角膜上皮分化取向性iPS細(xì)胞的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的主要目的在于提供一種分化誘導(dǎo)出角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞的方法，其用于得到易于獲得、并且在產(chǎn)生血管化的可能性的觀點(diǎn)等中安全性更高的角膜上皮細(xì)胞片。一種多能干細(xì)胞向角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法，其中，包括在基質(zhì)細(xì)胞或來源于羊膜的因子的存在下培養(yǎng)多能干細(xì)胞的工序。
【專利說明】角膜上皮分化取向性iPS細(xì)胞
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明主要涉及多能干細(xì)胞向角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法、角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞的制造方法、來源于該角膜上皮干細(xì)胞的角膜上皮細(xì)胞片、以及在向角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞的分化誘導(dǎo)中使用的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)。
【背景技術(shù)】
[0002]保持良好的視覺功能對(duì)于QOL的維持而言極其重要。因此，對(duì)于視覺功能受損的眼病、特別是對(duì)于難治性眼病而言，開發(fā)根本性治療的社會(huì)需求極高。作為難治性眼病的一組，已知作為角膜上皮干細(xì)胞缺損癥的史-約(Stevens-Johnson)綜合征、眼類天皰瘡、堿腐蝕等疾病。在角膜上皮干細(xì)胞缺損癥中，由于由外傷、自身免疫等造成的慢性炎癥反應(yīng)，存在于眼的角膜緣的角膜上皮干細(xì)胞陷入不可逆的功能不全、或者消失，從而呈現(xiàn)角膜混濁的癥狀。結(jié)果，眼的結(jié)膜上皮侵入到角膜中央部，由此角膜失去本來具有的透明性，導(dǎo)致顯著的視力下降。作為用于恢復(fù)角膜上皮干細(xì)胞缺損癥等嚴(yán)重的角膜疾病患者的視力的措施，一直以來施行角膜移植術(shù)。特別地，對(duì)于雙眼發(fā)病的雙眼性患者而言，現(xiàn)狀是由于不存在來源于患者本人的正常角膜，因此只能施行異體角膜移植術(shù)。但是，在進(jìn)行異體角膜移植術(shù)時(shí)，存在能夠供給所需角膜的供體不足的問題、會(huì)對(duì)來源于供體的角膜產(chǎn)生排斥反應(yīng)的問題，因此，希望開發(fā)使用了自體細(xì)胞源的治療法。
[0003]對(duì)于單眼性角膜疾病患者而言，在正常眼的角膜周邊(角膜緣)存在角膜上皮干細(xì)胞，因此施行在取該細(xì)胞后，由該細(xì)胞再生角膜片并移植的方法(非專利文獻(xiàn)I)。由自身的角膜上皮干細(xì)胞再生的角膜片為來源于自身的細(xì)胞，因此具有不產(chǎn)生排斥反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)。
[0004]另一方面，對(duì)于雙眼性角膜疾病患者而言，由于不存在角膜上皮干細(xì)胞，因此無法進(jìn)行上述措施。需要說明的是，多數(shù)角膜上皮干細(xì)胞缺損癥的患者是雙眼性的。作為使用雙眼性角膜疾病患者的自體細(xì)胞的再生治療方法，已開發(fā)出使用患者自身的口腔粘膜上皮的干細(xì)胞的自體口腔粘膜上皮細(xì)胞片移植法(非專利文獻(xiàn)2)。自體口腔粘膜上皮細(xì)胞片移植法已經(jīng)進(jìn)行臨床應(yīng)用，并留下了良好的臨床成績。具體而言，在15個(gè)病例中，在一年的觀察期中的透明治愈率為93% (14/15眼)，視力改善率為80% (12/15眼)。即，已報(bào)告多數(shù)眼病患者通過自體口腔粘膜上皮細(xì)胞片移植法恢復(fù)視力。
[0005]另一方面，口腔粘膜為血管豐富的組織，因此認(rèn)為，對(duì)于應(yīng)用了自體口腔粘膜上皮細(xì)胞片移植法的患者而言，長期來看，有可能在移植的口腔粘膜上皮細(xì)胞片中發(fā)生血管化，進(jìn)而有可能發(fā)生血管化而口腔粘膜上皮細(xì)胞片的透明性下降。因此，理想的是由來源于患者的自體細(xì)胞制作角膜上皮本身。但是現(xiàn)狀是，由來源于患者的自體細(xì)胞分化誘導(dǎo)出用于制作角膜上皮、特別是角膜上皮片的角膜上皮細(xì)胞、角膜上皮干細(xì)胞的方法仍然未知。
[0006]用于分化誘導(dǎo)出特定細(xì)胞的方法，僅對(duì)于一部分特定細(xì)胞已知。例如作為將胚胎干細(xì)胞分化誘導(dǎo)為神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)嵴的細(xì)胞或神經(jīng)管等的方法，已知SDIA法(專利文獻(xiàn)2和非專利文獻(xiàn)3) oSDIA法的特征在于在基質(zhì)細(xì)胞的存在下對(duì)胚胎干細(xì)胞進(jìn)行，其被認(rèn)為是用于在胚胎干細(xì)胞中抑制向表皮細(xì)胞等的分化、而進(jìn)行向神經(jīng)細(xì)胞等的分化誘導(dǎo)的方法。可見，利用SDIA法分化誘導(dǎo)出的是神經(jīng)細(xì)胞等，與在胚胎學(xué)上認(rèn)為與表皮細(xì)胞近似的角膜上皮細(xì)胞、角膜上皮干細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法不同。
[0007]近年來，由山中等開發(fā)的人工誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)能夠由可以容易地獲取的患者自身的成纖維細(xì)胞等體細(xì)胞建成(專利文獻(xiàn)I)。已知iPS細(xì)胞具有與胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)匹敵的多潛能性。將iPS細(xì)胞用于細(xì)胞源的再生醫(yī)療，被期待是能夠同時(shí)解決供體不足問題和排斥反應(yīng)問題的方法。另外，無需在ES細(xì)胞的情況下為必須的將早期胚胎破壞的工序，因此也不存在與早期胚胎的破壞有關(guān)的倫理問題。但是，現(xiàn)狀是至今仍然沒有由人ES細(xì)胞、人iPS細(xì)胞分化誘導(dǎo)出角膜上皮的報(bào)告。
[0008]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0009]專利文獻(xiàn)
[0010]專利文獻(xiàn)1:國際公開第2007/069666號(hào)
[0011]專利文獻(xiàn)2:國際公開第2001/088100號(hào)
[0012]專利文獻(xiàn)3:日本特開2004-261533號(hào)
[0013]專利文獻(xiàn)4:日本特開2005-333904號(hào)`
[0014]非專利文獻(xiàn)
[0015]非專利文獻(xiàn)I:Nishida K.等，Transplantation2004, 77:379-385.[0016]非專利文獻(xiàn)2 =Nishida K.等，N Engl J Med2004，351:1187-1195.[0017]非專利文獻(xiàn)3:Kawasaki H.等，Neuron2000, 28:31-40.
【發(fā)明內(nèi)容】

[0018]發(fā)明解決的課題
[0019]本發(fā)明的目的在于提供一種分化誘導(dǎo)出和制造角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞的方法，其用于得到與以往的自體口腔粘膜上皮細(xì)胞片同等地易于獲得、并且在產(chǎn)生血管化的可能性的觀點(diǎn)等中安全性更高的角膜上皮細(xì)胞片。另外，本發(fā)明的目的還在于提供來源于上述角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞的角膜上皮細(xì)胞片、用于向角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞分化誘導(dǎo)的細(xì)胞材料等。
[0020]解決課題的手段
[0021]本發(fā)明人為了解決上述課題進(jìn)行了廣泛深入的研究，結(jié)果驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過在基質(zhì)細(xì)胞的存在下培養(yǎng)多能干細(xì)胞，能夠?qū)⒄T導(dǎo)多能干細(xì)胞分化誘導(dǎo)為角膜上皮細(xì)胞和角膜上皮干細(xì)胞。另外還發(fā)現(xiàn)，通過使用由來源于眼表上皮的細(xì)胞制備的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)，可更有效地實(shí)現(xiàn)向角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞的分化誘導(dǎo)。通過基于所述發(fā)現(xiàn)反復(fù)進(jìn)行研究，完成了本發(fā)明。
[0022]即，本發(fā)明包含下述方式的發(fā)明。
[0023]項(xiàng)1.一種多能干細(xì)胞向角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法，其中，包括在基質(zhì)細(xì)胞或來源于羊膜的因子的存在下培養(yǎng)多能干細(xì)胞的工序。
[0024]項(xiàng)2.根據(jù)項(xiàng)I所述的分化誘導(dǎo)方法，其中，所述培養(yǎng)在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行。
[0025]項(xiàng)3.根據(jù)項(xiàng)2所述的分化誘導(dǎo)方法，其中，所述無血清培養(yǎng)基至少在從培養(yǎng)開始至培養(yǎng)開始后I~2周之間實(shí)質(zhì)上不含有BMP4。[0026]項(xiàng)4.根據(jù)項(xiàng)I~3中任一項(xiàng)所述的分化誘導(dǎo)方法，其中，所述多能干細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)。
[0027]項(xiàng)5.根據(jù)項(xiàng)4所述的方法，其中，所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞為通過在來源于眼表上皮的細(xì)胞中導(dǎo)入能夠向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的重編程因子而得到的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。
[0028]項(xiàng)6.—種包括下述工序的角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞的制造方法:
[0029](I)在基質(zhì)細(xì)胞或來源于羊膜的因子的存在下培養(yǎng)多能干細(xì)胞的工序、和
[0030](2)從所述培養(yǎng)的細(xì)胞中選擇角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞的工序。
[0031]項(xiàng)7.根據(jù)項(xiàng)6所述的制造方法，其中，所述選擇角膜上皮干細(xì)胞的工序?yàn)檫x擇具有自我增殖能力且表達(dá)角膜上皮干細(xì)胞特異性標(biāo)記的細(xì)胞的工序。
[0032]項(xiàng)8.—種角膜上皮細(xì)胞片，其來源于利用項(xiàng)6或7所述的制造方法得到的角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞。
[0033]項(xiàng)9.一種誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，其通過對(duì)來源于眼表上皮的細(xì)胞導(dǎo)入能夠向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的重編程因子而得到。
[0034]項(xiàng)10.根據(jù)項(xiàng)9所述的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，其用于向角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞的分化誘導(dǎo)。
[0035]項(xiàng)11.一種用于向角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞分化誘導(dǎo)的細(xì)胞材料，其含有權(quán)利要求9或10所述的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。
[0036]發(fā)明效果
[0037]根據(jù)本發(fā)明，首次在世界范圍提供使用患者自身的細(xì)胞，向角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法、以及制造角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明得到的角膜上皮干細(xì)胞、以及來源于其的角膜上皮細(xì)胞片與口腔粘膜上皮細(xì)胞片同等程度地易于獲得。另外，由患者自身的細(xì)胞分化誘導(dǎo)出的角膜上皮細(xì)胞、角膜上皮干細(xì)胞、和來源于其的角膜上皮細(xì)胞片，在向該患者自身移植(自體移植)時(shí)，由于為患者自身的細(xì)胞，因此不具有排斥反應(yīng)。并且，根據(jù)本發(fā)明，可提供不具有口腔粘膜上皮細(xì)胞片的情況等的血管化問題的、安全性比現(xiàn)有技術(shù)更高的角膜上皮細(xì)胞片。
[0038]另外，根據(jù)本發(fā)明，可提供適于在向角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞的分化誘導(dǎo)中使用的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。
[0039]另外，利用本發(fā)明而人工制作的角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞，能夠成為以往只能通過由患者獲得而得到的角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞的供給源，因此能夠作為眼角膜領(lǐng)域的再生醫(yī)療中的有助于進(jìn)一步的技術(shù)提高的有用的工具使用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]圖1(a)示出由眼表上皮建成的人iPS細(xì)胞株B31(上段左)、B34(上段中)、B41(上段右)、C51(下段中)和D43(下段左)的相位差顯微鏡圖像。作為對(duì)照，示出人iPS細(xì)胞株253G1 (下段右)的相位差顯微鏡圖像。(b)示出B41細(xì)胞株的ES細(xì)胞標(biāo)記(ESMarker)染色圖像。對(duì)于E_Cadherin、Nanog、0ct3/4和Sox2分別示出相位差顯微鏡圖像(左)、核染色(中)、免疫染色圖像(右)。
[0041]圖2(a)示出B34、B41、C51和D43細(xì)胞株的核型分析的結(jié)果。(b)示出由B41細(xì)胞株形成的畸胎瘤(上段)、以及在畸胎瘤中形成的外胚葉(中段左:色素上皮和表皮、中段右:神經(jīng))、中胚葉(下段左)、和內(nèi)胚葉(下段右)。
[0042]圖3示出分化誘導(dǎo)條件下的B41株、201B7株和253G1株中的、利用RT-PCR測定pax6和K12(角蛋白12)的基因表達(dá)量得到的結(jié)果。最下段為在B41株的誘導(dǎo)初期(2周)添加BMP4時(shí)的pax6和K12的基因表達(dá)分析結(jié)果。橫軸以周示出分化誘導(dǎo)后的經(jīng)過期間，縱軸示出相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)基因GAPDH的表達(dá)量的相對(duì)比。
[0043]圖4a示出分化誘導(dǎo)條件下的B41株中的、pax6(右上和右下)以及K12(左上和左下)的表達(dá)。
[0044]圖4b利用免疫染色示出該B41株中的K14和K12的表達(dá):相位差顯微鏡圖(左上)、K12 (右上)、K14 (左下)、K14+K12 (右下)。
[0045]圖4c利用免疫染色示出分化誘導(dǎo)后的253G1株中的p63、K14、和K12的表達(dá):相位差顯微鏡圖(上段左)、p63(上段右)、K14(中段左)、K12(中段右)、p63+K12+K14(下段左)。
[0046]圖4d示出對(duì)在添加有BMP4的條件下進(jìn)行分化誘導(dǎo)后的B41株考查pax6、K12、和K14的表達(dá)的結(jié)果:相位差顯微鏡圖(左上)、K12 (右上)、pax6 (左下)、K14 (右下)。
[0047]圖4e示出對(duì)在添加有BMP4的條件下進(jìn)行分化誘導(dǎo)后的253G1株考查pax6、K12、和K14的表達(dá)的結(jié)果:相位差顯微鏡圖(左上)、K12 (右上)、pax6 (左下)、K14 (右下)。
[0048]圖5(a)示出由B41株分化誘導(dǎo)的角膜上皮干細(xì)胞(或前體細(xì)胞)的位相差圖像(相位(phase))、以及pax6和K14(角蛋白14)的免疫染色圖像:相位差顯微鏡圖(左上)、?&妨(右上)、1(14(左下)、1(14和？&妨(右下)。(b)示出該細(xì)胞的位相差圖像(相位)、以及p63+K14(角蛋白14)的免疫染色圖像:相位差顯微鏡圖(左上)、pax6(右上)、K14(左下)、K14+pax6 (右下)。
【具體實(shí)施方式】
[0049]本發(fā)明的目的主要在于提供向多能干細(xì)胞的角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法、制造方法、角膜上皮細(xì)胞片、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和細(xì)胞材料。以下，以分化誘導(dǎo)方法、制造方法、角膜上皮細(xì)胞片、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、細(xì)胞材料的順序進(jìn)行說明。
[0050]1.分化誘導(dǎo)方法
[0051]本發(fā)明的、多能干細(xì)胞向角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法，為包括在基質(zhì)細(xì)胞的存在下或來源于羊膜的因子的存在下培養(yǎng)多能干細(xì)胞的工序的分化誘導(dǎo)方法。以下詳述本發(fā)明的分化誘導(dǎo)方法，該說明對(duì)于后述的角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞的制造方法也共通。
[0052]在本發(fā)明中，多能干細(xì)胞向角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)。本發(fā)明的分化誘導(dǎo)方法包含:向角膜上皮干細(xì)胞和角膜上皮細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法、角膜上皮干細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法、和角膜上皮細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法。優(yōu)選為向角膜上皮干細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法，但并不限定于此。
[0053]在此，角膜是存在于包括人在內(nèi)的多數(shù)哺乳類的眼球的、在眼球壁的前面形成與外界接觸的部分的外層的膜，是透明的具有皿狀形態(tài)的膜。解剖學(xué)上已知，角膜從外側(cè)起主要由角膜上皮、角膜實(shí)質(zhì)和角膜內(nèi)皮構(gòu)成。
[0054]一般認(rèn)為， 角膜上皮在發(fā)育中來源于外胚葉，由表皮進(jìn)行分化。已知正常的角膜上皮具有再生能力，角膜上皮的再生通過角膜上皮干細(xì)胞反復(fù)進(jìn)行自我增殖和分化來實(shí)現(xiàn)。即，角膜上皮干細(xì)胞是具備子細(xì)胞有與自身相同的特性的自我增殖能力、和最終分化為角膜上皮細(xì)胞的分化能力的細(xì)胞。一般認(rèn)為，角膜上皮干細(xì)胞經(jīng)過角膜上皮前體細(xì)胞和過渡放大細(xì)胞(transient amplifying cell) (TA細(xì)胞)分化為角膜上皮細(xì)胞。在正常的角膜中，角膜上皮干細(xì)胞存在于位于角膜上皮與結(jié)膜的邊界的角膜緣、特別是角膜緣上皮基底部。另一方面，在發(fā)生史-約綜合征、眼類天皰瘡、堿腐蝕等角膜上皮干細(xì)胞缺損癥的角膜中，角膜上皮干細(xì)胞陷入不可逆的功能不全、或者消失。
[0055] 在本發(fā)明中向角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，只要為具有分化多能性、并且具有增殖能力的細(xì)胞，則能夠使用所有多能干細(xì)胞。上述分化多能性包含向包括外胚葉性的細(xì)胞優(yōu)選表皮系的細(xì)胞、特別優(yōu)選角膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞進(jìn)行分化的能力。
[0056]根據(jù)分化誘導(dǎo)出的角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞的使用目的，上述多能干細(xì)胞可以適當(dāng)選擇來源于存在角膜上皮干細(xì)胞的哺乳類(例如人、小鼠、猴子、牛、狗、貓、兔子、豬、山羊等)的多能干細(xì)胞。在出于人眼病的治療、人眼病的治療領(lǐng)域中的開發(fā)工具等目的而使用的情況下，上述多能干細(xì)胞優(yōu)選為來源于人的多能干細(xì)胞。來源于人的多能干細(xì)胞可以為來源于所有年齡段的人(嬰兒、幼兒、少年、青年、成年、壯年、老年)的多能干細(xì)胞。另外，與人的性別無關(guān)。在出于人眼病的治療目的使用分化誘導(dǎo)出的角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞的情況下，優(yōu)選來源于從眼病患者獲取的細(xì)胞。需要說明的是，在使用從眼病患者獲取的細(xì)胞的情況下，期望進(jìn)行所謂的知情同意。
[0057]作為上述多能干細(xì)胞的優(yōu)選的具體例，可以例示胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，但不限定于此。
[0058]上述胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)是指來源于早期胚胎的內(nèi)部細(xì)胞塊、且具有實(shí)質(zhì)上能夠向所有細(xì)胞分化的分化多能性和自我增殖能力的干細(xì)胞。作為上述胚胎干細(xì)胞，能夠使用來源于現(xiàn)在已建成的、或者今后要新建成的所有胚胎干細(xì)胞的株系的細(xì)胞。需要說明的是，一般公知，例如可以通過從母胎中摘出早期胚胎(例如從受精卵至囊胚之間的早期胚胎)，并在飼養(yǎng)細(xì)胞例如小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF細(xì)胞、Mouse Embryonic Fibroblast)的存在下培養(yǎng)早期胚胎的內(nèi)部細(xì)胞塊來制作胚胎干細(xì)胞，但本發(fā)明中使用的胚胎干細(xì)胞的制作方法并不限定于此。
[0059]上述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)是指通過在體細(xì)胞中導(dǎo)入能夠向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的重編程因子而具備分化多能性和自我增殖能力的、來源于體細(xì)胞的細(xì)胞(例如參考專利文獻(xiàn)I)。
[0060]作為制造上述誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的方法，可以廣泛使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法和今后會(huì)確立的方法。即，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可以通過在體細(xì)胞中導(dǎo)入能夠向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的重編程因子來制造。或者作為在本發(fā)明中使用的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，可以使用已經(jīng)建成的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞株。
[0061]上述能夠?qū)Ⅲw細(xì)胞誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞的重編程因子，只要是能夠?qū)Ⅲw細(xì)胞初始化的因子，則沒有特別限制，可以廣泛使用現(xiàn)在公知的因子和今后被開發(fā)的因子。
[0062]作為上述能夠?qū)Ⅲw細(xì)胞誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞的重編程因子的具體例，可以列舉:0CT家族、SOX家族和KLF家族的組合；0CT家族、SOX家族、KLF家族和MYC家族的組合；0CT家族、SOX家族、NANOG和LIN28的組合等，但并不限定于此。
[0063]作為上述OCT家族，可以列舉選自0CT3/4、OCTlA和0CT6中的至少一個(gè)，但不限定于此。作為上述SOX家族，可以列舉選自S0X1、S0X2、S0X3、S0X7、S0X15、S0X17和S0X18中的至少一個(gè)，優(yōu)選列舉SOXl和/或S0X2，但不限定于此。作為上述KLF4，可以列舉選自KLFl、KLF2、KLF4和KLF5中的至少一個(gè)，優(yōu)選列舉選自KLF2、KLF4和KLF5中的至少一個(gè)，但不限定于此。上述MYC家族可以列舉選自C-MYC、N-MYC、和L-MYC中的至少一個(gè)，但不限定于此。
[0064]作為上述能夠?qū)Ⅲw細(xì)胞誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞的重編程因子，可以優(yōu)選使用廣泛已知的a)人中的0CT3/4、S0X2和KLF4這三個(gè)因子的組合、或者所述三個(gè)因子再加上C-MYC的四個(gè)因子的組合、以及0CT3/4、S0X2、NANOG和LIN28這四個(gè)因子的組合；b)小鼠中的0ct3/4、Sox2和Klf4這三個(gè)因子的組合、或者所述三個(gè)因子再加上c-Myc的四個(gè)因子的組合；等。需要說明的是，0CT3/4、S0X2、KLF4 和 C-MYC(0ct3/4、Sox2、Klf4 和 c_Myc)的組合也已知為“山中因子”。
[0065]上述能夠?qū)Ⅲw細(xì)胞誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞的重編程因子，以能夠?qū)Ⅲw細(xì)胞誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞為限，可以為基因(核酸分子)或基因產(chǎn)物(蛋白質(zhì))中的任意一種，但從提高誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的建成效率的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選為基因(核酸分子)。需要說明的是，關(guān)于上述具體的誘導(dǎo)因子，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，堿基序列(基因)和氨基酸序列(蛋白質(zhì))均是公知的。該堿基序列和氨基酸序列被例如美國國立生物工程信息中心(National Centerfor Biotechnology Information、NCBI)公布的數(shù)據(jù)庫公開。
[0066]上述能夠?qū)Ⅲw細(xì)胞誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞的重編程因子，可以來源于與被導(dǎo)入重編程因子的體細(xì)胞同種的生物，也可以來源于與被導(dǎo)入重編程因子的體細(xì)胞異種的生物。從提高誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的建成效率的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選來源于同種的生物。
[0067]本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)選擇將上述能夠?qū)Ⅲw細(xì)胞誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞的重編程因子導(dǎo)入被初始化的體細(xì)胞的方法。例如，在上述重編程因子為基因的情況下，可以利用在動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染中通常使用的方法進(jìn)行上述重編程因子向體細(xì)胞中的導(dǎo)入。具體而言，作為將上述重編程因子導(dǎo)入體細(xì)胞的方法，可以例示:使用載體的方法、磷酸鈣法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、電穿孔法、顯微注射法等。這些方法中，從導(dǎo)入效率的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選使用載體的方法。在使用載體將上述重編程因子導(dǎo)入體細(xì)胞的情況下，可以使用病毒載體、非病毒載體、人工病毒等作為載體，從安全性的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選使用慢病毒、腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒等病毒載體。需要說明的是，在使用載體的情況下，上述重編程因子可以是各基因各自整合到不同的載體，也可以是兩種以上的基因整合到一個(gè)載體。
[0068]上述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞所來源的體細(xì)胞，只要為可誘導(dǎo)出誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的體細(xì)胞，則可以使用所有體細(xì)胞。可誘導(dǎo)出誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的體細(xì)胞，在正常和腫瘤性中優(yōu)選正常的體細(xì)胞。
[0069]為了得到上述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞而使用的細(xì)胞，沒有特別限制，包括迄今為止已確認(rèn)可制造iPS細(xì)胞的任意細(xì)胞(例如成纖維細(xì)胞)和今后會(huì)報(bào)告的任意細(xì)胞。從向角膜上皮細(xì)胞的分化誘導(dǎo)效率特別高的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選使用對(duì)來源于眼表上皮的細(xì)胞導(dǎo)入能夠向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的重編程因子而得到的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。來源于眼表上皮的細(xì)胞例如可以由從角膜緣上皮、角膜上皮或結(jié)膜上皮獲取的約2mm2左右的組織片得到，但不限定于此。來源于眼表上皮的細(xì)胞可以為由如上所述獲取的組織片得到的細(xì)胞、或者將該細(xì)胞適當(dāng)培養(yǎng)而得到的細(xì)胞。
[0070]上述導(dǎo)入有能夠向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的重編程因子的體細(xì)胞，通過進(jìn)行培養(yǎng)可被誘導(dǎo)為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從廣范圍適當(dāng)選擇所使用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時(shí)間。
[0071]在要制造誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用公知的方法確認(rèn)已制造出誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。例如，出于簡便的目的，可以利用表達(dá)出SSEA3、SSEA4、E-Cadherin、Nanog、0ct3/4、Sox2等胚胎干細(xì)胞標(biāo)記來確認(rèn)已制造出誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。
[0072]在上述培養(yǎng)工序中，在基質(zhì)細(xì)胞的存在下或在來源于羊膜的因子的存在下培養(yǎng)多能干細(xì)胞。
[0073]在基質(zhì)細(xì)胞的存在下進(jìn)行上述培養(yǎng)的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)選擇其具體的手段。例如在基質(zhì)細(xì)胞存在下的培養(yǎng)，可以為使用基質(zhì)細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞的方法。具體而言，在基質(zhì)細(xì)胞存在下的培養(yǎng)，可以利用在基質(zhì)細(xì)胞于培養(yǎng)容器中達(dá)到鋪滿(confluent)狀態(tài)的狀況下培養(yǎng)多能干細(xì)胞的手段來進(jìn)行。在此，“鋪滿狀態(tài)”是指本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的、細(xì)胞增殖到大致在前表面將培養(yǎng)容器表面覆蓋的細(xì)胞數(shù)的狀態(tài)。在使用基質(zhì)細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下，可以根據(jù)需要利用絲裂霉素C(MMC)處理、X射線照射等手段對(duì)基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞分裂的失活處理 。
[0074]在能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的目的的范圍內(nèi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)選擇上述基質(zhì)細(xì)胞。在此，基質(zhì)細(xì)胞是指一般包圍組織(例如上皮和內(nèi)皮)或器官的支持細(xì)胞。作為上述基質(zhì)細(xì)胞，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，可以優(yōu)選利用通過作為SDIA法(專利文獻(xiàn)2和非專利文獻(xiàn)3)的公知方法而使用的基質(zhì)細(xì)胞，但并不限定于此。
[0075]作為該基質(zhì)細(xì)胞的具體例，可以例示來源于小鼠顱蓋的MC3T3-G2/PA6細(xì)胞、來源于M-CSF缺陷小鼠顱蓋的0P9細(xì)胞、和來源于小鼠胎兒的NIH/3T3細(xì)胞，但并不限定于此。上述基質(zhì)細(xì)胞可以使用一種或者組合使用兩種以上。上述基質(zhì)細(xì)胞優(yōu)選為來源于小鼠顱蓋的MC3T3-G2/PA6細(xì)胞。需要說明的是，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，上述細(xì)胞均為公知，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地得到。
[0076]在此，SDIA法是指將胚胎干細(xì)胞分化誘導(dǎo)為外胚葉細(xì)胞(神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)嵴的細(xì)胞或神經(jīng)管)的方法，是由專利文獻(xiàn)2和非專利文獻(xiàn)3公開的方法。SDIA法的特征在于在基質(zhì)細(xì)胞的存在下對(duì)胚胎干細(xì)胞進(jìn)行，其被認(rèn)為是用于在胚胎干細(xì)胞中抑制向表皮細(xì)胞等的分化、而進(jìn)行向神經(jīng)細(xì)胞等的分化誘導(dǎo)的方法。
[0077]上述在來源于羊膜的因子的存在下的培養(yǎng)，可以按照專利文獻(xiàn)4中公開的方法進(jìn)行。上述在來源于羊膜的因子的存在下的培養(yǎng)，可以通過在羊膜或來源于羊膜的加工物的存在下進(jìn)行培養(yǎng)來實(shí)現(xiàn)，但并不限定于此。上述羊膜或來源于羊膜的加工物與要進(jìn)行共培養(yǎng)的多能干細(xì)胞所來源的生物，可以為相同的生物來源，也為不同的生物來源。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于公知的方法適當(dāng)獲得上述羊膜或來源于羊膜的加工物。
[0078]上述培養(yǎng)可以在基質(zhì)細(xì)胞的存在下或者在來源于羊膜的因子的存在下進(jìn)行?！按嬖谙碌呐囵B(yǎng)”是指只要基質(zhì)細(xì)胞或來源于羊膜的因子與多能干細(xì)胞在能夠進(jìn)行物質(zhì)往來的狀態(tài)下進(jìn)行培養(yǎng)，則沒有特別制限。即，在基質(zhì)細(xì)胞的存在下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，可以為基質(zhì)細(xì)胞與多能干細(xì)胞能夠接觸的狀態(tài)、或者基質(zhì)細(xì)胞與多能干細(xì)胞無法接觸的狀態(tài)中的任意一種情況。
[0079]上述培養(yǎng)只要在基質(zhì)細(xì)胞的存在下或者在來源于羊膜的因子的存在下進(jìn)行，則多能干細(xì)胞的狀態(tài)沒有特別限定，可以為凝集狀態(tài)(團(tuán)塊)或非凝集狀態(tài)中的任意一種。在多能干細(xì)胞為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞的情況下，優(yōu)選在凝集狀態(tài)下進(jìn)行誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的培養(yǎng)，但并不限定于此。
[0080]在此，“凝集狀態(tài)”并不是指利用酶處理等使要被培養(yǎng)的多能干細(xì)胞完全形成分散狀態(tài)，而是在存在細(xì)胞之間的粘附的狀態(tài)(團(tuán)塊狀態(tài))下開始培養(yǎng)，并在存在細(xì)胞之間的粘附的狀態(tài)下繼續(xù)培養(yǎng)。使細(xì)胞形成凝集狀態(tài)的手段對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是公知的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從該公知的手段中進(jìn)行適當(dāng)選擇。一般而言，多能干細(xì)胞的團(tuán)塊狀態(tài)包含約50~10000左右的多能干細(xì)胞，但并不限定于此。需要說明的是，“凝集狀態(tài)”中包含“胚狀體(embryoid bodies) ”。
[0081]在上述培養(yǎng)中，多能干細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞或來源于羊膜的因子的豐度比沒有特別限定，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)設(shè)定。在基質(zhì)細(xì)胞的存在下進(jìn)行上述培養(yǎng)的情況下，相對(duì)于達(dá)到鋪滿的3.Scm2的基質(zhì)細(xì)胞的層，多能干細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞的豐度比可以優(yōu)選設(shè)定為約I~150團(tuán)塊左右、更優(yōu)選約15~40團(tuán)塊左右。需要說明的是，3.Scm2是指通常作為培養(yǎng)容器使用的12孔培養(yǎng)容器(十二孔板(12well plate))的每一個(gè)孔的面積。
[0082]上述培養(yǎng)在實(shí)現(xiàn)向角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞的分化誘導(dǎo)的期間進(jìn)行。培養(yǎng)時(shí)間可根據(jù)所使用的多能干細(xì)胞的種類等而不同，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)設(shè)定，沒有特別限定。例如，可以培養(yǎng)至在后述的角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞中觀察到特異性標(biāo)記基因的表達(dá)為止。從實(shí)現(xiàn)充分的分化誘導(dǎo)的觀點(diǎn)出發(fā)，例如優(yōu)選進(jìn)行約6周以上、優(yōu)選約8周以上、特別優(yōu)選約12周以上的培養(yǎng)。例如可以將培養(yǎng)時(shí)間設(shè)定為約6~20周左右、優(yōu)選約8~16周左右、更優(yōu)選約8~14周左右。
[0083]在本發(fā)明的培養(yǎng) 工序中，優(yōu)選使用無血清培養(yǎng)基。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從公知的培養(yǎng)基和今后會(huì)新開發(fā)的培養(yǎng)基中、能夠培養(yǎng)哺乳類的細(xì)胞且實(shí)質(zhì)上不含有血清的培養(yǎng)基中適當(dāng)選擇無血清培養(yǎng)基。可以例示例如格拉斯哥極限必需培養(yǎng)基(Glasgow MinimumEssential Medium, G-MEM)、達(dá)爾伯克(氏)改良伊格爾(氏)培養(yǎng)基(Dulbecco ' sModified Eagle Medium,D-MEM)等作為上述無血清培養(yǎng)基,但并不限定于此。上述無血清培養(yǎng)基中可以含有約5~20%左右、優(yōu)選約10%左右的敲除血清替代物(Knockout SerumReplacement, KSR、商品名、Invitogen公司);約0.5~5mM左右、優(yōu)選約2mM左右的L-谷氨酰胺；約0.5~5%左右、優(yōu)選約I %左右的丙酮酸(丙酮酸鈉，Gibco公司)、約0.5~5%左右、優(yōu)選約I %左右的非必需氨基酸溶液(非必需氨基酸、Gibco公司)；約0~1%左右、優(yōu)選約0.1%左右的2-巰基乙醇(2-mercaptoethanol)等添加物。
[0084]根據(jù)常規(guī)方法，上述無血清培養(yǎng)基優(yōu)選定期進(jìn)行更換。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，無血清培養(yǎng)基的更換可以利用公知的方法進(jìn)行。更換無血清培養(yǎng)基時(shí)，更換前后所使用的無血清培養(yǎng)基可以使用組成相同的培養(yǎng)基，也可以使用組成不同的培養(yǎng)基。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)設(shè)定更換與更換之間的時(shí)間、和進(jìn)行更換的頻率。培養(yǎng)基更換優(yōu)選以約I~3天左右一次、更優(yōu)選以約2天左右一次的頻率進(jìn)行。在使用基質(zhì)細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下，通常不更換飼養(yǎng)細(xì)胞，但并不限定于此。
[0085]上述無血清培養(yǎng)基優(yōu)選至少從培養(yǎng)開始至培養(yǎng)開始后約第I~2周左右(例如約第二周左右)之間實(shí)質(zhì)上不含有BMP4。BMP4 (Bone Morphorogenic Protein4 (骨形態(tài)發(fā)生蛋白4))是公知的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明之前，一般認(rèn)為BMP4具有抑制外胚葉性細(xì)胞的神經(jīng)分化、向上皮細(xì)胞(表皮、角膜上皮等)分化誘導(dǎo)的作用。上述無血清培養(yǎng)基特別優(yōu)選至少在從培養(yǎng)工序開始至I~2周左右實(shí)質(zhì)上不含BMP4。在此，“實(shí)質(zhì)上不含BMP4”是指培養(yǎng)基中的BMP4含量為低于不影響本發(fā)明的分化誘導(dǎo)方法的效果的程度的量，只要為該含量，則例如為低于0.5nM、更優(yōu)選低于0.1nM、進(jìn)一步優(yōu)選低于0.05nM，從其他觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選為不使其有意含有。簡便起見，可以使用以不含BMP4的培養(yǎng)基的形式販賣的市售的培養(yǎng)基試劑、以及將其多種組合而得到的培養(yǎng)基試劑作為實(shí)質(zhì)上不含BMP4的無血清培養(yǎng)基。
[0086]上述無血清培養(yǎng)基可以為實(shí)質(zhì)上不含有視黃酸的培養(yǎng)基，但并不限定于此。
[0087]上述培養(yǎng)可以使用例如上述無血清培養(yǎng)基、以本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來進(jìn)行。作為優(yōu)選的進(jìn)行培養(yǎng)的方法，可以例示在約37°C左右和約5%左右的二氧化碳濃度的條件下進(jìn)行培養(yǎng)的方法，但并不限定于此。在上述條件下的培養(yǎng)可以使用例如公知的0)2培養(yǎng)箱來進(jìn)行。
[0088]這樣，可以實(shí)現(xiàn)向角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法。需要說明的是，由本發(fā)明分化誘導(dǎo)出的角膜上皮干細(xì)胞也可以包含角膜上皮前體細(xì)胞。
[0089]可以利用對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言公知的手段來驗(yàn)證分化誘導(dǎo)出了角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞。作為用于進(jìn)行上述驗(yàn)證的具體方法，可以列舉例如:定期(例如每兩周)地獲取上述培養(yǎng)中的細(xì)胞的一部分，利用定量RT-PCR法檢測標(biāo)記基因(例如眼組織特異性表達(dá)的pax6基因、分化后的角膜上皮特異性表達(dá)的K12(角蛋白12)基因)等)的表達(dá)。此時(shí)，可以將能夠確認(rèn)到標(biāo)記基因的表達(dá)作為分化誘導(dǎo)出了角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞的指標(biāo)。
[0090]2.制誥方法
[0091]本發(fā)明的角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞的制造方法包括下述工序:
[0092](I)培養(yǎng)多能干細(xì)胞的工序、和
[0093](2)從所述培養(yǎng)的細(xì)胞中選擇角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞的工序。
[0094]以下詳述本發(fā)明的制造方法。
[0095]工序(I)的培養(yǎng)多能干細(xì)胞的工序，為上述“1.分化誘導(dǎo)方法”欄中記載的培養(yǎng)多能干細(xì)胞的工序。即在基質(zhì)細(xì)胞的存在下或在來源于羊膜的因子的存在下培養(yǎng)多能性肝細(xì)胞的工序。關(guān)于工序(I)，例如，對(duì)于培養(yǎng)的多能干細(xì)胞，可以繼續(xù)至角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞中表達(dá)特異性標(biāo)記為止。
[0096]接著，在工序⑵中，從工序⑴中培養(yǎng)的細(xì)胞(細(xì)胞團(tuán))中選擇角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)設(shè)定選擇角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞的手段。
[0097]例如選擇角膜上皮干細(xì)胞時(shí)，作為選擇手段的一種方式，可以列舉從工序⑴中培養(yǎng)的細(xì)胞(細(xì)胞團(tuán))中選擇自我增殖能力和/或角膜上皮干細(xì)胞特異性標(biāo)記的表達(dá)作為指標(biāo)。更具體而言，可以通過進(jìn)行如下工序來選擇角膜上皮干細(xì)胞:選擇具有自我增殖能力的細(xì)胞的工序、和選擇表達(dá)角膜上皮干細(xì)胞特異性標(biāo)記的細(xì)胞的工序，但并不限定于此。需要說明的是，選擇具有自我增殖能力的細(xì)胞的工序、和選擇表達(dá)角膜上皮干細(xì)胞特異性標(biāo)記的細(xì)胞的工序所進(jìn)行的順序沒有限定，先進(jìn)行任意一道工序都能夠選擇出角膜上皮干細(xì)胞。
[0098] 對(duì)于細(xì)胞具有增殖能力的評(píng)價(jià)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過公知的方法進(jìn)行。例如，可以通過將細(xì)胞接種至培養(yǎng)體系中進(jìn)行繼代培養(yǎng)使細(xì)胞增殖來確認(rèn)，但不限定于此?？梢酝ㄟ^在繼代培養(yǎng)中形成菌落來確認(rèn)細(xì)胞增殖。可以優(yōu)選用于確認(rèn)形成菌落的繼代培養(yǎng)在與飼養(yǎng)細(xì)胞(例如NIH/3T3細(xì)胞等)的共培養(yǎng)體系下進(jìn)行、或者在用于上皮干細(xì)胞的培養(yǎng)基中進(jìn)行，但并不限定于此。
[0099]用于進(jìn)行上述繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基，只要為能夠培養(yǎng)角膜上皮干細(xì)胞的培養(yǎng)基(例如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的keratinocyte-conditioned medium(角質(zhì)形成細(xì)胞條件培養(yǎng)基)(KCM培養(yǎng)基)、keratinocyte serum-free medium(角質(zhì)形成細(xì)胞無血清培養(yǎng)基)(KSFM培養(yǎng)基、能夠從Invitrogen公司等購入)、CnT_20培養(yǎng)基(CELLnTEC公司)、CnT_50培養(yǎng)基(CELLnTEC公司)等)，則沒有特別限定。
[0100]在上述繼代培養(yǎng)中，例如在使用十二孔板的情況下，再接種密度優(yōu)選設(shè)定為2000~16000細(xì)胞/孔左右。
[0101]上述增殖能力優(yōu)選為自我復(fù)制能力。對(duì)于細(xì)胞具有自我增殖能力的的評(píng)價(jià),例如能夠以細(xì)胞具有增殖能力、并且增殖后的細(xì)胞所具有的特性不隨繼代培養(yǎng)而改變?yōu)橹笜?biāo)，但并不限定于此。對(duì)于增殖后的細(xì)胞所具有的特性，可以優(yōu)選利用后述角膜上皮干細(xì)胞標(biāo)記來確認(rèn)，但并不限定于此。
[0102]對(duì)于細(xì)胞表達(dá)角膜上皮干細(xì)胞特異性標(biāo)記的評(píng)價(jià)，可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行。作為角膜上皮干細(xì)胞標(biāo)記，可以例示例如:作為復(fù)層上皮干細(xì)胞(和前體細(xì)胞)的特異性標(biāo)記的K14(角蛋白14)蛋白和/或p63蛋白和/或N-cadherin蛋白等,但并不限定于此。另外，也可以檢測眼組織特異性標(biāo)記(例如pax6蛋白)和/或角膜上皮特異性分化標(biāo)記(例如K12(角蛋白12)蛋白)。另外，也可以在檢測出角膜上皮特異性分化標(biāo)記(K12)后，檢測在角膜上皮干細(xì)胞中特異性表達(dá)的細(xì)胞表面標(biāo)記(例如Integrin alpha6、N-cadherin 等)。
[0103]已表達(dá)出角膜上皮干細(xì)胞標(biāo)記的具體的檢測方法是公知的，例如優(yōu)選基于免疫細(xì)胞化學(xué)的檢測。更詳細(xì)而言，可以例示:基于使用抗體染色法的顯微鏡觀察的檢測、利用細(xì)胞分選儀(流式細(xì)胞儀)的細(xì)胞表面標(biāo)記的檢測等。或者可以在要進(jìn)行分化誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞中導(dǎo)入上述角膜上皮干細(xì)胞標(biāo)記的報(bào)告基因(例如將編碼角膜上皮干細(xì)胞標(biāo)記的基因的啟動(dòng)子區(qū)域、和綠色熒光蛋白(GFP)等熒光蛋白連接而得到的報(bào)告基因)，并在分化誘導(dǎo)后檢測報(bào)告基因的表達(dá)。
[0104]另外，在選擇角膜上皮細(xì)胞的情況下，可以列舉選擇表達(dá)角膜上皮細(xì)胞標(biāo)記的細(xì)胞的工序。作為角膜上皮細(xì)胞標(biāo)記，可以列舉:眼組織特異性標(biāo)記(例如pax6蛋白)、角膜上皮特異性分化標(biāo)記(例如K12(角蛋白12)蛋白質(zhì))等，但并不限定于此。作為檢測角膜上皮細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)的手段，可以例示例如:在要進(jìn)行分化誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞中導(dǎo)入上述角膜上皮細(xì)胞標(biāo)記的報(bào)告基因(例如將編碼角膜上皮干細(xì)胞標(biāo)記的基因的啟動(dòng)子區(qū)域、和綠色熒光蛋白(GFP)等熒光蛋白連接而得到的報(bào)告基因)，并在分化誘導(dǎo)后檢測報(bào)告基因的表達(dá)。
[0105]在選擇角膜上皮干細(xì)胞的情況下，作為上述工序(2)的具體方式，可以例示下述(a)和(b)的方式，但并不限定于此:[0106](a)在工序(I)的分化誘導(dǎo)后，確認(rèn)表達(dá)角膜上皮干細(xì)胞標(biāo)記的細(xì)胞，然后利用酶處理等回收細(xì)胞，并將其再接種到能夠選擇性培養(yǎng)角膜上皮干細(xì)胞的體系(例如以NIH/3T3細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞的共培養(yǎng)體系等)中，以菌落形成為指標(biāo)選擇增殖的細(xì)胞，由此來純化角膜上皮干細(xì)胞。
[0107](b)在工序(I)的分化誘導(dǎo)后，確認(rèn)表達(dá)角膜上皮特異性標(biāo)記的細(xì)胞，然后使用細(xì)胞分選儀等選擇表達(dá)在角膜上皮干細(xì)胞中特異性表達(dá)的細(xì)胞表面標(biāo)記的細(xì)胞，由此來純化角膜上皮干細(xì)胞。[0108]這樣，可制造出角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞。需要說明的是，利用本發(fā)明的制造方法得到的角膜上皮干細(xì)胞也包括角膜上皮前體細(xì)胞。
[0109]3.角膜上皮細(xì)胞片
[0110]本發(fā)明的角膜上皮細(xì)胞片是來源于通過上述“2.制造方法”欄中記載的方法得到的角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞的角膜上皮細(xì)胞片。上述角膜上皮細(xì)胞片可以是角膜上皮細(xì)胞片的復(fù)層化片。
[0111]對(duì)于角膜上皮細(xì)胞片的制造手段，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從公知的方法和今后開發(fā)的方法中進(jìn)行適當(dāng)選擇?？梢允褂美鐚＠墨I(xiàn)3或4、或非專利文獻(xiàn)I或2等中公開的下述方法。
[0112]作為角膜上皮細(xì)胞片的制造手段的具體例，沒有特別限定，可以列舉包括下述工序的手段:在飼養(yǎng)細(xì)胞的存在下、在溫度感應(yīng)性培養(yǎng)皿或載體上培養(yǎng)上述角膜上皮干細(xì)胞的工序，和回收通過所述工序得到的細(xì)胞片的工序。
[0113]作為上述培養(yǎng)工序中使用的飼養(yǎng)細(xì)胞，可以使用例如經(jīng)絲裂霉素C(MMC)處理后的NIH/3T3細(xì)胞，但并不限定于此。
[0114]上述培養(yǎng)工序中使用的溫度感應(yīng)性培養(yǎng)皿，只要是能夠通過改變溫度(優(yōu)選降低)將細(xì)胞片剝離的培養(yǎng)皿，則沒有特別限定。具體而言，可以例示包覆有聚(N-異丙基丙烯酰胺)等溫度感應(yīng)性高分子的培養(yǎng)皿。簡便起見，也可以使用市售的溫度感應(yīng)性培養(yǎng)皿。
[0115]作為上述載體，可以例示:膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白(優(yōu)選膠原蛋白)等細(xì)胞外基質(zhì)，但并不限定于此。
[0116]本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)設(shè)定進(jìn)行上述培養(yǎng)工序的條件?？梢栽诶缂s37°C左右和約5%左右的二氧化碳濃度的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，但并不限定于此。培養(yǎng)時(shí)間可以設(shè)定為約2周左右。
[0117]關(guān)于上述回收，在溫度感應(yīng)性培養(yǎng)皿上進(jìn)行培養(yǎng)的情況下，可以通過降低溫度、將形成的細(xì)胞片從溫度感應(yīng)性培養(yǎng)皿上剝離來進(jìn)行。在載體上進(jìn)行培養(yǎng)的情況下，可以將形成的片與載體一起回收。
[0118]上述角膜上皮細(xì)胞片可以優(yōu)選用于史-約綜合征、眼類天皰瘡、堿腐蝕等難治性眼病的治療等。
[0119]4.可有效地分化為角膜上皮干細(xì)胞和角膜上皮細(xì)胞的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞
[0120]通過對(duì)來源于眼表上皮的細(xì)胞導(dǎo)入能夠向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的重編程因子而得到的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，與在成纖維細(xì)胞等中導(dǎo)入重編程因子而得到的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞相比，可以更快、更高效地分化誘導(dǎo)為角膜上皮細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞，因此是有益的。
[0121]上述來源于眼表上皮的細(xì)胞可使用前述“1.分化誘導(dǎo)方法”欄中記載的來源于眼表上皮的細(xì)胞。具體而言，可以例示例如:可以由從角膜緣上皮、角膜上皮或結(jié)膜上皮獲取的約2mm2左右的組織片得到的、來源于眼表上皮的細(xì)胞，但不限定于此。來源于眼表上皮的細(xì)胞可以為由如上所述獲取的組織片得到的細(xì)胞、或者將該細(xì)胞適當(dāng)培養(yǎng)而得到的細(xì)胞。
[0122]上述能夠向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的重編程因子，可以優(yōu)選使用前述“1.分化誘導(dǎo)方法”欄中記載的能夠向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的重編程因子。另外，將該能夠向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的重編程因子導(dǎo)入來源于眼表上皮的細(xì)胞的手段，也可以優(yōu)選使用前述“1.分化誘導(dǎo)方法”欄中記載的導(dǎo)入細(xì)胞的手段。
[0123]如后述的實(shí)施例所示，本發(fā)明的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞具有分化誘導(dǎo)為角膜上皮干細(xì)胞的高取向性。在此，作為“分化誘導(dǎo)為角膜上皮干細(xì)胞的高取向性”，可以使用例如作為角膜上皮特異性標(biāo)記的角蛋白12(K12)的表達(dá)取向性。在分化誘導(dǎo)為角膜上皮干細(xì)胞的高取向性為K12的表達(dá)取向性的情況下，在分化誘導(dǎo)開始后的早期階段就高表達(dá)K12。因此，本發(fā)明的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可以優(yōu)選在向角膜上皮干細(xì)胞的分化誘導(dǎo)中使用。
[0124]5.細(xì)朐材料
[0125]如前所述，本發(fā)明的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞具有分化誘導(dǎo)為角膜上皮干細(xì)胞的高取向性。因此，本發(fā)明也提供包括前述“4.誘導(dǎo)多能干細(xì)胞”欄中記載的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在內(nèi)的、用于向角膜上皮干細(xì)胞分化誘導(dǎo)的細(xì)胞材料。
[0126]上述細(xì)胞材料可以優(yōu)選在向角膜上皮干細(xì)胞的分化誘導(dǎo)及其制造中使用。另外，所得到的角膜上皮細(xì)胞可以進(jìn)一步在角膜上皮細(xì)胞片的制造中使用、作為藥物開發(fā)工具使用等，但不限定于此。
[0127]實(shí)施例
[0128]以下基于實(shí)施例`等詳細(xì)說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于此。
[0129](I)來源于眼表皮細(xì)胞的iPS細(xì)胞的制造
[0130]從用于研究的輸入鞏角膜片上摘除來源于人的角膜內(nèi)皮細(xì)胞、周邊的結(jié)合組織等，在此基礎(chǔ)上，通過分散處理僅分離出眼表的角結(jié)膜上皮層。通過胰蛋白酶處理將所得到的上皮細(xì)胞制成單細(xì)胞，并在NIH/3T3細(xì)胞的培養(yǎng)上清與新鮮KCM培養(yǎng)基的1:1混合培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0131]接著，在增殖后的來源于眼表的上皮細(xì)胞中感染分別搭載有人0ct3/4、SoX2、Klf4和c-Myc(山中四因子)的慢病毒載體。在感染后的2~4天后，將細(xì)胞再接種至iPS細(xì)胞的培養(yǎng)體系(iPS培養(yǎng)基中的MEF飼養(yǎng)細(xì)胞上)，培養(yǎng)約3~6周。確認(rèn)外因性山中四因子的消失，利用SSE4抗體選出陽性菌落，建成iPS細(xì)胞株(B31、B34、B41、C51和D43 ;共5株)。建成的iPS細(xì)胞株和已有的iPS細(xì)胞株253G1的相位差顯微鏡圖像如圖1 (a)所示。本次建成的任意一種人iPS細(xì)胞株均與公知的來源于成纖維細(xì)胞的人iPS細(xì)胞株同樣地在MEF飼養(yǎng)細(xì)胞上形成多能干細(xì)胞所特有的鵝卵石狀的菌落。
[0132]對(duì)于所制造的iPS細(xì)胞株之一的B41株，利用免疫染色驗(yàn)證作為ES細(xì)胞標(biāo)記的E-cadherin(H-108兔子多克隆抗體、SantaCruz公司、50倍稀釋)、Nanog(R&D公司、山羊多克隆抗體、100倍稀釋)、0ct3/4 (R&D公司、山羊多克隆抗體、100倍稀釋)和Sox2 (245610、小鼠單克隆抗體、R&D公司、100倍稀釋)的表達(dá)。二抗使用與各一抗的物種相對(duì)應(yīng)的Alexa568抗體(Invitrogen公司、200倍稀釋)。最后利用Hoechest33342將核染色。免疫染色圖像如圖1(b)所示?？梢源_認(rèn)，所制造的iPS細(xì)胞表達(dá)了四種ES細(xì)胞標(biāo)記即E-cadherin、Nanog、Oct3/4和Sox2中的任意一種。即，可以認(rèn)為，正常地進(jìn)行了向iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)。
[0133]然后，按照常規(guī)方法驗(yàn)證所制造的四株iPS細(xì)胞(B34、B41、C51和D43)的核型。核型分析的結(jié)果如圖2(a)所示?？梢源_認(rèn)，所驗(yàn)證的四株人iPS細(xì)胞中的每一株，在其50個(gè)細(xì)胞中的50個(gè)細(xì)胞的核型均為46，XX[20]，具有正常的人的核型。
[0134]然后，利用常規(guī)方法對(duì)所得到的iPS細(xì)胞進(jìn)行畸胎瘤形成試驗(yàn)。結(jié)果如圖2(b)所示。在畸胎瘤中，可以確認(rèn)外胚葉(視網(wǎng)膜色素上皮、表皮和神經(jīng))、中胚葉和內(nèi)胚葉。
[0135](II)向角膜上皮細(xì)胞和角膜上皮干細(xì)胞的分化誘導(dǎo)
[0136]以MC3T3-G2/PA6細(xì)胞(PA6細(xì)胞)為飼養(yǎng)細(xì)胞，對(duì)上述⑴中制造的iPS細(xì)胞(B41株)、和公知的來源于人成纖維細(xì)胞的253G1株和201B7株進(jìn)行培養(yǎng)。
[0137](I)使用下述培養(yǎng)基并在MEF (mouse embryonic fibroblast (小鼠胚胎成纖維細(xì)胞))飼養(yǎng)細(xì)胞上分別對(duì)上述三種人iPS細(xì)胞進(jìn)行繼代培養(yǎng)。
[0138]用于人iPS的培養(yǎng)基
[0139]
【權(quán)利要求】
1.一種多能干細(xì)胞向角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法，其中，包括在基質(zhì)細(xì)胞或來源于羊膜的因子的存在下培養(yǎng)多能干細(xì)胞的工序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分化誘導(dǎo)方法，其中，所述培養(yǎng)在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分化誘導(dǎo)方法，其中，所述無血清培養(yǎng)基至少在從培養(yǎng)開始至培養(yǎng)開始后I~2周之間實(shí)質(zhì)上不含BMP4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的分化誘導(dǎo)方法，其中，所述多能干細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分化誘導(dǎo)方法，其中，所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞為通過在來源于眼表上皮的細(xì)胞中導(dǎo)入能夠向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的重編程因子而得到的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。
6.一種包括下述工序的角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞的制造方法: (1)在基質(zhì)細(xì)胞或來源于羊膜的因子的存在下培養(yǎng)多能干細(xì)胞的工序、和 (2)從所述培養(yǎng)的細(xì)胞中選擇角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞的工序。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制造方法，其中，所述選擇角膜上皮干細(xì)胞的工序?yàn)檫x擇具有增殖能力且表達(dá)角膜上皮干細(xì)胞特異性標(biāo)記的細(xì)胞的工序。
8.一種角膜上皮細(xì)胞片，其來源于利用權(quán)利要求6或7所述的制造方法而得到的角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞。
9.一種誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，其通過對(duì)來源于眼表上皮的細(xì)胞導(dǎo)入能夠向多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的重編程因子而得到。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，其用于向角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞的分化誘導(dǎo)。
11.一種用于向角膜上皮干細(xì)胞和/或角膜上皮細(xì)胞分化誘導(dǎo)的細(xì)胞材料，其含有權(quán)利要求9或10所述的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N5/0735GK103492555SQ201280019381
【公開日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2012年4月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月20日
【發(fā)明者】林龍平, 西田幸二 申請(qǐng)人:國立大學(xué)法人大阪大學(xué)