源多核苷酸的植物。通常，異源多核苷酸穩(wěn)定整合于轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)化植物的基因組中，使得該多核苷酸被傳遞到后續(xù)各代。異源多核苷酸可單獨整合進基因組中，或者作為重組表達盒的一部分整合進基因組中。[0126]應(yīng)理解，本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”包括任何其基因型已因異源核酸的存在而被變更的細胞、細胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，包括那些最初如此變更的轉(zhuǎn)基因以及那些通過從最初的轉(zhuǎn)基因進行有性雜交或無性繁殖而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因在內(nèi)。本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因(的)”不涵蓋通過常規(guī)植物育種方法或通過諸如隨機異花受精、非重組病毒感染、非重組細菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或自發(fā)突變之類的自然發(fā)生事件導致的基因組(染色體基因組或染色體外基因組)改變。[0127]“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化”旨在意指被引入進植物中的核苷酸構(gòu)建體整合進植物的基因組中，并能夠被其后代遺傳?！八矔r轉(zhuǎn)化”旨在意指多核苷酸被引入植物中但沒有整合進植物的基因組中，或者多肽被引入進植物中。[0128]轉(zhuǎn)化方案以及將核苷酸序列引入植物中的方案，可根據(jù)要進行轉(zhuǎn)化的植物或植物細胞的類型(即單子葉植物或雙子葉植物)而異。將核苷酸序列引入植物細胞中并隨后插入進植物基因組中的合適方法包括:顯微注射(Crossway等人(1986)Biotechniques(《生物技術(shù)》)4:320-334)、電穿孔(Riggs等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美國國家科學院院刊)))83:5602-5606)、農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化(美國專利N0.5，563，055和N0.5，981，840)、直接基因轉(zhuǎn)移(Paszkowski等人(1984)EMBOJ.(《歐洲分子生物學組織雜志》)，3:2717-2722)以及彈道粒子加速(參見例如美國專利N0.4，945，050、N0.5，879，918、N0.5,886,244和N0.5，932，782;Tomes等人(1995)PlantCell,Tissue,andOrganCulture:FundamentalMethods(《植物細胞、組織和器官培養(yǎng):基本方法》)，Gamborg和Phillips編輯,柏林斯普林格出版社；以及McCabe等人(1988)Biotechnology(《生物技術(shù)》)6:923-926);以及Lecl轉(zhuǎn)化(W000/28058)。對于馬鈴薯轉(zhuǎn)化，參見Tu等人(1998)PlantMolecularBiology(《植物分子生物學》)37:829-838;以及Chong等人(2000)TransgenicResearch(《轉(zhuǎn)基因研究》)9:71-78。另外的轉(zhuǎn)化程序可見于Weissinger等人(1988)Ann.Rev.Genet.(《遺傳學年鑒》)22:421-477;Sanford等人(1987)ParticulateScienceandTechnology(《顆?？茖W與技術(shù)》)5:27-37(洋蔥)；Christou等人(1988)PlantPhysiol.(《植物生理學》)87:671-674(大豆);McCabe等人(1988)Bio/Technology(《生物技術(shù)》)6:923-926(大豆);Finer和McMullen(1991)InVitroCellDev.Biol.(《體外細胞和發(fā)育生物學》)27P:175-182(大豆)；Singh等人(1998)Theor.Appl.Genet.(《理論與應(yīng)用遺傳學》)96:319-324(大豆);Datta等人(1990)Biotechnology(《生物技術(shù)》)8:736-740(水稻);Klein等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美國國家科學院院刊》)85:4305-4309(玉蜀黍)；Klein等人(1988)Biotechnology(《生物技術(shù)》)6:559-563(玉蜀黍)；美國專利N0.5，240，855、N0.5，322，783和N0.5，324，646；Klein等人(1988)PlantPhysiol.(《植物生理學》)91:440-444(玉蜀黍);Fromm等人(1990)Biotechnology(《生物技術(shù)》)8:833-839(玉蜀黍);Hooykaas_VanSlogteren等人(1984)Nature(London)(《自然》(倫敦))311:763-764;美國專利N0.5，736，369(谷類)；Bytebier等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美國國家科學院院刊》)84:5345-5349(百合科(Liliaceae));DeWet等人(1985)TheExperimentalManipulationofOvuleTissues(《胚珠組織的實驗操縱》),Chapman等人編輯，紐約朗文出版社(Longman,NewYork),第197-209頁(花粉)；Kaeppler等人(1990)PlantCellReports(《植物細胞報道》)9:415-418;以及Kaeppler等人(1992)Theor.Appl.Genet.(《理論與應(yīng)用遺傳學》)84:560-566(晶須介導的轉(zhuǎn)化);D’Halluin等人(1992)PlantCell(《植物細胞》)4:1495-1505(電穿孔)；Li等人(1993)PlantCellReports(《植物細胞報道》)12:250-255;以及Christou和Ford(1995)AnnalsofBotany(《植物學年刊》)75:407-413(水稻);0sjoda等人(1996)NatureBiotechnology(《自然生物技術(shù)》)14:745-750(玉蜀黍，經(jīng)由根瘤農(nóng)桿菌)；所有這些文獻和專利均以引用方式并入本文。[0129]在特定實施例中，可使用多種瞬時轉(zhuǎn)化方法將本發(fā)明的經(jīng)修飾的Cry3家族序列提供給植物。這種瞬時轉(zhuǎn)化方法包括但不限于將經(jīng)修飾的Cry3家族蛋白或其變體和片段直接引入植物中，或者將經(jīng)修飾的Cry3家族轉(zhuǎn)錄物引入植物中。這類方法包括例如顯微注射或粒子轟擊。參見例如Crossway等人(1986)MolGen.Genet.(《分子遺傳學與普通遺傳學》)202:179-185;Nomura等人(1986)PlantSc1.(《植物科學》)44:53-58;!fepler等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sc1.(《美國國家科學院院刊》)91:2176-2180；以及Hush等人(1994)TheJournalofCellScience(《細胞科學雜志》)107:775-784;將所有這些文獻以引用方式并入本文。或者，可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)將經(jīng)修飾的Cry3家族多核苷酸瞬時轉(zhuǎn)化進植物中。這類技術(shù)包括病毒載體系統(tǒng)以及將多核苷酸以避免該DNA隨后釋放的方式進行沉淀。因此，從粒子結(jié)合的DNA可發(fā)生轉(zhuǎn)錄，但其釋放出來而整合進基因組中的頻率則大大降低。這種方法包括使用包被有聚乙基亞胺(PEI;Sigma#P3143)的粒子。[0130]用于將多核苷酸靶向插入于植物基因組中的特定位置的方法是本領(lǐng)域已知的。在一個實施例中，將多核苷酸插入所需的基因組位置是用位點特異性重組系統(tǒng)來實現(xiàn)的。參見(例如)W099/25821、W099/25854、W099/25840、W099/25855和W099/25853，將這些文獻都以引用方式并入本文。簡單而言，可將本發(fā)明的多核苷酸包含在轉(zhuǎn)移盒中，該轉(zhuǎn)移盒旁側(cè)為有兩個不相同的重組位點。將轉(zhuǎn)移盒引入進在其基因組中穩(wěn)定摻入了這樣的靶位點的植物中，該靶位點旁側(cè)為兩個對應(yīng)于該轉(zhuǎn)移盒的所述位點的不相同重組位點。提供適當?shù)闹亟M酶，將該轉(zhuǎn)移盒整合于該靶標位點處。所關(guān)注的多核苷酸因此整合在植物基因組中的特定染色體位置。[0131]可根據(jù)常規(guī)方式將已轉(zhuǎn)化的細胞培育成植株。參見例如，McCormick等人(1986)PlantCellR印orts(《植物細胞報道》)5:81-84。然后可栽培這些植株并用同一轉(zhuǎn)化株系或不同的株系進行授粉，并鑒定出具有所需表型特征的組成型或誘導型表達的所得子代?？膳囵B(yǎng)兩代或更多代以確保所需表型特征的表達得到穩(wěn)定保持和遺傳，然后收獲種子以確保所需表型特征的表達已得到實現(xiàn)。[0132]本發(fā)明的核苷酸序列可通過使植物與病毒或病毒核酸接觸而提供給植物。通常，這種方法涉及將所關(guān)注的核苷酸構(gòu)建體摻入于病毒DNA或RNA分子內(nèi)。已經(jīng)認識到，本發(fā)明的重組蛋白可最初作為病毒多聚蛋白的一部分來合成，其以后可通過體內(nèi)或體外蛋白水解加工而產(chǎn)生所需的殺蟲蛋白。還認識到，這種包含本發(fā)明殺蟲蛋白的氨基酸序列的至少一部分的病毒多聚蛋白可具有所需的殺蟲活性。這種病毒多聚蛋白及編碼它們的核苷酸序列為本發(fā)明所涵蓋。給植物提供核苷酸構(gòu)建體并在植物中產(chǎn)生所編碼的蛋白質(zhì)的方法(涉及病毒DNA或RNA分子)是本領(lǐng)域已知的。參見例如，美國專利N0.5，889，191、N0.5，889，190、N0.5，866，785、N0.5，589，367和N0.5，316，931;將這些專利以引用方式并入本文。[0133]如本文所用，術(shù)語植物還包括植物細胞、植物原生質(zhì)體、從中可再生出植物的植物細胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、在植物或植物部分中完好的植物塊和植物細胞例如胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果實、仁、穗、穗軸、殼、莖、根、根尖、花粉囊等。谷物旨在意指商業(yè)種植者出于栽培或繁殖物種之外的目的生產(chǎn)的成熟種子。再生的植物的子代、變體和突變體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，條件是這些部分包含所引入的多核苷酸。[0134]本發(fā)明可用于任何植物物種(包括但不限于單子葉植物和雙子葉植物)的轉(zhuǎn)化。所關(guān)注的植物的例子包括但不限于玉米(Zeamays)、蕓苔屬(Brassica)物種(例如，卷心菜型油菜(B.napus)、蕪菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea)，特別是可用作種子油來源的那些蕓苔屬植物；苜猜(Medicagosativa)、水稻(Oryzasativa)、黑麥(Secalecereale)、高梁(Sorghumbicolor,Sorghumvulgare)、小米(例如珍珠粟(Pennisetumglaucum)、稷(Panicummiliaceum)、粟(Setariaitalica)、龍爪稷(Eleusinecoracana))、向日葵(Helianthusannuus)，紅花(Carthamustinctorius)、小麥(Triticumaestivum)，大豆(Glycinemax)、煙草(Nicotianatabacum)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、落花生(Arachishypogaea)、棉花(海島棉(Gossypiumbarbadense)、陸地棉(Gossypiumhirsutum))、甘薯(Ipomoeabatatus)、木薯(Manihotesculenta)、咖啡(Coffeaspp.)、椰子(Cocosnucifera)、菠蘿(Ananascomosus)、柑橘(Citrusspp.)、可可(Theobromacacao)、茶(Camelliasinensis)、香蓮(Musaspp.)、魚號梨(Perseaamericana)、無花果(Ficuscasica)、番石植(Psidiumguajava)、芒果(Mangiferaindica)、撤攬(Oleaeuropaea)、木瓜(Caricapapaya)、腰果(Anacardiumoccidentale)、澳洲堅果(Macadamiaintegrifolia)、杏樹(Prunusamygdalus)、糖用甜菜(Betavulgaris)、甘鹿(Saccharumspp.)、燕麥、大麥、蔬菜、觀賞植物和針葉樹。[0135]蔬菜包括番煎(Lycopersiconesculentum)、萬苣(例如Lactucasativa)、青豆(Phaseolusvulgaris)、利馬豆(PhaseolusIimensis)、豌豆(Lathyrusspp.)和黃瓜屬(Cucumis)的成員如黃瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)和香甘瓜(C.melo)。觀賞植物包括杜鹽花(Rhododendronspp.)、八仙花(Macrophyllahydrangea)、朱槿(Hibiscusrosasanensis)、玫瑰(Rosaspp.)、郁金香(Tulipaspp.)、水仙花(Narcissusspp.)、矮牽?；?Petuniahybrida)、康乃馨(Dianthuscaryophyllus)、一品紅(Euphorbiapulcherrima)和菊花?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明的針葉樹包括(例如)松樹如火炬松(Pinustaeda)、濕地松(Pinuselliotii)、西黃松(Pinusponderosa)、黑松(Pinuscontorta)和福射松(Pinusradiata);花旗松(Pseudotsugamenziesii);西鐵杉(Tsugacanadensis);北美云杉(Piceaglauca);紅杉(Sequoiasempervirens);微樹(truefirs)如銀微(Abiesamabilis)和膠微(Abiesbalsamea);以及雪松如西方紅雪松(Thujaplicata)和阿拉斯加黃雪松(Chamaecyparisnootkatensis)。本發(fā)明的植物包括作物植物(例如玉米、苜猜、向日葵、蕓苔屬植物、大豆、棉花、紅花、花生、高粱、小麥、小米、煙草等等)，例如玉米和大豆植物。[0136]草坪草包括但不限于:一年生藍草(Poaannua);一年生黑麥草(Loliummultif1rum);加拿大藍草(Poacompressa);紫羊茅(Festucarubra);細弱剪股穎(Agrostistenuis);匍匍翦股穎(Agrostispalustris)；光穗冰草(Agropyrondesertorum);扁穗冰草(Agropyroncristatum);硬羊茅(Festucalongifolia);肯塔基藍草(Poapratensis);果園草(Dactylisglomerata);多年生黑麥草(Loliumperenne)；紫羊茅(Festucarubra);紅頂草(Agrostisalba);粗莖藍草(Poatrivialis);羊茅(Festucaovina);無芒雀麥草(Bromusinermis);高羊茅(Festucaarundinacea);梯牧草(Phleumpratense);域毛剪股穎(Agrostiscanina);減茅(Puccinelliadistans)；西方冰草(Agropyronsmithii);百慕達草(Cynodonspp.);圣奧古斯丁草(Stenotaphrumsecundatum);結(jié)縷草(Zoysiaspp.);美洲雀稗(Paspalumnotatum);地經(jīng)草(Axonopusaffinis);百足草(Eremochloaophiuroides);狼尾草(Pennisetumclandesinum);海濱雀稗(Paspalumvaginatum);藍格蘭馬草(Boutelouagracilis);野牛草(Buchloedactyloids);垂穗草(Boutelouacurtipendula)。[0137]所關(guān)注的植物包括谷物植物(提供所關(guān)注的種子)、油籽植物和豆科植物。所關(guān)注的種子包括谷物種子，如玉米、小麥、大麥、大米、高粱、黑麥、小米等。油籽植物包括棉花、大豆、紅花、向日葵、蕓苔屬植物、玉蜀黍、苜蓿、棕櫚、椰子、亞麻、蓖麻、橄欖等。豆科植物包括豆類和豌豆。莢果類包括瓜爾豆、槐豆、胡蘆巴、大豆、四季豆、豇豆、綠豆、利馬豆、蠶豆、小扁豆、鷹嘴豆等等。[0138]在某些實施例中，本發(fā)明的核酸序列可與所關(guān)注多核苷酸序列的任何組合進行堆疊，以產(chǎn)生具有所需表型的植物。例如，本發(fā)明的多核苷酸可與任何其他編碼具有殺蟲和/或殺昆蟲活性的多肽的多核苷酸進行堆疊，所述多肽為例如其他蘇云金芽孢桿菌毒蛋白(描述于美國專利N0.5，366，892、N0.5，747，450、N0.5，736，514、N0.5，723，756、N0.5，593，881、以及Geiser等人(I986)Gene(《基因》)48:109)、五鄰體蛋白(pentin)(描述于美國專利N0.5，981，722)等。所產(chǎn)生的組合還可包括所關(guān)注的多核苷酸中的任何一者的多個拷貝。本發(fā)明的多核苷酸也可與任何其他基因或基因的組合堆疊，以產(chǎn)生具有多種所需的性狀組合的植物，所述性狀包括(但不限于):動物飼料所需的性狀例如高油基因(如美國專利N0.6，232，529);平衡的氨基酸(例如hordothionin(美國專利N0.5，990，389、N0.5，885，801、N0.5，885，802和N0.5，703，049);大麥高賴氨酸(Williamson等人(1987)Eur.J.Biochem.(《歐洲生物化學期刊》)165:99-106;和TO98/20122)以及高甲硫氨酸蛋白(Pedersen等人(1986)J.Biol.Chem.(《生物化學雜志》)261:6279；Kirihara等人(1988)Gene(《基因》)71:359;以及Musumura等人(1989)PlantMol.Biol.(《植物分子生物學》)12:123));消化性提高(例如經(jīng)修飾的貯藏蛋白(提交于2001年11月7日的序列號為10/053，410的美國專利申請)；和硫氧還蛋白(提交于2001年12月3日的序列號為10/005,429的美國專利申請))，將這些專利的公開內(nèi)容以引用方式并入本文。[0139]本發(fā)明還提供通過使用本發(fā)明的殺蟲蛋白與至少一種其他或“第二”殺蟲蛋白的組合來增加昆蟲靶標范圍的方法。本領(lǐng)域已知的任何殺蟲蛋白都可應(yīng)用于本發(fā)明的方法中。這種殺蟲蛋白包括但不限于BtS-內(nèi)毒素、蛋白酶抑制劑、α-淀粉酶和過氧化物酶。[0140]本發(fā)明的多核苷酸也可與疾病或除草劑抗性所需的性狀進行堆疊(例如伏馬毒素脫毒基因(美國專利N0.5，792，931);無毒性和疾病抗性基因(Jones等人(1994)Science(《科學》)266:789；Martin等人(1993)Science(《科學》)262:1432；以及Mindrinos等人(1994)Cell(《細胞》)78:1089);導致除草劑抗性的乙酰乳酸合成酶(ALS)突變體，例如S4和/或Hra突變；谷氨酰胺合酶的抑制劑如草胺膦或basta(例如bar基因)；和草甘膦抗性(如序列號為10/004，357的美國專利申請和序列號為10/427,692的美國專利申請中所公開的EPSPS基因和GAT基因)；以及加工或過程產(chǎn)物所需的性狀，如高油(例如美國專利N0.6，232，529);改性油(例如脂肪酸去飽和酶基因(美國專利N0.5,952,544；W094/11516));改性淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGP酶)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脫支酶(SDBE));以及聚合物或生物塑料(例如美國專利N0.5.602，321；β-酮硫解酶、聚羥基丁酸合酶和乙酰乙?；?CoA還原酶(Schubert等人(1988)J.Bacteriol.(《細菌學雜志》)170:5837-5847)有利于聚羥基鏈烷酸酯(PHA)的表達)，將上述文獻的公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。還可將本發(fā)明的多核苷酸與提供諸如雄性不育(如，參見美國專利N0.5.583，210)、莖桿強度、開花時間之類的農(nóng)藝性狀或諸如細胞周期調(diào)節(jié)或基因靶向(如，W099/61619；W000/17364;W099/25821)之類的轉(zhuǎn)化技術(shù)性狀的多核苷酸組合，將上述文獻的公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。[0141]這些堆疊的組合可通過任何方法來產(chǎn)生，包括但不限于通過任何常規(guī)方法或TopCross方法或者遺傳轉(zhuǎn)化來對植物進行雜交育種。如果性狀是通過遺傳轉(zhuǎn)化植株來堆疊，則所關(guān)注的多核苷酸序列可在任何時間以任何順序進行組合。例如，可將包含一種或多種期望性狀的轉(zhuǎn)基因植物用作靶標，通過后續(xù)的轉(zhuǎn)化引入更多性狀?？梢杂霉厕D(zhuǎn)化方案將性狀與所關(guān)注的多核苷酸同時引入，其中所關(guān)注的多核苷酸由轉(zhuǎn)化盒的任何組合提供。例如，如果將要引入兩條序列，則可將該兩條序列包含在單獨的轉(zhuǎn)化盒中(反式)或包含在同一轉(zhuǎn)化盒中(順式)?？赏ㄟ^相同啟動子或不同啟動子驅(qū)動所述序列表達。在某些情況中，可能期望引入會抑制所關(guān)注多核苷酸的表達的轉(zhuǎn)化盒。這可以與其他抑制盒或過表達盒的任何組合進行組合以在植物中生成所需的性狀組合。還認識到可使用位點特異性重組體系在所需的基因組位置堆疊多核苷酸序列。參見(例如)W099/25821、W099/25854、W099/25840、W099/25855和W099/25853，將這些文獻的全部均以引用的方式并入本文。[0142]本發(fā)明的組合物可用于以多種方式影響昆蟲害蟲并保護植物、種子和植物產(chǎn)品。例如，所述組合物可在涉及通過選自噴霧、噴粉、廣播或種子涂覆的程序?qū)⒂行Я康臍⑾x組合物置于害蟲的環(huán)境中的方法中使用。[0143]在植物繁殖材料(果實、塊莖、鱗莖、球莖、谷物、種子)，但尤其是種子，作為商品出售之前，其通常用保護劑涂料進行處理，所述保護劑涂料包含除草劑、殺昆蟲劑、殺真菌劑、殺細菌劑、殺線蟲劑、殺軟體動物劑或這些制品中的幾種的混合物，如果需要的話還進一步加上制劑領(lǐng)域常用的載體、表面活性劑或促施用助劑，以提供對抗細菌、真菌或動物害蟲造成的損害的保護。為了處理種子，可通過如下方法將保護劑涂料施用至種子:用液體制劑浸潰塊莖或谷物，或用組合的濕或干制劑對種子進行涂覆。另外，在特殊的情況中，其他施用至植物的方法也是可能的，例如針對芽或果實進行的處理。[0144]包含編碼本發(fā)明殺蟲蛋白的核苷酸序列的本發(fā)明植物種子，可用包含種子處理化合物的種子保護劑涂料進行處理，所述種子處理化合物為例如克菌丹、萎銹靈、福美雙、甲霜靈、甲基嘧啶磷以及其他常用于種子處理的化合物。在本發(fā)明的范圍內(nèi)的一個實施例中，將包含本發(fā)明的殺蟲組合物的種子保護劑涂料單獨使用或與常用于種子處理的種子保護劑涂料之一組合使用。[0145]認識到，可用編碼殺蟲蛋白的基因來轉(zhuǎn)化昆蟲病原生物體。這種生物體包括桿狀病毒、真菌、原生動物、細菌和線蟲。[0146]本發(fā)明還涵蓋轉(zhuǎn)化有至少一種本發(fā)明核酸的微生物、轉(zhuǎn)化有包含該核酸的表達盒的微生物或轉(zhuǎn)化有包含該表達盒的載體的微生物。在一些實施例中，該微生物是在植物上繁殖的微生物。本發(fā)明的一個實施例涉及包囊的殺蟲蛋白，其包含能夠表達至少一種本發(fā)明的殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)化微生物。[0147]可通過合適的載體將編碼本發(fā)明的殺蟲蛋白的基因引入微生物宿主中，并將所述宿主施用至環(huán)境或施用至植物或動物。在將核酸插入細胞中的語境中的術(shù)語“引入”，意指“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導”，包括指涉核酸摻入進真核或原核細胞中，其中該核酸可摻入進細胞的基因組(例如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)中、轉(zhuǎn)化成自主復制子或者瞬時表達(例如轉(zhuǎn)染的mRNA)。[0148]可選擇已知可占領(lǐng)一種或多種所關(guān)注的作物的“植物圈”(葉面、葉圍、根圍和/或根面)的微生物宿主。選擇這些微生物以便能夠在特定環(huán)境中成功地與野生型微生物競爭，提供表達殺蟲蛋白的基因的穩(wěn)定維持和表達，并且理想的是，提供對該殺蟲劑的改善保護使其不受環(huán)境降解和失活。[0149]這種微生物包括細菌、藻類和真菌。特別要關(guān)注的是諸如以下的微生物:細菌，例如假單胞菌屬(Pseudomonas)、歐文氏菌屬(Erwinia)、沙雷氏菌屬(Serratia)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、根瘤菌屬(Rhizobium)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、Methylius、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、醋桿菌屬(Acetobacter)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、固氮菌屬(Azotobacter)、明串珠菌屬(Leuconostoc)以及產(chǎn)喊桿菌屬(Alcaligenes);真菌，特別是酵母，例如酵母菌屬(Saccharomyces)、隱球菌屬(Cryptococcus)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、擲抱酵母屬(Sporobolomyces)、紅酵母屬(Rhodotorula)和短梗霉屬(Aureobasidium)。特別要關(guān)注的是諸如以下的植物圈細菌物種:丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)、突光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、木醋桿菌(Acetobacterxylinum)、農(nóng)桿菌、球形紅假單胞菌(Rhodopseudomonasspheroides)、野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)、苜猜根瘤菌(Rhizobiummelioti)、富營養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligenesentrophus)、木質(zhì)棍狀桿菌(Clavibacterxyli)和維捏蘭德固氮菌(Azotobacterrosuesvinlandir),以及諸如以下的植物圈酵母物種:深紅酵母(Rhodotorularubra)、粘紅酵母(R.glutinis)、海濱紅酵母(R.marina)、澄黃紅酵母(R.aurantiaca)、淺白色隱球酵母(Cryptococcusalbidus)、流散隱球酵母(C.diffluens)、羅倫隱球酵母(C.1aurentii)、羅斯酵母(Saccharomycesrosei)、普地酵母(S.pretoriensis)、釀酒酵母(S.cerevisiae)、粉紅擲抱酵母(Sporobolomycesrosues)、香氣擲抱酵母(S.0dorus)、佛地克魯維酵母(Kluyveromycesveronae)和出芽短梗霉(Aureobasidiumpollulans)。特別要關(guān)注的是有色素微生物。[0150]有多種方式可用來將表達殺蟲蛋白的基因引入處于容許該基因的穩(wěn)定維持和表達的條件下的微生物宿主中。例如，可構(gòu)建出這樣的表達盒，其包括所關(guān)注的核苷酸構(gòu)建體及為了該核苷酸構(gòu)建體的表達該核苷酸構(gòu)建體所有效連接的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)信號、與宿主生物體中的序列同源的核苷酸序列(據(jù)此將發(fā)生整合)和/或在宿主中具有功能的復制系統(tǒng)(據(jù)此將發(fā)生整合或穩(wěn)定維持)。[0151]轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)信號包括但不限于啟動子、轉(zhuǎn)錄起始位點、操縱子、活化子、增強子、其他調(diào)節(jié)元件、核糖體結(jié)合位點、起始密碼子、終止信號等。參見例如，美國專利N0.5，039，523和N0.4,853,331；EP00480762A2；Sambrook等人(1992)MolecularCloning:ALaboratoryManual(《分子克隆實驗指南》)，Maniatis等人編輯(紐約冷泉港的冷泉港實驗室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork)),下文稱為“SambrookII，，;Davis等人編輯(1980)AdvancedBacterialGenetics(《高級細菌遺傳學》)，紐約冷泉港的冷泉港實驗室出版社；以及其中引用的參考文獻。[0152]若含殺蟲蛋白的細胞要被進行處理以在將經(jīng)處理的細胞施用于靶標害蟲的環(huán)境時延長殺蟲蛋白在細胞中的活性，則合適的宿主細胞可包括原核生物或真核生物，通常限于那些不會產(chǎn)生對高等生物體(如哺乳動物)有毒的物質(zhì)的細胞。但是，若毒素不穩(wěn)定或施用水平足夠低而避免對哺乳動物宿主的毒性的任何可能性，則可以使用會產(chǎn)生對高等生物體有毒的物質(zhì)的生物體。作為宿主，特別要關(guān)注的將是原核生物和低等真核生物如真菌。示例性的原核生物(革蘭氏陰性和革蘭氏陽性二者)包括腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌屬(Escherichia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、志賀氏菌屬(Shigella)、沙門氏菌屬(Salmonella)和變形桿菌屬(Proteus)；芽孢桿菌科(Bacillaceae);根瘤菌科(Rhizobiceae),如根瘤菌屬(Rhizobium);螺菌科(Spirillaceae)，如發(fā)光桿菌屬(photobacterium)、發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)、沙雷氏菌屬(Serratia)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、弧菌屬(Vibrio)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、螺菌屬(Spirillum);乳桿菌科(LactobaciIIaceae);假單胞菌科(Pseudomonadaceae),如假單胞菌屬(Pseudomonas)和醋桿菌屬(Acetobacter);固氮菌科(Azotobacteraceae)和硝化桿菌科(Nitrobacteraceae)。真核生物有真菌，如藻菌綱(Phycomycetes)和子囊菌綱(Ascomycetes),其包括酵母如酵母菌屬(Saccharomyces)和裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces);擔子菌綱(Basidiomycetes)酵母，如紅酵母屬(Rhodotorula)、短梗霉屬(Aureobasidium)、擲抱酵母屬(Sporobolomyces)等。[0153]在為了殺蟲蛋白生產(chǎn)目的而選擇宿主細胞時特別要關(guān)注的特征包括殺蟲蛋白基因向宿主中引入的便利性、表達系統(tǒng)的可獲得性、表達的效率、蛋白質(zhì)在宿主中的穩(wěn)定性以及輔助遺傳能力的存在。對于作為殺蟲劑微膠囊使用特別要關(guān)注的特征包括殺蟲劑的保護質(zhì)量，如厚細胞壁、色素沉著以及包涵體的胞內(nèi)包裝或形成；葉親和力；哺乳動物毒性的缺乏；對害蟲取食的吸引力；在不對毒素造成損害的情況下殺滅和固定的容易性；等等。其他考慮因素包括配制和操作容易性、經(jīng)濟性、貯存穩(wěn)定性等。[0154]特別要關(guān)注的宿主生物包括酵母,例如紅酵母屬物種(Rhodotorulaspp.)、短梗霉屬物種(Aureobasidiumspp.)、酵母屬物種(Saccharomycesspp.)和擲抱酵母屬物種(Sporobolomycesspp.);葉面生物體例如假單胞菌屬物種(Pseudomonasspp.)、歐文氏菌屬物種(Erwiniaspp.)和黃桿菌屬物種(Flavobacteriumspp.)和其他此類生物體，包括銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、突光假單胞菌、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、芽孢桿菌屬物種、蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、臘狀芽抱桿菌(Bacilluscereus)等。[0155]可將編碼本發(fā)明的殺蟲蛋白的基因引入在植物上繁殖的微生物(體表寄生菌)中，以將殺蟲蛋白遞送至潛在的靶害蟲。體表寄生菌例如可以是革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌。[0156]根定殖細菌例如可通過本領(lǐng)域已知的方法從所關(guān)注的植物分離。具體而言，可從植物的根分離出定殖根的臘狀芽孢桿菌菌株(參見例如，Handelsman等人(1991)Appl.Environ.Microbiol.(《應(yīng)用與環(huán)境微生物學》)56:713_718)?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的標準方法將編碼本發(fā)明的殺蟲蛋白的基因引入根定殖蠟狀芽孢桿菌中。[0157]可通過電轉(zhuǎn)化手段將編碼殺蟲蛋白的基因例如引入到根定殖芽孢桿菌中。具體而言，可將編碼殺蟲蛋白的基因克隆進穿梭載體如PHT3101中(Lerecius等人(1989)FEMSMicrobiol.Letts.(《歐洲微生物學會聯(lián)合會微生物學快報》)60:211_218)。含有特定殺蟲蛋白基因的編碼序列的穿梭載體PHT3101可例如通過電穿孔手段轉(zhuǎn)化進根定殖芽孢桿菌中(Lerecius等人(1989),FEMSMicrobiol.Letts.(《歐洲微生物學會聯(lián)合會微生物學快報》)60:211-218)。[0158]可設(shè)計表達系統(tǒng)，使得殺蟲蛋白被分泌到革蘭氏陰性細菌(如大腸桿菌)的細胞質(zhì)之外。分泌殺蟲蛋白的好處是:(I)避免所表達的殺蟲蛋白的潛在細胞毒性作用；和(2)改進殺蟲蛋白的純化效率，包括但不限于提高每體積細胞培養(yǎng)液的蛋白質(zhì)回收和純化效率和降低每單位蛋白質(zhì)的回收和純化時間和/或成本。[0159]可例如通過將適當?shù)拇竽c桿菌信號肽與殺蟲蛋白的氨基末端融合，使殺蟲蛋白在大腸桿菌中分泌。大腸桿菌識別的信號肽可存在于已知在大腸桿菌中分泌的蛋白質(zhì)，例如OmpA蛋白(Ghrayeb等人(1984)EMB0J,(《歐洲分子生物學組織雜志》)3:2437-2442)。OmpA是大腸桿菌外膜的主要蛋白質(zhì)，因此它的信號肽據(jù)認為在轉(zhuǎn)移過程中有效。另外，在加工前不需要對OmpA信號肽進行修飾，而其他信號肽例如脂蛋白信號肽則需要(DufTaud等人(1987)Meth.Enzymol.(《酶學方法》)153:492)。[0160]可在細菌宿主中發(fā)酵本發(fā)明的殺蟲蛋白，并且將所得的細菌加工并以與蘇云金芽孢桿菌菌株用作殺昆蟲噴劑相同的方式用作微生物噴劑。在殺蟲蛋白從芽孢桿菌分泌的情況中，用本領(lǐng)域已知的程序?qū)⒎置谛盘栆瞥蛘咄蛔?。這種突變和/或缺失能防止殺蟲蛋白在發(fā)酵過程中分泌到生長培養(yǎng)基中。殺蟲蛋白保持在細胞內(nèi)，然后將細胞進行加工以得到包囊的殺蟲蛋白。任何合適的微生物都可用于這個目的。已用假單胞菌屬將蘇云金芽孢桿菌內(nèi)毒素表達為包囊蛋白，并且將所得的細胞進行加工并作為殺蟲劑噴施(Gaertner等人(1993)AdvancedEngineeredPesticides(《高級工程化殺蟲劑》)，Kim編輯)。[0161]作為另一個選擇，通過將異源基因引入細胞宿主中來產(chǎn)生殺菌蛋白。異源基因的表達直接或間接導致該殺蟲劑的胞內(nèi)產(chǎn)生和維持。然后將這些細胞在當將細胞施用于靶標害蟲的環(huán)境時能延長該產(chǎn)生的毒素在細胞中的活性的條件下進行處理。所得的產(chǎn)物保持該毒素的毒性。然后可按照常規(guī)技術(shù)配制這些天然包囊的殺蟲蛋白以便施用于靶害蟲的寄生環(huán)境，例如土壤、水和植物的葉。參見例如EPA0192319，以及其中引用的參考文獻。[0162]在本發(fā)明中，可將轉(zhuǎn)化的微生物(其包括完整生物體、細胞、孢子、殺蟲蛋白、殺蟲組分、害蟲影響組分、突變體、活的或死的細胞和細胞組分，包括活的或死的細胞和細胞組分的混合物在內(nèi)，和包括破碎的細胞和細胞組分在內(nèi))或者分離的殺蟲蛋白與可接受的載體一起配制成例如以下殺蟲組合物:懸浮液、溶液、乳液、撒粉、可分散顆粒、可潤濕粉末以及可乳化濃縮物、氣溶膠、浸潰顆粒、助劑、可涂覆糊、還有例如在聚合物物質(zhì)中的包囊物。[0163]本發(fā)明提供包含本發(fā)明的轉(zhuǎn)化微生物的殺蟲組合物。在這種實施例中，轉(zhuǎn)化微生物通常以殺蟲有效量與合適的載體一起存在于殺蟲組合物中。本發(fā)明還涵蓋這樣的殺蟲組合物，其以殺昆蟲有效量單獨包含本發(fā)明的分離蛋白或包含本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)與本發(fā)明的轉(zhuǎn)化微生物和/或本發(fā)明的包囊殺蟲蛋白的組合，以及包含合適的載體。[0164]以上所公開的這類組合物可通過加入以下物質(zhì)來獲得:表面活性劑、惰性載體、防腐劑、保濕劑、取食刺激劑、引誘劑、包囊劑、粘合劑、乳化劑、染料、紫外保護劑、緩沖劑、助流劑或肥料、微量營養(yǎng)物供體或其他能影響植物生長的制品?？蓪ǖ幌抻诔輨?、殺昆蟲劑、殺真菌劑、殺細菌劑、殺線蟲劑、殺軟體動物劑、殺蝴劑、植物生長調(diào)節(jié)劑、收獲助劑和肥料的一種或多種農(nóng)業(yè)化學品與常用于配制領(lǐng)域的載體、表面活性劑或助劑進行組合，以便于產(chǎn)品處理和施用于特定的靶害蟲。合適的載體和助劑可以是固體或液體，并對應(yīng)于通常用于配制技術(shù)的物質(zhì)，例如天然或再生的礦物質(zhì)、溶劑、分散劑、濕潤劑、增粘劑、粘合劑或肥料。本發(fā)明的活性成分通常以組合物的形式施用，并且可施用至待處理的作物區(qū)、植物或種子。例如，可在糧倉或筒倉等內(nèi)貯藏準備時或貯藏期間，將本發(fā)明的組合物施用至籽粒。本發(fā)明的組合物可與其他化合物同時施用或相繼施用。施用含有本發(fā)明細菌菌株產(chǎn)生的至少一種殺蟲蛋白的本發(fā)明活性成分或本發(fā)明農(nóng)用化學組合物的方法包括但不限于:葉面噴施、種子包衣和土壤施用。施用次數(shù)和施用速度取決于相應(yīng)害蟲侵擾的強度。[0165]合適的表面活性劑包括但不限于陰離子化合物如例如金屬的羧酸鹽；長鏈脂肪酸的羧酸鹽；N-?；“彼猁}；磷酸與脂肪醇乙氧基化物的單酯或二酯或者這類酯的鹽；月旨肪醇硫酸鹽如十二烷基硫酸鈉、十八烷基硫酸鈉或十六烷基硫酸鈉；乙氧基化脂肪醇硫酸鹽；乙氧基化烷基酚硫酸鹽；木質(zhì)素磺酸鹽；石油磺酸鹽；烷基芳基磺酸鹽如烷基苯磺酸鹽或低級烷基萘磺酸鹽，例如丁基萘磺酸鹽；磺化的萘-甲醛縮合物的鹽；磺化的苯酚-甲醛縮合物的鹽；更復雜的磺酸鹽如酰胺磺酸鹽，例如油酸和N-甲基牛磺酸的磺化縮合產(chǎn)物；或者二烷基磺基琥珀酸鹽，例如琥珀酸二辛酯的磺酸鈉。非離子劑包括脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪酸酰胺或者脂肪烷基或烯基取代的酚與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物，多元醇醚的脂肪酸酯例如脫水山梨糖醇脂肪酸酯，這種酯類與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯，環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的嵌段共聚物，炔二醇如2，4，7，9-四乙基-5-癸炔-4，7-二醇，或者乙氧基化的炔二醇。陽離子表面活性劑的例子包括例如脂族單胺、二胺或聚胺如乙酸鹽、環(huán)烷酸鹽或者油酸鹽；或者含氧胺如聚氧乙烯烷基胺的氧化胺；通過羧酸與二胺或聚胺的縮合制備的酰胺連接的胺；或者季銨鹽。[0166]惰性材料的例子包括但不限于無機礦物質(zhì)如高嶺土、頁硅酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽或者植物材料如軟木、粉末玉米穗軸、花生殼、稻殼和胡桃殼。[0167]本發(fā)明的組合物可以合適的形式直接施用或作為在施用前需要用適當量的水或其他稀釋劑稀釋的主要組合物的濃縮物。殺蟲濃度將隨具體制劑的性質(zhì)而異，具體而言，隨它是濃縮物還是直接施用而異。組合物含有I至98%的固體或液體惰性載體和O至50%或0.1至50%的表面活性劑。這些組合物將以商業(yè)產(chǎn)品的標示比率施用，例如當為干燥形式時約0.01磅至5.0磅每英畝，當為液體形式時約0.01品脫至10品脫每英畝。[0168]在又一個實施例中，本發(fā)明的組合物以及轉(zhuǎn)化的微生物和殺蟲蛋白可在配制前先進行處理，以延長當施用于靶標害蟲的環(huán)境時的殺蟲活性，只要預處理對殺蟲活性無害。這種處理可通過化學和/或物理手段進行，只要處理不會有害地影響組合物的性質(zhì)。化學試劑的例子包括但不限于鹵化劑；醛類如甲醛和戊二醛；抗感染劑如氯化苯甲烴銨；醇類如異丙醇和乙醇；以及組織固定劑如Bouin固定劑和Helly固定劑(參見例如,Humason(1967)AnimalTissueTechniques(《動物組織技術(shù)》)(W.H.FreemanandC0.公司))。[0169]在本發(fā)明的其他實施例中，可能有利的是用蛋白酶例如胰蛋白酶處理經(jīng)修飾的Cry3家族多肽以活化該蛋白質(zhì)，然后再將本發(fā)明實施例的殺蟲蛋白組合物施用于靶標害蟲的環(huán)境。通過絲氨酸蛋白酶活化原毒素的方法是本領(lǐng)域公知的。參見例如Cooksey(1968)Biochem.J.(《生物化學雜志》)6:445-454;以及Carroll和Ellar(1989)Biochem.J.(《生物化學雜志》)261:99-105，將這些文獻的教導內(nèi)容以引用方式并入本文。例如，合適的活化方案包括但不限于將待活化的多肽例如純化的經(jīng)修飾的Cry3多肽(例如具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列)與胰蛋白酶以1/100重量比的Cry3蛋白質(zhì)/胰蛋白酶在20nMNaHCO3(pH8)中混合，并在36°C下消化樣品3小時。[0170]組合物(包括本發(fā)明的轉(zhuǎn)化微生物和殺蟲蛋白)可通過例如以下方式施用于害蟲、植物、植物種子、植物部分或耕作區(qū)的環(huán)境:噴霧、霧化、撒粉、散播、涂覆或傾倒、引入土壤中或引到土壤上、引入灌溉水中、在害蟲已開始出現(xiàn)時或者在害蟲出現(xiàn)前進行種子處理或普通施用或散粉作為保護措施。例如，可將本發(fā)明的殺蟲蛋白和/或轉(zhuǎn)化微生物與谷物混合以在貯藏過程中保護谷物。通常重要的是在植物生長的早期階段獲得對害蟲的良好防治，因為這是植物可能受到最嚴重損害的時期。本發(fā)明的組合物可便利地含有另一種殺昆蟲劑，如果認為這有必要的話。在本發(fā)明的一個實施例中，在種植時將組合物直接施用于土壤，施用的形式為載體與芽孢桿菌菌株或者本發(fā)明的轉(zhuǎn)化微生物的死細胞的組合物的顆粒形式。另一個實施例是包含農(nóng)業(yè)化學品例如除草劑、殺昆蟲劑、肥料、惰性載體與芽孢桿菌菌株或者本發(fā)明的轉(zhuǎn)化微生物的死細胞的組合物的顆粒形式。[0171]可在種植前或之后將殺蟲組合物施用于耕作區(qū)。耕作區(qū)可包括昆蟲害蟲或者耕作區(qū)的環(huán)境條件可有利于昆蟲害蟲(如，昆蟲害蟲生長優(yōu)選的空氣溫度、季節(jié)、土壤溫度)。本文所用的“耕作區(qū)”包括期望在其中栽培植物的任何區(qū)域。這種耕作區(qū)包括但不限于在其中栽培植物的田地(如作物田、草地、樹林地、生產(chǎn)林、用于栽培水果和蔬菜的田地等等)、溫室、生長室等等。[0172]在本發(fā)明的一些實施例中，多核苷酸編碼抗體，當在至少一種選自植物和微生物的生物體中表達時所述抗體結(jié)合至所關(guān)注的經(jīng)修飾的多肽(即，經(jīng)修飾的Cry3家族蛋白)的表位。此類抗體可測定所關(guān)注的多肽的表達水平和/或蛋白酶活性。[0173]在另一個實施例中，該抗體的結(jié)合導致由細胞質(zhì)量控制機制進行的抗體_Cry3蛋白復合物的周轉(zhuǎn)增加?？贵w在植物細胞中的表達以及通過抗體表達并結(jié)合至植物細胞中的蛋白質(zhì)來抑制分子途徑是本領(lǐng)域所熟知的。參見例如Conrad和Sonnewald(2003)NatureBiotech.(《自然生物技術(shù)》)21:35-36，將該文獻以引用的方式并入本文。[0174]所謂“表位”意指抗體針對其而產(chǎn)生的并將與抗體結(jié)合的抗原分子的一部分。表位可包含線性氨基酸殘基(即，表位內(nèi)的殘基以線性方式一個接一個順序排列)、非線性氨基酸殘基(本文稱為“非線性表位”;這些表位不順序排列)，或線性或非線性氨基酸殘基二者。通常，表位為短氨基酸序列，如，長度為約五個氨基酸。用于鑒定表位的系統(tǒng)性技術(shù)是本領(lǐng)域已知的并在例如美國專利N0.4，708,871中有所描述。簡而言之，可合成衍生自抗原的一組重疊寡肽，并使之結(jié)合至針的固相陣列上，每個針上有一獨特寡肽。針的陣列可構(gòu)成96孔微量滴定板，從而允許同時測定所有96個寡肽，例如用于結(jié)合至生物標記特異性單克隆抗體?；蛘?，曬菌體展示肽文庫試劑盒(新英格蘭生物實驗室(NewEnglandBiolabs))目前可商購獲得，適用于表位作圖。使用這些方法，可以確定連續(xù)氨基酸的每個可能子集的結(jié)合親和力以便鑒別給定抗體所結(jié)合的表位。當表位長度肽序列用于免疫抗體所來源的動物時，表位還可通過推理鑒定。[0175]還提供了本文所公開的抗體的抗原結(jié)合片段和變體。此類變體將保留親本抗體的所需結(jié)合性質(zhì)。用于制備抗體片段和變體的方法是本領(lǐng)域普遍可用的。例如，本文所公開的抗體的氨基酸序列變體可通過在所克隆的編碼所關(guān)注抗體的DNA序列中突變來制備。誘變和核苷酸序列變更的方法是本領(lǐng)域所熟知的。參見例如Walker和Gaastra編輯(1983)TechniquesinMolecularBiology(《分子生物學技術(shù)》)(紐約麥克米倫出版公司(MacMillanPublishingCompany,NewYork))；Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美國國家科學院院刊》)82:488-492;Kunkel等人(1987)MethodsEnzymo1.(《酶學方法》)154:367-382;Sambrook等人(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(《分子克隆:實驗室指南》)(紐約冷泉港出版社)；美國專利N0.4，873，192;以及其中引用的參考文獻；將這些文獻以引用方式并入本文。[0176]還提供具有本發(fā)明抗體的結(jié)合特性的抗體?！敖Y(jié)合特性”或“結(jié)合特異性”在用于提及抗體時是指抗體識別與比較抗體相同或類似的抗原表位。此類抗體的例子包括例如在競爭性結(jié)合測定法中與本發(fā)明的抗體競爭的抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用標準方法確定抗體是否競爭性干擾另一種抗體。[0177]在構(gòu)建所關(guān)注抗體多肽的變體中，進行修飾使得變體繼續(xù)具有所需活性，即與Cry3蛋白相似的結(jié)合特異性。顯然，將在編碼該變體多肽的DNA中所作的突變必須不將序列設(shè)置在閱讀框外，并且優(yōu)選將不會產(chǎn)生互補區(qū)，該互補區(qū)可以產(chǎn)生二級mRNA結(jié)構(gòu)。參見歐洲專利公開N0.75，444。[0178]優(yōu)選地，抗體變體包含與參考抗體分子的氨基酸序列或與參考抗體分子的較短部分具有至少70%或75%的序列同一性，優(yōu)選至少80%或85%的序列同一性，更優(yōu)選至少90%、91%、92%、93%、94%或95%的序列同一性的氨基酸序列。更優(yōu)選地，所述分子具有至少96%、97%、98%或99%的序列同一性。出于本發(fā)明的目的，使用Smith-Waterman同源性搜索算法，使用具有空位開放罰分=12且空位延伸罰分=2、BLOSUM矩陣=62的仿射空位搜索，來確定％序列同一'I"生。Smith-Waterman同源性搜索算法在如下文獻中提出:Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.(《應(yīng)用數(shù)學進展》)2:482-489。變體可例如與參考抗體相差少至I至15個氨基酸殘基,少至I至10個氨基酸殘基例如6-10個,少至5個,少至4、3、2個，或甚至I個氨基酸殘基。[0179]用于制備抗體和用于選擇適當抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。參見例如Celis編輯(出版中)CellBiology&LaboratoryHandbook(《細胞生物學與實驗室手冊》),第三版(紐約學術(shù)出版社(AcademicPress,NewYork)),將該文獻全文以引用的方式并入本文中。在一些實施例中，涉及Cr蛋白的商業(yè)抗體可用于實踐本發(fā)明。[0180]以下實例以舉例說明的方式給出，而非限制本發(fā)明。[0181]SM.[0182]實例1-1P3-1序列設(shè)計[0183]為了將氨基酸序列多樣性引入Cry3Aa，通過計算機模擬設(shè)計稱為IP3-1的新Cry3型蛋白。在將一定多樣性引入Cry3Aa的設(shè)計過程中，進行適度改變例如I—V、L—F、K—H、G—A，預計這只會在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中引起非常小的變化。此類結(jié)構(gòu)變化在與通過改組引入的額外多樣性組合時可導致更高的活性。[0184]為了設(shè)計IP3-1，對所有可用的天然存在的Cry3肽序列進行比對。一個殘基接一個殘基地掃描Cry3序列，以找出Cry3蛋白中不同的特定殘基。將Cry3Aa上找到的這些多樣化殘基一個接一個地更改為其他Cry3蛋白中找到的另一殘基。通過計算機在結(jié)構(gòu)上評估每個突變以確保多肽的結(jié)構(gòu)完整性。使用同源建模根據(jù)其氨基酸序列來預測Cry3Aa衍生物的三維構(gòu)象。使用AccelrysDiscoveryStudio?v2.0產(chǎn)生Cry3衍生物的同源模型。將通過X射線結(jié)晶學確定的Cry3Aa結(jié)構(gòu)(蛋白數(shù)據(jù)庫ID1DLC，鏈A;參見Li等人(1991)Nature(《自然》)353:815-821)用作參考。AccelrysDiscoveryStudio調(diào)用MODELER(Sali和Blundell(1993)J.Mol.Biol.(《分子生物學雜志》)234:779-815)利用共軛梯度和模擬退火優(yōu)化程序來構(gòu)建模型蛋白結(jié)構(gòu)。如此構(gòu)建的同源模型可確認二級結(jié)構(gòu)元件內(nèi)的溶劑暴露位置和突變殘基側(cè)鏈的詳細取向。當在結(jié)構(gòu)評估期間鑒定出某些殘基具有重大問題時，丟棄此類突變。在突變和結(jié)構(gòu)評估循環(huán)之后，獲得IP3-1的最終氨基酸序列。[0185]利用大腸桿菌密碼子用法將IP3-1氨基酸序列回譯為核苷酸序列。IP3-1核苷酸和氨基酸序列分別在SEQIDNO:4和5中示出。合成IP3-1核苷酸序列并克隆進pMAL大腸桿菌載體中，以將IP3-1蛋白表達為MBP融合體。pMAL載體得自新英格蘭生物實驗室公司(NewEnglandBiolabs),將合成的DNA克隆進該載體中，并根據(jù)制造商推薦的方法純化MBP-1P3-1融合蛋白。融合蛋白在大腸桿菌中表達為可溶性蛋白質(zhì)。然而，當用因子Xa在PH8下消化該融合蛋白以從MBP分離IP3-1蛋白時，IP3-1蛋白沉淀。不含MBP的IP3-1在廣泛pH范圍(如測試的pH5至pH9)中幾乎完全不可溶。該計算機設(shè)計的IP3-1的溶解度和玉米根蟲(CRW)殺昆蟲活性顯示出與天然存在的Cry3Aa的報道特性相同(數(shù)據(jù)未示出)。[0186]為了增加IP3-1的溶解度，嘗試了若干突變(圖1)。如下所述制備了多個突變體，并測定它們的溶解度和殺昆蟲活性。在這些之中，有兩組突變(組1:K152E-R158E和組2:E221S-K232S)在大約pH7處表現(xiàn)出一定程度改善的溶解度。此外，這些突變體表現(xiàn)出對抗WCRff的明顯活性。[0187]在突變條件下改組IP3-1DNA，如Stemmer(1994)Nature(《自然》)370:389-391所述。選出五千個改組變體，并篩查它們對抗WCRW的殺昆蟲活性。在這些之中，3個改組變體表現(xiàn)出高CRW活性(表I)。這些變體稱為IP3-H1、IP3-H4和IP3-H7(圖1)。對這些變體進行測序，在IP3-1上找到下列突變:[0188]IP3-H1:1340V、K384E、Q472L、F589L[0189]IP3-H4:K63R、N97D、Ql19H、F584L、I(M)593V[0190]IP3-H7:112T、K63E、Q232H、K496E、Y557H、S610T[0191]如圖1中證實的，每個改組變體含有將堿性氨基酸殘基轉(zhuǎn)換為中性或酸性殘基的至少一個突變。IP3-H變體具有對抗WCRW、SCRW和NCRW的活性，而野生型Cry3Aa和IP3-1表現(xiàn)出低活性或無活性。從這些改組的CRW活性變體中，將上述的兩組突變組合以產(chǎn)生如下新序列:[0192]添加K152E-R158E突變產(chǎn)生:H1—H2、H4—H5和H7—H8[0193]進一步添加E221S-K232S突變產(chǎn)生:H2—H3、H5—H6和H8—H9[0194]通過SDS-PAGE分析純化的蛋白質(zhì)以確定精確的濃度。將蛋白質(zhì)濃度調(diào)整為2.0mg/ml并在37°C下將其混合于96孔板的昆蟲飲食中。該飲食用低溫融化性瓊脂糖制備，從而允許在37°C下與IP3蛋白徹底混合。在該飲食在室溫下凝固后，在每孔中侵染昆蟲(新生CRW幼蟲)。將板用透氣性塑料膜密封，并在28°C下溫育4天。根據(jù)進食抑制和死亡率，對昆蟲對IP3蛋白的響應(yīng)進行評分。通過概率元分析計算EC50并示于表I中。_5]表1:1P3變體多肽的殺昆蟲活性【權(quán)利要求】1.一種經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽，所述多肽在與天然存在的Cry3多肽相比時包含至少一個氨基酸置換，其中所述置換使所述經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽比所述天然存在的Cry3多肽堿性更弱。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽，其中所述置換包括將堿性氨基酸替換為中性或酸性氨基酸，將中性氨基酸替換為酸性氨基酸，或它們的組合。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽，其中所述酸性氨基酸包含谷氨酸或天冬氨酸殘基。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽，其中所述中性氨基酸包含絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸或纈氨酸殘基。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽，其中所述經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽包含氨基酸置換，所述置換將天然存在的Cry3多肽的一個或多個組氨酸、賴氨酸或精氨酸殘基替換為谷氨酸或天冬氨酸殘基。6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽，其中所述經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽包含氨基酸置換，所述置換將天然存在的Cry3多肽的一個或多個組氨酸、賴氨酸或精氨酸殘基替換為絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸或纈氨酸殘基。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽，其中所述天然存在的Cry3殺蟲多肽具有與SEQIDN0:6、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33有至少90%序列同一性的氨基酸序列。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽,其中所述天然存在的Cry3殺蟲多肽具有SEQIDN0:6、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33中所示的氨基酸序列。9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽，其中所述一個或多個置換位于這樣的位置，所述位置選自對應(yīng)于SEQID吣:6的位置12、63、97、106、117、119、140、152、158、186、206、221、222、230、232、258、292、294、340、346、384、468、472、491、496、503、531、557、584、589、593和610的位置。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項所述的經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽，其中所述經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽具有與SEQIDNO:1、2、3、8、11或14所示的氨基酸序列有至少90%序列同一性的氨基酸序列。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽，其中所述經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽具有SEQIDΝΟ:1、2、3、8、11或14中所示的氨基酸序列。12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項所述的經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽，其中所述經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽在與SEQIDNO:6的位置152或158對應(yīng)的位置處包含酸性氨基酸殘基或中性氨基酸殘基，其中所述經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽表現(xiàn)出對蛋白酶消化的抗性。13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項所述的經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽，其中所述經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽在與天然存在的Cry3多肽相比時具有改善的殺蟲活性。14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項所述的經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽，其中所述經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽在與天然存在的Cry3多肽相比時在pH5至9的溶液中具有更大溶解度。15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項所述的經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽，其中所述經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽具有對抗鞘翅目(Coleopteran)的殺蟲活性。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽，其中所述鞘翅目為西方玉米根蟲或南方玉米根蟲。17.一種多核苷酸，其具有編碼根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項所述的經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽的核苷酸序列。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列與SEQIDNO:7、9、10、12、13或15所示的序列具有至少90%序列同一1丨生。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列在SEQIDNO:7、9、10、12、13或15中示出。20.—種表達盒,其包含根據(jù)權(quán)利要求17-19中任一項所述的多核苷酸。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的表達盒，其中所述多核苷酸有效連接至驅(qū)動在微生物或植物中表達的啟動子。22.—種宿主細胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求17-19中任一項所述的多核苷酸。23.—種植物,其包含根據(jù)權(quán)利要求17-19中任一項所述的多核苷酸,其中所述多核苷酸有效連接至在所述植物中有活性的啟動子。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的植物，其中所述植物為單子葉植物。25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的植物，其中所述植物為雙子葉植物。26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的植物，其中所述單子葉植物選自玉蜀黍、甘蔗、小麥、水稻、大麥、高粱和黑麥。`27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的植物，其中所述單子葉植物為玉蜀黍。28.一種轉(zhuǎn)基因種子，其由根據(jù)權(quán)利要求23-27中任一項所述的植物產(chǎn)生。29.—種產(chǎn)生具有改善殺蟲活性的植物的方法，所述方法包括將具有編碼經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽的核苷酸序列的多核苷酸引入所述植物中，所述經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽在與天然存在的Cry3多肽相比時具有至少一個氨基酸置換，其中所述置換使所述經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽比所述天然存在的Cry3多肽堿性更弱，其中所述多核苷酸序列有效連接至驅(qū)動在植物細胞中表達的啟動子序列。30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述置換包括將堿性氨基酸替換為中性或酸性氨基酸，將中性氨基酸替換為酸性氨基酸，或它們的組合。31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述酸性氨基酸包含谷氨酸或天冬氨酸殘基。32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述中性氨基酸包含絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸或纈氨酸殘基。33.根據(jù)權(quán)利要求29-32中任一項所述的方法，其中所述經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽包含氨基酸置換，所述置換將天然存在的Cry3多肽的一個或多個組氨酸、賴氨酸或精氨酸殘基替換為谷氨酸或天冬氨酸殘基。34.根據(jù)權(quán)利要求29-32中任一項所述的方法，其中所述經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽包含氨基酸置換，所述置換將天然存在的Cry3多肽的一個或多個組氨酸、賴氨酸或精氨酸殘基替換為絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸或纈氨酸殘基。35.根據(jù)權(quán)利要求29-34中任一項所述的方法，其中所述天然存在的Cry3殺蟲多肽具有與SEQIDN0:6、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33有至少90%序列同一性的氨基酸序列。36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述天然存在的Cry3殺蟲多肽具有SEQIDN0:6、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33中所示的氨基酸序列。37.根據(jù)權(quán)利要求29-36中任一項所述的方法，其中所述一個或多個置換位于這樣的位置，所述位置選自對應(yīng)于SEQIDNO:6的位置12、63、97、106、117、119、140、152、158、186、206、221、222、230、232、258、292、294、340、346、384、468、472、491、496、503、531、557、584、589、593和610的位置。38.根據(jù)權(quán)利要求29-37中任一項所述的方法，其中所述經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽具有與SEQIDNO:1、2、6、8、11或14所示的所述氨基酸序列有至少90%序列同一性的氨基酸序列。39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽具有SEQIDNO:1、2、3、8、11或14中所示的所述氨基酸序列。40.根據(jù)權(quán)利要求29-39中任一項所述的方法，其中所述經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽在與SEQIDNO:6的位置152或158對應(yīng)的位置處包含酸性氨基酸殘基或中性氨基酸殘基，其中所述經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽表現(xiàn)出對蛋白酶消化的抗性。41.根據(jù)權(quán)利要求29-40中任一項所述的方法，其中所述經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽在與天然存在的Cry3多肽相比時具有改善的殺蟲活性。42.根據(jù)權(quán)利要求29-41中任一項所述的方法，其中所述經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽在與天然存在的Cry3多肽相比時在pH5至9的溶液中具有更大溶解度。43.根據(jù)權(quán)利要求29-42中任一項所述的方法，其中所述經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽具有對抗鞘翅目的殺蟲活性。44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述鞘翅目為西方玉米根蟲或南方玉米根蟲。45.一種用于防治耕作區(qū)的昆蟲害蟲的方法，其包括在所述區(qū)域種植根據(jù)權(quán)利要求28所述的轉(zhuǎn)基因種子。46.一種殺蟲組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項所述的經(jīng)修飾的Cry3殺蟲多肽。47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的殺蟲組合物，其還包含載體。48.一種用于防治耕作區(qū)的昆蟲害蟲的方法，其包括向所述昆蟲害蟲的環(huán)境施加有效量的根據(jù)權(quán)利要求46或47所述的殺蟲組合物。49.一種包含根據(jù)權(quán)利要求17-19中任一項所述的多核苷酸的微生物,其中所述多核苷酸有效連接至驅(qū)動在所述微生物中表達的啟動子。50.一種殺蟲組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求49所述的至少一種微生物。51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的殺蟲組合物，其還包含載體。52.一種用于防治耕作區(qū)的昆蟲害蟲的方法，其包括向所述昆蟲害蟲的環(huán)境施加有效量的根據(jù)權(quán)利要求50或51所述的殺蟲組合物。53.一種用于防治耕作區(qū)的昆蟲害蟲的方法，其包括在所述區(qū)域種植根據(jù)權(quán)利要求28所述的轉(zhuǎn)基因種子。54.根據(jù)權(quán)利要求48、52和53中任一項所述的方法，其中所述昆蟲害蟲為鞘翅目?！疚臋n編號】C12N15/82GK103459601SQ201280015789【公開日】2013年12月18日申請日期:2012年2月10日優(yōu)先權(quán)日:2011年2月11日【發(fā)明者】E.伯穆德斯,R.從,侯晶彤,山本敬司申請人:先鋒國際良種公司