從植物汁制備異麥芽酮糖的方法
【專利摘要】本發(fā)明的主題是制備異麥芽酮糖的方法，所述方法包括下述方法步驟：A)使固定化的酶復(fù)合物與含有蔗糖的溶液接觸，所述酶復(fù)合物能夠催化蔗糖生成異麥芽酮糖的轉(zhuǎn)化；B)將至少部分蔗糖異構(gòu)化為異麥芽酮糖；C)分離出所述酶復(fù)合物，和任選地D)進(jìn)一步純化所述異麥芽酮糖，其特征在于，作為含有蔗糖的溶液使用選自濃汁或稀汁的至少一種，優(yōu)選濃汁。
【專利說明】從植物汁制備異麥芽酮糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及使含有蔗糖的植物汁異構(gòu)化生成異麥芽酮糖的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]借助于異麥芽酮糖合酶(鹿糖葡萄糖基變位酶(Succharose Glucosylmutasen),EC 5.4.99.11)將水溶液中的蔗糖酶促異構(gòu)化生成異麥芽酮糖是一種已知的方法。
[0003]例如，DE1049800描述了一種借助于細(xì)菌菌株紅色精蛋白桿菌
由含有蔗糖的植物汁發(fā)酵制備異麥芽酮糖的方法?？商鎿Q地，酶促轉(zhuǎn)化也可以用死生物體進(jìn)行。在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，通過離心逐批分離出細(xì)胞群，并進(jìn)一步后處理產(chǎn)物。該方法參見文獻(xiàn) H.Schiweck, alimenta 19, 5-16, 1980。
[0004]EP0001099描述了一種用尤其是濃汁或稀汁作為底物連續(xù)發(fā)酵細(xì)菌菌株紅色精蛋白桿菌(CBS574.77)和普城沙雷菌plymuthica ) (ATCC 15928)同時(shí)將蔗糖異構(gòu)化為異麥芽酮糖的方法，其中所述底物溶液本身是細(xì)胞生長的營養(yǎng)培養(yǎng)基。在反應(yīng)以后，借助于離心從產(chǎn)物溶液分離出細(xì)胞。在與底物培養(yǎng)基不同的培養(yǎng)基中與實(shí)際異構(gòu)化分離培養(yǎng)生物催化上有效的生物體已經(jīng)被明確證實(shí)是不利的。
[0005]DE3241788描述了一種用細(xì)菌菌株的游離細(xì)胞由蔗糖水溶液制備l_0_a -D-吡喃型葡萄糖苷-D-果糖(1-0-a -D-Glucopyranosido-D-Fructose)的方法,所述細(xì)菌菌株選自紅色精蛋白桿菌(CBD574.77)、普城沙雷菌(ATCC 15928)、粘質(zhì)沙雷氏菌iSerratiamarescens) (NCIB 8285)、腸膜明串珠菌(Zewcofliosioc(NRRL-B-512 F)和大黃歐文氏菌(NCPPB 1578)。在所述的方法中，可以使用濃汁，并且所述濃汁同樣充當(dāng)細(xì)胞的生長過程的碳源。在固定化的細(xì)胞的情況中，則使用純的蔗糖溶液。
[0006]在前述2篇說明書中公開的發(fā)酵制備異麥芽酮糖的情況中，存在在無菌條件下使用經(jīng)濟(jì)上和能源上有利的濃汁的可能性。但是，這里必須指出的缺點(diǎn)是，部分蔗糖被用于形成細(xì)胞群，并且需要昂貴的無菌硬件以及復(fù)雜的細(xì)胞混懸液與產(chǎn)物流的分離。
[0007]EP0983374描述了一種用固定化的細(xì)菌菌株同時(shí)制備異麥芽酮糖和甜菜堿的方法，所述細(xì)菌菌株選自紅色精蛋白桿菌(CBD574.77)、普城沙雷菌(ATCC 15928)和大黃歐文氏菌(NCPPB 1578)。該制備方法始于糖蜜，即在制糖制工藝結(jié)束時(shí)生成的組合物。在該方法中，不能使用濃汁作為底物，并且需要通過例如結(jié)晶明確地貧化蔗糖。
[0008]W097/44478描述了一種用活的、固定化的細(xì)菌菌株制備異麥芽酮糖的方法，所述細(xì)菌菌株選自紅色精蛋白桿菌(CBD574.77)、普城沙雷菌(ATCC 15928)和大黃歐文氏菌(ATCC 29284)。該制備方法始于糖蜜或純蔗糖溶液。
[0009]EP0028900描述了一種用細(xì)菌菌株大黃歐文氏菌(NCPPB 1578)的固定化細(xì)胞制備異麥芽酮糖的方法。該生產(chǎn)方法始于純的蔗糖溶液與最多15% v/v糖蜜的摻混物。
[0010]DE2217628、EP49472、EP3038219和EP91063描述了用固定化的細(xì)菌細(xì)胞將純蔗糖酶促轉(zhuǎn)化為異麥芽酮糖的方法。為此，EP0625578使用選自紅色精蛋白桿菌(CBS574.77)、普城沙雷菌(ATCC 15928)、粘質(zhì)沙雷菌(5ferraiia(NCIB 8285)、腸
膜明串珠菌(NRRL-B 512 F (ATCC 1083 a))和大黃歐文氏菌(NCPPB 1578)的細(xì)菌菌株。EP0392556 和 EP1257638 描述了選自土生結(jié)克雷伯菌(Z/e/wieWa terrigena ) JCM 1687、克雷伯菌屬OWdWh sp.) N0.88 (FERM BP-2838)和新加坡克雷伯菌OVdWhsingaporensis ) LX3和LX21的細(xì)菌菌株的用途。
[0011]使用固定化的細(xì)胞的異構(gòu)化方法描述于DE3133123和EP0915986中，并在固定化方法的范圍中用作藻酸鈣酶催化劑或離子交換劑。
[0012]所有已知的用固定化的細(xì)胞將蔗糖異構(gòu)化為異麥芽酮糖的方法的一個(gè)共同點(diǎn)是，僅使用制糖工藝的最終產(chǎn)物，即純的蔗糖或糖蜜。
[0013]因此，本發(fā)明的目的是，提供能夠由容易獲得的蔗糖來源制備異麥芽酮糖的方法。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]令人驚奇地，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在使用固定化的酶復(fù)合物的條件下使用含有蔗糖的植物汁來制備異麥芽酮糖，能夠?qū)崿F(xiàn)該目的。
[0015]因此，本發(fā)明提供了制備異麥芽酮糖的方法，所述方法包括下述方法步驟:
A)使固定化的酶復(fù)合物與含有蔗糖的溶液接觸，所述酶復(fù)合物能夠催化蔗糖生成異麥芽酮糖的轉(zhuǎn)化；
B)將至少部分蔗糖異構(gòu)化為異麥芽酮糖；
C)分離出所述酶復(fù)合物，和任選地
D)進(jìn)一步純化所述異麥芽酮糖，
其特征在于，作為含有蔗糖的溶液使用選自濃汁或稀汁的至少一種，優(yōu)選濃汁。
[0016]在這方面，本發(fā)明有利地提供了含有蔗糖的植物汁作為異構(gòu)化的底物的用途。
[0017]令人驚訝地，盡管事實(shí)上所使用的含有蔗糖的溶液是未純化的并因而是非常復(fù)雜的底物混合物，但是通過本發(fā)明卻實(shí)現(xiàn)了與用高純度蔗糖相同的異構(gòu)化中的收率和甚至更高的選擇性。
[0018]本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，通過增加固定化的細(xì)胞的停留時(shí)間以及使用粗制的植物汁作為底物，實(shí)現(xiàn)了顯著更高的資源效率，因?yàn)楣?jié)省了得到高純度蔗糖的純化步驟。
[0019]本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，通過直接使用濃汁，能夠節(jié)省能量和生產(chǎn)裝置(Betriebsmittel)ο
[0020]本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，通過使用濃汁，不需要用于穩(wěn)定酶活性的任何種類的緩沖溶液或另外的添加劑，而是進(jìn)行所使用的酶的天然穩(wěn)定化。
[0021]本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，與使用純的蔗糖水溶液相反，使用含有蔗糖的植物汁會防止床的滲漏。
[0022]本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，通過在異構(gòu)化過程中使用濃汁，與使用經(jīng)純化的蔗糖溶液相比，可以降低生齲的單糖類果糖和葡萄糖的含量。
[0023]術(shù)語“異麥芽酮糖”應(yīng)當(dāng)理解為是指6-0- a -D-吡喃型葡萄糖苷_D_果糖。
[0024]術(shù)語“酶復(fù)合物”應(yīng)當(dāng)理解為是指，具有至少一種活性酶的組合物或混合物組合物，其也可以是復(fù)合物性質(zhì)的，例如，活細(xì)胞。酶復(fù)合物的另外的例子是融合蛋白，其中至少一種活性酶與至少一種另外的多肽連接，但是純化的酶本身也可以是本發(fā)明意義上的酶復(fù)合物。
[0025]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“固定化的酶復(fù)合物”應(yīng)當(dāng)理解為是指這樣的酶復(fù)合物:其結(jié)合在基質(zhì)上，或者被基質(zhì)包封，使得所述酶復(fù)合物在水溶液中其自由擴(kuò)散或其自由運(yùn)動(dòng)受到限制，例如減慢。
[0026]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“稀汁”應(yīng)當(dāng)理解為是指，在由糖用甜菜或甘蔗制糖的過程中，在汁純化以后存在的產(chǎn)物?；谡麄€(gè)汁計(jì)，稀汁通常包含10-20重量％的蔗糖。
[0027]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“濃汁”應(yīng)當(dāng)理解為是指經(jīng)濃縮的“稀汁”，基于整個(gè)汁計(jì)，其包含超過20重量％的鹿糖。
[0028]除非另外說明，所有給出的百分比(%)是質(zhì)量百分比。
[0029]在根據(jù)本發(fā)明的方法中，作為含有蔗糖的溶液有利地使用濃汁；如果需要的話，可以用水將其稀釋至最多1:5的體積比，基于濃汁:水，從而得到更好的可控的異構(gòu)化。
[0030]具體地，用水稀釋濃汁如此來選擇，使得在方法步驟A)開始時(shí)，基于整個(gè)汁計(jì)，在濃汁中存在20-80重量％、尤其是30-50重量％的蔗糖濃度。
[0031]具體地，可有利地使用糖用甜菜的稀汁或濃汁，其中糖用甜菜的濃汁是特別優(yōu)選的。
[0032]含于固定化的酶復(fù)合物中的酶優(yōu)選地是酶類別EC 5.4.99.11中的至少一種蔗糖葡萄糖基變位酶。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，特別優(yōu)選使用這樣的蔗糖葡萄糖基變位酶，其得自:紅色精蛋白桿菌、尤其是菌株紅色精蛋白桿菌CBS 574.77和具有Seq ID Nr.5和6的那些；紅色精朊桿菌ruber) Z12 ;普城沙雷菌、尤其是菌株普城沙雷菌ATCC 15928 ;氣味沙雷氏菌oi/ori/era)、尤其是菌株氣味沙雷氏菌4Rxl3(Seq ID Nr.7);粘質(zhì)沙雷菌、尤其是菌株粘質(zhì)沙雷菌NCIB 8285 ;腸膜明串珠菌、尤其是菌株腸膜明串珠菌ATCC 1083 a;大黃歐文氏菌、尤其是菌株大黃歐文氏菌ATCC29283 (SeqID Nr.1)、NCPPB 1578、DSM 4484 (Seq ID Nr.8)、NX-5 (Seq ID Nr.9)和 WAC2928(Seq ID Nr.10);歐文氏菌屬sp.)、尤其是菌株歐文氏菌屬D12 ;放射形土壤桿菌(Agrobacterium radiobacter )、尤其是菌株放射形土壤桿菌MX-232 ; 土生結(jié)克雷伯菌、尤其是菌株土生結(jié)克雷伯菌JCM 1687 ;克雷伯菌屬、尤其是菌株克雷伯菌屬FERMBP_2838、LX3 (Seq ID Nr.ll^PNK33_98_8(Seq ID Nr.12);肺炎克雷伯菌(Z/e/wieBa
尤其是菌株肺炎克雷伯菌342 (Seq ID Nr.4);新加坡克雷伯菌、尤其是菌株新加坡克雷伯菌LX21 ;嗜中酸假單胞菌尤其是菌株嗜中酸假單胞菌MX-45 (Seq ID Nr.2);分散泛菌尤其是菌株分散泛菌UQ68J (Seq ID Nr.3);植物生克雷伯菌(Z/e/wieBa尤其是菌株植物生
克雷伯菌 CCRC 19112、MXlO 和 UQ14S (Seq ID Nr.13);腸桿菌屬(Afltero如ciersp.)、尤其是菌株腸桿菌屬 FMB-1 (Seq ID Nr.16)、SZ62 和 Ejp617 (Seq ID Nr.14);維涅蘭德固氮菌(Azotobacter vinelandii)DJ (Seq ID Nr.15),其中紅色精蛋白桿菌 CBS 574.77和紅色精朊桿菌Z12是特別優(yōu)選的。
[0033]所述酶可以以經(jīng)純化形式作為多肽來使用。為了易于純化，這些可以作為融合蛋白存在，其中，例如，使能夠易于純化的標(biāo)簽與所述酶融合，所述標(biāo)簽例如His-標(biāo)簽、Strep-標(biāo)簽、GST-標(biāo)簽或MBP-標(biāo)簽。
[0034]在根據(jù)本發(fā)明的方法中，優(yōu)選的是，所述酶復(fù)合物是整個(gè)細(xì)胞，所述細(xì)胞優(yōu)選地選自:紅色精蛋白桿菌、尤其是菌株紅色精蛋白桿菌CBS 574.77 ;紅色精朊桿菌Z12 ;普城沙雷菌、尤其是菌株普城沙雷菌ATCC 15928 ;氣味沙雷氏菌、尤其是菌株氣味沙雷氏菌4Rxl3 ;粘質(zhì)沙雷菌、尤其是菌株粘質(zhì)沙雷菌NCIB 8285 ;腸膜明串珠菌、尤其是菌株腸膜明串珠菌ATCC 1083 a ;大黃歐文氏菌、尤其是菌株大黃歐文氏菌ATCC29283、NCPPB 1578、DSM 4484、NX-5和WAC2928 ;歐文氏菌屬、尤其是菌株歐文氏菌屬D12 ;放射形土壤桿菌、尤其是菌株放射形土壤桿菌MX-232 ;土生結(jié)克雷伯菌、尤其是菌株土生結(jié)克雷伯菌JCM1687 ;克雷伯菌屬、尤其是菌株克雷伯菌屬FERM BP-2838、LX3和NK33-98-8 ;肺炎克雷伯菌、尤其是菌株肺炎克雷伯菌342 ;新加坡克雷伯菌、尤其是菌株新加坡克雷伯菌LX21 ;嗜中酸假單胞菌、尤其是菌株嗜中酸假單胞菌MX-45 ;分散泛菌、尤其是菌株分散泛菌UQ68J ；植物生克雷伯菌、尤其是菌株植物生克雷伯菌CCRC 19112、MXlO和UQ14S ;腸桿菌屬、尤其是菌株腸桿菌屬FMB-1、SZ62和Ejp617 ;維涅蘭德固氮菌辦，其中紅色精蛋白桿菌CBS574.77和紅色精朊桿菌Z12是特別優(yōu)選的。
[0035]酶復(fù)合物的固定化例如可以以CLEAs {insoluble crosslinked enzymeaggregates (不可溶交聯(lián)酶聚集體))的形式進(jìn)行(Cao, L.等人，2000，Cross-linkedenzyme aggregates: a simple and effective method for the immobilization ofpenicillin acylase, Org.Lett., 2: 1361-1264),或者在天然或合成起源的固體載體材料上進(jìn)行。天然材料例如是多糖諸如藻酸鹽、瓊脂糖(Agarose)、瓊脂糖凝膠(Sepharose)、纖維素及其衍生物(例如DEAE-或CM-纖維素)。也可以使用改性的瓊脂糖凝膠，例如被環(huán)氧基-活化的、溴氰根-活化的、NHS-活化的、硫醇-活化的瓊脂糖凝膠。這些瓊脂糖例如是在公司 GE Healthcare、BioRacU Sigma 和 Pierce 商購可得的。
[0036]作為合成有機(jī)聚合物可以使用聚苯乙烯-衍生物、聚丙烯酸酯、尤其是環(huán)氧化物活化的丙烯酸樹脂珠(Eupergit)、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、乙烯基-和烯丙基聚合物、聚酯或聚酰胺。
[0037]作為無機(jī)載體可以是基于硅氧化物或鋁氧化物或其混合物的材料。
[0038]酶復(fù)合物的固定化還可以通過包封在聚合的多孔凝膠中進(jìn)行，例如RSi(OCH3)3或者RSi (OCH3) 3與Si (OCH3) 4的混合物的疏水性溶膠-凝膠材料(Reetz，Μ.Τ.; Zonta,A.; Simpelkampj J.; Rufinskaj A.; Teschej B.J.Sol-Gel Sc1.Technol.1996，7，第 35-43 頁)或多孔的聚合娃膠-凝膠(Elgren，Τ.Μ.; Zadvornyj 0.Α.; Brecht, Ε.;Douglas, Τ.; Zorin, N.A.; Maroneyj M.J.& Peters, J.1)。
[0039]此外，除了固定化以外，在酶膜反應(yīng)器中的酶的多次使用是可能的。
[0040]在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的酶復(fù)合物，尤其是細(xì)胞，優(yōu)選地被固定在多糖諸如藻酸鹽、果膠、角叉菜膠、殼聚糖或聚乙烯醇例如Lentikats或其混合物中，尤其是藻酸鹽中；在這點(diǎn)上，參見例如 Shimizu，H.，攀yl〈1997) Screening of novel microbialenzymes for the production of biologically and chemically useful compounds,見:Advances in biochemical engineering bio technology,第 58 卷:New Enzymes forOrganic Synthesis (Scheper，T.,編)第 45-88 頁，Springer, New York。
[0041]一種對于在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的酶復(fù)合物的任意形式而言特別優(yōu)選的固定化是，在EP2011865中描述的方法，其中給固定在惰性載體上的酶復(fù)合物提供通過氫化硅烷化得到的有機(jī)硅涂層。[0042]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的是，在方法步驟B)中，具有4-9.5的pH-值。該pH-值有利地借助于酸、尤其是無機(jī)酸來調(diào)節(jié)，所述酸優(yōu)選選自硫酸、鹽酸或乙酸。
[0043]此外，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的是，在方法步驟B)中，具有20_40°C、優(yōu)選25_35°C的溫度，該溫度在含有蔗糖的溶液中測得。
[0044]在方法步驟C)中，將酶復(fù)合物與異麥芽酮糖分離；這例如通過過濾、沉降或離心來進(jìn)行。因?yàn)槊笍?fù)合物的被固定物特性，該分離相對于未固定的酶變得容易。
[0045]由于工藝經(jīng)濟(jì)的原因，根據(jù)本發(fā)明，如果以固體床的形式使用經(jīng)固定化的酶復(fù)合物，是優(yōu)選的，含有鹿糖的溶液從所述固體床中流過(H.Schiweck, Zuckerind.(1990)，115 (7)，555-565)。相應(yīng)的以固體床的方法描述于A.Liese,等人.Processes在A.Liese, K.Seelbach, C.Wandrey (編)，Industrial Biotransformations第2版(2006), ffiley-VCH, Weinheim中。在這樣的方法中，方法步驟A)至C)連續(xù)進(jìn)行，并且從而彼此逐漸變成直至同時(shí)進(jìn)行。
[0046]可以在任選的方法步驟D)中進(jìn)一步純化異麥芽酮糖。這尤其可通過結(jié)晶或色譜法進(jìn)行。相應(yīng)的方法描述于DE3241788和EP0983374中。
[0047]下面列出的實(shí)施例示例性描述了本發(fā)明，而非意在將其范圍由整個(gè)說明書和權(quán)利要求書給出的本發(fā)明限制在實(shí)施例中所提及的實(shí)施方案中。
[0048]實(shí)施例: 實(shí)施例1:生物催化劑的制備
用1-5 ml無菌營養(yǎng)培養(yǎng)基將細(xì)胞從菌株紅色精蛋白桿菌(CBS574.77)的傳代培養(yǎng)物上洗下，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基由50 g/kg的鹿糖、15 g/kg的玉米泡脹水、7 g/kg的硫酸銨、0.5g/kg的酵母浸出物、I g/kg的硫酸二氫鉀、0.41 g/kg的氯化鎂七水合物、0.004 g/kg的氯化錳四水合物、0.047 g/kg的檸檬酸鐵一水合物和926 g/kg的水組成，需要時(shí)將其調(diào)節(jié)至pH 7.2。該混懸液充當(dāng)預(yù)培養(yǎng)物的接種物，在I I搖瓶中所述預(yù)培養(yǎng)物包含200 ml上述營養(yǎng)物溶液。
[0049]在30°C培養(yǎng)20小時(shí)以后，以使初始光密度(OD6J為I的方式，用所述預(yù)培養(yǎng)物給2- L發(fā)酵罐接種，所述發(fā)酵罐裝有I升無菌生產(chǎn)培養(yǎng)基，所述生產(chǎn)培養(yǎng)基由50 g/kg的蔗糖、15 g/kg的玉米泡脹水、3 g/kg的硫酸銨、4 g/kg的磷酸氫銨、0.5 g/kg的酵母浸出物、I g/kg的硫酸二氫鉀、0.41 g/kg的氯化鎂七水合物、0.004 g/kg的氯化猛四水合物、0.047g/kg的檸檬酸鐵一水合物和926 g/kg的水組成,其被調(diào)節(jié)至pH 7.2。
[0050]在30°C、pH 7 (經(jīng)調(diào)節(jié))和30%的p02 (級聯(lián)攪拌器，Airflow)下進(jìn)行發(fā)酵。在發(fā)酵過程中，補(bǔ)料蔗糖。15-20 h以后，發(fā)酵過程結(jié)束，可以收獲生物質(zhì)用于固定化。
[0051]為此，將得到的混懸液與水和4%濃度的藻酸鹽溶液以體積比1:1進(jìn)行混合。然后將該混懸液通過滴入到2%濃度的CaCl2-溶液中來固定化。用聚乙烯亞胺和戊二醛后固化所得到的珠子。得到的生物催化劑可以在4-10°C保存數(shù)周。
[0052]實(shí)施例2:通過使純蔗糖溶液異構(gòu)化來制備異麥芽酮糖(非根據(jù)本發(fā)明的)
如(65--/-1n UlIman，s Encyclopedia of Industrial Chemisty (2007)hK
得自糖用甜菜的濃汁制備純蔗糖；蔗糖收率為88.3%。
[0053]將在實(shí)施例1中得到的經(jīng)固定化的細(xì)胞填充到可加熱的柱反應(yīng)器中，并將溫度調(diào)節(jié)至20-35°C。由所述純蔗糖和自來水制備具有35-45%的干物質(zhì)(TS)-含量的蔗糖溶液。使該溶液連續(xù)通流穿過所述柱反應(yīng)器。
[0054]流出柱反應(yīng)器的異麥芽酮糖溶液的HPLC-分析表明了在該方法步驟中的收率、選擇性和轉(zhuǎn)化率的平均值:
收率:85%
選擇性:91%
轉(zhuǎn)化率:94%
基于使用的蔗糖計(jì)，該方法的收率為孤
[0055]實(shí)施例3:通過使?jié)庵悩?gòu)化來制備異麥芽酮糖(根據(jù)本發(fā)明的)
將在實(shí)施例1中得到的經(jīng)固定化的細(xì)胞填充到可加熱的柱反應(yīng)器中，并將溫度調(diào)節(jié)至20-35°C，并使上述經(jīng)稀釋的得自糖用甜菜的具有35-45%的干物質(zhì)(TS)-含量的濃汁連續(xù)通流穿過。
[0056]流出柱反應(yīng)器的異麥芽酮糖溶液的HPLC-分析表明了收率、選擇性和轉(zhuǎn)化率的平均值:
收率:82%
選擇性:91%
轉(zhuǎn)化率:90%
基于使用的蔗糖計(jì)，該方法的收率為_，因而比根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的方法的收率高了 7%。
[0057]實(shí)施例4:濃汁的異構(gòu)化與經(jīng)純化的蔗糖溶液的異構(gòu)化的選擇性對比 在調(diào)溫至30°C的柱反應(yīng)器中裝入根據(jù)實(shí)施例1得到的固定化的細(xì)胞。
[0058]使經(jīng)純化的蔗糖溶液連續(xù)通流穿過柱反應(yīng)器1，所述經(jīng)純化的蔗糖溶液的濃度用自來水調(diào)節(jié)至40%干物質(zhì)-含量，并用濃硫酸調(diào)節(jié)至pH-值為6。
[0059]使得自糖用甜菜的濃汁連續(xù)通流穿過柱反應(yīng)器2，所述濃汁被稀釋至40%的蔗糖干物質(zhì)-含量，并用濃硫酸調(diào)節(jié)至PH-值為6。
[0060]為了能夠更好地測定選擇性，通過調(diào)節(jié)體積流，將2個(gè)柱反應(yīng)器中的異麥芽酮糖收率調(diào)節(jié)為79%的相同值，基于各自的蔗糖干物質(zhì)-含量計(jì)。通過得到的異麥芽酮糖溶液的HPLC-分析，進(jìn)行分析確定。
[0061]實(shí)現(xiàn)的選擇性如下:
選擇性(濃汁):85%
選擇性(蔗糖溶液):83%
另外，與使用經(jīng)純化的蔗糖溶液相比，通過使用濃汁使終產(chǎn)物中不希望的，致齲的單糖類果糖和葡萄糖的形成減少了大約10% (基于干物質(zhì)計(jì))。
【權(quán)利要求】
1.制備異麥芽酮糖的方法，所述方法包括下述方法步驟: A)使固定化的酶復(fù)合物與含有蔗糖的溶液接觸，所述酶復(fù)合物能夠催化蔗糖轉(zhuǎn)化成異麥芽酮糖； B)將至少部分蔗糖異構(gòu)化為異麥芽酮糖； C)分離出所述酶復(fù)合物，和任選地 D)進(jìn)一步純化所述異麥芽酮糖， 其特征在于， 作為含有蔗糖的溶液使用選自濃汁或稀汁的至少一種，優(yōu)選濃汁。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法， 其特征在于， 作為含有蔗糖的溶液使用用水稀釋過的濃汁，基于整個(gè)汁計(jì)，其具有20-80重量％、尤其是30-50重量％的蔗糖濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法， 其特征在于， 含于固定化的酶復(fù)合物中的酶是酶類別EC 5.4.99.11中的至少一種蔗糖葡萄糖基變位酶，特別得自下述菌的一種:紅色精蛋白桿菌、尤其是菌株紅色精蛋白桿菌CBS 574.77和具有Seq ID Nr.5和6的那些；紅色精朊桿菌Z12 ;普城沙雷菌、尤其是菌株普城沙雷菌ATCC 15928 ;氣味沙雷氏菌、尤其是菌株氣味沙雷氏菌4Rxl3(Seq ID Nr.7);粘質(zhì)沙雷菌、尤其是菌株粘質(zhì)沙雷菌NCIB 8285 ;腸膜明串珠菌、尤其是菌株腸膜明串珠菌ATCC 1083a ;大黃歐文氏菌、尤其是菌株大黃歐文氏菌ATCC29283 (Seq ID Nr.1), NCPPB 1578、DSM4484 (Seq ID Nr.8)、NX_5 (Seq ID Nr.9)和 WAC2928 (Seq ID Nr.10);歐文氏菌屬、尤其是菌株歐文氏菌屬D12 ;放射形土壤桿菌、尤其是菌株放射形土壤桿菌MX-232 ;土生結(jié)克雷伯菌、尤其是菌株土生結(jié)克雷伯菌JCM 1687 ;克雷伯菌屬、尤其是菌株克雷伯菌屬FERM BP-2838、LX3 (Seq ID Nr.11)和 NK33-98-8 (Seq ID Nr.12);肺炎克雷伯菌、尤其是菌株肺炎克雷伯菌342 (Seq ID Nr.4);新加坡克雷伯菌、尤其是菌株新加坡克雷伯菌LX21 ;嗜中酸假單胞菌、尤其是菌株嗜中酸假單胞菌MX-45 (Seq ID Nr.2);分散泛菌、尤其是菌株分散泛菌UQ68J (Seq ID Nr.3);植物生克雷伯菌、尤其是菌株植物生克雷伯菌CCRC 19112、MX10和UQ14S (Seq ID Nr.13);腸桿菌屬、尤其是菌株腸桿菌屬FMB-1 (SeqID Nr.16)、SZ62 和 Ejp617 (Seq ID Nr.14);維涅蘭德固氮菌 DJ (Seq ID Nr.15)。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中的至少一項(xiàng)所述的方法， 其特征在于， 所述酶復(fù)合物是細(xì)胞，尤其是選自得自下述菌的細(xì)胞:紅色精蛋白桿菌、尤其是菌株紅色精蛋白桿菌CBS 574.77 ;紅色精朊桿菌Z12 ;普城沙雷菌、尤其是菌株普城沙雷菌ATCC15928 ;氣味沙雷氏菌、尤其是菌株氣味沙雷氏菌4Rxl3 ;粘質(zhì)沙雷菌、尤其是菌株粘質(zhì)沙雷菌NCIB 8285 ;腸膜明串珠菌、尤其是菌株腸膜明串珠菌ATCC 1083 a ;大黃歐文氏菌、尤其是菌株大黃歐文氏菌ATCC29283、NCPPB 1578、DSM 4484、NX-5和WAC2928 ;歐文氏菌屬、尤其是菌株歐文氏菌屬D12 ;放射形土壤桿菌、尤其是菌株放射形土壤桿菌MX-232 ;土生結(jié)克雷伯菌、尤其是菌株土生結(jié)克雷伯菌JCM 1687 ;克雷伯菌屬、尤其是菌株克雷伯菌屬FERM BP-2838、LX3和NK33-98-8 ;肺炎克雷伯菌、尤其是菌株肺炎克雷伯菌342 ;新加坡克雷伯菌、尤其是菌株新加坡克雷伯菌LX21 ;嗜中酸假單胞菌、尤其是菌株嗜中酸假單胞菌MX-45 ;分散泛菌、尤其是菌株分散泛菌UQ68J ;植物生克雷伯菌、尤其是菌株植物生克雷伯菌CCRC 19112、MXlO和UQ14S ;腸桿菌屬FMB-1、SZ62和Ejp617 ;維涅蘭德固氮菌O/。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述細(xì)胞被固定在多糖諸如藻酸鹽、果膠、角叉菜膠、殼聚糖或聚乙烯醇，例如Lentikats,或它們的混合物中，尤其是藻酸鹽中。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中的至少一項(xiàng)所述的方法， 其特征在于， 在方法步驟B)中，存在4-9.5的pH-值。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中的至少一項(xiàng)所述的方法， 其特征在于， 在方法步驟B)中，存在20-40°C的溫度。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中的至少一項(xiàng)所述的方法， 其特征在于， 以固體床的形式使用經(jīng)固 定化的酶復(fù)合物，所述含有蔗糖的溶液通過所述固體床流過。
【文檔編號】A23L1/236GK103501636SQ201280021859
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2012年2月8日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月5日
【發(fā)明者】J.哈伯蘭, O.澤納克, K.格拉曼, M.霍爾特坎普, J.沃爾特, T.希勒, A.莫爾, G.格林貝格, T.哈斯 申請人:贏創(chuàng)德固賽有限公司