工程化破囊壺菌屬微生物的制作方法【專利摘要】本發(fā)明尤其提供破囊壺菌以及相關(guān)方法和試劑，包括來自破囊壺菌屬或破囊壺菌和/或在破囊壺菌屬或破囊壺菌中可操作的工程化調(diào)控序列、適用于工程化微生物例如破囊壺菌屬的選擇性標(biāo)記、使微生物突變的方式、通過突變誘發(fā)產(chǎn)生的新型菌株、以及在微生物中產(chǎn)生與特定化合物有關(guān)的方法和組合物?！緦＠f明】工程化破囊壺菌屬微生物[0001]相關(guān)申請的交叉引用[0002]本申請要求2011年3月7日提交的美國臨時申請序列號61/449，848的權(quán)益和優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容以全文引用的方式并入本文中。[0003]序列表[0004]本說明書參考如國際申請在提交時所公開的序列表(標(biāo)題為“Sequence_Listing.txt”，在2012年3月7日創(chuàng)建，并且為108千字節(jié))。所述序列表的全部內(nèi)容以引用的方式并入本文中?！?br>技術(shù)領(lǐng)域：
】[0005]本發(fā)明涉及可以提供有用的化合物和試劑來源的經(jīng)過基因改造的破囊壺菌屬類。[0006]發(fā)明背景[0007]多不飽和脂肪酸(PUFA)長久以來被認(rèn)為對健康具有有益影響。營養(yǎng)補(bǔ)充物的主要來源是來自具有高濃度PUFA的例如鍉魚、沙丁魚、鮭魚、鯡魚、鯖魚和金槍魚等魚類物種的油。然而，來源缺乏可靠性，并且從魚類分離得到的PUFA的質(zhì)量和/或數(shù)量具有可變性，這意味著對PUFA的替代性來源仍存在需要。[0008]破囊壺菌屬類是水生的真核微生物，其有能力產(chǎn)生有用的產(chǎn)物，包括PUFA和抗氧化劑(Carmona等人，Biosc1.Biotechnol.Biochem.67(4):884-888，2003)。這些生物體在世界各地的海洋和河口中均有發(fā)現(xiàn)。破囊壺菌屬類能夠利用廣泛各種碳源和氮源來生長，從而表明一種利用廉價營養(yǎng)物進(jìn)行工業(yè)化培養(yǎng)的潛力。[0009]對改進(jìn)的PUFA來源和其他有用的化合物仍存在需要。發(fā)明概要[0010]本發(fā)明涵蓋利用可用的PUFA來源和其他有用的化合物和試劑來認(rèn)識某些問題。本發(fā)明涵蓋如下認(rèn)知:不論是通過傳統(tǒng)的突變誘發(fā)還是以別的方式而被基因改造的破囊壺菌屬類可以提供有用的PUFA來源和其他化合物和試劑。[0011]在多種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于對破囊壺菌屬類進(jìn)行基因工程化的系統(tǒng)，以及具有多種用途(例如產(chǎn)生PUFA和/或產(chǎn)生生物燃料)的基因工程化破囊壺菌屬類。[0012]在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的核酸分子，其包含破囊壺菌屬或破囊壺菌基因元件，例如破囊壺菌屬或破囊壺菌啟動子或終止子。所提供的分離的核酸分子中的示例性啟動子包括(但不限于)微管蛋白(tubulin)啟動子(例如與SEQIDN0:6或SEQIDNO:10具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高序列一致性的核酸序列)、Δ5延伸酶(elongase)啟動子(例如與SEQIDNO:19具有至少80%序列一致性的核酸序列)和Λ4去飽和酶(desaturase)啟動子(例如與SEQIDN0:24具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高序列一致性的核酸序列)。所提供的分離的核酸分子中的示例性終止子包括(但不限于)微管蛋白終止子(例如與SEQIDNO:14或SEQIDNO:16具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高序列一致性的核酸序列)。[0013]在一些實(shí)施方案中，提供分離的核酸分子，其包含可操作地連接到破囊壺菌屬或破囊壺菌基因啟動子和破囊壺菌屬或破囊壺菌基因終止子的異源序列。在一些實(shí)施方案中，所述異源序列編碼多肽。在一些實(shí)施方案中，所提供的分離的核酸分子進(jìn)一步包含希奧辛(zeocin)抗性基因。[0014]在某些實(shí)施方案中，提供宿主細(xì)胞，其包含一種或多種所提供的分離的核酸。[0015]在某些實(shí)施方案中，提供誘使微生物(例如破囊壺菌屬或破囊壺菌)細(xì)胞突變的方法，包括以下步驟:在培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述微生物細(xì)胞，所述培養(yǎng)基包含希奧辛并且希奧辛濃度能殺死60-80%的所述細(xì)胞；以及分離在培養(yǎng)中存活下來的細(xì)胞亞群，從而使微生物細(xì)胞突變。[0016]在某些實(shí)施方案中，提供破囊壺菌屬或破囊壺菌細(xì)胞，其含有對編碼與破囊壺菌屬或破囊壺菌的PUFA生物合成途徑有關(guān)的酶多肽或酶多肽復(fù)合物的部分的一個或多個基因的一種或多種修飾。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)在可比條件下培養(yǎng)經(jīng)過修飾的細(xì)胞和參考細(xì)胞時，相較于參考破囊壺菌屬或破囊壺菌細(xì)胞，所述一種或多種修飾使經(jīng)過修飾的細(xì)胞產(chǎn)生的一種或多種PUFA增加。在一些實(shí)施方案中，所述酶多肽或酶多肽復(fù)合物選自由以下組成的組:脂肪酸合酶(FAS)、Λ5延伸酶、Λ12延伸酶、Λ4去飽和酶以及聚酮PUFA合酶(PKS)。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種PUFA選自由以下組成的組:α-亞麻酸(“ALA”)、花生四烯酸(“ARA”)、二十二碳六烯酸(“DHA”)、二十二碳五烯酸(“DPA”)、二十碳五烯酸(“EPA”)、Y-亞麻酸(“GLA”)以及亞油酸(“LA”)。在一些實(shí)施方案中，所述酶或酶復(fù)合物選自由以下組成的組:聚酮PUFA合酶(PKS)、Λ9去飽和酶、延伸酶以及ω-3去飽和酶。[0017]在某些實(shí)施方案中，提供使破囊壺菌屬或破囊壺菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法，包括以下步驟:(a)提供感受態(tài)(competent)破囊壺菌屬或破囊壺菌細(xì)胞；(b)將重組核酸遞送到所述感受態(tài)破囊壺菌屬或破囊壺菌細(xì)胞中，其中所述重組核酸包含選擇性標(biāo)記；以及(C)在含有選擇劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述感受態(tài)破囊壺菌屬或破囊壺菌細(xì)胞，所述選擇劑能在無所述選擇性標(biāo)記存在下減少細(xì)胞的生長。在一些實(shí)施方案中，所述選擇性標(biāo)記是抗生素抗性基因。在一些實(shí)施方案中，所述選擇劑是抗生素。例如，所述抗生素可以是希奧辛。在一些實(shí)施方案中，希奧辛是以大于50μg/mL(例如約100μg/mL)的濃度存在。[0018]在所提供的使破囊壺菌屬或破囊壺菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法的一些實(shí)施方案中，重組核酸進(jìn)一步包含不同于所述選擇性標(biāo)記的基因表達(dá)盒。[0019]在一些實(shí)施方案中，所提供的使破囊壺菌屬或破囊壺菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法進(jìn)一步包括以下步驟:分離含有所述選擇性標(biāo)記的感受態(tài)破囊壺菌屬或破囊壺菌細(xì)胞。[0020]在一些實(shí)施方案中，所述遞送步驟包括:生物彈射式遞送(biolisticdelivery)涂有所有重組核酸的粒子。例如，包含金粒子的粒子可以用于生物彈射式遞送中。[0021]在一些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基含有介于較低鹽濃度與較高鹽濃度之間的鹽含量。在一些實(shí)施方案中，較低濃度是約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約12、約15、約17、約18、約19g/L或約20g/L。在一些實(shí)施方案中，較高鹽濃度是約20、約22、約25、約27、約30、約32、約35、約37、約40、約45、約50、約55、約60、約65g/L或約70g/L。在一些實(shí)施方案中，鹽濃度是介于約3g/L與約70g/L之間；介于約5g/L與約60g/L之間；介于10g/L與約40g/L的鹽之間(例如介于約15g/L與約35g/L的鹽之間，或介于約18g/L與約35g/L的鹽之間；或介于約9g/L與約18g/L之間)。在一些實(shí)施方案中，所述鹽是或包含選自以下的鹽:鈉鹽(例如海鹽、氯化鈉、食鹽(tablesalt)、硫酸鈉等)、鉀鹽以及其組合。在一些實(shí)施方案中，所述鹽是或包含非氯鹽。在一些實(shí)施方案中，所述鹽是或包含非氯化物的鈉鹽。[0022]在某些實(shí)施方案中，提供遺傳轉(zhuǎn)化感受態(tài)破囊壺菌屬或破囊壺菌細(xì)胞。[0023]在某些實(shí)施方案中，提供已用重組核酸轉(zhuǎn)化的破囊壺菌屬或破囊壺菌細(xì)胞。[0024]在某些實(shí)施方案中，提供培養(yǎng)破囊壺菌屬或破囊壺菌細(xì)胞的方法，所述方法包括:使包含破囊壺菌屬或破囊壺菌細(xì)胞的培養(yǎng)物在第一組條件下生長，在所述第一組條件下生物質(zhì)發(fā)生增加(并且任選地，其他特征也發(fā)生增加或減少)；將所述第一組培養(yǎng)條件改變成第二組條件，在所述第二組條件下脂質(zhì)生產(chǎn)率發(fā)生增加，其中所述改變包含以下中的一者或多者:(a)使氧濃度從第一氧濃度降低到第二氧濃度；(b)使C:N比率從第一C:N比率增加到第二C:N比率；(C)使溫度從第一溫度降低到第二溫度；以及其組合。[0025]在某些實(shí)施方案中，提供提供PUFA的方法，所述方法包括:提供相較于參考破囊壺菌屬或破囊壺菌細(xì)胞經(jīng)過修飾的破囊壺菌屬或破囊壺菌細(xì)胞，其中經(jīng)過修飾的細(xì)胞含有一種或多種遺傳修飾，當(dāng)在可比條件下培養(yǎng)經(jīng)過修飾的細(xì)胞和參考細(xì)胞時，相較于參考細(xì)胞，所述遺傳修飾使經(jīng)過修飾的細(xì)胞產(chǎn)生的一種或多種PUFA增加；以及在足以實(shí)現(xiàn)所述一種或多種PUFA的產(chǎn)生的條件下和時間內(nèi)培養(yǎng)經(jīng)過修飾的破囊壺菌屬或破囊壺菌細(xì)胞。[0026]在一些實(shí)施方案中，所述提供步驟包括提供含有至少一個工程化破囊壺菌屬或破囊壺菌啟動子的破囊壺菌屬或破囊壺菌細(xì)胞。[0027]在一些實(shí)施方案中，所述提供步驟包括提供含有至少一個工程化破囊壺菌屬或破囊壺菌終止子的破囊壺菌屬或破囊壺菌細(xì)胞。[0028]在一些實(shí)施方案中，所述提供步驟包括提供相對于參考破囊壺菌屬或破囊壺菌細(xì)胞經(jīng)過修飾的破囊壺菌屬或破囊壺菌細(xì)胞，其中經(jīng)過修飾的破囊壺菌屬或破囊壺菌細(xì)胞含有至少一種已表達(dá)的異源多肽。在一些實(shí)施方案中，所述至少一種異源蛋白是由可操作地與工程化破囊壺菌屬或破囊壺菌啟動子、工程化破囊壺菌屬或破囊壺菌終止子或兩者連接在一起的基因表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，所述至少一種異源多肽包含至少一種異源PUFA生物合成多肽。[0029]在一些實(shí)施方案中，所述遺傳修飾包含至少一個核苷酸突變，其使PUFA生物合成多肽的表達(dá)或活性增加。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)或活性發(fā)生增加的PUFA生物合成多肽是內(nèi)源PUFA產(chǎn)生多肽。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)或活性發(fā)生增加的PUFA產(chǎn)生多肽是異源PUFA生物合成多肽。[0030]在某些實(shí)施方案中，提供表達(dá)異源PUFA產(chǎn)生多肽的工程化破囊壺菌屬或破囊壺菌細(xì)胞。[0031]在某些實(shí)施方案中，提供工程化破囊壺菌屬或破囊壺菌細(xì)胞，當(dāng)在可比條件下培養(yǎng)工程化細(xì)胞和非工程化細(xì)胞時，所述工程化細(xì)胞產(chǎn)生的至少一種PUFA的含量比非工程化破囊壺菌屬或破囊壺菌細(xì)胞高至少36%。[0032]在某些實(shí)施方案中，提供組合物，其包含:至少一種PUFA;以及以下的一種或多種組分:含有抗生素抗性基因的破囊壺菌屬或破囊壺菌細(xì)胞或者是含有抗生素抗性基因的破囊壺菌屬或破囊壺菌細(xì)胞的子代。在一些實(shí)施方案中，抗生素抗性基因是希奧辛抗性基因。[0033]在某些實(shí)施方案中，提供組合物，其包含:至少一種PUFA;以及以下的一種或多種組分:(a)已在培養(yǎng)基中或在培養(yǎng)基上培養(yǎng)的破囊壺菌屬或破囊壺菌細(xì)胞，所述培養(yǎng)基包含希奧辛并且希奧辛濃度能殺死60-80%的所述細(xì)胞；或(b)已在培養(yǎng)基中或在培養(yǎng)基上培養(yǎng)的破囊壺菌屬或破囊壺菌細(xì)胞的子代，所述培養(yǎng)基包含希奧辛并且希奧辛濃度能殺死60-80%的所述細(xì)胞。[0034]在以下附圖和說明書中闡述本發(fā)明的一個或多個實(shí)施方案的詳情。本發(fā)明的其他特征、目標(biāo)和優(yōu)勢將從說明書和附圖以及權(quán)利要求書中顯而易見。所有被引專利、專利申請和參考資料(包括屬于公共序列數(shù)據(jù)庫記錄的參考資料)以全文引用的方式并入以用于所有目的。[0035]附圖簡述[0036]圖1顯示PUFA在破囊壺菌屬種0NC-T18(“0NC-T18”，ATCC登錄號:PTA_6245;國際專利申請?zhí)朠CT/IB2006/003977，其全部內(nèi)容以引用的方式并入本文中)中的預(yù)測生物合成途徑的示意圖。FAS:脂肪酸合酶；EL:延伸酶；Λ8:Λ8去飽和酶；Λ5:Λ5去飽和酶；Λ4:Λ4去飽和酶；ω3:ω-3去飽和酶;C14:0:肉豆蘧酸；C16:0:棕櫚酸；C16:ln-7:棕櫚烯酸；C18:0:硬脂酸；C18:ln-7:順式-十八碳烯酸；C18:ln_9:油酸；C18:2n_6(LA):亞油酸；C18:3n_3(ALA):α-亞麻酸；C18:3n_6(GLA):Y-亞麻酸；C18:4n_3(STA):亞麻油酸；C20:2n-6(EDA):二十碳二烯酸；C20:3n_6(DGLA):二高-y-亞麻酸;C20:4n_3(ETA):二十碳四烯酸；C20:3n-3(ETE):二十碳四烯酸；C20:4n_6(ARA):花生四烯酸；C20:5n_3(EPA):十二碳五烯酸；C22:4n-6(DTA):二十二碳四烯酸；C22:5n_3(DPA):二十二碳五烯酸；C22:5n-6:二十二碳五烯酸；C22:6n_3(DHA):二十二碳六烯酸；以及PKS:聚酮PUFA合酶。a-6指示ω-6PUFA生物合成途徑并且指示o-3PUFA生物合成途徑。[0037]圖2是生成基因表達(dá)載體pd4DPZl的示意圖。[0038]圖3是生成基因表達(dá)載體pd5EPZl的示意圖。[0039]圖4是生成基因表達(dá)載體pd5EPrsGFPl以及由所述過程產(chǎn)生的中間質(zhì)粒的構(gòu)建體的示意圖。[0040]圖5是生成基因表達(dá)載體P341PZ40T的示意圖。[0041]圖6是生成基因表達(dá)載體P341PZ347T的示意圖。[0042]圖7是生成基因表達(dá)載體P341PZ713T的示意圖。[0043]圖8是生成基因表達(dá)載體P701PZ40T的示意圖。[0044]圖9是生成基因表達(dá)載體P341PsmRsGFP40T的示意圖。[0045]圖10是生成基因表達(dá)載體PD4DPZ18S以及由所述過程產(chǎn)生的中間質(zhì)粒的構(gòu)建體的示意圖。[0046]圖11是生成基因表達(dá)載體p341PZ5EpEx以及由所述過程產(chǎn)生的中間質(zhì)粒的構(gòu)建體的示意圖。[0047]圖12說明抗生素希奧辛對0NC-T18在生長培養(yǎng)基0NC-T18-GM0板中在不同鹽度下的生長和群落數(shù)目的影響。結(jié)果表明0NC-T18在0NC-T18-GM0培養(yǎng)基中在較高鹽度(例如35g/L人工海鹽)下比在較低鹽度(例如8.5g/L人工海鹽)下生長得更快速并且產(chǎn)生更多群落。在中等鹽度(例如18g/L人工海鹽)下，濃度為30μg/mL的希奧辛能完全地抑制ONC-T18在0NC-T18-GM0瓊脂板中的生長。[0048]圖13說明用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的0NC-T18菌株的希奧辛抗性，其中在生長培養(yǎng)基(0NC-T18-GM0)的瓊脂板中在不同0NC-T18基因啟動子和終止子下驅(qū)動希奧辛抗性基因。結(jié)果顯示所有0NC-T18轉(zhuǎn)化體菌株對抗生素希奧辛具抗性，但對野生型0NC-T18菌株無抗性。一些轉(zhuǎn)化體菌株對希奧辛(例如5000μg/mL)具高度抗性。[0049]圖14說明希奧辛抗性基因的轉(zhuǎn)基因在已轉(zhuǎn)化的希奧辛抗性菌株中的檢測。利用PCR技術(shù)使用希奧辛抗性基因特異性引物由每個轉(zhuǎn)化體菌株的基因組DNA擴(kuò)增希奧辛基因特異性DNA片段。[0050]圖15說明野生型和不同的轉(zhuǎn)化0NC-T18菌株在含有濃度為18g/L或35g/L的海鹽的生長培養(yǎng)基(0NC-T18-GM0)的瓊脂板中的生長速率。將IuL細(xì)胞懸浮液點(diǎn)樣于0NC-T18-GM0瓊脂板上并且每日測量群落的直徑。[0051]圖16說明野生型和不同的轉(zhuǎn)化0NC-T18菌株在含有濃度為18g/L或35g/L的人工海鹽的液體生長培養(yǎng)基(0NC-T18-GM0)中的生物質(zhì)生產(chǎn)率。結(jié)果顯示在較低鹽度下，所測試的所有菌株產(chǎn)生的生物質(zhì)比在較高鹽度下要多。[0052]圖17說明野生型和不同的轉(zhuǎn)化0NC-T18菌株在含有濃度為18g/L或35g/L的人工海鹽的液體生長培養(yǎng)基(0NC-T18-GM0)中的DHA生產(chǎn)率。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化菌株的DHA生產(chǎn)率在廣泛范圍內(nèi)有差別；相較于在較高鹽度下，多數(shù)菌株在較低鹽度下產(chǎn)生高DHA產(chǎn)率，并且可以由篩選單一群落培養(yǎng)物來分離出高DHA產(chǎn)率生產(chǎn)菌株。[0053]圖18說明生長在具有不同鹽度的液體0NC-T18-GM0培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)化菌株的脂肪酸分布(fattyacidprofile)和總脂質(zhì)生產(chǎn)率。此圖說明ble轉(zhuǎn)基因在已轉(zhuǎn)化的0NC-T18菌株中的穩(wěn)定性。[0054]圖19說明誘變0NC-T18菌株和親代菌株的生物質(zhì)、脂質(zhì)和DHA生產(chǎn)率的比較。[0055]定義[0056]感受態(tài):如本文中關(guān)于細(xì)胞所用的術(shù)語“感受態(tài)”是指細(xì)胞吸收細(xì)胞外遺傳物質(zhì)的能力。細(xì)胞可以天然地呈感受態(tài)和/或以人工方式誘導(dǎo)(例如在實(shí)驗室中)成呈感受態(tài)。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)通過特定方法，例如特定轉(zhuǎn)化方法引入細(xì)胞外遺傳物質(zhì)時，感受態(tài)細(xì)胞能夠吸收細(xì)胞外遺傳物質(zhì)。例如，細(xì)胞可以對一種轉(zhuǎn)化方法呈感受態(tài)，但對另一種卻并不是如此。或者或另外，細(xì)胞可以對不止一種轉(zhuǎn)化方法呈感受態(tài)。感受態(tài)細(xì)胞可以獲自多種來源中的任一種。例如，它們可以從自然界分離得之，在實(shí)驗室中制備，并且/或者從市場上購得。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞的感受態(tài)是暫時的。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞的感受態(tài)是永久的。[0057]組分:術(shù)語“組分”當(dāng)在本文中關(guān)于細(xì)胞使用時意指細(xì)胞的任何部分，例如細(xì)胞中所含的結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)的一部分、大分子復(fù)合物和/或分子，包括(但不限于)細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、細(xì)胞核、細(xì)胞溶質(zhì)、遺傳物質(zhì)(例如染色體)、細(xì)胞器或者任何上述組分的任何部分或任何上述組分中所含的生物分子。典型地含于細(xì)胞中的細(xì)胞器可能視細(xì)胞類型而有所不同。例如，一些細(xì)胞器僅存在于真核細(xì)胞中。一些細(xì)胞器僅存在于植物細(xì)胞中，并且一些僅存在于動物細(xì)胞中。細(xì)胞器的類型的非限制性實(shí)例為細(xì)胞核、線粒體、葉綠體、過氧化物酶體、溶酶體、空泡、高爾基氏體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體以及中心體。細(xì)胞中所含的生物分子的非限制性實(shí)例包括(但不限于)核酸(例如DNA和/或RNA)、多肽(例如蛋白質(zhì))、核蛋白復(fù)合物、脂質(zhì)和磷脂。一些細(xì)胞可以含有外源遺傳物質(zhì)(例如通過人的手引入到細(xì)胞中的物質(zhì))。這樣的外源物質(zhì)包括在這個定義內(nèi)。一些細(xì)胞可以具有細(xì)胞外組分，例如細(xì)胞外囊、鞭毛或菌毛(傘毛)。這些細(xì)胞外組分也包括在這個定義內(nèi)。[0058]工程化:一般來說，術(shù)語“工程化”是指已通過人的手加以操縱的狀態(tài)。例如，當(dāng)不按自然界中的順序連接在一起的兩個或更多個序列通過人的手加以操縱而在工程化聚核苷酸中彼此直接連接時，所述聚核苷酸被認(rèn)為是“工程化”的。例如，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，工程化聚核苷酸包含在自然界中發(fā)現(xiàn)與第一編碼序列操作性締合，但不與第二編碼序列操作性締合，并且已通過人的手來連接而與第二編碼序列操作性締合的調(diào)控序列。為了只舉一個本文中所述的特定實(shí)例，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，破囊壺菌Λ4去飽和酶啟動子連接到編碼多肽而不是破囊壺菌Λ4去飽和酶多肽的核酸。同等地，如果已對細(xì)胞或生物體進(jìn)行操縱以使其遺傳信息發(fā)生改變(例如已引入先前不存在的新遺傳物質(zhì)，例如通過轉(zhuǎn)化、雜交或其他機(jī)制來實(shí)現(xiàn)，或者先前存在的遺傳物質(zhì)已發(fā)生改變或被移除，例如通過取代或缺失突變來實(shí)現(xiàn))，那么所述細(xì)胞或生物體被認(rèn)為是“工程化”的。如同常見作法，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，工程化聚核苷酸或細(xì)胞的子代典型地仍被稱為“工程化”的，即使已對先前實(shí)體進(jìn)行實(shí)際操縱也是如此。[0059]遺傳修飾:如本文所用的術(shù)語“遺傳修飾”是指通過人的手經(jīng)由使用遺傳工程化進(jìn)行操縱。術(shù)語“遺傳修飾”涵蓋對細(xì)胞遺傳物質(zhì)任何類型的改變，包括對細(xì)胞遺傳物質(zhì)的核苷酸(例如DNA或RNA)序列的改變以及對細(xì)胞遺傳物質(zhì)的化學(xué)修飾(例如會影響基因座表達(dá)的修飾，例如甲基化)。已以這種方式操縱的細(xì)胞或生物體被認(rèn)為是“經(jīng)過遺傳修飾”的或者是“轉(zhuǎn)基因”的。例如，如本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因細(xì)胞”是指DNA含有原本不存在于非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中的外源核酸的細(xì)胞。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可以由轉(zhuǎn)化細(xì)胞衍生或再生或者由轉(zhuǎn)基因細(xì)胞衍生。在本發(fā)明背景下，示例性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞包括(但不限于)轉(zhuǎn)基因破囊壺菌屬或破囊壺菌細(xì)胞。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞典型地表達(dá)賦予細(xì)胞不同于相同菌株的天然非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的特征的DNA序列。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的子代同樣典型地被認(rèn)為是轉(zhuǎn)基因的。[0060]異源:如本文所用的術(shù)語“異源”是指核酸(例如包括調(diào)控序列和/或基因的核酸)或多肽，是指核酸或多肽是以人工方式引入細(xì)胞中并且/或者并不是天然地存在于其所存在的細(xì)胞中。在一些實(shí)施方案中，異源核酸具有與天然地存在于細(xì)胞中的核酸一致的核苷酸序列。例如，在一些實(shí)施方案中，破囊壺菌屬宿主細(xì)胞被工程化而包括具有破囊壺菌屬或破囊壺菌調(diào)控序列的核酸。盡管破囊壺菌屬或破囊壺菌調(diào)控序列可以天然地存在于宿主細(xì)胞中，但所引入的核酸根據(jù)本公開是異源的。在許多實(shí)施方案中，異源核酸具有不同于天然地存在于細(xì)胞中的任何核酸的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，對特定細(xì)胞來說異源的核酸具有與天然地存在于不同于其中引入異源核酸的細(xì)胞的來源生物體中的核酸一致的核酸序列。[0061]宿主細(xì)胞:如本文所用的“宿主細(xì)胞”是根據(jù)本公開經(jīng)過操縱的細(xì)胞。例如，在一些實(shí)施方案中，對宿主細(xì)胞進(jìn)行操縱以使得其產(chǎn)生的一種或多種PUFA增加(例如經(jīng)由增加PUFA的修飾來實(shí)現(xiàn))。如本文所用的“經(jīng)過修飾的宿主細(xì)胞”是相較于其他相同親代細(xì)胞，和/或相較于特定參考細(xì)胞(例如野生型細(xì)胞)，已根據(jù)本公開經(jīng)過修飾、工程化或操縱的任何宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)過修飾的宿主細(xì)胞具有至少一種(并且任選地不止一種)修飾，相較于親代或參考細(xì)胞，所述修飾使經(jīng)過修飾的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的PUFA或其他細(xì)胞物質(zhì)增加(例如至少一種增加PUFA的修飾)。[0062]引入:如本文中關(guān)于將核酸引入到細(xì)胞或生物體中所用的術(shù)語“引入”意在具有其最廣泛的含義并且涵蓋例如通過轉(zhuǎn)化方法(例如氯化鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、電穿孔、粒子轟擊)引入，以及通過包括轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合和雜交的其他方法引入。在一些實(shí)施方案中，利用載體來將核酸引入細(xì)胞或生物體中。[0063]分離:如本文所用的術(shù)語“分離”意謂所分離的實(shí)體已經(jīng)與至少一個先前與其締合的組分分離開來。當(dāng)多數(shù)其他組分已被移除時，所分離的實(shí)體被“純化”或被“濃縮”。分離和/或純化和/或濃縮可以使用本領(lǐng)域中已知的任何技術(shù)，包括(例如)分餾、萃取、沉淀或其他分離法來進(jìn)行。[0064]可操作地連接:如本文所用的術(shù)語“可操作地連接”是指兩個核酸序列之間的關(guān)系，其中核酸序列之一的表達(dá)是通過另一核酸序列來控制、調(diào)控或調(diào)節(jié)。在一些實(shí)施方案中，可操作地連接到第二核酸序列的一個核酸序列直接或間接地共價連接到所述第二序列，不過任何有效的三維締合是可以接受的。單一核酸序列可以可操作地連接到多個其他序列。例如，單一啟動子可以引導(dǎo)多個RNA種類的轉(zhuǎn)錄。[0065]多肽:如本文所用的術(shù)語“多肽”一般具有其在技術(shù)上公認(rèn)的具有至少三個氨基酸的聚合物的含義。然而，所述術(shù)語也用于指多肽的特定功能類別，例如去飽和酶、延伸酶等。對于每個所述類別，本說明書提供所述多肽的已知序列的數(shù)個實(shí)例。然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識到，術(shù)語“多肽”意在足夠普遍地不僅涵蓋具有本文中(或在本文中具體提及的參考資料或數(shù)據(jù)庫中)所列出的完整序列的多肽，而且涵蓋代表所述完整多肽的功能性片段(即保留至少一種活性的片段)的多肽。此外，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員了解到，蛋白質(zhì)序列一般容許在不破壞活性的情況下有一些取代。因此，保留活性并且與相同類別的另一多肽共有至少約30-40%總序列一致性，常常大于約50%、60%、70%或80%，并且進(jìn)一步通常在一個或多個高度保守的區(qū)域中包括至少一個一致性要高得多的區(qū)域，常常大于90%或者甚至95%、96%、97%、98%或99%，通常涵蓋至少3_4個并且常常達(dá)到20個或更多個氨基酸的任何多肽涵蓋在如本文所用的相關(guān)術(shù)語“多肽”之內(nèi)。其他具有相似性和/或一致性的區(qū)域可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過分析本文所述的不同多肽的序列來測定。正如由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知，多種策略是已知的，并且可利用用于執(zhí)行氨基酸或核苷酸序列的比較以便評估一致性和/或相似性程度的工具。這些策略包括(例如)手動比對、計算機(jī)輔助的序列比對和其組合。許多用于執(zhí)行序列比對的算法(其一般由計算機(jī)實(shí)施)是廣泛可用的，或者可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員來生成。代表性算法包括例如Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.，1981,2:482);Needleman和Wunsch的同源性比對算法(J.Mol.Biol.,1970,48:443)；Pearson和Lipman白勺搜索相似性的方法(Proc.Natl.Acad.Sc1.(USA),1988,85:2444);和/或這些算法的計算機(jī)化實(shí)施(例如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.，Madison,Wis.)。容易獲得的合并這些算法的計算機(jī)程序包括例如BLASTN、BLASTP、GappedBLAST、PILEUP、CLUSTALW等。當(dāng)利用BLAST和GappedBLAST算法時，可以使用相應(yīng)程序的默認(rèn)參數(shù)?；蛘撸瑢?shí)踐者可以視其實(shí)驗和/或其他要求而定使用非默認(rèn)參數(shù)(參見例如，網(wǎng)址:URLwww.ncb1.nlm.nih.gov)。[0066]PUFA生物合成途徑:“PUFA生物合成途徑”是產(chǎn)生PUFA和/或PUFA前體的生物合成途徑。[0067]PUFA生物合成多肽:如本文所用的術(shù)語“PUFA生物合成多肽”是指與產(chǎn)生例如(但不限于)以下的PUFA有關(guān)的多肽:α亞麻酸(“ALA”)、花生四烯酸(“ARA”)、二十二碳六烯酸(“DHA”)、二十二碳五烯酸(“DPA”)、十二碳五烯酸(“EPA”)、Y-亞麻酸(“GLA”)、亞油酸(“LA”)和/或亞麻酸。在一些實(shí)施方案中，PUFA生物合成多肽是可在最終產(chǎn)生PUFA的合成途徑中催化特定步驟的酶。在一些實(shí)施方案中，PUFA生物合成多肽是脂肪酸合酶。在一些實(shí)施方案中，PUFA生物合成多肽催化脂肪酸的延長過程。在一些實(shí)施方案中，PUFA生物合成多肽催化脂肪酸的去飽和過程。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語“PUFA生物合成多肽”還可以涵蓋本身不會催化合成反應(yīng)，但可調(diào)控有此作用的其他多肽的表達(dá)和/或活性的多肽。PUFA生物合成多肽包括例如脂肪酸合酶多肽、延伸酶多肽、Λ9去飽和酶多肽、Λ12去飽和酶多肽、Δ6去飽和酶多肽、Δ8去飽和酶多肽、Δ5去飽和酶多肽、Δ4去飽和酶多肽和ω3去飽和酶多肽。[0068]增加PUFA的修飾:如本文所用的“增加PUFA的修飾”是指對宿主細(xì)胞所作的增加至少一種PUFA的產(chǎn)生的修飾。在一些實(shí)施方案中，所述的產(chǎn)生增加使得PUFA含量比野生型高至少1%_1000%，例如比其中引入修飾的親代細(xì)胞和/或比特定參考細(xì)胞(例如野生型細(xì)胞)高約1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、210%、220%、230%、240%、250%、260%、270%、280%、290%、300%、310%、320%、330%、340%、350%、360%、370%、380%、390%、400%、410%、420%、430%、440%、450%、460%、470%、480%、490%、500%、550%、600%、650%、700%、750%、800%、850%、900%、950%、1000%。在一些實(shí)施方案中，增加I3UFA的修飾增加一種或多種PUFA生物合成多肽的表達(dá)或活性。在一些實(shí)施方案中，增加PUFA的修飾降低一種或多種會干擾PUFA生物合成多肽表達(dá)或活性(包括例如由與PUFA生物合成多肽競爭接近底物而引起)的多肽的表達(dá)或活性。在一些實(shí)施方案中，增加PUFA的修飾包含將異源核酸引入到宿主細(xì)胞中。在一些實(shí)施方案中，增加PUFA的修飾增加細(xì)胞中脂肪酸的總含量。在一些實(shí)施方案中，增加PUFA的修飾增加細(xì)胞中一種或多種特定PUFA的總含量，并且或者并不增加細(xì)胞中脂肪酸的總含量。在一些實(shí)施方案中，增加PUFA的修飾增加包括(但不限于)ALA、ARA、DHA、DPA、EPA、GLA和/或LA的PUFA的含量。[0069]子代:術(shù)語“子代”當(dāng)在本文中關(guān)于細(xì)胞使用時意指由另一細(xì)胞(“親代細(xì)胞”)(例如通過細(xì)胞分裂或出芽)產(chǎn)生以使得“子代細(xì)胞”含有親代細(xì)胞的至少一些遺傳物質(zhì)的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，子代細(xì)胞含有親代細(xì)胞的所有遺傳物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，子代細(xì)胞并不含有親代細(xì)胞的所有遺傳物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，子代細(xì)胞含有除親代細(xì)胞的遺傳物質(zhì)以外的一些遺傳物質(zhì)。在一些這樣的實(shí)施方案中，所述其他遺傳物質(zhì)對細(xì)胞的菌株或種類來說是異源的。術(shù)語“子代”意在不僅涵蓋親代細(xì)胞的直接子代(例如由親代細(xì)胞單次分裂或出芽而產(chǎn)生的細(xì)胞)，而且涵蓋親代細(xì)胞的所有間接子代(例如由親代細(xì)胞不止一次的分裂或出芽周期而產(chǎn)生的細(xì)胞)。因此，給定親代細(xì)胞可以具有許多細(xì)胞子代，即使所述細(xì)胞可能在每一分裂或出芽周期內(nèi)僅僅產(chǎn)生有限數(shù)目的(例如兩個)細(xì)胞也是如此。術(shù)語“子代”也意在涵蓋已經(jīng)通過人的手進(jìn)行一次或多次操縱(例如被遺傳操縱或被遺傳工程化)的細(xì)胞。因此，例如，當(dāng)親代細(xì)胞系被遺傳操縱或遺傳工程化時，由此產(chǎn)生的所有細(xì)胞被認(rèn)為是所述細(xì)胞系的子代。那些子代的所有子代也被認(rèn)為是親代細(xì)胞系的子代，以此類推。[0070]啟動子或啟動子元件:如本文所用的術(shù)語“啟動子”和“啟動子元件”是指可調(diào)控可操作地連接到啟動子的所選聚核苷酸序列的表達(dá)并且影響所選聚核苷酸序列在細(xì)胞中的表達(dá)的聚核苷酸。如本文所用的術(shù)語“破囊壺菌啟動子”是指在破囊壺菌細(xì)胞中起作用的啟動子。如本文所用的術(shù)語“破囊壺菌屬啟動子”是指在破囊壺菌屬細(xì)胞中起作用的啟動子。[0071]參考細(xì)胞:如本文所用的短語“參考細(xì)胞”是指出于比較目的就至少一個特征來講是正常的細(xì)胞。例如，用于與遺傳工程化細(xì)胞作比較的參考細(xì)胞可以是未被遺傳工程化的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，參考細(xì)胞不含遺傳修飾。在一些實(shí)施方案中，參考細(xì)胞是野生型菌株的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，參考細(xì)胞含有與其相比較的特定菌株所特有的一些遺傳修飾，但不含有與其相比較的所述特定菌株所特有的一種或多種遺傳修飾。例如，這樣的參考細(xì)胞將可用于評估其不含有的所述一種或多種遺傳修飾的作用。因此，例如，術(shù)語“參考破囊壺菌細(xì)胞”(或“參考破囊壺菌屬細(xì)胞”)意指同與其相比較的細(xì)胞相同或類似的菌株的破囊壺菌細(xì)胞(或破囊壺菌屬細(xì)胞)，只是參考破囊壺菌細(xì)胞(或參考破囊壺菌屬細(xì)胞)缺乏與參考破囊壺菌細(xì)胞(或參考破囊壺菌屬細(xì)胞)作比較的破囊壺菌細(xì)胞(或破囊壺菌屬細(xì)胞)的一種或多種特征(例如一種或多種遺傳修飾)。[0072]選擇性標(biāo)記:如本文所用的短語“選擇性標(biāo)記”是指編碼允許選擇的產(chǎn)物(蛋白質(zhì))的核苷酸序列(例如基因)，抑或基因產(chǎn)物(例如蛋白質(zhì))本身。術(shù)語“選擇性標(biāo)記”在本文中是如同本領(lǐng)域中對其普遍理解的那樣來使用并且是指在細(xì)胞或生物體內(nèi)的存在可在某些確定的培養(yǎng)條件(選擇性條件)下賦予所述細(xì)胞或生物體顯著的生長或存活優(yōu)勢或劣勢的標(biāo)記。例如，這些條件可以是存在或不存在特定化合物或特定環(huán)境條件，例如升高的溫度、增加的輻射、存在在無標(biāo)記時具有毒性的化合物等等。存在或不存在這樣的化合物或環(huán)境條件被稱為一個“選擇性條件”或“數(shù)個選擇性條件”?！吧L優(yōu)勢”意指相對于其他相同細(xì)胞或生物體來說增強(qiáng)的活力(例如具有生長優(yōu)勢的細(xì)胞或生物體相對于其他相同細(xì)胞，平均具有增加的壽命)、增加的增殖速率(在本文中也稱為“生長速率”)抑或兩者。一般來說，相較于缺乏生長優(yōu)勢的其他相同細(xì)胞群體，具有生長優(yōu)勢的細(xì)胞群體將展現(xiàn)較少的死亡或不能存活的細(xì)胞和/或較大的細(xì)胞增殖速率。盡管典型的是選擇性標(biāo)記將賦予細(xì)胞生長優(yōu)勢，但是某些選擇性標(biāo)記賦予細(xì)胞生長劣勢，例如它們使該細(xì)胞對某些化合物或環(huán)境條件的有害效應(yīng)比不表達(dá)標(biāo)記的其他相同細(xì)胞更加敏感。抗生素抗性標(biāo)記是一類能用于選擇表達(dá)標(biāo)記的細(xì)胞的選擇性標(biāo)記的非限制性實(shí)例。在適當(dāng)濃度的抗生素(選擇性條件)存在下，這樣的標(biāo)記賦予表達(dá)標(biāo)記的細(xì)胞生長優(yōu)勢。因此，表達(dá)抗生素抗性標(biāo)記的細(xì)胞能夠在抗生素存在下存活和/或增殖，而不表達(dá)抗生素抗性標(biāo)記的細(xì)胞不能在抗生素存在下存活并且/或者無法增殖。例如，常用于植物細(xì)胞中的這種類型的選擇性標(biāo)記是NPTII蛋白質(zhì)，其編碼提供針對抗生素卡那霉素的抗性的蛋白質(zhì)。其他選擇性標(biāo)記包括賦予針對羧芐青霉素(例如內(nèi)酰胺酶)的抗性的蛋白質(zhì)、賦予針對慶大霉素、潮霉素等抗性的蛋白質(zhì)。選擇性標(biāo)記的第二非限制性類別是營養(yǎng)標(biāo)記。這樣的標(biāo)記一般是在生物合成途徑中起作用以產(chǎn)生為細(xì)胞生長或存活所需的化合物的酶。一般來說，在非選擇性條件下，所需化合物存在于環(huán)境中或者通過替代性途徑在細(xì)胞中產(chǎn)生。在選擇性條件下，需要其中涉及標(biāo)記的生物合成途徑起作用以產(chǎn)生所述化合物。[0073]選擇劑:如本文所用的短語“選擇劑”是指可對細(xì)胞或細(xì)胞群體引入選擇性壓力以有利于或?qū)咕哂羞x擇性標(biāo)記的細(xì)胞或細(xì)胞群體的試劑。例如，在某些實(shí)施方案中，選擇劑是抗生素并且選擇性標(biāo)記是抗生素抗性基因。在某些示例性實(shí)施方案中，希奧辛用作選擇劑。[0074]來源生物體:如本文所用的“來源生物體”是天然地含有或產(chǎn)生將要根據(jù)本發(fā)明引入到接受細(xì)胞或宿主細(xì)胞中的聚核苷酸、多肽或其他化合物(例如異源核酸)的生物體。在一些實(shí)施方案中，將要選擇的特定來源生物體對于本公開的實(shí)施來說并不是必需的。相關(guān)考慮因素可以例如包括潛在來源和宿主生物體在進(jìn)化中如何密切相關(guān)、或者來源生物體與其他相關(guān)核酸和/或多肽的序列所選自的其他來源生物體如何相關(guān)。當(dāng)多個不同異源核酸將要被引入宿主細(xì)胞中并且/或者由宿主細(xì)胞表達(dá)時，不同序列可以來自不同來源生物體，或來自同一來源生物體。為了只舉一個實(shí)例，在一些情況下，個別多肽可以代表具有復(fù)雜蛋白活性的個別亞單位，并且/或者可能為與其他多肽協(xié)同作用以便實(shí)現(xiàn)本公開的目標(biāo)所需。在一些實(shí)施方案中，將會常常需要這樣的多肽來自同一來源生物體，并且/或者是充分相關(guān)的以在共同表達(dá)于宿主細(xì)胞中時適當(dāng)?shù)仄鹱饔?。在一些?shí)施方案中，這樣的多肽可以來自不同、甚至不相關(guān)的來源生物體。將進(jìn)一步了解到，在異源多肽將要表達(dá)于宿主細(xì)胞中時，將會常常需要利用編碼所述多肽的核酸序列，其已被調(diào)整以適應(yīng)宿主細(xì)胞的密碼子偏好性并且/或者使編碼序列與在宿主細(xì)胞中具活性的調(diào)控元件連接。例如，當(dāng)宿主細(xì)胞是破囊壺菌細(xì)胞時，將會常常需要改變編碼給定多肽的基因序列，以使得其更接近地符合這種細(xì)胞的密碼子偏好性。在某些實(shí)施方案中，對編碼給定多肽的基因序列進(jìn)行優(yōu)化，甚至當(dāng)這樣的基因序列衍生自宿主細(xì)胞本身(并且因此不是異源的)時也如此。例如，編碼相關(guān)多肽的基因序列可能沒有為了表達(dá)于給定宿主細(xì)胞中而被進(jìn)行密碼子優(yōu)化，即使這樣的基因序列是從宿主細(xì)胞菌株中分離出來也是如此。在這樣的實(shí)施方案中，可以對基因序列進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化以引起宿主細(xì)胞的密碼子偏好性。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會知道宿主細(xì)胞密碼子偏好性并且將會能夠采用本文所公開的方法和組合物來優(yōu)化給定多肽在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。[0075]底物:如本文中用于描述酶的底物的“底物”是指可以通過酶的活性來修飾的任何實(shí)體。[0076]終止子:如本文所用的術(shù)語“終止子”是指阻止可操作地連接到終止子的所選聚核苷酸序列在細(xì)胞中表達(dá)的聚核苷酸。在一些實(shí)施方案中，終止子序列在基因中處于終止密碼子下游。如本文所用的術(shù)語“破囊壺菌終止子”是指在破囊壺菌細(xì)胞中起作用的終止子。如本文所用的術(shù)語“破囊壺菌屬終止子”是指在破囊壺菌屬細(xì)胞中起作用的終止子。[0077]轉(zhuǎn)化:如本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”是指將外源核酸分子(例如載體或重組核酸分子)引入到接受細(xì)胞或微生物中的過程。外源核酸分子可能被整合到或可能沒有被整合到(即共價連接到)構(gòu)成宿主細(xì)胞或微生物基因組的染色體DNA中。例如，外源聚核苷酸可以維持在附加型元件(例如質(zhì)粒)上?；蛘呋蛄硗?，外源聚核苷酸可以整合到染色體中以使得其通過子細(xì)胞經(jīng)由染色體復(fù)制而遺傳。轉(zhuǎn)化方法包括(但不限于)磷酸鈣沉淀；Ca2+處理；接受細(xì)胞與含有重組核酸的細(xì)菌原生質(zhì)體融合；用含有重組核酸的脂質(zhì)體處理接受細(xì)胞；DEAE葡聚糖；使用聚乙二醇(PEG)進(jìn)行的融合；電穿孔；磁穿孔(magnetoporation);生物彈射式遞送；反轉(zhuǎn)錄病毒感染；脂轉(zhuǎn)染；以及直接將DNA微量注射到細(xì)胞中。在一些情形下，外源核酸通過與另一細(xì)胞雜交而引入到一種細(xì)胞中。例如，在釀酒酵母(S.cerevisiae)中，細(xì)胞彼此雜交。[0078]已轉(zhuǎn)化的:如關(guān)于細(xì)胞所用的術(shù)語“已轉(zhuǎn)化的”是指已對細(xì)胞進(jìn)行如本文所述的“轉(zhuǎn)化”，以使得細(xì)胞攜帶外源遺傳物質(zhì)(例如重組核酸)。術(shù)語“已轉(zhuǎn)化的”也可以或者替代性地用于指微生物、微生物菌株、組織、生物體等等。[0079]某些具體實(shí)施方案的詳細(xì)描述[0080]如本文所述，本發(fā)明提供多種與產(chǎn)生PUFA和/或修飾破囊壺菌屬類有關(guān)的試劑和方法。一般來講，本發(fā)明涉及修飾破囊壺菌屬宿主細(xì)胞，并且尤其涉及工程化破囊壺菌屬類，尤其涉及使其相關(guān)化合物(例如PUFA)的產(chǎn)生增加。本發(fā)明涵蓋鑒別某些破囊壺菌屬種基因調(diào)控元件，以及開發(fā)誘使破囊壺菌屬或破囊壺菌突變的方法。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步提供工程化破囊壺菌屬種菌株，以及由其并且用其產(chǎn)生的產(chǎn)物。本發(fā)明的這些和其他方面的具體實(shí)施方案的某些詳情更詳細(xì)地描述于下文中。[0081]宿主細(xì)胞[0082]如上所述，本發(fā)明提供用于操縱宿主細(xì)胞的試劑和方法。[0083]一般來講，可以利用所鑒別的試劑(例如調(diào)控元件、載體、選擇性標(biāo)記、誘變劑等)和方法(包括例如誘變方法)以及任何適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞。已閱讀了本公開并且因此手頭上擁有這些試劑的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會容易地能夠鑒別其中這些元件具有活性的適當(dāng)宿主細(xì)胞。[0084]在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的宿主細(xì)胞是破囊壺菌屬細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是破囊壺菌目(Thraustochytriales)的成員。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是破囊壺菌科亞綱的成員。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是選自以下的屬的成員:破囊壺菌、吾肯氏壺菌(Ulkenia)、裂殖壺菌(Schizochytrium)、橙黃壺菌(Aurantiochytrium)>不動壺菌(Aplanochytrium)>葡萄串壺菌(Botryochytrium)>日本壺菌(Japonochytrium)、捕圓壺菌(Oblongichytrium)、帕里蒂氏壺菌(Parietichytrium)以及葫蘆狀壺菌(Sicyoidochytrium)。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞不屬于裂殖壺菌屬。[0085]在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明利用的宿主細(xì)胞是破囊壺菌屬的成員。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是來自以下種類之一的破囊壺菌細(xì)胞:聚合破囊壺菌(Thraustochytriumaggregatum)、金黃色破囊壺菌(Thraustochytriumaureum)、蓋氏破囊壺菌(Thraustochytriumgaertnerium)、金尼破囊壺菌(Thraustochytriumkinnei)、動抱破囊壺菌(Thraustochytriummotivum)、多基底增殖破囊壺菌(Thraustochytriummultirudimentale)、厚皮破囊壺菌(Thraustochytriumpachydermum)、羅斯破囊壺菌(Thraustochytriumroseum)、破囊壺菌屬種1.3A4.1、破囊壺菌屬種ATCC26185、破囊壺菌屬種BL13、破囊壺菌屬種BL14、破囊壺菌屬種BL2、破囊壺菌屬種BL3、破囊壺菌屬種BL4、破囊壺菌屬種BL5、破囊壺菌屬種BL6、破囊壺菌屬種BL7、破囊壺菌屬種BL8、破囊壺菌屬種BL9、破囊壺菌屬種BP3.2.2、破囊壺菌屬種BP3.3.3、破囊壺菌屬種caudivorum、破囊壺菌屬種CHN-1、破囊壺菌屬種FJN-10、破囊壺菌屬種HKl、破囊壺菌屬種HK10、破囊壺菌屬種HK5、破囊壺菌屬種HK8、破囊壺菌屬種HK8a、破囊壺菌屬種KK17-3、破囊壺菌屬種KL1、破囊壺菌屬種KL2、破囊壺菌屬種KL2a、破囊壺菌屬種0NC-T18、破囊壺菌屬種PJA10.2、破囊壺菌屬種TRl.4、破囊壺菌屬種TRR2、紋狀破囊壺菌(Thraustochytriumstriatum)或威瑟氏吾肯氏破囊壺菌(Thraustochytriumvisurgense)。[0086]在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的宿主細(xì)胞是裂殖壺菌屬的成員。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是來自以下種類之一的破囊壺菌細(xì)胞:賠蝓裂殖壺菌(Schizochytriumlimacinum)、紅樹林裂殖壺菌(Schizochytriummangrovei)、小裂殖壺菌(Schizochytriumminutum)、裂殖壺菌屬種(ATCC20111)、裂殖壺菌屬種(ATCC20888)、裂殖壺菌屬種BR2.1.2、裂殖壺菌屬種BUCAAA032、裂殖壺菌屬種BUCAAA093、裂殖壺菌屬種BUCACD152、裂殖壺菌屬種BUCARA021、裂殖壺菌屬種BUCHA0113、裂殖壺菌屬種BURABQ133、裂殖壺菌屬種BURARM801、裂殖壺菌屬種BURARM802、裂殖壺菌屬種FJU-512、裂殖壺菌屬種KH105、裂殖壺菌屬種KR-5、裂殖壺菌屬種PJ10.4、裂殖壺菌屬種SEK210、裂殖壺菌屬種SEK345、裂殖壺菌屬種SEK346、裂殖壺菌屬種SR21或裂殖壺菌屬種T1001。[0087]在某些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是破囊壺菌屬種0NC-T18細(xì)胞。ONC-T18是最初從加拿大新斯科舍省芬迪灣阿德沃基特港(AdvocateHarbor,BayofFundy,NovaScotia,Canada)的鹽沼草葉子中分離出來的海產(chǎn)破囊壺菌。0NC-T18描述于美國專利公布2009/0117194中，其以全文引用的方式并入本文中。在一些實(shí)施方案中，破囊壺菌細(xì)胞具有與SEQIDN0:68至少97%、98%、99%、99.1%、99.2%,99.3%,99.4%,99.5%,99.6%,99.7%,99.8%、99.9%或更高(例如包括100%)—致的18srRNA序列。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是來自以ATCC菌株登錄號PTA-6245保藏的細(xì)胞的破囊壺菌屬種0NC-T18細(xì)胞。[0088]工程化微生物[0089]本公開尤其提供用于操縱例如破囊壺菌屬類微生物的調(diào)控元件、選擇性標(biāo)記、誘變方法和轉(zhuǎn)化方法。正如由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在考慮本公開之后將會認(rèn)識到，本文中提供的工具可以單獨(dú)使用并且以多種組合形式使用以實(shí)施任何所要的遺傳修飾。例如，在某些實(shí)施方案中，所提供的轉(zhuǎn)化方法用于引入編碼一個或多個基因的核酸分子。核酸分子可以包括本文中提供的啟動子、終止子或選擇性標(biāo)記序列或其組合。在某些實(shí)施方案中，所提供的誘變方法用于產(chǎn)生具有所要性質(zhì)的菌株(例如破囊壺菌屬菌株)。這些菌株也可以被轉(zhuǎn)化(例如用包括本文中提供的一個或多個調(diào)控元件的核酸)。[0090]某因表汰[0091]本公開涵蓋用于工程化微生物的組合物和方法。在某些實(shí)施方案中，本公開提供用于工程化破囊壺菌屬類(例如破囊壺菌)的組合物和方法?！肮こ袒奔?xì)胞包括已被修飾(例如通過引入外源核酸而被修飾)的細(xì)胞以及其保留所述修飾的子代。[0092]在一些實(shí)施方案中，本公開提供包括來自破囊壺菌屬或破囊壺菌的調(diào)控序列的核酸。在真核生物中的基因表達(dá)常常需要調(diào)控序列，其具有種特異性，或者在密切相關(guān)的生物體中起作用。來自破囊壺菌屬或破囊壺菌的調(diào)控序列的可用性允許相關(guān)基因表達(dá)于破囊壺囷屬類中。在一些實(shí)施方案中，調(diào)控序列包括啟動子序列。在一些實(shí)施方案中，調(diào)控序列包括終止子序列。[0093]本公開提供分離的核酸,其包括破囊壺菌屬或破囊壺菌啟動子。在一些實(shí)施方案中，本文中提供的核酸包括破囊壺菌Λ4去飽和酶基因啟動子。示例性Λ4去飽和酶基因啟動子的序列示于SEQIDN0:24中。在一些實(shí)施方案中，本文中提供的核酸包括破囊壺菌Λ5延伸酶基因啟動子。示例性Λ5延伸酶基因啟動子的序列示于SEQIDNO:19中。破囊壺菌△5延伸酶基因啟動子在破囊壺菌屬類(例如破囊壺菌)中是強(qiáng)啟動子。在一些實(shí)施方案中，本文中提供的核酸包括破囊壺菌屬或破囊壺菌微管蛋白基因啟動子。示例性破囊壺菌微管蛋白基因啟動子的序列示于SEQIDNO:6和10中。[0094]在一些實(shí)施方案中，本文中提供的包括破囊壺菌屬或破囊壺菌啟動子的分離的核酸是一種盒子，例如表達(dá)盒。在一些實(shí)施方案中，本文中提供的包括破囊壺菌屬或破囊壺菌啟動子的分離的核酸是一種載體，例如表達(dá)載體。[0095]在一些實(shí)施方案中，本公開提供已被工程化而包括破囊壺菌屬或破囊壺菌基因啟動子的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，破囊壺菌屬或破囊壺菌細(xì)胞被工程化而包括破囊壺菌屬或破囊壺菌啟動子，例如破囊壺菌△4去飽和酶基因啟動子、破囊壺菌△5延伸酶基因啟動子或破囊壺菌微管蛋白基因啟動子。[0096]本公開提供包括破囊壺菌屬或破囊壺菌基因終止子的分離的核酸。在一些實(shí)施方案中，本文中提供的核酸包括破囊壺菌屬或破囊壺菌微管蛋白基因終止子。示例性破囊壺菌微管蛋白基因終止子的序列示于SEQIDN0:14和18中。[0097]在一些實(shí)施方案中，本文中提供的包括破囊壺菌屬或破囊壺菌基因終止子的分離的核酸是一種盒子，例如表達(dá)盒。在一些實(shí)施方案中，本文中提供的包括破囊壺菌屬或破囊壺菌基因終止子的分離的核酸是一種載體，例如表達(dá)載體。[0098]在一些實(shí)施方案中，所提供的分離的核酸包括一個或多個基因調(diào)控元件。在一些這樣的實(shí)施方案中，所包括的基因調(diào)控元件有助于誘導(dǎo)性基因調(diào)控?？梢耘c所提供的核酸組合使用的誘導(dǎo)性系統(tǒng)的非限制性實(shí)例包括四環(huán)素誘導(dǎo)性系統(tǒng)、乙醇誘導(dǎo)性系統(tǒng)和化學(xué)誘導(dǎo)性基因表達(dá)系統(tǒng)。(參見例如Park和MorschhSuser(2005)；Li等人(2005);以及Jepson等人(1998),所述文獻(xiàn)各自的全部內(nèi)容以引用的方式并入本文中)。[0099]本文中提供的具有調(diào)控序列的核酸可以可操作地連接到異源序列，例如編碼異源多肽的基因。例如，在一些實(shí)施方案中，提供基因表達(dá)盒，其典型地包含可操作地連接到異源核酸序列的破囊壺菌屬或破囊壺菌基因啟動子，所述異源核酸序列可操作地連接到破囊壺菌屬或破囊壺菌基因終止子。在一些實(shí)施方案中，異源核酸序列包含基因中的編碼序列的至少一部分，例如異源核酸序列編碼基因產(chǎn)物，例如多肽或RNA。在一些實(shí)施方案中，所提供的基因表達(dá)盒進(jìn)一步包含選擇標(biāo)記(例如希奧辛抗性基因，例如Shble，或本文中所討論的任何其他選擇標(biāo)記)。[0100]分子生物學(xué)和DNA操縱程序一般可以根據(jù)Sambrook等人或Ausubel等人(SambrookJ,FritschEF,ManiatisT(eds).1989.MolecularCloning.ALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress:NewYork；AusubelFM,BrentR,KingstonRE,MooreDD,SeidmanJG,SmithJA,StruhlK(eds).1998.CurrentProtocolsinMolecularBiology.Wiley:NewYork)來執(zhí)行。[0101][0102]在另一方面，本公開提供用于誘使微生物突變的試劑和/或方法，以及通過誘變產(chǎn)生的菌株和/或細(xì)胞。例如,如本文中所述，已經(jīng)發(fā)現(xiàn),例如博萊霉素(bleomycin)、腐草霉素(phleomycin)和/或他利霉素(tallysomycin)的抗生素可以用于誘使微生物突變。用于例如破囊壺菌屬類(例如破囊壺菌)的微生物的這樣的有效誘變劑的可用性允許開發(fā)具有所要特征的菌株。特別是，本公開證實(shí)，希奧辛(腐草霉素Dl)可以用于誘使例如破囊壺菌屬類(例如破囊壺菌)的微生物突變。[0103]抗生素希奧辛是來自輪枝鏈霉菌(Streptomycesverticillus)突變體的培養(yǎng)肉湯的堿性水溶性銅螯合糖肽(InvivoGen,SanDiego,CA,USA)。希奧辛是作為已被廣泛用作對抗淋巴瘤、頭頸部癌和睪丸癌的有效抗腫瘤劑的糖肽的抗生素的腐草霉素族群的成員(Umezawa等人，Newantibiotics,bleomycinAandB,JournalofAntibiot.,(1966)19:200-209；Sikic等人，BleomycinChemotherapy,AcademicPress,Orlando,Florida,(1985))。普遍認(rèn)為,這些抗生素的分子作用模式與其通過插入其平面的含有聯(lián)噻唑的部分來結(jié)合DNA并且使DNA裂解，從而產(chǎn)生導(dǎo)致細(xì)胞死亡的單鏈斷鏈或雙鏈斷鏈的能力有關(guān)(Povirk等人,NucleicAcidsResearch,(1977)4:3573-3580)。由于具有針對廣譜細(xì)胞類型的毒性，該組抗生素被用作用于陽性選擇的藥物。本公開涵蓋以下發(fā)現(xiàn):希奧辛是可用于工業(yè)微生物菌株改良的誘變劑。另外，本文中顯示，在希奧辛能殺死多數(shù)處理過的細(xì)胞的特定濃度下，存活細(xì)胞的突變頻率有增加。產(chǎn)生突變頻率有增加的細(xì)胞的能力允許更容易地選擇和分離已被誘變的菌株。[0104]在一些實(shí)施方案中，本公開提供用于誘使破囊壺菌屬細(xì)胞突變的系統(tǒng)和/或方法。在一些實(shí)施方案中，本公開提供用于誘使選自由以下組成的組的細(xì)胞突變的系統(tǒng)和方法:破囊壺菌細(xì)胞、吾肯氏壺菌細(xì)胞、裂殖壺菌細(xì)胞、橙黃壺菌細(xì)胞、不動壺菌細(xì)胞、葡萄串壺菌細(xì)胞、日本壺菌細(xì)胞、橢圓壺菌細(xì)胞、帕里蒂氏壺菌細(xì)胞、葫蘆狀壺菌細(xì)胞、被孢霉屬(Mortierella)真菌、異養(yǎng)生長的藻類(例如隱甲藻屬(Crypthecodinium)中的種)。在一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于誘變0NC-T18的系統(tǒng)和/或試劑。[0105]在某些示例性實(shí)施方案中，微生物通過施加于包含相關(guān)抗生素(例如希奧辛)的合適固體培養(yǎng)基(例如瓊脂培養(yǎng)基)而被誘變，其中抗生素是以低于其展現(xiàn)完全或接近完全地抑制細(xì)胞生長時的濃度的濃度存在。用于這些方法的微生物并不攜帶希奧辛抗性基因(例如Shble)。在一些實(shí)施方案中，抗生素(例如希奧辛)以低于其殺死至少85%、90%、95%或100%的那種類型的細(xì)胞時的濃度的濃度用于誘變。在一些實(shí)施方案中，抗生素(例如希奧辛)以高于其殺死30%、40%、50%或60%的那種類型的細(xì)胞時的濃度的濃度用于誘變。在一些實(shí)施方案中，抗生素(例如希奧辛)被用于突變。在一些實(shí)施方案中，抗生素以其使暴露于其的細(xì)胞中的突變頻率增加超過針對所述細(xì)胞所觀測到的自發(fā)突變頻率時的濃度和條件使用。在一些實(shí)施方案中，抗生素以其抑制那種類型的細(xì)胞生長或者殺死60-80%的那種類型的細(xì)胞時的濃度和條件使用。[0106]ONC-T18細(xì)胞對濃度為100g/mL的希奧辛具高度敏感性(參見實(shí)施例3)。因此，在一些實(shí)施方案中，希奧辛以低于100g/mL的濃度(例如90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35或30g/mL)用于誘變。在一些實(shí)施方案中，希奧辛以約50g/mL的濃度用于誘變。在一些實(shí)施方案中，其中用希奧辛誘使細(xì)胞突變的培養(yǎng)基具有18g/L或更小的鹽濃度。相對于在較低濃度下或在無誘變劑存在下生長的細(xì)胞，已被誘變的細(xì)胞會顯示形態(tài)變化。為了只舉幾個實(shí)例，在一些實(shí)施方案中，已被誘變的細(xì)胞顯示生長速率、顏色和/或全部或特定的脂質(zhì)量發(fā)生改變。[0107]在某些示例性誘變方法中,將細(xì)胞(例如破囊壺菌屬或破囊壺菌細(xì)胞)展布于含有濃度為40-60g/mL的抗生素(例如希奧辛)的固體培養(yǎng)基上。分離出在這些條件下在至少4天(例如5天、6天、7天、8天、9天或10天)之后顯露出的群落?？梢詼y試所分離的細(xì)胞由誘變產(chǎn)生的所要特征。例如，可以將來自誘變?nèi)郝涞募?xì)胞與參考細(xì)胞(例如親代細(xì)胞)比較以檢測例如生物質(zhì)和/或脂質(zhì)生產(chǎn)率的特征的變化。[0108]本公開提供微生物(例如破囊壺菌屬或破囊壺菌)，其通過抗生素(例如希奧辛)誘變來分離。在一些實(shí)施方案中，通過抗生素(例如希奧辛)誘變來分離的微生物菌株(例如破囊壺菌菌株)產(chǎn)生比親代或參考菌株多至少10%、20%、30%、40%、50%的總脂質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，通過希奧辛誘變來分離的破囊壺菌屬菌株產(chǎn)生比親代菌株多至少10%、20%、30%、40%、50%的ALA、ARA、DHA、DPA、EPA、GLA和/或LA，或其組合。在一些實(shí)施方案中，通過希奧辛誘變來分離的破囊壺菌屬菌株產(chǎn)生比親代菌株多至少10%、20%、30%、40%、50%的ARA、DHA、EPA，或其組合。[0109]通過希奧辛誘變來分離的0NC-T18的一個特定菌株產(chǎn)生比其親代菌株多約36%的DHA。[0110]歷[0111]本公開提供用于選擇例如破囊壺菌屬類(例如破囊壺菌)的微生物的方法。這樣的方法可以與例如如本文所述的轉(zhuǎn)化方法結(jié)合并且/或者作為例如如本文所述的轉(zhuǎn)化方法的一部分來使用以便對微生物進(jìn)行遺傳操縱。[0112]—般來說，在所提供的選擇方法中，使用選擇劑來有利于攜帶適用于選擇劑的選擇性標(biāo)記的微生物的生長超過不具有選擇性標(biāo)記的微生物。典型地，選擇劑抑制、減少和/或減緩不具有選擇標(biāo)記的微生物的生長。在選擇期間，典型地在如本文中所述的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，只是生長培養(yǎng)基補(bǔ)充有選擇劑(“選擇培養(yǎng)基”)。[0113]在本公開的某些選擇方法中，在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物持續(xù)一段足以允許培養(yǎng)物變得主要包含具有選擇標(biāo)記的細(xì)胞的時間。即，在生長于選擇培養(yǎng)基中的期間內(nèi)，不具有選擇標(biāo)記的細(xì)胞沒有發(fā)生生長并且在培養(yǎng)物中被具有選擇標(biāo)記的細(xì)胞超越。在一些實(shí)施方案中，在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物持續(xù)I到15天、I到12天、或I到9天。在某些實(shí)施方案中，在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物持續(xù)一段長于1、2、3、4、5、6、7、8、9天或10天并且/或者短于50、45、40、35、30、25、20、15、14、13、12、11天或10天的時間。在某些示例性實(shí)施方案中，在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物持續(xù)介于約3天與約5天、或介于約5天與約10天之間等的時間。在一些實(shí)施方案中，微生物在選擇之后保持在選擇培養(yǎng)基中。在一些實(shí)施方案中，將微生物轉(zhuǎn)移到無選擇劑的培養(yǎng)基中持續(xù)至少一段時間，例如在復(fù)原期(recoveryphase)期間。[0114]在一些實(shí)施方案中，在細(xì)胞已經(jīng)在選擇培養(yǎng)基中生長一段時間之后移除選擇性標(biāo)記。選擇性標(biāo)記的移除可以在細(xì)胞生長于選擇培養(yǎng)基中的這段時間之后立即，在細(xì)胞生長于無選擇劑的培養(yǎng)基中的“復(fù)原期”之后，或者稍后(例如在細(xì)胞已被儲存一段時間之后，在細(xì)胞已被冷凍并且接著熔融之后)執(zhí)行。對細(xì)胞進(jìn)行遺傳工程化以使得所引入的遺傳元件(例如選擇性標(biāo)記)可以稍后被移除的方法是本領(lǐng)域中熟知的。這樣的方法典型地采用使用重組酶多肽，其典型地識別特定核苷酸序列(“識別位點(diǎn)”或“識別序列”)。例如，選擇性標(biāo)記可以被工程化到具有側(cè)接選擇性標(biāo)記的特定重組酶的識別位點(diǎn)的破囊壺菌屬或破囊壺菌細(xì)胞中。當(dāng)需要缺失選擇性標(biāo)記時，細(xì)胞可以暴露于適當(dāng)重組酶(即識別側(cè)接選擇性標(biāo)記的識別位點(diǎn)的重組酶)，其在識別位點(diǎn)上進(jìn)行同源重組反應(yīng)，從而使介于識別位點(diǎn)之間的核酸序列缺失或倒位。[0115]在一些實(shí)施方案中，選擇劑是或者包含抗生素，并且選擇標(biāo)記是或者包含抗生素抗性基因。[0116]在一些實(shí)施方案中，使用選擇劑的組合并且/或者使用選擇標(biāo)記的組合。[0117]在某些示例性實(shí)施方案中，微生物通過施加于包含希奧辛的適合培養(yǎng)基而經(jīng)歷選擇，其中希奧辛以高于閾值濃度的濃度存在。[0118]閾值濃度可以大致對應(yīng)于希奧辛展現(xiàn)完全或接近完全地抑制不含有希奧辛抗性基因的細(xì)胞的生長時的濃度。在一些實(shí)施方案中，閾值濃度為或者高于希奧辛殺死至少85%,90%或100%的那種不含希奧辛抗性基因的類型的細(xì)胞時的濃度。在一些實(shí)施方案中，閾值濃度可以視培養(yǎng)條件(例如鹽濃度、培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)溫度、液體或固體培養(yǎng)物等)而變化。在許多實(shí)施方案中，閾值濃度高于50μg/mL。在一些實(shí)施方案中，閾值濃度為或者高于60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200μg/mL。在一些實(shí)施方案中，閾值濃度為或者約100μg/mL。[0119]在一些實(shí)施方案中，抗生素抗性基因是或者包含腐草霉素、博萊霉素和/或他利霉素抗性基因。在一些實(shí)施方案中，抗生素抗性基因是或者包含來自印度斯坦鏈異壁菌(S.hidustanus)的基因(例如ble基因)。[0120]在一些實(shí)施方案中，在選擇期間使用的培養(yǎng)基的鹽濃度不同于在無選擇下用于培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基中典型使用的鹽濃度。在一些實(shí)施方案中，在選擇期間使用的培養(yǎng)基中的鹽濃度大致與在無選擇下用于培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基中典型使用的鹽濃度相同。在某些示例性實(shí)施方案中，鹽濃度是介于約10g/L與約40g/L之間，介于約15g/L與約35g/L之間，并且/或者介于約18g/L與約35g/L之間。在一些實(shí)施方案中，鹽濃度是約18g/L。在一些實(shí)施方案中，鹽濃度是約35g/L。[0121]在一些實(shí)施方案中，當(dāng)培養(yǎng)基具有約18g/L的鹽濃度時使用30μg/mL或高于30μg/mL的希奧辛濃度。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)培養(yǎng)基具有約35g/L的鹽濃度時使用100μg/mL或高于100μg/mL的希奧辛濃度。[0122]在某些示例性實(shí)施方案中，在選擇期間使用的適合培養(yǎng)基是固體培養(yǎng)基。當(dāng)使用固體培養(yǎng)基時，微生物可以在固體培養(yǎng)基的平坦表面上被展布開來(例如使用接種環(huán)、細(xì)胞展布器、珠粒或其他展布機(jī)制)，以使得可以允許單細(xì)胞群落生長。[0123]可以對單細(xì)胞群落進(jìn)行揀選并且培養(yǎng)以獲得較多和/或充分?jǐn)?shù)量來用于分析(例如轉(zhuǎn)基因分析、生長特征分析、脂質(zhì)分布分析等)和/或產(chǎn)生如本文所述的化合物?；蛘呋蛄硗猓纱双@得的單細(xì)胞群落和/或培養(yǎng)物可被儲存(例如通過冷凍在適當(dāng)?shù)睦鋬雠囵B(yǎng)基中)以供后續(xù)使用。[0124]MiL[0125]本公開提供用于轉(zhuǎn)化破囊壺菌屬(例如破囊壺菌)細(xì)胞的方法。這樣的方法一般包含以下步驟:提供感受態(tài)破囊壺菌屬細(xì)胞；將異源(例如重組或工程化)核酸遞送到感受態(tài)細(xì)胞中，其中重組核酸包含選擇性標(biāo)記；以及在含有選擇劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)感受態(tài)細(xì)胞，所述選擇劑可在無選擇性標(biāo)記存在下減少細(xì)胞生長。[0126]本公開提供遺傳轉(zhuǎn)化感受態(tài)破囊壺菌屬細(xì)胞。在某些示例性實(shí)施方案中，感受態(tài)細(xì)胞屬于菌株0NC-T18。這樣的感受態(tài)細(xì)胞可以通過多種方法中的任一種來提供，這些方法的非限制性實(shí)例更詳細(xì)地描述于實(shí)施例5中。在制備感受態(tài)細(xì)胞的方法(例如實(shí)施例5中所述的方法)中，感受態(tài)細(xì)胞是通過用來自破囊壺菌屬或破囊壺菌的所要菌株的接種物對固體或液體培養(yǎng)基進(jìn)行接種并且允許細(xì)胞生長，在必要時供應(yīng)新鮮的培養(yǎng)基而獲得。感受態(tài)細(xì)胞的制備典型地涉及在液體培養(yǎng)基中的一個或多個生長階段，接著對細(xì)胞進(jìn)行離心分離，并且使細(xì)胞再懸浮于無菌液體中達(dá)到所要細(xì)胞密度。感受態(tài)細(xì)胞可以在實(shí)驗中需要時新鮮制備，并且/或者可以對其進(jìn)行制備并接著加以儲存(例如冷凍)以供將來使用。[0127]在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞生長于燒瓶(例如體積為250mL、500mL或1L)中。[0128]在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞生長于富含氮源的培養(yǎng)基中。為了只舉一例，在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞生長于具有高含量蛋白胨的培養(yǎng)基中。在一些這樣的實(shí)施方案中，細(xì)胞生長于包含至少5-25g/L蛋白胨(或其他氮源)的培養(yǎng)基中。[0129]在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞生長于高含量的溶解氧中。在一些實(shí)施方案中，在生長期間，例如以約100到約500、或約125到約400、或約150到約300rpm來攪動細(xì)胞。[0130]在一些實(shí)施方案中，在營養(yǎng)繁殖期間誘使細(xì)胞突變。在一些實(shí)施方案中，在旺盛的營養(yǎng)繁殖期間誘使細(xì)胞突變。在一些實(shí)施方案中，在游動孢子階段期間并不誘使細(xì)胞突變。[0131]異源(例如重組、合成(以化學(xué)方式或以生物學(xué)方式)和/或工程化，其中其核酸序列是通過人的手來選擇)核酸可以是DNA、RNA、RNA:DNA雜交體或其任何適合的衍生物。在許多實(shí)施方案中，重組核酸是以載體的一部分來遞送。多種載體中的任一種可以適于根據(jù)本公開的方法來使用，包括(但不限于)質(zhì)粒、粘粒、BAC(細(xì)菌人工染色體)、YAC(酵母人工染色體)和病毒載體。在一些實(shí)施方案中，異源DNA可以是或者包含化學(xué)合成的聚核苷酸。在一些實(shí)施方案中，異源DNA可以包含酶合成的聚核苷酸。在一些實(shí)施方案中，異源DNA為或者包含聚合酶鏈反應(yīng)(“PCR”)產(chǎn)物。[0132]重組或工程化核酸典型地包含用于如本文所述的選擇方法中的選擇標(biāo)記。典型地，選擇標(biāo)記包含允許基因產(chǎn)物的表達(dá)的基因表達(dá)盒，其當(dāng)存在于細(xì)胞中時，允許細(xì)胞生長于含有濃度為如本文所述的閾值濃度或高于這個閾值濃度的選擇劑的選擇培養(yǎng)基中。例如，在抗生素用作選擇劑的實(shí)施例中，選擇標(biāo)記包含用于表達(dá)相應(yīng)抗生素抗性基因的基因表達(dá)盒。[0133]在一些實(shí)施方案中，重組或工程化核酸進(jìn)一步包含用于表達(dá)一種或多種所要基因產(chǎn)物的一個或多個其他基因表達(dá)盒。代表性一種或多種所要基因產(chǎn)物可以例如包括具有商業(yè)價值的多肽，并且/或者可以是對于合成具有商業(yè)價值的一種或多種下游產(chǎn)物(例如如PUFA的化合物)來說很重要的多肽(例如酶多肽或其他生物合成途徑組分)?；蛘呋蛄硗猓虍a(chǎn)物可以賦予微生物某些所要特征(例如在一組特定條件下生長的適合性；在大規(guī)模生產(chǎn)方法中生長的適合性等)?；蛘呋蛄硗?，所要基因產(chǎn)物可以是允許標(biāo)記已經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的產(chǎn)物?；蛘呋蛄硗猓谝恍?shí)施方案中，對細(xì)胞進(jìn)行工程化以產(chǎn)生高含量的一種或多種生物燃料、藥物、疫苗、抗體、脂質(zhì)、消退素、神經(jīng)蛋白、藥物化合物、多肽等。[0134]本文中已經(jīng)描述了典型地含于基因表達(dá)盒中的元件，例如驅(qū)動基因表達(dá)的啟動子或其他基因調(diào)控元件、將要表達(dá)的基因以及在將被轉(zhuǎn)化的微生物中起作用的終止子序列。將要表達(dá)的基因可以稱為“轉(zhuǎn)基因”。轉(zhuǎn)基因在某些實(shí)施方案中可以是異源基因，例如通常不存在于微生物中的基因。選擇標(biāo)記和其他基因表達(dá)盒中的任一者或兩者可以包括這樣的異源基因。[0135]因此，適于根據(jù)本公開的方法來使用的載體包括基因表達(dá)載體。[0136]在一些實(shí)施方案中，將一種重組核酸遞送到微生物中。例如，可以用包含重組核酸的一種質(zhì)粒建構(gòu)體使微生物轉(zhuǎn)化。[0137]在一些實(shí)施方案中，將不止一種重組核酸遞送到微生物中。例如,可以將質(zhì)粒建構(gòu)體的組合(每個質(zhì)粒建構(gòu)體包含重組核酸)遞送到微生物中。在一些這樣的實(shí)施方案中，使用選擇劑與選擇標(biāo)記的組合來選擇所要重組核酸的組合的存在。[0138]多種用于將遺傳物質(zhì)(例如包含重組核酸的遺傳物質(zhì))引入到細(xì)胞中的方法中的任一種可以適于根據(jù)本公開的轉(zhuǎn)化方法來使用。引入方法包括(但不限于)磷酸鈣沉淀；Ca2+處理；接受細(xì)胞與含有重組核酸的細(xì)菌原生質(zhì)體融合；用含有重組核酸的脂質(zhì)體處理接受細(xì)胞；DEAE葡聚糖；使用聚乙二醇(PEG)進(jìn)行的融合；電穿孔；磁穿孔；生物彈射式遞送；反轉(zhuǎn)錄病毒感染；脂轉(zhuǎn)染；以及直接將DNA微量注射到細(xì)胞中。[0139]在某些示例性實(shí)施方案中，使用生物彈射式遞送方法(也稱為“基因炮擊(genecannon)”、“粒子轟擊”和“微拋射”方法)。在這樣的實(shí)施方案中，生物彈射裝置促使涂有重組核酸的粒子加速到足以穿透細(xì)胞膜(和/或細(xì)胞壁，若存在時)的速度。在一些實(shí)施方案中，粒子包含金粒子或由金粒子組成。用于生物彈射式遞送遺傳物質(zhì)的方法是本領(lǐng)域已知的，并且用于進(jìn)行這樣的生物彈射式遞送的設(shè)備和試劑可從市面上購得。參見例如Sanford等人，Part.Sc1.Technol.5:27(1987)；Sanford,J.C.,TrendsBiotech.6:299(1988)；Sanford,J.C.,Physiol.Plant79:206(1990)；以及Klein等人，BiotechnologylO:268(1992),其各自的全部內(nèi)容以引用的方式并入本文中。[0140]在一些實(shí)施方案中，使用正如將會由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所已知并了解的例如土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化等方法來遞送核酸。[0141]正如本文在“選擇”章節(jié)中所述，在遞送異源(例如重組或工程化)核酸之后，在含有可在無選擇性標(biāo)記存在下減少細(xì)胞生長的選擇劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。所選擇的細(xì)胞(例如展現(xiàn)存在選擇性標(biāo)記并且因此存在重組核酸)可以被儲存、分析并且/或者在適當(dāng)時以更多數(shù)量生長。[0142]在某些示例性實(shí)施方案中，對轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行一種或多種分析以確認(rèn)重組核酸的存在。例如，可以使用PCR分析來確認(rèn)作為重組核酸一部分的遺傳元件(例如轉(zhuǎn)基因和/或選擇性標(biāo)記)的存在。[0143]工程化菌株[0144]本公開尤其提供能夠操縱某些例如破囊壺菌屬類微生物的調(diào)控序列、轉(zhuǎn)化方法、誘變方法和遺傳選擇方法。本文中提供的組合物和方法可以在許多應(yīng)用的任一種中用于工程化微生物(例如破囊壺菌屬類)。如上所述，本文中提供的調(diào)控序列和選擇性標(biāo)記可以用于在生物體中表達(dá)任何相關(guān)多肽，在這種生物體中這些序列和/或選擇性標(biāo)記是可操作的(例如在破囊壺菌屬類中)。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)來自不同生物體的多肽。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)來自宿主細(xì)胞的多肽(例如過表達(dá))。[0145]在一些實(shí)施方案中，對微生物進(jìn)行工程化以使相關(guān)化合物的產(chǎn)生增加。在一些實(shí)施方案中，對微生物進(jìn)行工程化以使脂肪酸、抗氧化劑、消退素和/或保護(hù)素的產(chǎn)生增加?；蛘呋蛄硗?，在一些實(shí)施方案中，對細(xì)胞進(jìn)行工程化以產(chǎn)生高含量的一種或多種生物燃料、藥物、疫苗、抗體、脂質(zhì)、消退素、神經(jīng)蛋白、藥物化合物、多肽等。[0146]本公開提供已被工程化以使PUFA的產(chǎn)生增加的破囊壺菌屬微生物(例如破囊壺菌)。即，本公開提供工程化破囊壺菌屬細(xì)胞，其包括增加PUFA的修飾。在一些實(shí)施方案中，對這樣的微生物進(jìn)行工程化以改變PUFA生物合成多肽的表達(dá)(例如增加或減少)。[0147]如圖1中所示，ONC-T18中的PUFA生物合成涉及由脂肪酸合酶(FAS)酶復(fù)合物產(chǎn)生脂肪酸，例如肉豆蘧酸(C14:0)和硬脂酸(C18:0)，接著在這樣的脂肪酸上發(fā)生一系列酶促反應(yīng)。這些反應(yīng)各自典型地由去飽和酶(其移除氫原子以形成碳-碳雙鍵)或延伸酶(其通過向脂肪酸的羧酸末端添加兩個碳原子來延長脂肪酸)催化。聚酮PUFA合酶(PKS)復(fù)合物還在0NC-T18中產(chǎn)生DHA。0NC-T18中的PUFA生物合成似乎具有至少兩個交叉的生物合成途徑:ω-6和《-3PUFA生物合成途徑。使ω-6脂肪酸轉(zhuǎn)化為ω-3脂肪酸可以由ω-3去飽和酶所催化。因此，如圖1中所示，在途徑中的不同點(diǎn)產(chǎn)生多種脂肪酸。[0148]在一些實(shí)施方案中，調(diào)控編碼酶多肽的一個或多個基因在途徑中的表達(dá)以在適當(dāng)時增加特定PUFA和/或其他脂肪酸的產(chǎn)生。例如，可以下調(diào)FAS基因的表達(dá)以增加PUFA產(chǎn)生。Λ5延伸酶、Δ4去飽和酶和/或任何PKS基因的表達(dá)的下調(diào)可以增加EPA產(chǎn)生和/或PUFA產(chǎn)生。PKS基因中的任何一種的表達(dá)的下調(diào)可以增加ARA產(chǎn)生。PKS基因中的任何一種的表達(dá)的上調(diào)可以增加DHA產(chǎn)生。Λ12延伸酶基因的表達(dá)的上調(diào)可以增加ARA和EPA產(chǎn)生。[0149]在一些實(shí)施方案中，調(diào)控編碼酶多肽的一個或多個基因在途徑中的表達(dá)以產(chǎn)生生物燃料。例如，PKS、Λ9去飽和酶、延伸酶和ω-3去飽和酶基因中任一者的表達(dá)的下調(diào)和/或FAS基因表達(dá)的上調(diào)可以增加用作生物燃料庫存的短鏈脂質(zhì)的產(chǎn)生。[0150]在一些實(shí)施方案中，途徑組分的基因表達(dá)的改變(例如下調(diào)或上調(diào))是通過產(chǎn)生基因敲除體，例如通過同源重組來實(shí)現(xiàn)。典型地，使用包括(但不限于)生物彈射式拋射型DNA遞送的多種技術(shù)中的任一種將線性化DNA建構(gòu)體引入細(xì)胞中。在一些實(shí)施方案中，同源重組在0NC-T18中的頻率大于約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%。[0151]在一些實(shí)施方案中，途徑組分的基因表達(dá)的改變(例如下調(diào)或上調(diào))是通過誘使一個或多個基因靶標(biāo)突變來實(shí)現(xiàn)。[0152]在一些實(shí)施方案中，本文中提供的工程化微生物可以產(chǎn)生包含n_3DHA、EPA和n-6DPA的脂質(zhì)部分,其量為大于約4.0g/L培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中,本文中提供的微生物可以產(chǎn)生包含n-3DHA、EPA和n_6DPA的脂質(zhì)組合物，其量為大于約20.0g/L培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，微生物可以產(chǎn)生包含n-3DHA、EPA和n_6DPA的脂質(zhì)組合物，其量為大于約14.0g/L培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，微生物可以產(chǎn)生約1.5g/L到約5.0g/L之間(例如約4.6g/L)的n-3DHA、約0.5g/L到約1.5g/L之間(例如約0.22g/L)的Π-3ΕΡΑ以及約0.5g/L到約1.5g/L的n-6DPA。在一些實(shí)施方案中，本文中提供的工程化微生物可以產(chǎn)生包含n-3DHA、EPA、n_6DPA或ARA的脂質(zhì)組合物，產(chǎn)量達(dá)到約120g/L，這對應(yīng)于超過約75%的總脂質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，本文中提供的工程化微生物可以產(chǎn)生包含短鏈脂肪酸(典型地為C12-C18脂肪酸)的脂質(zhì)組合物，產(chǎn)量達(dá)到約128g/L，這對應(yīng)于超過約80%的總脂質(zhì)。此外，微生物可以產(chǎn)生包含肉豆蘧酸、肉豆蘧油酸、十五烷酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸、Y-亞麻酸、二十碳二烯酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸以及二十二碳五烯酸的脂質(zhì)部分，其量為大于300mg/g或者甚至800mg/g細(xì)胞生物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，微生物也可以產(chǎn)生包含以下的部分:介于44.3mg/g與57mg/g之間的肉豆蘧酸(等于1134.5至Ij1458.1mg/L)、0.5至Ij0.65mg/g的肉豆蘧油酸(等于13.3到16.63mg/L)、33.5到34.6mg/g的十五烷酸(等于856.9到885.lmg/L)、121.9到165.lmg/g的棕櫚酸(等于3118.2到4923.3mg/L)、7.9到28.5mg/g的棕櫚烯酸(等于202.1到729mg/L)、4.38到5.9mg/g的硬脂酸(等于112到151mg/L)、6.94到9.9mg/g的油酸(等于177.5到253.2mg/L)、0.4到1.3mg/g的亞油酸(等于11.26到33.3mg/L)、0.5到1.0mg/g的二十碳二烯酸(等于12.8到25.6mg/L)、0.4到0.5mg/g的花生四烯酸(等于10.2到13mg/L)、75到IOOmg/g的二十二碳六烯酸(等于1918到2560mg/L)、l.9到6mg/g的二十碳五烯酸(等于48.6到153.5mg/L)以及17.1到33.7mg/g的二十二碳五烯酸(等于437.4到862.lmg/L)，在細(xì)胞生物質(zhì)內(nèi)的總脂肪酸含量介于301到800mg/g之間(等于7700到20，209mg/L)。[0153]發(fā)酵和產(chǎn)生[0154]某些本發(fā)明方法包括培養(yǎng)微生物(例如破囊壺菌屬，例如破囊壺菌屬種)的步驟或者可以與培養(yǎng)微生物(例如破囊壺菌屬，例如破囊壺菌屬種)的步驟結(jié)合使用。破囊壺菌屬類的培養(yǎng)方法已經(jīng)例如描述于美國專利公布US2009/0117194A1中，其全部內(nèi)容以引用的方式并入本文中。典型地，微生物生長于生長培養(yǎng)基(也稱為“培養(yǎng)基”)中。多種培養(yǎng)基中的任一種可以適于根據(jù)本發(fā)明的選擇方法來使用。典型地，培養(yǎng)基為微生物供應(yīng)多種營養(yǎng)組分，包括碳源和氮源。[0155]可以在能增加生物質(zhì)和/或相關(guān)化合物的產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)本文中提供的微生物。典型地在生理鹽水培養(yǎng)基中培養(yǎng)破囊壺菌屬類。例如，可以在鹽濃度介于約2.0-50.0g/L之間的培養(yǎng)基中培養(yǎng)破囊壺菌屬類。在一些實(shí)施方案中，在鹽濃度介于約2-35g/L之間的培養(yǎng)基中培養(yǎng)破囊壺菌屬類。在一些實(shí)施方案中，在鹽濃度介于約18_35g/L之間的培養(yǎng)基中培養(yǎng)破囊壺菌屬類。已經(jīng)在某些情形下發(fā)現(xiàn)，破囊壺菌屬類在低鹽條件下生長得很好。在一些實(shí)施方案中，在鹽濃度介于約5-20g/L之間的培養(yǎng)基中培養(yǎng)破囊壺菌屬類。在一些實(shí)施方案中，在鹽濃度介于約5-15g/L之間的培養(yǎng)基中培養(yǎng)破囊壺菌屬類。培養(yǎng)基可能包括或可能不包括NaCl。培養(yǎng)基可能包括或可能不包括加入NaCl。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基含有人工海鹽，例如INSTANTOCEAN?，Aquaria，Inc。培養(yǎng)基可能包括或可能不包括天然或人工海水。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基含有天然或人工海水，例如約2%到100%海水。[0156]氯離子會導(dǎo)致腐蝕發(fā)酵器或其他下游加工設(shè)備。在一些實(shí)施方案中，降低培養(yǎng)基中的氯離子濃度。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基包括不含氯離子的鈉鹽(例如硫酸鈉)作為鈉源。例如，總鈉量的很大一部分可以由非氯鹽供應(yīng)，以使得培養(yǎng)基中的總鈉量的不到約100%、75%、50%或25%是由氯化鈉供應(yīng)。[0157]在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基的氯離子濃度小于約3g/L、500mg/L、250mg/L或120mg/Lo在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基的氯離子濃度介于約60mg/L與120mg/L之間。[0158]適于根據(jù)本發(fā)明來使用的非氯化物的鈉鹽的實(shí)例包括(但不限于)蘇打灰(碳酸鈉與氧化鈉的混合物)、碳酸鈉、碳酸氫鈉、硫酸鈉以及其混合物。參見例如美國專利號5，340，742和6，607，900，所述文獻(xiàn)各自的全部內(nèi)容以引用的方式并入本文中。[0159]破囊壺菌屬培養(yǎng)物的培養(yǎng)基可以包括多種碳源中的任一者。碳源的實(shí)例包括脂肪酸；脂質(zhì)；甘油；甘油三酯；碳水化合物，例如葡萄糖、淀粉、纖維素、半纖維素、果糖、右旋糖、木糖、乳果糖、半乳糖、麥芽三糖、麥芽糖、乳糖、糖原；明膠；淀粉(玉米或小麥)；乙酸鹽；m-肌醇(源自于玉米漿)、半乳糖醛酸(源自于果膠)、L-巖藻糖(源自于半乳糖)、龍膽二糖、葡糖胺、a-D-葡萄糖-1-磷酸鹽(源自于葡萄糖)、纖維二糖、糊精和α-環(huán)糊精(源自于淀粉)；蔗糖(來自糖蜜)；多元醇，例如麥芽糖醇、赤蘚糖醇、阿東糖醇和油酸，例如甘油和吐溫80;氨基糖，例如N-乙?；?D-半乳糖胺、N-乙酰基-D-葡糖胺和N-乙?；?β-D-甘露糖胺；以及任何種類的生物質(zhì)或廢物流。[0160]在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基包括碳源，濃度為約5g/L到約200g/L。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基具有介于約1:1與約40:1之間的C:N比率(碳氮比率)。在使用兩相培養(yǎng)物的一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)物的C:N比率在第一相中介于約1:1與約5:1之間，接著在第二相中為約1:1到約1:約O(即沒有或幾乎沒有氮)。[0161]破囊壺菌屬類培養(yǎng)物的培養(yǎng)基可以包括多種氮源中的任一者。示例性氮源包括銨鹽溶液(例如于H2O中的NH4)、銨鹽或胺鹽(例如(NH4)2S04、(NH4)3P04、NH4N03、NH4OOCH2CH3(NH4Ac))、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物、麥芽提取物、魚粉、谷氨酸鈉、大豆提取物、酪蛋白氨基酸以及酒糟。氮源在適合培養(yǎng)基中的濃度范圍典型地介于約lg/L與約25g/L之間。[0162]在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基包括磷酸鹽，例如磷酸鉀或磷酸鈉。培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽和微量營養(yǎng)物可以包括硫酸銨、碳酸氫鈉、原釩酸鈉、鉻酸鉀、鑰酸鈉、亞硒酸、硫酸鎳、硫酸銅、硫酸鋅、氯化鈷、氯化鐵、氯化錳氯化鈣以及EDTA?？梢园ňS生素，例如吡哆醇鹽酸鹽、鹽酸硫胺素、泛酸鈣、對氨基苯甲酸、核黃素、煙酸、生物素、葉酸和維生素B12。[0163]例如，適合培養(yǎng)基可能包含介于約11與約13g/L之間(例如約12g/L)的硫酸鈉、介于約0.45與約0.55g/L之間(例如約0.5g/L)的KC1、介于約1.8與約2.2g/L之間(例如約2g/L)的MgSO4.7H20、介于約0.3與約0.4g/L之間(例如約0.35g/L)的HodagK-60消泡劑、介于約0.60與約0.70g/L之間(例如約0.65g/L)的K2SO4、介于約0.9與約1.lg/L之間(例如約1.0g/L)的KH2PO4、介于約0.95與約1.lg/L之間(例如約lg/L)的(NH4)2SO4'介于約0.15與約0.19之間(例如約0.17g/L)的CaCl2.H20、介于約2與約10g/L之間(例如約4.5g/L)的95DE玉米糖漿(固體基準(zhǔn))、介于約2.7與約3.3mg/L之間(例如約3mg/mL)的MnCl2.4H20、介于約2.7與約3.3mg/L之間(例如約3mg/mL)的ZnSO4.7H20、介于約0.035與約0.045mg/L之間(例如約0.04mg/L)的CoCl2.6Η20、介于約O與約0.045mg/L之間(例如約0.04mg/L)的Na2MoO4.2H20、介于約1.8與約2.2mg/L之間(例如約2mg/L)的CuSO4.5H20、介于約1.8與約2.2mg/L之間(例如約2mg/L)的NiSO4.6H20、介于約9與約Ilmg/L之間(例如約10mg/L)的FeSO4.7H20、介于約4與約15mg/L之間(例如約9.5mh/L)的硫胺素、介于約0.05與約0.25mg/L之間(例如約0.15mg/L)的維生素B12、介于約1.3與約5.1之間(例如約3.2mg.L)泛酸鈣以及約28%NH40H溶液。[0164]在適當(dāng)時，使用酸或堿，并且/或者使用氮源將培養(yǎng)基的pH值調(diào)整到3.0到10.0之間。在一些實(shí)施方案中，將培養(yǎng)基調(diào)整到PH4.0到6.5之間?？梢詫ε囵B(yǎng)基進(jìn)行殺菌。[0165]在一些實(shí)施方案中，用于培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基是液體培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，用于培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基是固體培養(yǎng)基。除了如本文所論述的碳源和氮源以外，固體培養(yǎng)基可以含有一種或多種組分(例如瓊脂或瓊脂糖)，其提供結(jié)構(gòu)支持并且/或者允許培養(yǎng)基呈固體形式。[0166]可以對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)持續(xù)介于1-60天之間的任何天數(shù)。在一些實(shí)施方案中，進(jìn)行培養(yǎng)持續(xù)14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或I天，或更少時間。在一些實(shí)施方案中，在介于4到30°C之間，例如18到28°C的溫度下進(jìn)行培養(yǎng)。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)包括通氣振蕩培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)、靜置培養(yǎng)、分批培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)、滾動式分批培養(yǎng)或波動培養(yǎng)等等。可以使用常規(guī)的攪拌式發(fā)酵器、泡罩塔發(fā)酵器(分批培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng))、波動發(fā)酵器等進(jìn)行培養(yǎng)。[0167]在一些實(shí)施方案中,通過振蕩對培養(yǎng)物進(jìn)行通氣。在一些實(shí)施方案中,振蕩從100到lOOOrpm，例如從350到600rpm、從1000到450rpm變動。在一些實(shí)施方案中，在產(chǎn)生生物質(zhì)的階段期間以及在產(chǎn)生脂質(zhì)的階段期間以不同方式對培養(yǎng)物進(jìn)行通氣(例如使用不同的振蕩速度)。例如，在一些實(shí)施方案中，通過振蕩，在生物質(zhì)階段期間以介于約150與約350rpm之間的速度并且在產(chǎn)生脂質(zhì)的階段期間以介于約30與約120rpm之間的速度對培養(yǎng)物進(jìn)行通氣。或者或另外，振蕩速度可以視培養(yǎng)容器類型(例如燒瓶形狀或尺寸)而變化。[0168]在一些實(shí)施方案中，溶解氧(DO)含量在生物質(zhì)產(chǎn)生階段期間高于其在脂質(zhì)產(chǎn)生階段期間的含量，例如DO含量在脂質(zhì)產(chǎn)生階段期間發(fā)生降低。在一些實(shí)施方案中，使溶解氧含量降低到低于飽和值；在一些實(shí)施方案中，使溶解氧含量降低到極低或者甚至無法檢測的程度。[0169]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可以通過根據(jù)涉及改變一個或多個培養(yǎng)條件以便獲得較高數(shù)量的所要化合物的方法培養(yǎng)細(xì)胞來促進(jìn)所要脂質(zhì)的產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，首先在能最大化生物質(zhì)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，接著將一個或多個培養(yǎng)條件改變成有利于脂質(zhì)生產(chǎn)率的條件。所改變的條件可以包括氧濃度、C:N比率、溫度以及其組合。在某些實(shí)施方案中，進(jìn)行兩階段培養(yǎng)，其中第一階段有利于生物質(zhì)產(chǎn)生(例如使用高氧條件(例如一般來講或相對于第二階段來講)、低C:N比率和環(huán)境溫度)，接著為第二階段，其有利于脂質(zhì)產(chǎn)生(例如其中氧被減少，C:N比率升高，并且溫度降低)。即，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供涉及在第一組條件下培養(yǎng)細(xì)胞的方法，所述第一組條件包括一個或多個選自以下的條件:第一氧濃度、第一C:N比率、第一溫度以及其組合。在這個第一組條件下進(jìn)行的培養(yǎng)持續(xù)第一時間段，其持續(xù)時間可有所變化。在第一時間段結(jié)束時(這并非必定為離散的時間點(diǎn))，改變一個或多個條件以便在第二組條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述第二組條件包括一個或多個選自以下的條件:第二氧濃度、第二C:N比率、第二溫度以及其組合。在一些實(shí)施方案中，在第一時間段結(jié)束時改變一些條件，并且維持一些條件直到第二時間段結(jié)束，在所述第二時間段時可以再次改變一個或多個條件，并且/或者可以第一次改變一個或多個條件。在一些實(shí)施方案中，第一C:N比率在約2:1到約1:1的范圍內(nèi)；并且第一溫度在約10到約30°C的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，第二C:N比率是約1:約O;并且第二溫度在約15°C到約30°C的范圍內(nèi)。[0170]在一些實(shí)施方案中，從第一條件到第二條件的改變是逐步地進(jìn)行并且/或者發(fā)生；在一些實(shí)施方案中，從第一條件到第二條件的改變是突然地進(jìn)行并且/或者發(fā)生。[0171]在本文提供的培養(yǎng)方法的一些實(shí)施方案中，在培養(yǎng)期間以數(shù)種可能方式，包括例如通過改變通氣強(qiáng)度來改變(例如降低)氧濃度。[0172]在本文提供的培養(yǎng)方法的一些實(shí)施方案中，在培養(yǎng)期間將溫度改變(例如降低)至少2°C。在一些實(shí)施方案中，將溫度改變31:、41:、51:、61:、71:、81:、91:或101:。在一些實(shí)施方案中，將溫度從約25°C改變到約20°C。[0173]可以通過任何可用的方法來評估相關(guān)化合物的細(xì)胞生產(chǎn)率。[0174]產(chǎn)物[0175]根據(jù)本公開產(chǎn)生的PUFA和其他化合物可以用于多種應(yīng)用的任一種中，例如利用其生物或營養(yǎng)性質(zhì)。在本公開的一些實(shí)施方案中，化合物被用于藥物、食物補(bǔ)充劑、動物飼料添加劑、化妝品等中。根據(jù)本公開產(chǎn)生的化合物也可以作為中間體用于產(chǎn)生其他化合物。[0176]應(yīng)認(rèn)識到，在本公開的一些實(shí)施方案中，在宿主細(xì)胞的背景下，由如本文所述的經(jīng)過操縱的細(xì)胞產(chǎn)生的PUFA和/或其他化合物被合并到最終產(chǎn)物(例如食物或飼料補(bǔ)充劑、嬰兒配方食品、藥物等)中。例如，宿主細(xì)胞可以被凍干，冷凍干燥，冷凍，巴氏滅菌，或者以別的方式滅活，并且接著全細(xì)胞可以被合并到最終產(chǎn)物中或者用作最終產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞(無論是否經(jīng)過干燥)可以在合并于產(chǎn)物中之前進(jìn)一步加以處理(例如經(jīng)由溶解、超聲處理、珠粒研磨、壓力處理、冷凍-熔融、用于分離組分的脈沖場電泳(PFE)和/或酶處理、或者其組合來進(jìn)行；在一些實(shí)施方案中，利用至少兩種或更多種這樣的處理)?？梢允褂眠m當(dāng)溶劑將溶解的細(xì)胞萃取到油中并且使用熟知方法進(jìn)行精煉。在一些實(shí)施方案中,最終產(chǎn)物僅僅合并從整體分離出的宿主細(xì)胞的一部分(例如根據(jù)尺寸、溶解度分餾)。例如，在本公開的一些實(shí)施方案中，從宿主細(xì)胞中分離出脂質(zhì)并且合并到最終產(chǎn)物中或者用作最終產(chǎn)物。含有PUFA的脂質(zhì)可以使用超臨界流體萃取法或者用一種或多種溶劑(例如丙酮、氯仿、異丙醇、己烷、二氯甲烷或甲醇)的萃取法來萃取。在一些實(shí)施方案中，通過例如尿素包合法(ureacomplexation)、柱色譜法和/或超臨界流體分懼法等多種方法中的任一者來濃縮脂質(zhì)。用于濃縮溶劑萃取的脂質(zhì)的技術(shù)包括水解(例如使用堿、酸，或者酶水解)、進(jìn)一步的萃取、酸化、結(jié)晶、過濾以及其組合(參見例如美國專利公布2009/0117194)。[0177]在本公開的一些實(shí)施方案中，一種或多種產(chǎn)生的PUFA和/或其他化合物被合并到食物或飼料的組分(例如食物補(bǔ)充劑)中。可以根據(jù)本公開合并化合物的食物產(chǎn)品的類型不受特別限制，并且包括飲料，例如牛奶、水、運(yùn)動飲料、能量飲料、茶和果汁；點(diǎn)心，例如果凍和餅干；含有脂肪的食物和飲料，例如乳制品；加工食品，例如軟米(或粥)；嬰兒配方食品；早餐谷類食品等等。在一些實(shí)施方案中，一種或多種產(chǎn)生的化合物被合并到例如復(fù)合維生素的膳食補(bǔ)充劑中。在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本公開產(chǎn)生的PUFA化合物包括于膳食補(bǔ)充劑中并且可以直接地合并到食物或飼料的組分(例如食物補(bǔ)充劑)中。[0178]可以合并根據(jù)本公開產(chǎn)生的化合物的飼料的實(shí)例包括例如寵物食物，例如貓食物、狗食物等等；用于水族箱魚、養(yǎng)殖魚或甲殼類動物等的飼料；用于農(nóng)場飼養(yǎng)動物(包括牲畜以及水產(chǎn)業(yè)中養(yǎng)殖的魚類或甲殼類動物)的飼料。合并根據(jù)本公開產(chǎn)生的化合物的食物或飼料物質(zhì)優(yōu)選的是對作為預(yù)期接受者的生物體來說是可口的。這種食物或飼料物質(zhì)可以具有目前關(guān)于食物物質(zhì)所知的任何物理性質(zhì)(例如物體、液體、柔軟的)。[0179]在一些實(shí)施方案中，一種或多種產(chǎn)生的化合物(例如I3UFA)被合并到藥物中。這樣的藥物的實(shí)例包括例如各種片劑、膠囊、可飲用的藥劑等。在一些實(shí)施方案中，所述藥物適用于局部應(yīng)用。劑型不受特別限制，并且包括膠囊、油劑、顆粒、細(xì)粒劑、粉劑、片劑、丸劑、寶塔糖劑等等。油劑和填充油的膠囊可以提供額外的優(yōu)點(diǎn)，這既是因為其沒有在制造期間發(fā)生成分分解現(xiàn)象，又是因為含有PUFA的脂質(zhì)液滴可以容易地合并到油基配制物中。[0180]根據(jù)本公開的藥物可以根據(jù)本領(lǐng)域中確立的技術(shù)，包括例如如在美國藥典(UnitedStatesPharmacopoeia)中所述的普通程序來制備。[0181]根據(jù)本公開產(chǎn)生的化合物(不論是已分離的還是在細(xì)胞的背景下)可以通過與多種藥劑中的任一者組合而合并到如本文所述的產(chǎn)物中。例如，這樣的化合物可以與一種或多種粘合劑或填充劑組合。在一些實(shí)施方案中，發(fā)明性產(chǎn)物將包括一種或多種螯合劑、顏料、鹽、表面活性劑、保濕劑、粘度調(diào)節(jié)劑、增稠劑、軟化劑、芳香劑、防腐劑等等以及其組合。實(shí)施例[0182]實(shí)施例1:分離和鑒定啟動子和終止子序列[0183]此實(shí)施例描述了從0NC-T18中鑒定和分離某些示例性基因表達(dá)啟動子和終止子核酸序列。[0184]加拿大海洋營養(yǎng)有限公司(OceanNutritionCanadaLimited)已經(jīng)使用鳥槍法測序和焦磷酸測序(GS-20；454)技術(shù)基本上對0NC-T18的基因組進(jìn)行了測序。尤其，本公開內(nèi)容提供了例如利用公眾可獲得的EST(表達(dá)序列標(biāo)簽)收集信息(Huang等人，2008)、功能注釋和/或生物信息學(xué)軟件(例如可從AppliedMaths獲得的Kodon軟件包和/或一種或多種算法(如BLAST))來對這種序列信息進(jìn)行分析。為了提供用于表達(dá)同源性和異源性基因(例如參與破囊壺菌屬微生物內(nèi)的脂質(zhì)和脂肪酸生物合成的基因)的工具，使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)從破囊壺菌屬種0NC-T18的基因組DNA克隆看家微管蛋白基因啟動子和終止子以及去飽和酶和延長酶啟動子。[0185]1.分離和鑒定微管蛋白基因啟動子#701。使用生物信息學(xué)軟件包KodonUppliedMaths)，基于破囊壺菌屬種0NC-T18基因組序列數(shù)據(jù)來設(shè)計寡核苷酸引物#52(SEQIDN0:1)和#53(SEQIDNO:2)0寡核苷酸引物是由Invitrogen(California,USA)合成并且購自Invitrogen(California,USA)。[0186]在振蕩孵育箱中，在以150rpm進(jìn)行恒定攪動下，在25°C下從培養(yǎng)在生長培養(yǎng)基(ONC-T18-GM0)中的細(xì)胞中提取ONC-T18的基因組DNA，持續(xù)36小時。通過在Sorva11SuperT21離心機(jī)中，用具有適配器Sorvall#00436的轉(zhuǎn)子ST-H750以4300rpm在室溫下離心5分鐘來收集50mL培養(yǎng)物中的細(xì)胞。使用Ultraclean微生物DNA分離試劑盒(UltracleanMicrobialDNAIsolationkit)(M0BIOLaboratories公司，SolanaBeach,California),遵循制造商的方案從所述細(xì)胞中分離基因組DNA。[0187]生長培養(yǎng)基0NC-T18-GM0的組分是:5g/L酵母提取物(RM668，HiMedialabs)、5g/L大豆蛋白胨(RM007，HiMedialabs)、10g/LD(+)-葡萄糖(CEREL0SE?右旋糖020010，CornProductsInternational)、35g/L人工海鹽(INSTANTOCEAN?,Aquarialnc.)、1.25mg/L微量元素(5g/LNaH2P04.Η20、3.15g/LFeCl3.6Η20、4.36g/LNa2EDTA.2Η20、0.6125mg/LCuSO4.5Η20、0.0597g/LNa2Mo04.2Η20、0.022g/LZnS04.7Η20、0.01g/LCoCl2.6Η20、0.18g/LMnCl2.4Η20、13μg/LH2Se03、2.7mg/LNiS04.6H20、1.84mg/LNa3V04以及1.94mg/LK2Cr04)以及1.25mg/L維生素(lmg/L維生素B12、lmg/L生物素、0.20g/L鹽酸硫胺素)。[0188]使用以下PCR條件從0NC-T18的基因組DNA擴(kuò)增包括部分開放閱讀框序列在內(nèi)的微管蛋白基因啟動子#701:94V，持續(xù)I分鐘；94°C，持續(xù)30秒；以及68°C，持續(xù)6分鐘，并且重復(fù)30個循環(huán)，以及72°C，持續(xù)10分鐘。在50μL反應(yīng)混合物中進(jìn)行PCR，所述反應(yīng)混合物含有2.5單位TaKaRaLATaq?DNA聚合酶(TAKARABIO公司，Shiga,Japan)、IXLAPCR緩沖液I1、dNTP混合物(各自0.40mM)、225ng模板基因組DNA、0.20μM引物#52以及0.20μM引物#53。[0189]在用于電泳的0.8%瓊脂糖凝膠中在65伏下拆分PCR產(chǎn)物，持續(xù)60分鐘。用刀片剪出具有預(yù)期大小的條帶，并且使用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen,Valencia,California),按照制造商的方案提取并且純化DNA。[0190]使用Perfectly13丨unt--克隆試劑盒(Novagen,SanDiego,California),按照制造商的方案將經(jīng)過純化的DNA片段克隆到pT7Blue-3載體中。使用直接群落PCR方法篩選陽性克隆。簡單地說，使用牙簽挑選經(jīng)過轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(Escherichiacoli)群落,并且分別在200μLPCR管中在含有下列組分的20μLPCR反應(yīng)混合物中渦旋:TaqDNA聚合酶(Sigma)UXPRC緩沖液、2.5mMMgCl2、dNTP混合物(各自0.20mM)、0.25μM引物#62(SEQID勵:3)以及0.25411引物#63(SEQIDΝ0:4)。同時，還將群落劃線接種到參考培養(yǎng)板上以便分離質(zhì)粒DNA。[0191]在以下條件下進(jìn)行PCR:94°C，持續(xù)3分鐘，歷經(jīng)一個循環(huán)；94°C，持續(xù)I分鐘，53°C，持續(xù)2分鐘，以及72°C，持續(xù)4分鐘，并且重復(fù)30個循環(huán)；以及72°C，持續(xù)10分鐘。在0.8%瓊脂糖凝膠中區(qū)分PCR產(chǎn)物。擴(kuò)增得到具有預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物的群落被認(rèn)為是陽性群落。[0192]使用Zyppy?質(zhì)粒微量制備試劑盒(ZymoResearch公司，Orange,California)從3mL培養(yǎng)物中的細(xì)菌大腸桿菌細(xì)胞中分離陽性克隆JZ2-17-10的質(zhì)粒DNA。使用正向引物#62(SEQIDN0:3)和反向引物#63(SEQIDNO:4)對它的插入物進(jìn)行測序。使用生物信息學(xué)軟件包Kodon(AppliedMaths)和算法BLAST對所得序列進(jìn)行組裝和分析。來自于克隆JZ2-17-10的插入物的核苷酸序列的長度是724個堿基對(SEQIDN0:5)。基于使用不同生物信息學(xué)軟件進(jìn)行的分析將部分預(yù)測性微管蛋白基因開放閱讀框(ORF)的預(yù)測性翻譯起始密碼ATG的具有498個核苷酸的上游確定為預(yù)測性基因表達(dá)啟動子(序列#701；SEQIDN0:6)。在這個序列內(nèi)鑒定出典型的基因啟動子元件。使用基本局部比對搜索工具(BLAST)(Altschul等人，1990)在包括專利序列的數(shù)據(jù)庫在內(nèi)的不同基因庫數(shù)據(jù)庫中對與這個預(yù)測性啟動子序列#701(SEQIDN0:6)同源的序列進(jìn)行搜索。沒有發(fā)現(xiàn)與這個獨(dú)特的啟動子序列#701同源的序列。在BLAST搜索中，ORF的5’端部分序列與萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)β微管蛋白2(TUB2)基因(基因庫登錄號:ΧΜ_001693945)具有最大的同源性。[0193]所鑒定的啟動子序列的長度是498個核苷酸，并且含有處于位置444上的-10普里布諾盒(Pribnow-Schallerbox)(AGGAAGACT)和處于位置424上的-35盒(CTGACG)、處于位置459上的預(yù)測性轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)以及處于位置468上的預(yù)測性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)AAGGTAGA。[0194]2.分離和鑒定微管蛋白基因啟動子#341。使用生物信息學(xué)軟件包KodonUppliedMaths)，基于破囊壺菌屬種0NC-T18基因組序列數(shù)據(jù)來設(shè)計寡核苷酸引物#54(SEQIDN0:7)和#55(SEQIDN0:8)。寡核苷酸引物是由Invitrogen(California,USA)合成并且購自Invitrogen(California,USA)。[0195]通過PCR，使用與對于分離微管蛋白基因啟動子#701所述的條件相同的條件，從0NC-T18的基因組DNA擴(kuò)增包括下游部分開放閱讀序列在內(nèi)的微管蛋白基因啟動子#341。使用PerfectlyBlunt^克隆試劑盒(Novagen,SanDiego,California),按照制造商的方案將所擴(kuò)增的經(jīng)過純化的DNA片段克隆到pT7Blue-3載體中。使用Zyppy?質(zhì)粒微量制備試劑盒(ZymoResearch公司，Orange,California)從3mL培養(yǎng)物中的大腸桿菌細(xì)胞中分離陽性克隆JZ2-17-14的質(zhì)粒DNA。[0196]使用正向引物#62(SEQIDNO:3)和反向引物#63(SEQIDNO:4)對重組質(zhì)粒DNA的插入物進(jìn)行測序。使用生物信息學(xué)軟件包Kodon(AppliedMaths)和算法BLAST對所得序列進(jìn)行組裝和分析。克隆JZ2-17-14的插入核苷酸序列的長度是1115個堿基對(SEQIDN0:9)。已經(jīng)鑒定出微管蛋白基因的位于插入物的3’端序列處的部分ORF。ORF的預(yù)測性翻譯起始密碼ATG的上游序列被認(rèn)為是預(yù)測性啟動子#341(SEQIDNO:10)。[0197]使用基本局部比對搜索工具(BLAST)(Altschul等人，1990)在包括專利序列的數(shù)據(jù)庫在內(nèi)的不同基因庫數(shù)據(jù)庫中對與微管蛋白基因啟動子#341(SEQIDNO:10)同源的序列進(jìn)行搜索。沒有發(fā)現(xiàn)與這個獨(dú)特的微管蛋白基因啟動子#341序列同源的序列。在BLAST搜索中，預(yù)測性部分ORF的5’端序列與萊茵衣藻α微管蛋白2(TUA2)基因(基因庫登錄號:5728641)具有最大的同源性。[0198]這個長度是1104個核苷酸的啟動子序列含有處于位置542上的-10盒(CGCTAAAAT)和處于位置518上的-35盒(TTCACG)、處于位置557上的預(yù)測性轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)以及處于位置543上的預(yù)測性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)GCTAAAAT，以及處于位置143上的-10盒(TAGTAGATT)和處于位置125上的-35盒(TTGCTC)、處于位置158上的預(yù)測性轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)以及處于位置149上的預(yù)測性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)ATTTTGTA和處于位置150上的TTTTGTAA。[0199]3.分離和鑒定微管蛋白基因終止子#347。使用生物信息學(xué)軟件包KodonUppliedMaths)，基于0NC-T18的基因組序列數(shù)據(jù)來設(shè)計寡核苷酸引物#58(SEQIDNO:11)和#59(SEQIDNO:12)。寡核苷酸引物是由公司Invitrogen(California,USA)合成并且購自公司Invitrogen(California,USA)。[0200]通過PCR，使用與對于分離微管蛋白基因啟動子#341所述的條件相同的條件，從0NC-T18的基因組DNA擴(kuò)增微管蛋白基因終止子#347。使用PerfectlyBlunt?克隆試劑盒(Novagen,SanDiego,California),按照制造商的方案將經(jīng)過純化的DNA片段克隆到pT7Blue-3載體中。使用Zyppy?質(zhì)粒微量制備試劑盒(ZYMORESEARCH公司，Orange，California)從3mL培養(yǎng)物中的細(xì)菌大腸桿菌細(xì)胞中分離陽性克隆JZ2-17-22的質(zhì)粒DNA。[0201]使用正向引物#62(SEQIDN0:3)和反向引物#63(SEQIDNO:4)對重組質(zhì)粒DNA的插入物進(jìn)行測序。使用生物信息學(xué)軟件包Kodon(AppliedMaths)和算法BLAST對所得序列進(jìn)行組裝和分析?？寺Z2-17-22的核苷酸序列的插入物的長度是727個堿基對(SEQIDNO:13)。所述插入物的5’端序列已經(jīng)被鑒定為預(yù)測性部分0RF，所述預(yù)測性部分ORF含有預(yù)測性基因翻譯終止密碼子TAA。終止密碼子TAA的下游序列被認(rèn)為是預(yù)測性微管蛋白基因終止子#347(SEQIDNO:14)。[0202]使用基本局部比對搜索工具(BLAST)(Altschul等人，1990)在包括專利序列的數(shù)據(jù)庫在內(nèi)的不同基因庫數(shù)據(jù)庫中對與微管蛋白基因終止子#347序列(SEQIDN0:14)同源的序列進(jìn)行搜索。沒有發(fā)現(xiàn)與這個獨(dú)特的微管蛋白基因終止子#347序列的同源序列。在BLAST搜索中，預(yù)測性O(shè)RF的部分序列與水蕨(Ceratopterisrichardii)α微管蛋白基因(基因庫登錄號:ΧΜ_001691824)具有最大的同源性。[0203]長度是590個核苷酸的終止子序列含有預(yù)測性多聚腺苷酸化信號序列AAAACAAAAA，所述預(yù)測性多聚腺苷酸化信號序列的功能在于終止通過RNA聚合酶進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄。[0204]4.分離和鑒定微管蛋白基因終止子#713。使用生物信息學(xué)軟件包KodonUppliedMaths)，基于0NC-T18的基因組序列數(shù)據(jù)來設(shè)計寡核苷酸引物#60(SEQIDNO:15)和#61(SEQIDNO:16)。所述寡核苷酸引物是由Invitrogen(California,USA)合成并且購自Invitrogen(California,USA)。[0205]通過PCR，使用與對于分離微管蛋白基因啟動子#341所述的條件相同的條件，從0NC-T18的基因組DNA擴(kuò)增微管蛋白基因終止子#713。使用PerfectlyBlunt:意克隆試劑盒(Novagen,SanDiego,California),按照制造商的方案將經(jīng)過純化的DNA片段克隆到pT7Blue_3載體中。使用Zyppy?質(zhì)粒微量制備試劑盒(ZymoResearch公司，Orange，California)從3mL培養(yǎng)物中的細(xì)菌大腸桿菌細(xì)胞中分離陽性克隆JZ2-22-9的質(zhì)粒DNA。[0206]使用正向引物#62(SEQIDNO:3)和反向引物#63(SEQIDNO:4)對重組質(zhì)粒DNA的插入物進(jìn)行測序。使用生物信息學(xué)軟件包Kodon(AppliedMaths)和算法BLAST對所得序列進(jìn)行組裝和分析?？寺Z2-22-9的核苷酸序列的插入物的長度是869個堿基對(SEQIDNO:17)。所述插入物的5’端序列已經(jīng)被鑒定為預(yù)測性部分0RF，所述預(yù)測性部分ORF含有預(yù)測性基因翻譯終止密碼子TAA。終止密碼子TAA的下游序列被認(rèn)為是預(yù)測性微管蛋白基因終止子#347(SEQIDNO:18)。[0207]使用基本局部比對搜索工具(BLAST)(Altschul等人，1990)在包括專利序列的數(shù)據(jù)庫在內(nèi)的不同基因庫數(shù)據(jù)庫中對與微管蛋白基因終止子#713序列(SEQIDN0:18)同源的序列進(jìn)行搜索。沒有發(fā)現(xiàn)與這個獨(dú)特的微管蛋白基因終止子#713序列同源的序列。在BLAST搜索中，預(yù)測性O(shè)RF的部分序列與藍(lán)載藻(Cyanophoraparadoxa)βI微管蛋白(tubBl)基因(基因庫登錄號:AF092952)具有最大的同源性。[0208]長度是640個核苷酸的終止子序列(SEQIDNO:14)含有預(yù)測性多聚腺苷酸化信號序列CATAAA，所述多聚腺苷酸化信號序列的功能在于終止通過信使RNA聚合酶進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄。[0209]5.分離和鑒定Λ5延長酶基因(PCT/1B2007/004553)啟動子序列(SEQIDNO:19)?；谑褂蒙镄畔W(xué)軟件包Kodon(AppliedMaths)得到的0NC-T18基因組序列數(shù)據(jù)，設(shè)計了為了便于進(jìn)行下游分子克隆而在5’端上添加有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)XbaI的寡核苷酸引物#3(SEQIDN0:20)以及在5’端上添加有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)NcoI的引物#4(SEQIDN0:21)。所述寡核苷酸引物是由Invitrogen(California,USA)合成并且購自Invitrogen(California,USA)。使用PCR從0NC-T18的基因組DNA擴(kuò)增Λ5延長酶基因啟動子，使其沉淀，使用限制性內(nèi)切酶XhoI和NcoI消化，進(jìn)行瓊脂糖-凝膠純化并且將其克隆到載體pSV40/Zeo2(Invitrogen公司，California)的相應(yīng)限制性位點(diǎn)中。使用引物#14(SEQIDN0:22)和引物#15(SEQIDNO:23)對陽性克隆JZ1-57-7的插入物進(jìn)行測序。使用生物信息學(xué)軟件包Kodon(AppliedMaths)和算法BLAST對所得序列進(jìn)行組裝和分析?？寺Z1-57-7的核苷酸序列的插入物的長度是950個堿基對(SEQIDN0:19)，并且已經(jīng)被鑒定為0NC-T18的Λ5延長酶基因啟動子(SEQIDΝ0:19)。[0210]這個長度是950個核苷酸的啟動子序列(SEQIDNO:19)含有處于位置113上的-10盒(TGCCAGACT)、處于位置91上的-35盒(TTTTCT)、處于位置128上的預(yù)測性轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)以及處于位置87、92、93以及131上的預(yù)測性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)CTCCTTTT、TTTCTTTT、TTCTTTTT以及TTGCTCCT，以及處于位置444上的-10盒(AGTTCTGAT)、處于位置419上的-35盒(TTTCCG)以及處于位置459上的預(yù)測性轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。[0211]使用基本局部比對搜索工具(BLAST)(Altschul等人，1990)在包括專利序列的數(shù)據(jù)庫在內(nèi)的不同基因庫數(shù)據(jù)庫中對與Λ5延長酶基因啟動子序列(SEQIDN0:19)同源的序列進(jìn)行搜索。沒有發(fā)現(xiàn)與Λ5延長酶基因啟動子序列(SEQIDΝ0:19)同源的序列。[0212]6.分離和鑒定Λ4去飽和酶基因(PCT/1B2007/004553)啟動子序列(SEQIDΝ0:24)。使用為了便于進(jìn)行下游分子克隆而在5’端上添加有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)XhoI的寡核苷酸引物#1(SEQIDΝ0:25)以及在5’端上添加有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)NcoI的引物#2(SEQIDΝ0:26)來分離Λ4去飽和酶基因啟動子序列(SEQIDΝ0:24)。使用PCR來擴(kuò)增Λ4去飽和酶基因啟動子的DNA片段，使其沉淀，使用限制性內(nèi)切酶XhoI和NcoI消化，進(jìn)行瓊脂糖-凝膠純化并且將其克隆到使用相同限制性內(nèi)切酶消化并且經(jīng)過凝膠純化的載體pSV40/Zeo2(Invitrogen公司，California)的相應(yīng)限制性位點(diǎn)中。使用引物#14(SEQIDN0:22)和引物#15(SEQIDNO:23)對陽性克隆JZ1-57-1的插入物進(jìn)行測序。使用生物信息學(xué)軟件包Kodon(AppliedMaths)和算法BLAST對所得序列進(jìn)行組裝和分析?？寺Z1-57-1的核苷酸序列的插入物的長度是1216個堿基對(SEQIDNO:24)，并且已經(jīng)被鑒定為0NC-T18的Λ4去飽和酶基因啟動子(SEQIDΝ0:24)。[0213]這個長度是1216個核苷酸的啟動子序列(SEQIDNO:24)含有處于位置58上的-10盒(GCGTATTAT)、處于位置34上的-35盒(CTACAG)、處于位置73上的預(yù)測性轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)以及處于位置63和69上的預(yù)測性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)TTATATTT和TTTTCGCA，以及處于位置1038上的-10盒(CGTCATCCT)、處于位置1014上的-35盒(TGGACG)以及處于位置1053上的預(yù)測性轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。[0214]使用基本局部比對搜索工具(BLAST)(Altschul等人，1990)在包括專利序列的數(shù)據(jù)庫在內(nèi)的不同基因庫數(shù)據(jù)庫中對與Λ4去飽和酶基因啟動子序列(SEQIDN0:24)同源的序列進(jìn)行搜索。沒有發(fā)現(xiàn)與Λ4去飽和酶基因啟動子(SEQIDN0:15)同源的序列。[0215]實(shí)施例2:核酸構(gòu)建體[0216]這個實(shí)施例描述了破囊壺菌屬特異性基因表達(dá)載體的建構(gòu)。[0217]1.產(chǎn)生重組質(zhì)粒載體pD4DPZl(SEQIDNO:30;圖2)和pE5PZl(SEQIDN0:31；圖3)。利用PCR，使用0NC-T18的基因組DNA作為模板并且使用TaKaRaLATaq?DNA聚合酶(TAKARABIO公司，Shiga,Japan)來擴(kuò)增0NC-T18的Λ4去飽和酶和Λ5延長酶基因的啟動子DNA片段。利用在5’端上帶有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)XhoI的引物#1(SEQIDΝ0:25)和在5’端上包含限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)NcoI的引物#2(SEQIDΝ0:26)來對Λ4去飽和酶基因啟動子(SEQIDΝ0:24)進(jìn)行擴(kuò)增。使用在5’端上帶有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)XbaI的引物#3(SEQIDΝ0:20)和在5’端上含有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)NcoI的引物#4(SEQIDΝ0:21)來對Λ5延長酶啟動子(SEQIDNO:19)進(jìn)行擴(kuò)增。在含有以下各項的50μL體積的反應(yīng)混合物中進(jìn)行PCR反應(yīng):2.5單位TaKaRaLATaq?DNA聚合酶(TAKARABIO公司，Shiga,Japan)、IXLAPCR緩沖液I1、dNTP混合物(各自0.40mM)、225ng基因組DNA模板、0.20μM引物[引物對，用于擴(kuò)增Λ4去飽和酶基因啟動子的#1(SEQIDNO:25)和#2(SEQIDNO:26)，以及用于擴(kuò)增Λ5延長酶啟動子的#3(SEQIDΝ0:20)和#4(SEQIDNO:21)]，所述PCR反應(yīng)在以下條件下進(jìn)行:94°C，持續(xù)30秒，歷經(jīng)一個循環(huán)；98°C，持續(xù)10秒，以及55°C，持續(xù)5秒，720C，持續(xù)2分鐘，歷經(jīng)30個循環(huán)。[0218]遵循以下這些程序使PCR產(chǎn)物沉淀:添加不含核酸酶的ddH20到總體積200μL,接著添加20μL3MNaAc(ρΗ5.2)和440μL100%乙醇，并且通過短暫渦旋加以混合，在冰中孵育I小時，使用臺式離心機(jī)以全速離心10分鐘，棄去上清液，添加500yL75%乙醇并且以全速離心2分鐘，棄去上清液并且將DNA沉淀真空干燥約10分鐘。在37°C下，在含有IXNE緩沖液2和IXBSA(NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA,USA)的25μL體積的反應(yīng)混合物中，用限制性內(nèi)切酶NcoI(10單位)和XhoI(10單位)將Λ4去飽和酶基因啟動子的PCR產(chǎn)物消化2小時。在相同條件下使用限制性內(nèi)切酶NcoI(10單位)和XbaI(10單位)對Λ5延長酶基因啟動子的PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化。在用于電泳的0.8%瓊脂糖凝膠中，在88伏下拆分經(jīng)過消化的PCR產(chǎn)物，持續(xù)45分鐘。用刀片從瓊脂糖凝膠上切出PCR產(chǎn)物的DNA條帶,并且使用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen,Valencia,California),按照制造商的方案對DNA進(jìn)行提取和純化。將所得的具有酶特異性粘性末端的Λ4去飽和酶基因啟動子DNA片段連接到經(jīng)過相同的限制性內(nèi)切酶消化并且經(jīng)過瓊脂糖-凝膠純化的載體pSV40/Zeo2的相應(yīng)限制性位點(diǎn)NcoI和XhoI中，以便產(chǎn)生載體pD4DPZl(SEQIDNO:30;圖2)。將所得的具有酶特異性粘性末端的Λ5延長酶基因啟動子DNA片段連接到經(jīng)過NcoI和NheI限制性內(nèi)切酶消化并且經(jīng)過瓊脂糖-凝膠純化的載體pSV40/Zeo2(Invitrogen公司,California)的限制性位點(diǎn)中，以便產(chǎn)生載體pE5PZl(SEQIDN0:31;圖3)。在環(huán)境溫度下，在含有IX連接緩沖液、插入物和載體DNA(3:1摩爾比)以及0.5單位T4DNA連接酶(Invitrogen,California)的10μL體積的反應(yīng)混合物中將連接反應(yīng)進(jìn)行12小時。然后，將連接的DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌ToplO感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen公司，California)中。使用Zyppy?質(zhì)粒微量制備試劑盒(ZymoResearch公司，Orange,California)從3mL細(xì)菌培養(yǎng)物中分離轉(zhuǎn)化體的三個群落的質(zhì)粒DNA。預(yù)先地通過使用酶XhoI和NotI針對Λ5延長酶基因啟動子構(gòu)建體進(jìn)行限制性內(nèi)切酶消化，并且使用酶NcoI和XhoI針對Λ4去飽和酶基因啟動子構(gòu)建體進(jìn)行限制性內(nèi)切酶消化來測試克隆的完整性。使用引物#14(SEQIDΝ0:22))和引物#15(SEQIDNO:23)對Λ4去飽和酶基因啟動子載體的經(jīng)過預(yù)先鑒定的陽性克隆JZ1-57-1以及Λ5延長酶基因啟動子載體的經(jīng)過預(yù)先鑒定的陽性克隆JZ1-57-7的插入物進(jìn)行完全測序。所得的載體PD4DPZ1(SEQIDNO:30;圖2)含有來自印度斯坦鏈異壁菌的ble基因，所述ble基因由0NC-T18的Λ4去飽和酶基因啟動子和SV40終止子側(cè)接。所得的載體ΡΕ5ΡΖ1(SEQIDNO:31;圖3)也含有ble基因，所述ble基因由0NC-T18的Λ5延長酶基因啟動子和SV40終止子側(cè)接。[0219]本發(fā)明因此尤其提供了載體，所述載體包含與異源性基因可操作地連接的破囊壺菌啟動子。在一些實(shí)施方案中，這類載體包括例如終止子、一個或多個復(fù)制起點(diǎn)以及一個或多個檢測標(biāo)記或選擇標(biāo)記。[0220]2.產(chǎn)生綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記基因表達(dá)載體(SEQIDNO:32;圖4)。為了制備GFP基因的模板質(zhì)粒DNA,從ArabidopsisDepositCenter(Ohio,USA)購得含有質(zhì)粒PCD3-327[基因庫登錄號U70496;(Davis和Vierstra，1998)]的大腸桿菌細(xì)菌儲備液。將細(xì)菌劃線接種在含有100μg/mL氨比西林(ampicillin)的LB瓊脂板中。將單個群落接種在含有100μg/mL氨比西林的3mLLB培養(yǎng)基中，并且使其生長過夜。使用Ultraclean微生物微量制備DNA分離試劑盒(MOBIOLaboratoriesInc,SolanaBeach,California),按照制造商的方案分離所培養(yǎng)的細(xì)菌中的質(zhì)粒DNA。[0221]通過PCR，使用TaKaRaPrimeStarTaq?DNA聚合酶(TAKARABIO公司，Shiga,Japan)、模板質(zhì)粒pCD3_327DNA以及引物對#5(SEQIDN0:33)(在5’端上帶有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)XhoI)和#6(SEQIDNO:34)來擴(kuò)增GFP基因DNA片段。然后，用乙醇使PCR產(chǎn)物沉淀并且用限制性內(nèi)切酶XhoI進(jìn)行消化，并且進(jìn)行凝膠純化。將經(jīng)過凝膠純化的DNA連接到經(jīng)過XhoI和BsaAI酶消化并且經(jīng)過凝膠純化的載體ρΕ5ΡΖ1質(zhì)粒DNA(SEQIDNO:31;圖3)的骨架的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)XhoI和BsaAI中，以便將ble基因置換為綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記基因，并且產(chǎn)生表達(dá)載體pE5PRsGFPl(SEQIDNO:32;圖4)，在所述表達(dá)載體pE5PRsGFPl中，GFP基因由0NC-T18的Λ5延長酶基因啟動子和SV40終止子側(cè)接。[0222]本發(fā)明因此尤其提供了載體，所述載體包含與異源性基因可操作地連接的破囊壺菌啟動子。在一些實(shí)施方案中，這類載體包括例如終止子、一個或多個復(fù)制起點(diǎn)以及一個或多個檢測標(biāo)記或選擇標(biāo)記。根據(jù)本文所提供的對于多種這類載體以及關(guān)于某些元件(如啟動子和/或終止子)的序列信息(所述序列信息足以允許使得具有這類序列的元件(例如啟動子、終止子)與其他元件連接)的描述，閱讀本公開內(nèi)容的本領(lǐng)域技術(shù)人員將完全能夠經(jīng)常根據(jù)已知技術(shù)例如通過將所提供的序列與任何多種已知的其他元件組合來制備并且使用廣泛多種不同的單獨(dú)的載體構(gòu)建體。[0223]3.產(chǎn)生重組質(zhì)粒載體p341PZ40T(SEQIDNO:35;圖5)。為了建構(gòu)含有來自印度斯坦鏈異壁菌的ble基因的載體p341PZ40T(SEQIDNO:35;圖5)，所述ble基因由0NC-T18的微管蛋白基因啟動子#341和SV40終止子側(cè)接，通過PCR，使用弓丨物對#66(SEQIDNO:36)和#67(SEQIDN0:37)以及實(shí)施例1中所述的克隆JZ2-17-14的模板質(zhì)粒DNA來擴(kuò)增微管蛋白基因啟動子#341的DNA片段。引物#66(SEQIDN0:36)的5’端序列與衍生自載體pT7Blue_3(Novagen,Gibbstown,NJ,USA)的中間載體的小區(qū)域互補(bǔ)，并且它的3’端與0NC-T18的微管蛋白基因啟動子#341的5’端的負(fù)鏈互補(bǔ)。引物#67(SEQIDN0:37)的5’端序列與ble基因的開放閱讀框的5’端序列的正鏈互補(bǔ)，并且它的3’端與0NC-T18的微管蛋白基因啟動子#341的3’端的正鏈互補(bǔ)。[0224]還通過PCR，使用引物對#68(SEQIDN0:38)和#71(SEQIDN0:39)以及載體pSV40/Zeo2(Invitrogen,California)的質(zhì)粒模板DNA來擴(kuò)增ble基因ORF的DNA片段(包括位于它的3’端上的SV40終止子在內(nèi))。引物#68(SEQIDN0:38)的5’端序列與0NC-T18的微管蛋白基因啟動子#341的3’端序列的負(fù)鏈互補(bǔ)，并且它的3’端序列與ble基因ORF的5’端的負(fù)鏈互補(bǔ)。引物#71(SEQIDN0:39)的5’端序列與衍生自載體pT7Blue_3的中間載體的小區(qū)域互補(bǔ)，并且它的3’端序列與SV40終止子的3’端序列的正鏈互補(bǔ)。[0225]在含有以下各項的50μL體積的反應(yīng)混合物中進(jìn)行PCR反應(yīng):2.5單位TaKaRaPrimeStarTaq?DNA聚合酶(TakaraBio公司，Shiga,Japan)、IXPrimerStarPCR緩沖液、dNTP混合物(各自0.40禮)、11^模板質(zhì)粒0嫩、0.201^引物對中的每一種引物。使用以下PCR條件:98°C，持續(xù)10秒，以及55°C，持續(xù)5秒，以及72°C，持續(xù)2分鐘，歷經(jīng)30個循環(huán)。在用于電泳的0.8%瓊脂糖凝膠中，在65伏下拆分微管蛋白基因啟動子#341和ble基因ORF的PCR產(chǎn)物，持續(xù)60分鐘。用刀片剪出具有準(zhǔn)確大小的條帶，并且用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen,Valencia,California),按照制造商的方案對它們的DNA進(jìn)行提取和純化。然后，以相似的摩爾比混合經(jīng)過凝膠純化的PCR產(chǎn)物，將其用作DNA模板用于延伸PCR以將微管蛋白基因啟動子#341、包括SV40終止子在內(nèi)的ble基因ORF融合于一起(Higuchi,Krummel以及Saiki,1988；Zhang,Wege以及Jeske,2001)。在50μL體積的反應(yīng)混合物中，使用TaKaRaPrimeStarTaq?DNA聚合酶(TakaraBio公司，Shiga,Japan)、約IOOng混合PCR產(chǎn)物的模板DNA，以及引物對#66(SEQIDNO:36)和#71(SEQIDNO:39)(各自0.20μΜ)進(jìn)行延伸PCR。使用以下PCR條件:98°C，持續(xù)10秒，50°C，持續(xù)5分鐘，以及720C，持續(xù)3分鐘，歷經(jīng)6個循環(huán)；以及98°C，持續(xù)10秒，50°C，持續(xù)5秒，以及72°C，持續(xù)3分半鐘，歷經(jīng)25個循環(huán)。使用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen,Valencia,California),按照制造商的方案對含有0NC-T18特異性ble基因表達(dá)盒的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化，并且使用延伸PCR將其克隆到衍生自載體pT7Blue_3(Novagen,Gibbstown,NJ,USA)的中間載體中(Higuchi,Krummel以及Saiki,1988;Zhang,Wege以及Jeske,2001)。在含有以下各項的50μL體積的PCR反應(yīng)混合物中進(jìn)行延伸PCR:2.5單位TaKaRaPrimeStarTaq?DNA聚合酶(TakaraBio公司，Shiga,Japan)、IXPrimerStarPCR緩沖液、dNTP混合物(各自0.40mM)、200ng經(jīng)過凝膠純化的含有0NC-T18特異性ble基因表達(dá)盒的PCR產(chǎn)物的DNA，以及600ng由限制性內(nèi)切酶HindIII線性化的中間載體的質(zhì)粒DNA。使用以下PCR條件:980C，持續(xù)10秒，60°C，持續(xù)5秒，以及72°C，持續(xù)5分半鐘，歷經(jīng)30個循環(huán)。之后，通過用DpnI進(jìn)行限制性內(nèi)切酶消化來破壞模板質(zhì)粒DNA，所述DpnI特異性地消化從一些細(xì)菌菌株中分離的甲基化質(zhì)粒DNA。在37°C下，在含有以下各項的150μL的反應(yīng)體積中進(jìn)行這種消化:50μL延伸PCR產(chǎn)物、30單位DpnI以及IX限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液4(NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA,USA),持續(xù)2小時。在消化后，通過在80°C下孵育20分鐘來使DpnI酶失活。然后，在消化混合物中添加無菌水達(dá)到350μL并且進(jìn)一步脫鹽，并且使用MiciOcon柱(ΥΜ-100,Millipore公司，Billerica,MA)將DNA濃縮到約IOOng/μL。使用IμL經(jīng)過脫鹽的DNA來使用設(shè)置在1890伏的電穿孔儀(EppendOrf5210)以及Imm間隙的電穿孔小槽(Eppendorf,NY,USA)對ToplO大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen,California,USA)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。預(yù)先地通過實(shí)施例1中所述的直接群落PCR，使用引物對#64(SEQIDN0:40)和#65(SEQIDN0:41)對陽性群落進(jìn)行篩選。使用正向引物和反向引物以及內(nèi)部引物#15(SEQIDN0:23)、#16(SEQIDN0:42)、#54(SEQIDN0:7)、#64(SEQIDN0:40)、#65(SEQIDN0:41)以及#85(SEQIDNO:43)對陽性克隆JZ2-53-10的插入物進(jìn)行完全測序。使用生物信息學(xué)軟件包Kodon(AppliedMaths)對所得序列進(jìn)行組裝和分析并且確定所克隆的插入物的完整性。所得ble基因表達(dá)載體被命名為p341PZST(SEQIDNO:35;圖5)，在所述載體中，ble基因由0NC-T18的微管蛋白基因啟動子#341和SV40終止子側(cè)接。[0226]本發(fā)明因此尤其提供了載體，所述載體包含與異源性基因可操作地連接的破囊壺菌啟動子。在一些實(shí)施方案中，這類載體包括例如終止子、一個或多個復(fù)制起點(diǎn)以及一個或多個檢測標(biāo)記或選擇標(biāo)記。根據(jù)本文所提供的對于多種這類載體以及關(guān)于某些元件(如啟動子和/或終止子)的序列信息(所述序列信息足以允許使得具有這類序列的元件(例如啟動子、終止子)與其他元件連接)的描述，閱讀本公開內(nèi)容的本領(lǐng)域技術(shù)人員將完全能夠經(jīng)常根據(jù)已知技術(shù)例如通過將所提供的序列與任何多種已知的其他元件組合來制備并且使用廣泛多種不同的單獨(dú)的載體構(gòu)建體。[0227]4.產(chǎn)生重組質(zhì)粒載體p341PZ347T(SEQIDN0:44;圖6)。為了建構(gòu)含有來自印度斯坦鏈異壁菌的ble基因的載體p341PZ347T(SEQIDNO:44;圖6)，所述ble基因由ONC-T18的微管蛋白基因啟動子#341和微管蛋白基因終止子#347側(cè)接，通過PCR，使用引物對#66(SEQIDN0:36)和#67(SEQIDN0:37)以及實(shí)施例1中所述的克隆JZ2-17-14的模板質(zhì)粒DNA來擴(kuò)增微管蛋白基因啟動子#341的DNA片段。[0228]還通過PCR，使用引物對#68(SEQIDNO:38)和#72(SEQIDNO:45)以及載體pSV40/Zeo2(Invitrogen,California)的質(zhì)粒模板DNA來擴(kuò)增ble基因ORF的DNA片段。引物#72(SEQIDN0:45)的5’端序列與微管蛋白基因終止子#347的5’端序列的正鏈互補(bǔ)。[0229]通過PCR，使用引物對#73(SEQIDNO:46)和#74(SEQIDNO:47)以及實(shí)施例1中所述的克隆JZ2-17-22的模板質(zhì)粒DNA擴(kuò)增微管蛋白基因終止子#347的DNA片段。引物#73(SEQIDN0:46)的5’端序列與ble基因的開放閱讀框的3’端序列的負(fù)鏈互補(bǔ)，并且它的3’端與0NC-T18的微管蛋白基因終止子#347的5’端的負(fù)鏈互補(bǔ)。引物#74(SEQIDN0:47)的5’端序列與衍生自載體pT7Blue-3的中間載體的小區(qū)域互補(bǔ)，并且它的3’端與破囊壺菌屬種微管蛋白基因終止子#347的3’端的正鏈互補(bǔ)。[0230]完全如實(shí)施例2第3部分中所述來進(jìn)行PCR。使用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen,Valencia,California),按照制造商的方案對PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化。以相似的摩爾比混合微管蛋白基因啟動子#341、ble基因ORF以及微管蛋白基因終止子#347的經(jīng)過凝膠純化的PCR產(chǎn)物，將其用作DNA模板用于延伸PCR以便將微管蛋白基因啟動子#341、ble基因ORF以及微管蛋白基因終止子#347融合于一起。使用引物對#66(SEQIDN0:36)和#74(SEQIDN0:47)(各自0.20μM)，如實(shí)施例2第3部分中所述進(jìn)行延伸PCR。使用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen,Valencia,California),按照制造商的方案對融合PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化，并且使用延伸PCR，如實(shí)施例2第3部分中所述將其克隆到衍生自載體pT7blue-3的中間載體中。通過電穿孔將延伸PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到ToplO大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen,California,USA)中。最初通過群落PCR方法,使用引物對#64(SEQIDN0:40)和#65(SEQIDNO:41)、引物對#16(SEQIDN0:42)和#59(SEQIDNO:12)以及引物對#54(SEQIDN0:7)和#15(SEQIDNO:23)對陽性群落進(jìn)行篩選。使用正向引物和反向引物以及內(nèi)部引物#15(SEQIDN0:23)、#16(SEQIDN0:42)、#54(SEQIDN0:7)、#59(SEQIDNO:12)、#63(SEQIDN0:4)、#64(SEQIDN0:40)、#65(SEQIDN0:41)以及#85(SEQIDN0:43)對陽性克隆JZ2-69-2a的插入物進(jìn)行完全測序。使用生物信息學(xué)軟件包Kodon(AppliedMaths)對所得序列進(jìn)行組裝和分析并且確定所克隆的插入物的完整性。所得ble基因表達(dá)載體被命名為p341PZ347T(SEQIDNO:44;圖6)，在所述載體中，ble基因由0NC-T18的微管蛋白基因啟動子#341和終止子#347側(cè)接。[0231]本發(fā)明因此尤其提供了載體，所述載體包含與異源性基因可操作地連接的破囊壺菌啟動子和終止子(例如，這樣使得啟動子位于所述基因的上游而終止子位于下游)。在一些實(shí)施方案中，這類載體包括例如一個或多個復(fù)制起點(diǎn)和一個或多個檢測標(biāo)記或選擇標(biāo)記。本發(fā)明因此尤其提供了載體，所述載體包含與異源性基因可操作地連接的破囊壺菌啟動子。在一些實(shí)施方案中，這類載體包括例如終止子、一個或多個復(fù)制起點(diǎn)以及一個或多個檢測標(biāo)記或選擇標(biāo)記。[0232]5.產(chǎn)生重組質(zhì)粒載體p341P713T(SEQIDNO:48;圖7)。為了建構(gòu)含有來自印度斯坦鏈異壁菌的ble基因的載體p341PZ713T(SEQIDNO:48;圖7)，所述ble基因由0NC-T18的微管蛋白基因啟動子#341和微管蛋白基因終止子#713側(cè)接，通過PCR，使用引物對#66(SEQIDN0:36)和#67(SEQIDN0:37)以及實(shí)施例1中所述的克隆JZ2-17-14的模板質(zhì)粒DNA來擴(kuò)增微管蛋白基因啟動子#341的DNA片段。[0233]通過PCR，使用引物對#68(SEQIDN0:38)和#75(SEQIDN0:49)以及載體pSV40/Zeo2(Invitrogen,California)的質(zhì)粒模板DNA來擴(kuò)增ble基因ORF的DNA片段。引物#75(SEQIDN0:49)的5’端序列與微管蛋白基因終止子#713的5’端序列的正鏈互補(bǔ)。[0234]通過PCR，使用引物對#76(SEQIDN0:50)和#77(SEQIDN0:51)以及實(shí)施例1中所述的克隆JZ2-22-9的模板質(zhì)粒DNA來擴(kuò)增微管蛋白基因終止子#713的DNA片段。引物#76(SEQIDNO:50)的5’端序列與ble基因ORF的3’端序列的負(fù)鏈互補(bǔ)，并且它的3’端與0NC-T18的微管蛋白基因終止子#713的5’端的負(fù)鏈互補(bǔ)。引物#77(SEQIDN0:51)的5’端序列與衍生自載體pT7blue-3的中間載體的小區(qū)域互補(bǔ)，并且它的3’端與0NC-T18的微管蛋白基因終止子#713的3’端的正鏈互補(bǔ)。[0235]對微管蛋白基因啟動子#341、ble基因ORF以及微管蛋白基因終止子#713的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化，將其以相似的摩爾比混合，并且用作DNA模板以使用引物對#66(SEQIDN0:36)和#77(SEQIDN0:51)進(jìn)行延伸PCR以便將微管蛋白基因啟動子#341、ble基因ORF以及微管蛋白基因終止子#713融合于一起。使用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen,Valencia,California)對融合的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化，并且使用第二輪延伸PCR將其克隆到衍生自載體pT7blue-3的由HindIII線性化的中間載體中。使用I微升(約IOOng)延伸PCR產(chǎn)物DNA以通過電穿孔對ToplO大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen,California,USA)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。最初通過群落PCR，使用引物對#64(SEQIDN0:40)和#65(SEQIDN0.41)、引物對#16(SEQIDN0:42)和#77(SEQIDN0:51)以及引物對#54(SEQIDN0:7)和#15(SEQIDNO:23)對陽性群落進(jìn)行篩選。使用正向引物和反向引物以及內(nèi)部引物#15(SEQIDN0:23)、#16(SEQIDN0:42)、#54(SEQIDN0:7)、#63(SEQIDN0:4)、#64(SEQIDN0:40)、#65(SEQIDN0:41)以及#85(SEQIDN0:43)對陽性克隆JZ2-69-2b的插入物進(jìn)行完全測序。使用生物信息學(xué)軟件包Kodon(AppliedMaths)對所得序列進(jìn)行組裝和分析并且確定所克隆的插入物的完整性。所得ble基因表達(dá)載體被命名為p341PZ713T(SEQIDNO:48;圖7)，在所述載體中，ble基因由0NC-T18的微管蛋白基因啟動子#341和終止子#713側(cè)接。[0236]本發(fā)明因此尤其提供了載體，所述載體包含與異源性基因可操作地連接的破囊壺菌啟動子和終止子(例如，這樣使得啟動子位于所述基因的上游而終止子位于下游)。在一些實(shí)施方案中，這類載體包括例如一個或多個復(fù)制起點(diǎn)和一個或多個檢測標(biāo)記或選擇標(biāo)記。本發(fā)明因此尤其提供了載體，所述載體包含與異源性基因可操作地連接的破囊壺菌啟動子。在一些實(shí)施方案中，這類載體包括例如終止子、一個或多個復(fù)制起點(diǎn)以及一個或多個檢測標(biāo)記或選擇標(biāo)記。根據(jù)本文所提供的對于多種這類載體以及關(guān)于某些元件(如啟動子和/或終止子)的序列信息(所述序列信息足以允許使得具有這類序列的元件(例如啟動子、終止子)與其他元件連接)的描述，閱讀本公開內(nèi)容的本領(lǐng)域技術(shù)人員將完全能夠經(jīng)常根據(jù)已知技術(shù)例如通過將所提供的序列與任何多種已知的其他元件組合來制備并且使用廣泛多種不同的單獨(dú)的載體構(gòu)建體。[0237]6.產(chǎn)生重組質(zhì)粒載體p701PZ40T(SEQIDN0:52;圖8)。為了建構(gòu)含有來自印度斯坦鏈異壁菌的ble基因的載體p701PZ40T(SEQIDNO:52;圖8)，所述ble基因由ONC-T18的微管蛋白基因啟動子#701和SV40終止子側(cè)接，通過PCR，使用引物對#87(SEQIDN0:53)和#88(SEQIDN0:54)以及實(shí)施例1中所述的克隆JZ2-17-10的模板質(zhì)粒DNA來擴(kuò)增微管蛋白基因啟動子#701的DNA片段。引物#87(SEQIDN0:48)的5’端序列與載體P341PZ40T的小區(qū)域互補(bǔ)，并且它的3’端與微管蛋白基因啟動子#701的5’端序列的負(fù)鏈互補(bǔ)。引物#88(SEQIDNO:54)的5’端序列與ble基因ORF的5’端序列的正鏈互補(bǔ)，并且它的3’端與微管蛋白基因終止子#701的3’端的正鏈相匹配。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化并且使用延伸PCR將其克隆到p341PZ40T載體中以便置換微管蛋白基因啟動子#341(Higuchi等人，1988；Zhang等人，2001)。在延伸PCR中使用TaKaRaPrimeStarTaq?DNA聚合酶、200ng經(jīng)過凝膠純化的PCR產(chǎn)物的DNA以及600ng載體p341PZ40T的由BglII線性化的質(zhì)粒DNA。使用I微升(約100ng)延伸PCR產(chǎn)物DNA以通過電穿孔對ToplO大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen,California,USA)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。最初通過群落PCR方法,使用引物對#52(SEQIDN0:51)和#53(SEQIDNO:52)對陽性群落進(jìn)行篩選。使用正向引物和反向引物以及內(nèi)部引物#52(SEQIDNO:1)和#53(SEQIDN0:2)、#15(SEQIDN0:23)、#16(SEQIDN0:42)、#63(SEQIDN0:4)、#64(SEQIDN0:40)、#65(SEQIDN0:41)以及#85(SEQIDN0:43)對陽性克隆的插入物進(jìn)行完全測序。使用生物信息學(xué)軟件包Kodon(AppliedMaths)對所得序列進(jìn)行組裝和分析并且確定所克隆的插入物的完整性。所得ble基因表達(dá)載體被命名為p701PZ40T(SEQIDNO:52;圖7)，在所述載體中，ble基因由ONC-T18的微管蛋白基因啟動子#701和SV40終止子側(cè)接。[0238]7.產(chǎn)生重組質(zhì)粒載體p341PRsGP40T(SEQIDN0:55;圖9)。為了建構(gòu)含有來自維多利亞多管發(fā)光水母(Aequoreavictoria)的GFP基因的載體p341PRsGFP40T(SEQIDN0:55;圖9)，所述GFP基因由0NC-T18的微管蛋白基因啟動子#341和SV40終止子側(cè)接，通過PCR，使用引物對#66(SEQIDNO:36)和#78(SEQIDNO:56)以及實(shí)施例1中所述的克隆JZ2-17-14的模板質(zhì)粒DNA來擴(kuò)增微管蛋白基因啟動子#341的DNA片段。引物#78(SEQIDN0:56)的5’端序列與GFP基因ORF的5’端序列的正鏈互補(bǔ)，并且它的3’端與ONC-T18的微管蛋白基因啟動子#341的3’端的正鏈相匹配。[0239]還通過PCR，使用引物對#79(SEQIDNO:57)和#80(SEQIDNO:58)以及載體PCD3-327的模板質(zhì)粒DNA來擴(kuò)增GFP基因ORF的DNA片段。引物#79(SEQIDNO:57)的5’端序列與0NC-T18的微管蛋白基因啟動子#341的3’端序列的正鏈互補(bǔ)，并且它的3’端序列與GFP基因ORF的5’端的負(fù)鏈相匹配。引物#80(SEQIDN0:58)的5’端序列與SV40終止子的5’端序列的正鏈互補(bǔ)，并且它的3’端與GFP基因ORF的3’端序列的正鏈相匹配。[0240]還通過PCR，使用引物對#81(SEQIDN0:59)和#71(SEQIDN0:39)以及載體pSV40/Zeo2(Invitrogen,California)的模板質(zhì)粒DNA來擴(kuò)增SV40終止子的DNA片段。引物#81(SEQIDN0:59)的5’端序列與GFP基因ORF的3’端序列的負(fù)鏈互補(bǔ)，并且它的3’端序列與SV40終止子的5’端相匹配。[0241]對以上三種PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化，將其以相似的摩爾比混合，并且用作DNA模板以使用引物對#66(SEQIDN0:36)和#71(SEQIDNO:39)進(jìn)行延伸PCR以便將微管蛋白基因啟動子#341、GFP基因ORF以及SV40終止子融合于一起(Higuchi,Krummel以及Saiki,1988)。對含有0NC-T18特異性GFP基因表達(dá)盒的延伸PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化，并且在第二輪延伸PCR中將其克隆到由限制性內(nèi)切酶HindIII線性化的載體p341PZ40T中。凈化第二輪PCR產(chǎn)物，脫鹽，并且通過電穿孔將其轉(zhuǎn)化到ToplO大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。使用直接群落PCR以及引物對#54(SEQIDN0:7)和#86(SEQIDNO:60)對陽性群落進(jìn)行篩選。使用正向引物和反向引物以及內(nèi)部引物#15(SEQIDN0:23)、#16(SEQIDN0:42)、#54(SEQIDN0:7)、#63(SEQIDN0:4)、#64(SEQIDN0:40)、#65(SEQIDN0:41)、#85(SEQIDN0:43)以及#86(SEQIDNO:60)對陽性克隆JZ2-53-20的插入物進(jìn)行完全測序。使用生物信息學(xué)軟件包Kodon(AppliedMaths)對所得序列進(jìn)行組裝和分析并且確定所克隆的插入物的完整性。所得GFP基因表達(dá)載體被命名為p341PRsGFP40T(SEQIDN0:55;圖8)，在所述載體中，GFP基因由0NC-T18的微管蛋白基因啟動子#341和SV40終止子側(cè)接。[0242]8.產(chǎn)生重組質(zhì)粒載體pD4DPZ118S(SEQIDN0:61；圖10)。為了建構(gòu)PD4DPZ18S(SEQIDNO:61;圖10)載體，使用限制性內(nèi)切酶SalI和SphI對載體pD4DPZl的質(zhì)粒DNA進(jìn)行消化以便將所述載體線性化，然后使用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen,Valencia,California)按照制造商的方案進(jìn)行凝膠純化。通過使用酶XhoI和SphI進(jìn)行限制性酶切消化以從克隆JZ2-3-1的質(zhì)粒DNA釋放通過PCR使用引物對18SrRNAf(SEQIDN0:27)和18SrRNAr(SEQIDNO:28)從0NC-T18的基因組DNA加以擴(kuò)增并且被克隆到載體pT7Blue-3中的18SrDNA片段(SEQIDNO:29)，然后進(jìn)行凝膠純化并且將其連接到pD4DPZl的線性化載體的限制性位點(diǎn)SalI和SphI中，以便產(chǎn)生帶有18S核糖體RNA基因的DNA片段的pD4DPZ18S(SEQIDN0:61;圖10)。[0243]9.產(chǎn)生重組質(zhì)粒載體p341PZ5pEx(SEQIDN0:62;圖11)。為了建構(gòu)構(gòu)建體p341PZ5pEx以在破囊壺菌屬原生生物微生物中過表達(dá)同源基因和異源基因、抑制同源基因的表達(dá)或敲除同源基因，通過PCR，使用引物L(fēng)inkerF(SEQIDNO:63)和LinkerR(SEQIDN0:64)對希奧辛抗性基因表達(dá)載體pd5EPPZl進(jìn)行修飾以便將希奧辛抗性基因ORF置換為多克隆位點(diǎn)，包括核酸內(nèi)切酶限制性位點(diǎn)(Nco1、Spe1、Kpn1、Mlu1、Nde1、Sph1、Nrul、BstBI以及BamHI)。在PCR之后，使用核酸內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶DpnI破壞模板質(zhì)粒DNA。使PCR產(chǎn)物沉淀并且使用核酸內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶MluI消化，進(jìn)行凝膠純化，使用T4DNA連接酶(Invitrogen,California)重新連接到一起,然后將其轉(zhuǎn)化到ToplO大腸桿菌細(xì)胞中。使用限制性酶切消化對陽性克隆進(jìn)行初步篩選。通過DNA測序確定陽性克隆的完整性并且將其命名為質(zhì)粒p5eEP40T(SEQIDNO:65)。使用核酸內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoRI對陽性克隆的質(zhì)粒DNA進(jìn)行消化，并且對骨架質(zhì)粒DNA進(jìn)行凝膠純化。還從經(jīng)過相同的核酸內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoRI消化的載體pl8S341PZ40t中分離希奧辛抗性基因表達(dá)盒并且進(jìn)行凝膠純化，在所述希奧辛抗性基因表達(dá)盒中，希奧辛基因ORF由微管蛋白基因啟動子#341P和SV40終止子側(cè)接。然后將希奧辛抗性基因表達(dá)盒連接到質(zhì)粒p5eEP40T的相應(yīng)核酸內(nèi)切酶限制性位點(diǎn)HindIII和EcoRI中，從而產(chǎn)生基因表達(dá)載體p341PZ5pEx。[0244]實(shí)施例3:鑒定可以被用于對破囊壺菌屬種0NC-T18進(jìn)行遺傳操作的抗生素[0245]本實(shí)施例描述了鑒定如下抗生素的實(shí)驗，針對所述抗生素的抗性可以被用作選擇標(biāo)記以對0NC-T18進(jìn)行遺傳操作。[0246]使破囊壺菌屬種0NC-T18在瓊脂板上生長(每升0NC-T18_GM020g瓊脂)。將一菌環(huán)量的0NC-T18接種物接種到50mL液體0NC-T18-GM0中，并且將培養(yǎng)物在振蕩孵育箱中在25°C下在250rpm下孵育36小時。將0.5毫升的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到1.5mL試管中并且以全速渦旋30秒以便拆散細(xì)胞團(tuán)，然后在50mL無菌水中稀釋。將一百微升所得溶液鋪到每個0NC-T18-GM0培養(yǎng)基培養(yǎng)板上。每個培養(yǎng)板含有不同濃度中的一種濃度的不同抗生素中的一種。在25°C下孵育培養(yǎng)板并且每天觀測群落的出現(xiàn)和生長。如可以在表1中看到，0NC-T18的生長對所測試的大部分抗生素不敏感。然而，希奧辛顯著地抑制0NC-T18在0NC-T18-GM0瓊脂板中的生長。[0247]因此，本實(shí)施例將希奧辛鑒定為可以被用于在遺傳操作實(shí)驗中進(jìn)行選擇的抗生素。[0248]表1:不同的抗生素對破囊壺菌屬種0NC-T18生長的影響【權(quán)利要求】1.一種分離的核酸分子，其包含破囊壺菌基因啟動子。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸分子，其中所述啟動子是微管蛋白啟動子。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸分子，其中所述啟動子的核苷酸序列與SEQIDN0:6至少80%—致。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸分子，其中所述啟動子的核苷酸序列與SEQIDN0:10至少80%—致。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸分子，其中所述啟動子是A5延伸酶啟動子。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的核酸分子,其中所述啟動子的核苷酸序列與SEQIDNO:19至少80%—致。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸分子，其中所述啟動子是A4去飽和酶啟動子。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的核酸分子，其中所述啟動子的核苷酸序列與SEQIDNO:24至少80%—致。9.一種分離的核酸分子，其包含破囊壺菌基因終止子。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的核酸分子，其中所述終止子是微管蛋白終止子。11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的核酸分子，其中所述終止子的核苷酸序列與SEQIDNO:14至少80%—致。12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的核酸分子,其中所述終止子的核苷酸序列與SEQIDNO:16至少80%—致。13.一種分離的核酸分子，其包含可操作地連接到破囊壺菌基因啟動子和破囊壺菌基因終止子的異源序列。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離的核酸分子，其中所述異源序列編碼多肽。15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離的核酸分子，其進(jìn)一步包含希奧辛抗性基因。16.一種宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求13到15中任一項所述的核酸分子。17.一種誘使微生物細(xì)胞突變的方法，所述方法包括:在培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述微生物細(xì)胞，所述培養(yǎng)基包含希奧辛并且希奧辛濃度能殺死60-80%的所述細(xì)胞；分離在培養(yǎng)中存活下來的細(xì)胞亞群，從而使微生物細(xì)胞突變。18.—種破囊壺菌細(xì)胞，其含有對編碼與破囊壺菌的PUFA生物合成途徑有關(guān)的酶多肽或酶多肽復(fù)合物的部分的一個或多個基因的一種或多種修飾。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的細(xì)胞，其中當(dāng)在可比條件下培養(yǎng)經(jīng)過修飾的細(xì)胞和參考細(xì)胞時，相較于參考破囊壺菌細(xì)胞，所述一種或多種修飾使所述經(jīng)過修飾的細(xì)胞產(chǎn)生的一種或多種PUFA增加。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的細(xì)胞，其中所述酶多肽或酶多肽復(fù)合物選自由以下組成的組:脂肪酸合酶(FAS)、A5延伸酶、A12延伸酶、A4去飽和酶以及聚酮PUFA合酶(PKS)。21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的細(xì)胞，其中所述一種或多種PUFA選自由以下組成的組:花生四烯酸(ARA)、二十二碳六烯酸(DHA)、二十二碳五烯酸(DPA)、二十碳五烯酸(EPA)、Y-亞麻酸(GLA)、亞油酸(LA)以及亞麻酸。22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的細(xì)胞，其中所述酶或酶復(fù)合物選自由以下組成的組:聚酮PUFA合酶(PKS)、A9去飽和酶、延伸酶以及《-3去飽和酶。23.一種使破囊壺菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法，包括以下步驟:(a)提供感受態(tài)破囊壺菌細(xì)胞；(b)將重組核酸遞送到所述感受態(tài)破囊壺菌細(xì)胞中，其中所述重組核酸包含選擇性標(biāo)記；以及(c)在含有選擇劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述感受態(tài)破囊壺菌細(xì)胞，所述選擇劑能在無所述選擇性標(biāo)記存在下減少細(xì)胞的生長。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中選擇性標(biāo)記是抗生素抗性基因。25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中選擇劑是抗生素。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中抗生素是希奧辛。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述希奧辛是以大于50μg/mL的濃度存在。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述希奧辛是以約100ug/mL的濃度存在。29.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述重組核酸進(jìn)一步包含不同于所述選擇性標(biāo)記的基因表達(dá)盒。30.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其進(jìn)一步包括:(d)分離含有所述選擇性標(biāo)記的感受態(tài)破囊壺菌細(xì)胞。31.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述遞送步驟包括:生物彈射式遞送涂有所述重組核酸的粒子。32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述粒子包含金粒子。33.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述培養(yǎng)基含有介于約10g/L與約40g/L之間的鹽(例如介于約15g/L與約35g/L之間的鹽,或介于約18g/L與約35g/L之間的鹽)。34.一種遺傳轉(zhuǎn)化感受態(tài)破囊壺菌細(xì)胞。35.一種已用重組核酸轉(zhuǎn)化的破囊壺菌細(xì)胞。36.一種培養(yǎng)破囊壺菌細(xì)胞的方法,所述方法包括:使包含破囊壺菌細(xì)胞的培養(yǎng)物在第一組條件下生長，在所述第一組條件下生物質(zhì)發(fā)生增加，將所述第一組培養(yǎng)條件改變成第二組條件，在所述第二組條件下脂質(zhì)生產(chǎn)率發(fā)生增加，其中所述改變包含以下中的一者或多者:(a)使氧濃度從第一氧濃度降低到第二氧濃度；(b)使C:N比率從第一C:N比率增加到第二C:N比率；(c)使溫度從第一溫度降低到第二溫度；以及其組合。37.一種提供PUFA的方法，所述方法包括:提供相較于參考破囊壺菌細(xì)胞經(jīng)過修飾的破囊壺菌細(xì)胞，其中所述經(jīng)過修飾的細(xì)胞含有一種或多種遺傳修飾，當(dāng)在可比條件下培養(yǎng)所述經(jīng)過修飾的細(xì)胞和所述參考細(xì)胞時，相較于所述參考細(xì)胞，所述遺傳修飾使所述經(jīng)過修飾的細(xì)胞產(chǎn)生的一種或多種PUFA增加；以及在足以實(shí)現(xiàn)所述一種或多種PUFA的產(chǎn)生的條件下和時間內(nèi)培養(yǎng)所述經(jīng)過修飾的破囊壺菌細(xì)胞。38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述提供步驟包括提供含有至少一個工程化破囊壺菌啟動子的破囊壺菌細(xì)胞。39.根據(jù)權(quán)利要求37或權(quán)利要求38所述的方法，其中所述提供步驟包括提供含有至少一個工程化破囊壺菌終止子的破囊壺菌細(xì)胞。40.根據(jù)權(quán)利要求37到39中任一項所述的方法，其中所述提供步驟包括提供相對于參考破囊壺菌細(xì)胞經(jīng)過修飾的破囊壺菌細(xì)胞，其中所述經(jīng)過修飾的破囊壺菌細(xì)胞含有至少一種已表達(dá)的異源多肽。41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述至少一種異源蛋白是由可操作地與工程化破囊壺菌基因啟動子、工程化破囊壺菌終止子或兩者連接在一起的基因表達(dá)。42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述至少一種異源多肽包含至少一種異源PUFA生物合成多肽。43.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述遺傳修飾包含至少一個核苷酸突變，其使PUFA生物合成多肽的表達(dá)或活性增加。44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中表達(dá)或活性發(fā)生增加的所述PUFA生物合成多肽是內(nèi)源PUFA生物合成多肽。45.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中表達(dá)或活性發(fā)生增加的所述PUFA生物合成多肽是異源PUFA生物合成多肽。46.一種工程化破囊壺菌細(xì)胞，其表達(dá)異源PUFA生物合成多肽。47.一種工程化破囊壺菌細(xì)胞，當(dāng)在可比條件下培養(yǎng)所述工程化細(xì)胞和非工程化細(xì)胞時，所述工程化細(xì)胞產(chǎn)生的至少一種PUFA的含量比非工程化破囊壺菌細(xì)胞高至少36%。48.一種組合物，其包含:至少一種PUFA;以及以下的一種或多種組分:含有抗生素抗性基因的破囊壺菌細(xì)胞或者是含有抗生素抗性基因的破囊壺菌細(xì)胞的子代。49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的組合物，其中所述抗生素抗性基因是希奧辛抗性基因。50.一種組合物，其包含:至少一種PUFA;以及以下的一種或多種組分:(a)已在培養(yǎng)基中或在培養(yǎng)基上培養(yǎng)的破囊壺菌細(xì)胞，所述培養(yǎng)基包含希奧辛并且希奧辛濃度能殺死60-80%的所述細(xì)胞，或(b)已在培養(yǎng)基中或在培養(yǎng)基上培養(yǎng)的破囊壺菌細(xì)胞的子代，所述培養(yǎng)基包含希奧辛并且希奧辛濃度能殺死60-80%的所述細(xì)胞?！疚臋n編號】C12N1/00GK103649313SQ201280018055【公開日】2014年3月19日申請日期:2012年3月7日優(yōu)先權(quán)日:2011年3月7日【發(fā)明者】S.張,R.阿門塔申請人:Dsm營養(yǎng)產(chǎn)品股份公司