發(fā)酵制備有機(jī)化合物的微生物和方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及產(chǎn)生和/或分泌有機(jī)化合物的微生物，其中所述微生物與特定的起始菌株相比，其中具有海藻糖輸入蛋白活性的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的一或多個(gè)蛋白質(zhì)亞基表達(dá)增加，所述微生物能從培養(yǎng)基中攝取海藻糖；本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的微生物制備有機(jī)化合物的方法，其中海藻糖在發(fā)酵液中的積累被降低或避免。
【專利說明】發(fā)酵制備有機(jī)化合物的微生物和方法
[0001]本發(fā)明涉及產(chǎn)生和/或分泌有機(jī)化合物的微生物，所述微生物的海藻糖輸入蛋白 (importer)表達(dá)增加,本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的微生物制備有機(jī)化合物的方法。
現(xiàn)有技術(shù)
[0002]L-氨基酸用于人用藥物、制藥工業(yè)、食品工業(yè)，特別用于動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)。
[0003]已知L-氨基酸如L-賴氨酸是通過棒桿菌、特別是谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)菌株或者腸桿菌科菌株、特別是大腸桿菌(Bscherichia coli)的發(fā)酵產(chǎn)生的。 由于巨大的經(jīng)濟(jì)重要性，持續(xù)進(jìn)行著關(guān)于改良生產(chǎn)方法的工作。方法的改良涉及發(fā)酵技術(shù)措施如攪拌和供氧，或者涉及營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的組成成分，例如發(fā)酵期間的糖濃度，或者涉及產(chǎn)物形式的加工，例如離子交換層析，或者涉及微生物自身的固有性質(zhì)。
[0004]用于改良這些微生物的生產(chǎn)性質(zhì)的方法是誘變、選擇及突變體選擇等方法。以此方式獲得對(duì)抗代謝物有抗性或?qū)χ匾{(diào)控代謝物是營(yíng)養(yǎng)缺陷的并產(chǎn)生L-氨基酸的菌株。 已知的抗代謝物是賴氨酸類似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)。
[0005]一段時(shí)間以來，重組DNA技術(shù)的方法也已經(jīng)用于棒桿菌屬、特別是谷氨酸棒桿菌或者腸桿菌屬、特別是大腸桿菌的生產(chǎn)L 一氨基酸的菌株改良，通過修飾、即增強(qiáng)或弱化各個(gè)氨基酸生物合成基因及研究對(duì)氨基酸生產(chǎn)的作用而進(jìn)行改良。
[0006]許多細(xì)菌的染色體的核苷酸序列已經(jīng)被公開。
[0007]谷氛酸棒桿菌ATCC13032基因組的核昔酸序列在Ikeda and Nakagawa (Applied Microbiology and Biotechnology62, 99-109(2003)) > EPl108790 及 Kalinowski et al.(Journal of Biotechnolgyl04 (1-3)，(2003))中描述。
[0008]谷氨酸棒桿菌R基因組的核苷酸序列在Yukawa et al.(Microbiologyl53 (4): 10 42-1058(2007))中描述。
[0009]Corynebacterium efficiens 基因組的核苷酸序列在 Nishio et al (Genome Research.13(7)，1572—1579(2003))中描述。
[0010]白喉棒桿菌(Corynebacterium diphteriae) NCTC13129基因組的核苷酸序列由 Cerdeno-Tarraga et al.(Nucleic Acids Research31 (22), 6516-6523 (2003))描述。
[0011]Corynebacterium jeikeum基因組的核苷酸序列由 Tauch et al.(Journal of Ba cteriologyl87 (13)，4671-4682 (2005))描述。
[0012]關(guān)于發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的各個(gè)方面的綜述可見于R.Faurie and J.Thommel in Advances in Biochemical Engineering Biotechnology, volume79(Springer-Verlag, Ber I in, Heidelberg (Germany) 2003)描述。
[0013]在谷氨酸棒桿菌的工業(yè)發(fā)酵上清中發(fā)現(xiàn)大量分泌的海藻糖。這種外部積累的海藻糖不被細(xì)胞代謝再循環(huán)。因此，就工業(yè)發(fā)酵中的最大可實(shí)現(xiàn)的產(chǎn)物形成及在發(fā)酵罐中達(dá)到的生物量濃度而言，所述外部積累的海藻糖均代表顯著的損失。
[0014]外部積累的海藻糖的利用是期望的主要目標(biāo)。實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)具有多個(gè)可能的正面結(jié)果:(1)在發(fā)酵結(jié)束時(shí)保持未使用的底物碳的利用，(2)增加發(fā)酵中可實(shí)現(xiàn)的生物量，(3)增加在生物技術(shù)生產(chǎn)過程中的產(chǎn)物產(chǎn)量，即氨基酸的產(chǎn)生，(4)在發(fā)酵結(jié)束時(shí)避免產(chǎn)物上清中不希望的污染。
[0015]因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供發(fā)酵制備有機(jī)化合物的改良的微生物和方法。
[0016]本發(fā)明提供了產(chǎn)生和/或分泌有機(jī)化合物的微生物，其中所述微生物與特定的起始菌株相比，其中具有海藻糖輸入蛋白(importer)活性的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的一或多個(gè)蛋白質(zhì)亞基的表達(dá)增加，所述微生物能從培養(yǎng)基中攝取海藻糖。
[0017]本發(fā)明進(jìn)一步提供了發(fā)酵制備有機(jī)化合物的方法，包括如下步驟:
[0018]a)將上述本發(fā)明的微生物在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得發(fā)酵液，及
[0019]b)積累步驟a)的發(fā)酵液中的所述有機(jī)化合物；
[0020]其中所述發(fā)酵液中海藻糖的積累被降低或避免。優(yōu)選使所述發(fā)酵液中海藻糖的積累與特定微生物起始菌株相比降低50%或更多，70%或更多，80%或更多，90%或更多，95%或更多，98%或更多，99%或更多，最優(yōu)選99.5%或更多。
[0021]本發(fā)明在如下方面是有利的，即(I)海藻糖形式的底物碳在本發(fā)明中被利用，而若在其他情況中，海藻糖形式的底物碳在發(fā)酵結(jié)束時(shí)在發(fā)酵液中保持未被利用；(2)發(fā)酵中可達(dá)到的生物量是增加的；(3)生物技術(shù)生產(chǎn)過程中的產(chǎn)物產(chǎn)量即氨基酸的生產(chǎn)增加； 及(4)避免了在發(fā)酵結(jié)束時(shí)產(chǎn)物上清中不希望的污染。
[0022]令人驚奇地，已經(jīng)在谷氨酸棒桿菌中鑒定了海藻糖攝取系統(tǒng)。使用相應(yīng)的生產(chǎn)菌株，編碼海藻糖輸入系統(tǒng)的操縱子的所有基因的增強(qiáng)表達(dá)導(dǎo)致靶產(chǎn)物(有機(jī)化合物)增加。 令人驚奇地，當(dāng)僅一個(gè)亞基(例如通透酶亞基)被表達(dá)時(shí)也發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的海藻糖攝取。本發(fā)明因此提供了這樣的微生物，其細(xì)胞通過質(zhì)膜中的活性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)攝取外部積累的海藻糖。事實(shí)是谷氨酸棒桿菌具有代謝細(xì)胞質(zhì)中海藻糖的代謝能力，導(dǎo)致本發(fā)明的上述優(yōu)勢(shì)。優(yōu)選地， 所述微生物與所述微生物的特定起始菌株相比能降低、特別是避免介質(zhì)(培養(yǎng)基)中海藻糖的積累。
[0023]在所述微生物的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，具有海藻糖輸入蛋白活性的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白衍生自谷氨酸棒桿菌。
[0024]具有海藻糖輸入蛋白活性的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的蛋白質(zhì)亞基如下:整合膜蛋白(通透酶)，ATP-結(jié)合及水解(ATPase)蛋白，及周質(zhì)(或脂蛋白)底物結(jié)合蛋白。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的組成如下:兩個(gè)通透酶，兩個(gè)ATPase及一個(gè)周質(zhì)(或脂蛋白)底物結(jié)合蛋白。所述兩個(gè)通透酶和ATPase在每種情況中可具有不同的氨基酸序列。
[0025]本發(fā)明的微生物的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案與特定的起始菌株相比，其中具有海藻糖輸入蛋白活性的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的所有蛋白質(zhì)亞基的表達(dá)均增加。這意味著優(yōu)選具有海藻糖輸入蛋白活性的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的通透酶、ATPase和周質(zhì)亞基的表達(dá)均增加，即是過表達(dá)的。
[0026]在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的微生物與特定的起始菌株相比，其中具有海藻糖輸入蛋白活性的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的一或多個(gè)蛋白質(zhì)亞基的表達(dá)增加。此外，編碼具有海藻糖輸入蛋白活性的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的亞基的操縱子的基因的表達(dá)可增加，所述基因不一定編碼 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞基本身。
[0027]更加優(yōu)選地提供了這樣的微生物，所述微生物與特定的起始菌株相比，其中選自 a) -f)中的至少一種多核苷酸的表達(dá)增加:
[0028]a)編碼具有與SEQ ID NO: 2或14所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
[0029]b)編碼具有與SEQ ID N0:4或16所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
[0030]c)編碼具有與SEQ ID N0:6或18所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
[0031]d)編碼具有與SEQ ID N0:8或20所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
[0032]e)編碼具有與SEQ ID NO: 10或22所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
[0033]f)編碼具有與SEQ ID NO: 12或24所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
[0034]優(yōu)選地進(jìn)一步提供了這樣的微生物，所述微生物與特定的起始菌株相比，其中選自a)、b)、d)、e)中的至少一種多核苷酸的表達(dá)增加:
[0035]a)編碼具有與SEQ ID NO: 2或14所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
[0036]b)編碼具有與SEQ ID N0:4或16所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
[0037]d)編碼具有與SEQ ID N0:8或20所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
[0038]e)編碼具有與SEQ ID NO: 10或22所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
[0039]在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述微生物與特定的起始菌株相比,其中選自b)、d) 和e)中的至少一種多核苷酸的表達(dá)增加:
[0040]b)編碼具有與SEQ ID N0:4或16所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
[0041]d)編碼具有與SEQ ID N0:8或20所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
[0042]e)編碼具有與SEQ ID NO: 10或22所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
[0043]特別優(yōu)選地，所述微生物與特定的起始菌株相比，其中如下多核苷酸的表達(dá)增加:
[0044]d)編碼具有與SEQ ID N0:8或20所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；和/或
[0045]e)編碼具有與SEQ ID NO: 10或22所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
[0046]進(jìn)一步地,所述微生物的優(yōu)選的實(shí)施方案與特定起始菌株相比,其中多核苷酸a) 和b)的表達(dá)增加:
[0047]a)編碼具有與SEQ ID NO: 2或14所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；[0048]b)編碼具有與SEQ ID N0:4或16所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
[0049]及多核苷酸d)和/或e)的表達(dá)增加:
[0050]d)編碼具有與SEQ ID N0:8或20所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
[0051]e)編碼具有與SEQ ID NO: 10或22所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
[0052]進(jìn)一步優(yōu)選地，本發(fā)明提供了這樣的微生物，其與特定的起始菌株相比，其中多核苷酸a)、b)、c)、d)和e)及適當(dāng)時(shí)f)的表達(dá)增加。
[0053]有機(jī)化合物在本發(fā)明中是指維生素，如硫胺(維生素BI)，核黃素(維生素B2)，氰鈷胺(維生素B12)，葉酸(維生素M)，生育酚(維生素E)或者煙酸/煙堿，核苷或核苷酸如S-腺苷-甲硫氨酸，肌苷5’ - 一磷酸和鳥苷5’ - 一磷酸，L-氨基酸，或者胺如尸胺。優(yōu)選產(chǎn)生L-氨基酸及含有其的產(chǎn)物。
[0054]由本發(fā)明的微生物產(chǎn)生和/或分泌的有機(jī)化合物優(yōu)選選自維生素，核苷或核苷酸，L-氨基酸和胺。
[0055]術(shù)語L-氨基酸包括蛋白質(zhì)氨基酸及L-鳥氨酸和L-高絲氨酸。蛋白質(zhì)L-氨基酸是指在天然蛋白質(zhì)中存在的L-氨基酸，即在微生物、植物、動(dòng)物和人的蛋白質(zhì)中。蛋白質(zhì)氨基酸包括L-天冬氨酸，L-天冬酰胺，L-蘇氨酸，L-絲氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，L-甘氨酸，L-丙氨酸，L-半胱氨酸，L-纈氨酸，L-甲硫氨酸，L-異亮氨酸，L-亮氨酸，L-酪氨酸，L-苯丙氨酸，L-組氨酸，L-賴氨酸，L-色氨酸，L-精氨酸，L-脯氨酸，及在一些情況中 L-硒代半胱氨酸和L-吡咯賴氨酸。
[0056]所述有機(jī)化合物特別優(yōu)選選自蛋白質(zhì)L-氨基酸，L-鳥氨酸和L-高絲氨酸。特別優(yōu)選選自L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-纈氨酸、L-脯氨酸、L-谷氨酸和L-異亮氨酸，特別是 L-賴氨酸的蛋白質(zhì)L-氨基酸。
[0057]在下文提及的術(shù)語氨基酸或L-氨基酸也包含其鹽，例如在L-賴氨酸的情況中的賴氨酸一鹽酸鹽或者賴氨酸硫酸鹽。
[0058]所述微生物優(yōu)選選自細(xì)菌、酵母和真菌，特別優(yōu)選棒桿菌屬細(xì)菌和腸桿菌科細(xì)菌， 特別優(yōu)選的是谷氨酸棒桿菌。
[0059]在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼具有海藻糖輸入蛋白活性的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的蛋白質(zhì)亞基的多核苷酸的表達(dá)通過選自如下的一或多種措施而增加:
[0060]a)所述基因的表達(dá)在啟動(dòng)子控制下，所述啟動(dòng)子與所述基因的原始啟動(dòng)子相比在用于所述方法的微生物中的作用強(qiáng)；
[0061]b)增加編碼具有海藻糖輸入蛋白活性的多肽的基因的拷貝數(shù)，優(yōu)選通過將所述基因以增加的拷貝數(shù)插入質(zhì)粒中和/或通過將所述基因的至少一個(gè)拷貝整合進(jìn)所述微生物的染色體中而進(jìn)行；
[0062]c)使用核糖體結(jié)合位點(diǎn)表達(dá)所述基因，所述核糖體結(jié)合位點(diǎn)與所述基因的原始核糖體結(jié)合位點(diǎn)相比在用于所述方法的微生物中作用強(qiáng)；
[0063]d)所述基因的表達(dá)通過優(yōu)化用于所述方法的微生物密碼子選擇而實(shí)現(xiàn)；
[0064]e)所述基因的表達(dá)通過降低由所述基因轉(zhuǎn)錄的mRNA中的mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)而實(shí)現(xiàn)；[0065]f)所述基因的表達(dá)通過消除由所述基因轉(zhuǎn)錄的mRNA中的RNA聚合酶終止子序列而實(shí)現(xiàn)；
[0066]g)所述基因的表達(dá)通過在由所述基因轉(zhuǎn)錄的mRNA中使用mRNA穩(wěn)定化序列而實(shí)現(xiàn)。
[0067]上述增加表達(dá)的措施可以合適方式組合。優(yōu)選通過組合選自a)、b)和c)的至少兩種措施、特別優(yōu)選組合措施a)和b)，以增加編碼具有海藻糖輸入蛋白活性的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的蛋白質(zhì)亞基的多核苷酸的表達(dá)。
[0068]如上所述，本發(fā)明還涉及發(fā)酵制備有機(jī)化合物的方法，包括如下步驟:
[0069]a)將上述本發(fā)明微生物在合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得發(fā)酵液，及
[0070]b)積累步驟a)的發(fā)酵液中的所述有機(jī)化合物；
[0071]其中所述發(fā)酵液中海藻糖的積累被降低或避免。
[0072]優(yōu)選地，與特定的微生物起始菌株相比，本發(fā)明的微生物使所述發(fā)酵液中海藻糖的積累降低50%或更多，70%或更多，80%或更多，90%或更多，95%或更多，98%或更多，99% 或更多，及最優(yōu)選99.5%或更多。
[0073]在優(yōu)選的方法中，根據(jù)如下1-VIII的定義之一，用于培養(yǎng)的微生物與特定起始菌株相比一或多個(gè)多核苷酸的表達(dá)增加:
[0074]1:與特定起始菌株相比選自a)_f)中的多核苷酸的表達(dá)增加:
[0075]a)編碼具有與SEQ ID NO: 2或14所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
[0076]b)編碼具有與SEQ ID N0:4或16所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
[0077]c)編碼具有與SEQ ID N0:6或18所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
[0078]d)編碼具有與SEQ ID N0:8或20所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
[0079]e)編碼具有與SEQ ID NO: 10或22所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
[0080]f)編碼具有與SEQ ID NO: 12或24所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
[0081]I1:與特定起始菌株相比選自a)、b)、d)和e)中的多核苷酸的表達(dá)增加；
[0082]II1:與特定起始菌株相比選自b)、d)和e)中的多核苷酸的表達(dá)增加；
[0083]IV:與特定起始菌株相比多核苷酸d)和/或e)的表達(dá)增加；
[0084]V:與特定起始菌株相比多核苷酸a)、b)、d)和e)的表達(dá)增加；
[0085]V1:與特定起始菌株相比多核苷酸a)、b)、d)的表達(dá)增加；
[0086]VI1:與特定起始菌株相比多核苷酸a)、b)、e)的表達(dá)增加；
[0087]VII1:與特定起始菌株相比多核苷酸a)_e)及適當(dāng)時(shí)f)的表達(dá)增加。
[0088]本發(fā)明優(yōu)選從所述發(fā)酵液中產(chǎn)生液體或固體形式產(chǎn)物。
[0089]如上所述，術(shù)語微生物包括細(xì)菌、酵母和真菌。在細(xì)菌中，可以特別提及的是棒桿菌屬和腸桿菌科細(xì)菌。[0090]在棒桿菌屬中，優(yōu)選基于如下物種的菌株:
[0091]Corynebacterium efficiens,例如模式菌株 DSM44549，
[0092]谷氨酸棒桿菌，例如模式菌株ATCC13032或者菌株R，及
[0093]產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacteriumammoniagenes),例如菌株 ATCC6871,
[0094]特別優(yōu)選谷氨酸棒桿菌物種。
[0095]本領(lǐng)域已知一些代表性谷氨酸棒桿菌物種，其也有不同的名稱。這些菌株包括如:
[0096]菌株ATCC13870,稱作嗜乙酸乙酸棒桿菌(Corynebacteriumacetoacidophilum),
[0097]菌株DSM20137,稱作百合棒桿菌(Corynebacterium Iilium),
[0098]菌株ATCC17965,稱作 Corynebacterium melassecola,
[0099]菌株ATCC14067,稱作黃色短桿菌(Brevibacterium f Iavum),
[0100]菌株ATCC13869,稱作乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum),及
[0101]菌株ATCC14020,稱作 Brevibacterium divaricatum。
[0102]術(shù)語“產(chǎn)谷氨酸小球菌(Micrococcus glutamicus)”同樣用于谷氨酸棒桿菌。
[0103]Corynebacterium efficiens的一些代表性物種在本領(lǐng)域也稱作嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌 (Corynebacterium thermoaminogenes),例如菌株 FERM BP-1539。
[0104]用于過表達(dá)海藻糖輸入蛋白的微生物或菌株(起始菌株)優(yōu)選已經(jīng)具有在細(xì)胞中濃縮希望的L-氨基酸或者將其分泌進(jìn)周圍營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中并在此積累其的能力。在下文也使用“產(chǎn)生”這個(gè)詞語。更特別地，用于過表達(dá)的菌株具有在< (不超過)120小時(shí)、<96 小時(shí)、< 48小時(shí)、< 36小時(shí)、< 24小時(shí)或者< 12小時(shí)內(nèi)在細(xì)胞中濃縮或者在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中積累≥(至少)0.10g/U 0.25g/U 0.5g/U 1.0g/U 1.5g/U 2.0g/U 4g/ I或者> 10g/l希望的化合物的能力。起始菌株優(yōu)選是通過誘變和選擇、通過重組DNA技術(shù)或者通過組合這兩種方法產(chǎn)生的菌株。
[0105]本領(lǐng)域技術(shù)人員理解適于本發(fā)明的微生物也可以這樣獲得，即首先在野生型菌株中如在谷氨酸棒桿菌模式菌株ATCC13032中或者在菌株ATCC14067中過表達(dá)海藻糖輸入蛋白，然后通過本領(lǐng)域描述的進(jìn)一步遺傳措施使得所述微生物產(chǎn)生希望的L-氨基酸。僅用提及的多核苷酸轉(zhuǎn)化野生型菌株不構(gòu)成本發(fā)明的措施。
[0106]舉例的分泌或產(chǎn)生L-賴氨酸的谷氨酸棒桿菌菌株是:
[0107]谷氨酸棒桿菌MH20-22B (=DSM16835),在 Menkel et al.(Applied and Environmental Microbiology55 (3)，684-688 (1989))中描述，保藏號(hào)為 DSM16835 ；
[0108]谷氨酸棒桿菌DM1729,在 Georgi et al.(Metabolic Engineering?, 291-301 (2005))和 EP1717616A2 中描述，保藏號(hào)為 DSM17576 ；
[0109]谷氨酸棒桿菌DSM13994，在US6, 783，967中描述；及
[0110]谷氨酸棒桿菌DM1933,在 Blombach et al.(Appl Environ Microbiol.2009Jan ; 75 (2):419-27)中描述。
[0111]舉例的分泌或產(chǎn)生L-賴氨酸的Corynebacterium efficiens物種菌株是:
[0112]嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌AJ12521 (=FERM BP-3304)，在 US5, 250，423 中描述。
[0113]產(chǎn)生L-賴氨酸的微生物典型具有反饋抗性或者去敏感的天冬氨酸激酶。反饋抗性天冬氨酸激酶是指這樣的天冬氨酸激酶(LysC)，其與野生形式(野生型)對(duì)比示出對(duì)賴氨酸與蘇氨酸的混合物或者AEC(氨乙基半胱氨酸)與蘇氨酸的混合物或者單獨(dú)的賴氨酸或者單獨(dú)的AEC的抑制作用具有較低的敏感性。編碼與野生型相比去敏感的這些天冬氨酸激酶的基因或等位基因也稱作lysCFBK等位基因。在谷氨酸棒桿菌物種的天冬氨酸激酶的情況中，合適的野生型是菌株ATCC13032。本領(lǐng)域描述了編碼與野生型蛋白質(zhì)相比具有氨基酸取代的天冬氨酸激酶變體的許多l(xiāng)ysCFBK等位基因。棒桿菌屬細(xì)菌中的IysC基因也被稱作ask基因。由腸桿菌中IysC基因編碼的天冬氨酸激酶也稱作天冬氨酸激酶III。
[0114]含有關(guān)于谷氨酸棒桿菌天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)中氨基酸取代導(dǎo)致去敏感化的信息的詳細(xì)列表在W02009141330中描述。優(yōu)選的天冬氨酸激酶變體攜帶選自如下的氨基酸取代:在第380位氨基酸位置的L-異亮氨酸取代為L(zhǎng)-蘇氨酸，及任選在第381位置的L-苯丙氨酸取代為L(zhǎng)-絲氨酸，在第311位的L-異亮氨酸取代為L(zhǎng)-蘇氨酸，及在第279位的L-蘇氨酸取代為L(zhǎng)-丙氨酸。
[0115]含有關(guān)于大腸桿菌天冬氨酸激酶III蛋白質(zhì)中氨基酸取代導(dǎo)致對(duì)L-賴氨酸抑制作用去敏感化的信息的詳細(xì)列表在EP0834559A1第三頁(第29-41行)描述。優(yōu)選的天冬氨酸激酶變體含有在氨基酸序列第323位L-天冬氨酸代替甘氨酸，和/或第318位L-異亮氨酸代替L-甲硫氨酸。
[0116]舉例的分泌或產(chǎn)生L-甲硫氨酸的谷氨酸棒桿菌物種的菌株是:
[0117]谷氨酸棒桿菌DSM17322，在W02007/011939中描述。
[0118]舉例的產(chǎn)生或分泌L-色氨酸的已知代表性棒桿菌細(xì)菌菌株是:
[0119]谷氨酸棒桿菌K76 (=Ferm BP-1847)，在 US5, 563，052 中描述；
[0120]谷氨酸棒桿菌BPS13 (=Ferm BP-1777)，在 US5, 605，818 中描述；及
[0121]谷氨酸棒桿菌Ferm BP-3055，在US5, 235，940中描述。
[0122]舉例的產(chǎn)生或分泌L -纈氨酸的已知代表性棒桿菌細(xì)菌菌株是:
[0123]乳發(fā)酵短桿菌FERM BP-1763，在US5, 188，948中描述；
[0124]乳發(fā)酵短桿菌FERM BP-3007，在US5, 521，074中描述；
[0125]谷氨酸棒桿菌FERM BP-3006，在US5, 521，074中描述；及
[0126]谷氨酸棒桿菌FERM BP-1764，在US5, 188,948中描述。
[0127]舉例的產(chǎn)生或分泌L-異亮氨酸的已知代表性棒桿菌細(xì)菌菌株是:
[0128]黃色短桿菌FERM BP-760，在 US4, 656，135 中描述；
[0129]黃色短桿菌FERM BP-2215，在US5, 294，547中描述；及
[0130]谷氨酸棒桿菌FERM BP-758，在US4, 656，135中描述。
[0131]舉例的產(chǎn)生或分泌L-高絲氨酸的已知代表性棒桿菌細(xì)菌菌株是:
[0132]產(chǎn)谷氨酸小球菌ATCC14296，在US3, 189,526中描述；
[0133]產(chǎn)谷氨酸小球菌ATCC14297，在US3, 189,526中描述。
[0134]產(chǎn)生或分泌尸胺的微生物在例如W02007/113127中描述。
[0135]具有海藻糖輸入蛋白活性的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是指具有多個(gè)亞基的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物，其催化海藻糖從周圍環(huán)境中轉(zhuǎn)運(yùn)至微生物的細(xì)胞中。
[0136]ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)成最大的膜蛋白家族之一，其共同的結(jié)構(gòu)元件是ATP-結(jié)合盒，及其主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)特定底物穿過細(xì)胞膜。轉(zhuǎn)運(yùn)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的對(duì)抗?jié)舛忍荻刃枰哪芰客ㄟ^結(jié)合并水解ATPase單位上的ATP而產(chǎn)生。[0137]原核ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)通常由三部分組成:兩個(gè)整合膜蛋白(通透酶)，每個(gè)蛋白均具有5-7個(gè)跨膜節(jié)段，兩個(gè)結(jié)合并水解ATP (ATPase)的另外的蛋白質(zhì)，及一個(gè)周質(zhì)底物結(jié)合蛋白(或者錨定膜的脂蛋白)。所述三部分的一些基因構(gòu)成操縱子。因此ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白首先屬于初級(jí)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(primarily active transporters),其次屬于膜結(jié)合的 ATPase0
[0138]公開的數(shù)據(jù)庫(kù)如UniProtKB (Universal Protein Resource Knowledgebase) 數(shù)據(jù)庫(kù)含有極為不同的生物體的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的描述。UniProtKB數(shù)據(jù)庫(kù)由UniProt consortium 維護(hù)， 其包括 European Bioinformatics Institute (EBI, Wellcome Trust, Hinxton Cambridge, United Kingdom)、Swiss Institute of Bioinformatics(SIB, Centre Medical Universitaire, Geneva, Switzerland)及 Protein Information Resource(PIR, Georgetown University, Washington, DC, US)。
[0139]海藻糖輸入蛋白的基因可以借助于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)使用合適的引物自生物體分離。操作指南可見于Newton and Graham(Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994)的 “PCR” 實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)及在 TO2006/100211 中第 14-17 頁描述。
[0140]本發(fā)明利用來自棒桿菌的海藻糖輸入蛋白的基因。優(yōu)選使用編碼具有海藻糖輸入蛋白活性的多肽的基因，其氨基酸序列與選自SEQ ID N0:2、4、6、8、10及適當(dāng)時(shí)SEQ ID NO: 12 或 14、16、18、20、22、24 的氨基酸序列≥(至少)50%、≥ 60%、≥ 70%、≥ 80%、≥ 90%、 ≥92%、≥94%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99%相同。在本發(fā)明的研究中，鑒定了編碼谷氨酸棒桿菌的海藻糖輸入蛋白的操縱子。編碼谷氨酸棒桿菌中海藻糖輸入蛋白的操縱子具有多個(gè)讀框或基因。
[0141]表I概括了關(guān)于編碼谷氨酸棒桿菌海藻糖輸入蛋白的操縱子的讀框的信息。
[0142]表1:編碼谷氨酸棒桿菌海藻糖輸入蛋白的操縱子的基因/讀框
[0143]
【權(quán)利要求】
1.產(chǎn)生和/或分泌有機(jī)化合物的微生物，特征在于所述微生物與特定的起始菌株相 t匕，其中具有海藻糖輸入蛋白活性的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的一或多個(gè)蛋白質(zhì)亞基的表達(dá)增加，所述微生物能從培養(yǎng)基中攝取海藻糖。
2.權(quán)利要求1的微生物，特征在于所述微生物與特定的起始菌株相比，其中具有海藻糖輸入蛋白活性的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的所有蛋白質(zhì)亞基的表達(dá)均增加。
3.權(quán)利要求1或2的微生物，特征在于所述微生物與特定起始菌株相比，其中選自 a) -f)中的至少一種多核苷酸的表達(dá)增加:a)編碼具有與SEQID NO: 2或14所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；b)編碼具有與SEQID N0:4或16所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；c)編碼具有與SEQID NO:6或18所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；d)編碼具有與SEQID NO:8或20所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；e)編碼具有與SEQID NO: 10或22所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；f)編碼具有與SEQID NO: 12或24所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
4.權(quán)利要求1或2的微生物，特征在于所述微生物與特定的起始菌株相比，其中選自a)、b)、d)、e)中的至少一種多核苷酸的表達(dá)增加:a)編碼具有與SEQID NO: 2或14所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；b)編碼具有與SEQID N0:4或16所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；d)編碼具有與SEQID NO :8或20所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；e)編碼具有與SEQID NO: 10或22所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
5.權(quán)利要求1的微生物，特征在于所述微生物與特定的起始菌株相比，其中選自b)、d) 和e)中的至少一種多核苷酸的表達(dá)增加:b)編碼具有與SEQ ID N0:4或16所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；d)編碼具有與SEQID NO:8或20所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；e)編碼具有與SEQID NO: 10或22所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
6.權(quán)利要求1的微生物，特征在于所述微生物與特定起始菌株相比如下多核苷酸的表達(dá)增加:d)編碼具有與SEQID N0:8或20所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；和/或e)編碼具有與SEQID NO: 10或22所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
7.權(quán)利要求1的微生物，特征在于所述微生物與特定的起始菌株相比，其中多核苷酸 a)和b)的表達(dá)增加:a)編碼具有與SEQID NO: 2或14所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；b)編碼具有與SEQID N0:4或16所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；且多核苷酸d)和/或e)的表達(dá)增加:d)編碼具有與SEQID NO:8或20所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；e)編碼具有與SEQID NO: 10或22所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
8.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的微生物,特征在于所述微生物與特定的起始菌株相比,其中多核苷酸a)、b)、c)、d)和e)及適當(dāng)時(shí)f)的表達(dá)增加。
9.權(quán)利要求1-8任 一項(xiàng)的微生物,特征在于所述有機(jī)化合物選自維生素、核苷或核苷酸、L-氨基酸和胺。
10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的微生物，特征在于所述有機(jī)化合物選自蛋白質(zhì)L-氨基酸， L-鳥氨酸和L-高絲氨酸。
11.權(quán)利要求10的微生物，特征在于所述蛋白質(zhì)L-氨基酸選自L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-纈氨酸、L-脯氨酸、L-谷氨酸和L-異亮氨酸，優(yōu)選L-賴氨酸。
12.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的微生物，特征在于所述微生物選自細(xì)菌、酵母和真菌，優(yōu)選棒桿菌屬細(xì)菌和腸桿菌科細(xì)菌，特別優(yōu)選谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)。
13.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的微生物，特征在于通過選自如下一組的一或多項(xiàng)措施使編碼具有海藻糖輸入蛋白活性的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的蛋白質(zhì)亞基的多核苷酸的表達(dá)增加:a)所述基因的表達(dá)在啟動(dòng)子控制下，所述啟動(dòng)子與所述基因的原始啟動(dòng)子相比在用于所述方法的微生物中的作用強(qiáng)；b)增加編碼具有海藻糖輸入蛋白活性的多肽的基因的拷貝數(shù)，優(yōu)選通過將所述基因以增加的拷貝數(shù)插入質(zhì)粒中和/或通過將所述基因的至少一個(gè)拷貝整合進(jìn)所述微生物的染色體中而進(jìn)行；c)使用核糖體結(jié)合位點(diǎn)表達(dá)所述基因，所述核糖體結(jié)合位點(diǎn)與所述基因的原始核糖體結(jié)合位點(diǎn)相比在用于所述方法的微生物中作用強(qiáng)；d)所述基因的表達(dá)通過優(yōu)化用于所述方法的微生物的密碼子選擇而實(shí)現(xiàn)；e)所述基因的表達(dá)通過降低由所述基因轉(zhuǎn)錄的mRNA中的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)而實(shí)現(xiàn)；f)所述基因的表達(dá)通過消除由所述基因轉(zhuǎn)錄的mRNA中的RNA聚合酶終止子序列而實(shí)現(xiàn)；g)所述基因的表達(dá)通過在由所述基因轉(zhuǎn)錄的mRNA中使用mRNA穩(wěn)定化序列而實(shí)現(xiàn)。
14.發(fā)酵制備有機(jī)化合物的方法，包括如下步驟:a)將權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的微生物在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),獲得發(fā)酵液,及b)積累在步驟a)的發(fā)酵液中的有機(jī)化合物。
15.權(quán)利要求14的方法，特征在于海藻糖在發(fā)酵液中的積累被降低或消除。
16.權(quán)利要求15的方法，特征在于用于培養(yǎng)的微生物與特定的起始菌株相比，其中如下1-VIII之一的一或多個(gè)多核苷酸的表達(dá)增加:I:與特定起始菌株相比選自a)_f)中的多核苷酸的表達(dá)增加:a)編碼具有與SEQID NO: 2或14所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；b)編碼具有與SEQID N0:4或16所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；c)編碼具有與SEQID NO:6或18所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；d)編碼具有與SEQID NO:8或20所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；e)編碼具有與SEQID NO: 10或22所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；f)編碼具有與SEQID NO: 12或24所示氨基酸序列具有至少70%相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；II:與特定起始菌株相比選自a)、b)、d)和e)中的多核苷酸的表達(dá)增加；III:與特定起始菌株相比選自b)、d)和e)中的多核苷酸的表達(dá)增加；IV:與特定起始菌株相比多 核苷酸d)和/或e)的表達(dá)增加；V:與特定起始菌株相比多核苷酸a)、b)、d)和e)的表達(dá)增加；V1:與特定起始菌株相比多核苷酸a)、b)、d)的表達(dá)增加；VI1:與特定起始菌株相比多核苷酸a)、b)、e)的表達(dá)增加；VII1:與特定起始菌株相比多核苷酸a)-e)及適當(dāng)時(shí)f)的表達(dá)增加。
【文檔編號(hào)】C12P13/08GK103459412SQ201280016388
【公開日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2012年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月4日
【發(fā)明者】S·漢斯, B·巴特, A·雷特, W·克萊斯, R·克雷默, G·賽博爾德, A·亨里希 申請(qǐng)人:贏創(chuàng)德固賽有限公司