基因工程改造的代謝木糖的微生物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了使用木糖作為固定碳源來培養(yǎng)產(chǎn)油微生物的方法。還提供了經(jīng)過了基因工程改造以便代謝作為固定碳源的木糖以允許其將木糖轉(zhuǎn)化成油的微生物。本發(fā)明所提供的方法的特定優(yōu)點包括通過利用木糖的微生物發(fā)酵方法來生產(chǎn)油而不是生產(chǎn)醇。
【專利說明】基因工程改造的代謝木糖的微生物
相關(guān)申請的交叉引用
根據(jù)美國法典35篇119條(e)款，本申請要求享有2011年5月6日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/483，550和2011年6月15日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/497，501的權(quán)益。這些申請中的每一個都以引用的方式整體并入本文。
序列表引用 本申請包括如詳述結(jié)尾處所示的序列表。
政府利益
本發(fā)明在加利福尼亞州政府的支持下在加利福尼亞州能源委員會授權(quán)號PIR-08-018下完成。所述能源委員會享有本發(fā)明的某些權(quán)力。
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及產(chǎn)油微生物中木糖代謝途徑的表達以允許它們代謝木糖以便生產(chǎn)脂類或其它有用的生物質(zhì)，并且涉及由所述生物質(zhì)生產(chǎn)的油類化學(xué)品、食品、燃料以及其它產(chǎn)品。
發(fā)明背景
在生物技術(shù)中一個重要且困難的挑戰(zhàn)在于釋放纖維素材料中碳捕獲的巨大潛能用于轉(zhuǎn)化成有價值的物質(zhì)如液體燃料、化學(xué)品、食品和其它產(chǎn)品。一個特定的挑戰(zhàn)涉及使用通常發(fā)現(xiàn)于解聚的的半纖維素中的木糖作為微生物異養(yǎng)培養(yǎng)的碳源。盡管在使用酵母來將木糖用于生產(chǎn)乙醇方面已做了很多工作，但是大多數(shù)酵母菌株不能利用木糖抑或僅能非常低效地利用木糖(參見 Jeffries, 2006，Curr.0p.Biotech.17:320-326 ;和 Wang等，2004, Biotechnol.Lett.26(11):885-890)。
某些產(chǎn)油微生物(例如，產(chǎn)油酵母和產(chǎn)油微藻)能夠使固定碳能源轉(zhuǎn)化成更高價值的產(chǎn)品，如甘油三酯、脂肪酸、碳水化合物以及蛋白質(zhì)。此外，微藻自身可以作為食品來源體現(xiàn)價值。例如，已對產(chǎn)油微藻的某些物種進行了基因工程改造以生產(chǎn)“調(diào)制油”，這意味著其甘油三酯含量顯示出脂肪酸鏈長度和飽和度的分布相對于它們所來源的品種發(fā)生了改變。參見 PCT 公布號 2008/151149、2009/126843、2010/045358、2010/063031 和 2010/063032 以及PCT 申請?zhí)?USl 1/038，463 和 USl 1/038，464。
使用產(chǎn)油微生物將木糖轉(zhuǎn)化成有意義量的脂類和其它產(chǎn)品的能力將具有重要的環(huán)境意義，因為它可降低我們對化石燃料的依賴并降低微生物油的成本。
發(fā)明概述
一方面，本發(fā)明提供了一種植物界的微生物，所述微生物包含可操作以產(chǎn)生活性木糖代謝途徑酶的重組核酸。在一些情況下，所述微生物在基本上由木糖組成的碳源上培養(yǎng)時能夠增加細胞數(shù)量或產(chǎn)生脂類。在一些情況下，所述微生物將木糖轉(zhuǎn)化成甘油三酯。在一些情況下，所述微生物在使用葡萄糖作為碳源來培養(yǎng)時能夠積累按干細胞重量計10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%的甘油三酯。在一些情況下，所述微生物在純木糖上培養(yǎng)時能夠積累按干細胞重量計至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%的甘油三酯。在一些情況下，所述微生物在作為碳源的葡萄糖上培養(yǎng)時能夠積累按干細胞重量計至少50%的甘油三酯并且在純木糖上培養(yǎng)時能夠積累按干細胞重量計至少20%的甘油三酯。在一些情況下，所述微生物在氮限制條件下在60%為葡萄糖且40%為木糖的碳源上培養(yǎng)，如通過同位素示蹤所測量，這些細胞產(chǎn)生其中碳原子的至少5%、10%、20%、30%、40%、或50%來源于木糖的碳原子的脂類。在一些情況下，所述微生物在少于或等于21天、14天或7天中在具有2.5%木糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基中能夠消耗至少90%的木糖。
在一些情況下，所述重組核酸可操作以編碼以下一種或多種:活性木糖轉(zhuǎn)運體、木酮糖-5-磷酸轉(zhuǎn)運體、木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶、木糖醇脫氫酶或木糖還原酶。在一些情況下，所述重組核酸編碼可操作地連接有質(zhì)體靶向信號序列的木酮糖-5-磷酸轉(zhuǎn)運體并且其中所述木酮糖-5-磷酸轉(zhuǎn)運體可操作以轉(zhuǎn)運木酮糖-5-磷酸到質(zhì)體中。在一些情況下，所述重組核酸可操作以編碼(a)具有質(zhì)體靶向信號序列以便使木酮糖-5-磷酸轉(zhuǎn)運到質(zhì)體中的木酮糖-5-磷酸轉(zhuǎn)運體蛋白、(b)木酮糖激酶以及(C)木糖異構(gòu)酶抑或木糖醇脫氫酶與木糖還原酶二者。
在一些情況下，所述微生物屬于綠色植物亞界(subkingdom Viridiplantae)。在一些情況下，所述微生物屬于綠藻下界(infrakingdom Chlorophyta)或綠藻門(phyla Chlorophytae)、屬于利藻亞門(subphylum Tetraphytina)、四胞藻綱(classTrebouxiophyceae)或者小球藻目(order Chlorellale)。在一些情況下,所述微生物屬于小球藻屬(genus Chlorella)或原藻屬(genus Prototheca)。在一些情況下,所述微生物屬于桑椹形原藻或原殼小球藻種。
在一些情況下，所述微生物進一步包含可操作以改變由微生物產(chǎn)生的脂類的脂肪酸特性的重組修飾。在一些情況下，所述重組修飾包含編碼活性?；?ACP硫酯酶、酮脂酰-ACP合成酶或脂肪酸去飽和酶或者可操作以減少或消除酰基-ACP硫酯酶、酮脂酰-ACP合成酶或脂肪酸去飽和酶的外源基因。
另一方面，本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)微生物生物質(zhì)或者生產(chǎn)由生物質(zhì)產(chǎn)生的產(chǎn)品的方法，其中所述方法包括如上文或本文所討論的，在包含木糖的培養(yǎng)基中異養(yǎng)地培養(yǎng)重組微生物以便將木糖轉(zhuǎn)化成微生物生物質(zhì)。在一些情況下，所述微生物生物質(zhì)包含微生物脂類。在一些情況下，所述脂類用于制造選`自由以下組成的組的產(chǎn)品:化學(xué)品、潤滑劑、清潔劑、燃料、食用油以及化妝品成分。在一些情況下，所述產(chǎn)品是選自生物柴油或可再生柴油的燃料。
在一些情況下，所述培養(yǎng)基包含多于50%為木糖的碳源。在一些情況下，所述碳源的多于 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95% 為木糖。
另一方面，本發(fā)明提供了一種由如上文或本文所討論的任何微生物生產(chǎn)或者通過上文或本文所討論的任何方法生產(chǎn)的天然油。
另一方面，本發(fā)明提供了由上文所討論的天然油生產(chǎn)的油類化學(xué)品、食用油、燃料或其它產(chǎn)品。
另一方面，本發(fā)明提供了利用木糖作為碳源的重組產(chǎn)油微生物。在一個實施方案中，所述產(chǎn)油微生物是微藻、產(chǎn)油酵母、產(chǎn)油真菌或產(chǎn)油細菌。在另一個實施方案中，所述重組微生物是微藻細胞，包括但不限于原藻屬細胞，其包含允許細胞利用或者更有效地利用木糖作為碳源的一個或多個外源基因。在一些實施方案中，所述細胞是桑椹形原藻、克魯格尼原藻(Prototheca krugani)、大型原藻(Prototheca stagnora)或小型原藻(Protothecazopfii)種的品種，并且在其它實施方案中，所述細胞具有與SEQ ID No:l至9中的一個或多個具有至少70%、75%、80%、85%或95%核苷酸同一性的23S rRNA序列。所述外源基因包含可操作地連接有啟動子的編碼序列，并且在一些實施方案中，所述啟動子是來自原藻屬物種的內(nèi)源性基因。在另外的實施方案中，所述編碼序列編碼選自由以下組成的組的蛋白質(zhì):氧化還原酶途徑蛋白、木糖異構(gòu)酶途徑蛋白、木糖易位體蛋白和木糖轉(zhuǎn)運體蛋白。
在各種實施方案中，所述微藻細胞包含允許細胞利用或者更有效地利用木糖作為碳源的一個或多個外源基因。例如，本發(fā)明的微藻細胞包括已經(jīng)過工程改造以包含以下的那些細胞:(i)編碼木糖異構(gòu)酶途徑蛋白的一個或多個基因；或者(ii)編碼氧化還原酶途徑蛋白的一個或多個基因；或者(iii)編碼木糖異構(gòu)酶途徑蛋白的一個或多個基因；(iv)編碼木糖轉(zhuǎn)運體蛋白的一個或多個基因；或者(V)編碼木糖易位體蛋白一個或多個基因；或者(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(V)的組合。在一個實施方案中，所述微生物細胞經(jīng)過工程改造以表達木糖轉(zhuǎn)運體蛋白和木糖異構(gòu)酶途徑蛋白。在另一個實施方案中，所述微生物細胞經(jīng)過工程改造以表達木糖轉(zhuǎn)運體蛋白和氧化還原酶途徑蛋白。在又一個實施方案中，所述微生物細胞經(jīng)過工程改造以表達木糖轉(zhuǎn)運體蛋白、氧化還原酶途徑蛋白和木糖異構(gòu)酶蛋白。在另一個實施方案中，所述微生物細胞經(jīng)過工程改造以表達木糖轉(zhuǎn)運體蛋白、氧化還原酶途徑蛋白和木糖易位體蛋白。在另一個實施方案中，所述微生物細胞經(jīng)過工程改造以表達木糖轉(zhuǎn)運體蛋白、木糖異構(gòu)酶途徑蛋白和木糖易位體蛋白。在另一個實施方案中，所述微生物細胞經(jīng)過工程改造以表達木糖轉(zhuǎn)運體蛋白、木糖異構(gòu)酶途徑蛋白、木糖異構(gòu)酶途徑蛋白和木糖易位體蛋白。
在本發(fā)明的一些實施方案中，重組產(chǎn)油微生物包含編碼選自GPT-A-XPT(SEQ IDNO:45)、GPT-F-XPT(SEQ ID NO:47)或 S106SAD-XPT(SEQ ID NO:49)的木糖易位體蛋白的第一外源基因、編碼選自 SUTl (SEQ ID NO:37)、GXSI (SEQ ID NO:39)、XLTI (SEQ ID NO:43)或同向轉(zhuǎn)運體(SEQ ID N0:41)的木糖轉(zhuǎn)運體蛋白的第二外源基因、編碼選自XylA(SEQID NO: 15)或XYL3(SEQ ID NO: 51)的氧化還原酶途徑蛋白的第三外源基因以及編碼選自XYLl (SEQ ID NO:35), XYL2 (SEQ ID NO:50)或 XYL3 (SEQ ID N0:51)的木糖異構(gòu)酶途徑蛋白的第四外源基因。
在一個實施方案中，重組產(chǎn)油微生物包含編碼XylA、XYL3、SUTl和GPT-F-XPT的外源基因。在一個實施方案中，重組產(chǎn)油微生物包含編碼XylA、XYL2、XYL3、XLTl和S106SAD-XPT的外源基因。在一個實施方案中，重組產(chǎn)油微生物包含編碼XylA、XYLU XYL3、XLTl和S106SAD-XPT的外源基因。在一個實施方案中，重組產(chǎn)油微生物包含編碼XylA、XYLl、XYL3、GXSl和GPT-A-XPT的外源基因。在一個實施方案中，重組產(chǎn)油微生物包含編碼XYLl、XYL2、XYL3、同向轉(zhuǎn)運體和GPT-F-XPT的外源基因。在一個實施方案中，重組產(chǎn)油微生物包含編碼XYL1、XYL2、XYL3、GXSl和GPT-F-XPT的外源基因。在一個實施方案中，重組產(chǎn)油微生物包含編碼XYL2、XYL3、同向轉(zhuǎn)運體和S106SAD-XPT的外源基因。在一個實施方案中，重組產(chǎn)油微生物包含編碼XYL2、XYL3、XLT1和S106SAD-XPT的外源基因。在一個實施方案中，重組產(chǎn)油包含編碼XYL2、XYL3、GXSl和GPT-A-XPT的外源基因。
在一些情況下，在包含多于50%為木糖的碳源的培養(yǎng)基中繁殖或培養(yǎng)重組產(chǎn)油微生物。在一些情況下，在包含多于55%、多于60%、多于65%、多于70%、多于75%、多于80%、多于85%、多于90%、多于95%為木糖的碳源的培養(yǎng)基中繁殖或培養(yǎng)所述微生物。在一些情況下，在包含木糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基中繁殖或培養(yǎng)所述微生物。在一些情況下，所述微生物在包含多于50%為木糖的碳源的培養(yǎng)基中或者在包含木糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基中繁殖或培養(yǎng)時，產(chǎn)生由在包含葡萄糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基中進行繁殖或培養(yǎng)并且缺乏一個或多個外源基因的類似微生物細胞所產(chǎn)生的脂類的至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%或至少60%。
除非另外指出，否則上文和本說明書通篇所提及的編碼指定蛋白質(zhì)的外源基因是指可操作以編碼指定蛋白質(zhì)的基因。
本發(fā)明的另一個實施方案是通過在木糖存在下繁殖或培養(yǎng)重組產(chǎn)油微生物而產(chǎn)生的微生物脂類組合物。在一個實施方案中，在包含木糖的纖維素材料存在下繁殖和/或培養(yǎng)本文所討論的重組產(chǎn)油微生物。任選地，所述纖維素材料可進一步包含葡萄糖和蔗糖。所述微生物脂類組合物是通過裂解所述微生物細胞并分離所述油來產(chǎn)生。
發(fā)明詳述
1.定義
“活性”是指在細胞中具有功能的核酸。例如，用于驅(qū)動抗生素抗性基因以賦予微藻抗生素抗性的啟動子在微藻中具有活性。
“面積百分比”是指在實驗期間產(chǎn)生的色譜峰、光譜峰和其它峰的面積百分比的測定。峰的曲線下面積和特定峰的面積百分比的測定通常由本領(lǐng)域的技術(shù)人員來完成。例如在其中將樣品中的脂肪酸分子轉(zhuǎn)化成為脂肪酸甲酯(FAME)的FAME GC/FID檢測方法中，與其它任何脂肪酸如C14:l相比，對于14個碳原子的飽和脂肪酸(C14:0)觀察到單獨的峰。每種FAME的峰面積與其在混合 物中的百分含量是成正比的，并且其可以基于樣品中存在的所有峰的總和來計算(即[特定峰下面積/所有被測峰的總面積]X 100)。當涉及本發(fā)明的油類和細胞的脂類特性時，“C8-C14含量為至少4%”是指細胞中或者提取的甘油脂組合物中總脂肪酸的至少4%具有包括8、10、12或者14個碳原子的鏈長度。
“生物柴油”是利用生物學(xué)方法產(chǎn)生的脂肪酸烷基酯，其適于在柴油發(fā)動機中用作燃料。
“生物質(zhì)”是通過細胞生長和/或繁殖產(chǎn)生的物質(zhì)。生物質(zhì)可以包含細胞和/或胞內(nèi)內(nèi)含物以及胞外物質(zhì)，其包括但不限于由細胞分泌的化合物。
“生物反應(yīng)器”是封閉或者半封閉腔體，細胞培養(yǎng)于其中，任選地以懸浮形式。
“纖維素材料”是纖維材料的消化產(chǎn)物，其通常包括葡萄糖和木糖(例如來自半纖維素)，以及任選地另外的化合物(例如二糖、寡糖、木質(zhì)素、糠醛和其它化合物)。纖維素材料來源的非限制性實例包括甘蔗渣、甜菜漿、玉米秸桿、木片、鋸末和柳枝稷。
“表達載體”或者“表達構(gòu)建體”或者“質(zhì)粒”或者“重組DNA構(gòu)建體”是指通過人為干涉制備的核酸，包括利用使得宿主細胞中特定核酸進行轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的一系列特定核酸元件通過重組方法或者直接的化學(xué)合成來制備。表達載體可以是質(zhì)粒、病毒或者核酸片段的一部分。表達載體通常包含需要轉(zhuǎn)錄的核酸，其與啟動子可操作地連接。
“外源基因”是編碼被引入(“轉(zhuǎn)化”)到細胞中的RNA和/或蛋白質(zhì)表達的核酸。經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞可以被稱為重組細胞，其中可以引入額外的外源基因。相對于被轉(zhuǎn)化的細胞，外源基因可以來源于不同物種(因而是異源的)，或者來源于相同物種(因而是同源的)。因此，外源基因可以包括相對于基因的內(nèi)源拷貝在細胞基因組中占據(jù)不同位置或者處于不同控制下的同源基因。外源基因可以在細胞中存在多于一個拷貝。外源基因可以通過插入基因組或者作為附加分子存在于細胞中。
“外源提供”是指提供到細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中的分子。
“脂肪酸特性”應(yīng)意指脂肪酸就鏈長度和/或飽和型態(tài)而言在細胞和來源于細胞的油中的分布。在此上下文中，飽和型態(tài)可包括飽和酸相對于不飽和酸的指標或者在細胞的各種脂肪酸中的雙鍵位置分布的更詳細分析。
“固定碳源”是一種含碳分子，通常是有機分子，其在環(huán)境溫度和壓力下以固體或者液體形式存在于培養(yǎng)基中，可以被培養(yǎng)于培養(yǎng)基中的微生物使用。
“異養(yǎng)培育”和其變體如“異養(yǎng)培養(yǎng)”和“異養(yǎng)發(fā)酵”是指在固定碳源存在下對生長的有意促進(細胞大小、細胞含量和/或細胞活性增加)。通常，異養(yǎng)培養(yǎng)在沒有光的情況下進行。然而沒有光對于異養(yǎng)培養(yǎng)來說不是必須的。在沒有光的情況下培養(yǎng)意指在完全沒有或者近似完全沒有光的情況下培養(yǎng)微生物細胞。
“脂類產(chǎn)率增加”是指微生物培養(yǎng)物產(chǎn)量增加，例如通過增加每升培養(yǎng)物的細胞干重、增加生產(chǎn)脂類的細胞的百分比或者增加每單位時間內(nèi)每升培養(yǎng)物體積的脂類總量。
“可操作地連接”是兩個核酸序列之間的功能性連接，所述核酸序列例如控制序列(通常是啟動子)和相連序列(通常是編碼蛋白的序列，也被稱為編碼序列)。如果啟動子可以介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)錄，那么啟動子與外源基因可操作地連接。
“微藻”是含有葉綠體和或者質(zhì)體并且任選地能夠進行光合作用的真核微生物，或者是能夠進行光合作用的原核微生物。微藻包括不能代謝固定碳源作為能量的專性光能自養(yǎng)生物以及完全依靠固定碳源生存的異養(yǎng)生物。微藻包括細胞分裂后即刻與姐妹細胞分離的單細胞生物(例如衣藻(Chlamydomonas))以及例如團藻(Volvox,兩種不同細胞類型簡單多細胞光合微生物)的微生物。微藻包括例如小球藻、杜氏藻(Dunaliella)和原藻的細胞。微藻還包括顯示細胞-細胞粘附的其它光合微生物，例如阿格門氏藻(Agmenellum)、魚腥藻(Anabaena)和桑椹藻(Pyrobotrys`)。微藻還包括喪失進行光合作用的能力的專性異養(yǎng)微生物，例如某些雙鞭甲藻和原藻屬中的物種。
“微生物(Microorganism) ”和“微生物(microbe) ”是用顯微鏡可以看見的單細胞生物體。
“天然油”應(yīng)主要意指從生物體中獲得的甘油三酯油，其中所述油還沒有經(jīng)過與另外的天然油或合成油混合或者沒有經(jīng)過分餾以便大致上改變所述甘油三酯的脂肪酸特性。在此，術(shù)語“分餾”意指以相對于由生物體產(chǎn)生的特性(然而已完成)來改變其脂肪酸特性的方式從油中移除物質(zhì)。天然油包含了從生物體中獲得的這種油，其中所述油已經(jīng)過最低程度的處理，包括精煉、漂白和/或脫膠，這大致上沒有改變其甘油三酯特性。天然油還可以為“非酯交換型天然油”，這意指天然油沒有經(jīng)過一個過程，在所述過程中脂肪酸的與甘油的?；B接已重新分布并且脂肪酸基本上保持與從生物體中回收時相同的結(jié)構(gòu)。
提及兩種蛋白質(zhì)或者基因時的“天然共表達”意指蛋白質(zhì)或者其基因天然共表達于其來源的組織或者生物體中，例如由于編碼這兩種蛋白的基因處于共同調(diào)控序列的控制下，或者由于其響應(yīng)于相同刺激物而表達。
“氧化還原酶途徑”是能夠經(jīng)由木糖醇和木酮糖中間體將木糖轉(zhuǎn)化成木酮糖5-磷酸的蛋白質(zhì)和/或編碼所述蛋白質(zhì)的基因，其包括但不限于木糖還原酶(將木糖轉(zhuǎn)化成木糖醇)、木糖醇脫氫酶(將木糖醇轉(zhuǎn)化成木酮糖)以及木酮糖激酶(將木酮糖轉(zhuǎn)化為木酮糖5-磷酸)。說明性氧化還原酶途徑基因包括但不限于來自樹干畢赤酵母(Pichiastipitis)的 XYL1、XYL2 和 XYL3 基因。
“啟動子”是指導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄的核酸控制序列。本文中使用的啟動子包括轉(zhuǎn)錄起始位點附近的必需核酸序列,在II型聚合酶啟動子的情況下如TATA元件。任選地,啟動子還包括遠端的增強子或者抑制子元件，其可以位于離轉(zhuǎn)錄起始位點遠至數(shù)千堿基對的位置。
“重組”是由于引入外源核酸或者改變天然核酸而被修飾的細胞、核酸、蛋白質(zhì)或者載體。因此，例如重組細胞表達細胞天然(非重組)形式中沒有的基因或者表達與由非重組細胞表達的那些基因不同的天然基因。“重組核酸”是一般通過對核酸進行處理(例如利用聚合酶和核酸內(nèi)切酶)最初于體外形成的核酸，或者除此之外以通常天然不存在的形式?？梢援a(chǎn)生重組核酸，例如用以使兩種或者更多種核酸可操作地連接。因此，就本發(fā)明的目的而言，認為通過使通常天然不會連接的DNA分子相連接而于外體形成的分離的核酸或者表達載體是重組的。重組核酸一經(jīng)制備并引入到宿主細胞或者生物體中，其可以利用宿主細胞體內(nèi)的細胞體系進行復(fù)制；但是，這些核酸一經(jīng)重組產(chǎn)生，盡管其隨后在胞內(nèi)進行復(fù)制，就本發(fā)明的目的而言仍然認為其是重組的。類似地，“重組蛋白”是利用重組技術(shù)制備的蛋白質(zhì)，即通過重組核酸的表達。
“可再生柴油”是烷烴(例如ClO:O、C12:0、C14:0、C16:0和C18:0)的混合物，其通過脂類的加氧作用和脫氧作用產(chǎn)生。
“糖化”是使生物質(zhì)(通常是纖維素生物質(zhì)或者木質(zhì)纖維素生物質(zhì))轉(zhuǎn)化成為單糖(例如葡萄糖和木糖)的過程?！疤腔摹被蛘摺敖饩鄣摹笔侵竿ㄟ^糖化作用已經(jīng)轉(zhuǎn)化成為單糖的纖維素材料或者生物質(zhì)。
“蔗糖利用基因”是當表 達時幫助細胞能夠利用蔗糖作為能量(碳)來源的基因。本文中由蔗糖利用基因編碼的蛋白被稱為“蔗糖利用酶”，并且其包括蔗糖轉(zhuǎn)運體、蔗糖轉(zhuǎn)化酶和己糖激酶(例如葡糖激酶和果糖激酶)。
“木糖異構(gòu)酶途徑”是能夠經(jīng)由木糖中間體將木糖轉(zhuǎn)化成木酮糖-5-磷酸的蛋白質(zhì)和/或編碼蛋白質(zhì)的基因，其包括但不限于木糖異構(gòu)酶(將木糖轉(zhuǎn)化成木酮糖)和木酮糖激酶(將木酮糖轉(zhuǎn)化成木酮糖-5-磷酸)。說明性木糖異構(gòu)酶途徑基因包括但不限于梨囊鞭菌屬(Piromyces sp)基因XylA和樹干畢赤酵母基因XYL3。
“木酮糖-5-磷酸易位體”、“木酮糖-5-磷酸轉(zhuǎn)運體”或者“質(zhì)體戊糖磷酸易位體”是轉(zhuǎn)運木酮糖-5-磷酸的質(zhì)體膜蛋白和編碼這些蛋白質(zhì)的家族。木糖易位體的非限制性實例是編碼來自擬南芥的木酮糖-5-磷酸易位體的XPT基因。
“木糖轉(zhuǎn)運體”是將木糖從細胞培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)運到細胞中的蛋白質(zhì)和編碼這些蛋白質(zhì)的基因并且其包括但不限于被動轉(zhuǎn)運體和主動轉(zhuǎn)運體和易位體。被動轉(zhuǎn)運體在不消耗能量的情況下幫助沿著濃度梯度(從較高濃度區(qū)域到較低濃度區(qū)域)轉(zhuǎn)運分子，并且其包括但不限于樹干畢赤酵母SUTl、SUT2和SUT3轉(zhuǎn)運體以及釀酒酵母(S.cerevisiae)HXT轉(zhuǎn)運體。主動轉(zhuǎn)運體消耗能量以逆濃度梯度(并因此從較低濃度區(qū)域轉(zhuǎn)運到較高濃度區(qū)域)地轉(zhuǎn)運分子。主動轉(zhuǎn)運體包括但不限于使用ATP作為能量來源的初級主動轉(zhuǎn)運體(即ATP結(jié)合序列盒(ABC)轉(zhuǎn)運體)和使用來自化學(xué)滲透梯度的能量的次級主動轉(zhuǎn)運體，并且所述次級主動轉(zhuǎn)運體包括但不限于逆向轉(zhuǎn)運體和同向轉(zhuǎn)運體，即中間假絲酵母(Candida intermedia)的GXSl蛋白、來自擬南芥的H+-同向轉(zhuǎn)運體樣蛋白(例如At5g59250n)以及來自里氏木霉(Trichoderma reesei)的 XLTl 蛋白。
“木糖利用基因”是在表達時幫助細胞利用木糖作為碳源(例如用于產(chǎn)生能量和/或合成代謝)的能力的基因。在本文中由木糖利用基因編碼的蛋白質(zhì)被稱為“木糖利用酶”并且包括木糖轉(zhuǎn)運體、木糖易位體、氧化還原酶途徑蛋白和木糖異構(gòu)酶途徑蛋白。
I1.綜述
本發(fā)明的說明性實施方案通過將木糖利用途徑工程改造到原先缺乏代謝木糖的能力的生物體中而克服了在使用細胞培養(yǎng)物來將木糖轉(zhuǎn)化成高價值的細胞生物質(zhì)方面長期存在的挑戰(zhàn)。在各種方面，本公開內(nèi)容允許將活性木糖代謝途徑工程改造到植物界的生物體中并且尤其是到微生物(在本文中也被稱為微生物)中。這些生物體包括微藻。另一方面，本公開內(nèi)容允許將活性木糖代謝途徑工程改造到具有質(zhì)體和II型脂肪酸生物合成途徑二者的生物體中并且尤其是微生物中。
盡管其他人已經(jīng)在啤酒酵母(Saccharomyce)中使用木糖獲得了乙醇生產(chǎn)，但是這些生物體不適用于脂類的商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。與此相反，微生物如產(chǎn)油酵母和產(chǎn)油微藻可積累按干細胞重量計多于20%的脂類(主要為甘油三酯)。盡管產(chǎn)油酵母適用于生產(chǎn)脂類，但是微藻具有II型脂肪酸生物合成途徑，其有助于使用基因工程改造來定制脂類并且尤其是甘油三酯(由細胞產(chǎn)生)的脂肪酸特性。參見PCT公布W02011/151149、W02010/063032和W02011/15040。除生產(chǎn)脂類之外，本文所述的生物體可用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)、維生素、纖維以及其它天然產(chǎn)生的物質(zhì)或者可用作進一步基因工程改造的結(jié)果。
根據(jù)本發(fā)明的 一個實施方案，外源核酸被引入到具有可操作以產(chǎn)生木酮糖-5-磷酸轉(zhuǎn)運體(例如，木酮糖-5-磷酸易位體)蛋白的質(zhì)體的細胞中，所述轉(zhuǎn)運體蛋白可操作以引起木酮糖-5-磷酸轉(zhuǎn)運到細胞的質(zhì)體中。在一個特定的實施方案中，所述細胞用編碼可操作地連接有質(zhì)體靶向序列的木酮糖-5-磷酸轉(zhuǎn)運體的外源DNA轉(zhuǎn)化。所述質(zhì)體靶向序列可將轉(zhuǎn)運體蛋白引到質(zhì)體膜(優(yōu)選內(nèi)部質(zhì)體膜)中以便將木酮糖5-磷酸有效地轉(zhuǎn)運到可代謝它并且可能使之代謝成脂肪酸的質(zhì)體中。例如，所述生物體在代謝木酮糖-5-磷酸的質(zhì)體中可具有內(nèi)源性戊糖代謝途徑。如以下實施例所示的，已發(fā)現(xiàn)這是在細胞生長和/或脂類產(chǎn)生的同時促進木糖利用的有效方法。
任選地或者此外，這些細胞能夠從外部環(huán)境中攝取木糖并將木糖轉(zhuǎn)化成木酮糖-5-磷酸?？赡苄枰庠椿騺懋a(chǎn)生執(zhí)行這些功能的活性蛋白。例如且如以下實施例所述，這些細胞可以用可操作以編碼用于將木糖從外部培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)運到細胞中的活性木糖轉(zhuǎn)運體和用于將木糖轉(zhuǎn)化成木酮糖-5-磷酸的途徑的DNA轉(zhuǎn)化。例如，用于將木糖轉(zhuǎn)化成木酮糖-5-磷酸的途徑可以是用于將木酮糖轉(zhuǎn)化成木酮糖-5-磷酸的木酮糖激酶與用于將木糖轉(zhuǎn)化成木酮糖的途徑的組合。用于將木糖轉(zhuǎn)化成木酮糖的途徑可包括木糖異構(gòu)酶或者木糖還原酶與木糖醇脫氫酶的組合。可選地，木糖轉(zhuǎn)運到細胞中可依賴于天然蛋白(如己糖轉(zhuǎn)運體蛋白)的活性。
任選地，在任何以上實施方案的另一改進中，可以轉(zhuǎn)化這些細胞以表達活性木糖醇脫氫酶。這個修改可用于減小或消除木糖醇對木糖異構(gòu)酶的抑制。
各種基因可整合到生物體的染色體中或者可以是游離基因。優(yōu)選地，這些基因穩(wěn)定的表達并且可以是多個拷貝。在各種實施方案中，這些基因處于可調(diào)節(jié)啟動子或者組成型啟動子的控制下。轉(zhuǎn)化之后并且任選地為了維持穩(wěn)定性，這些細胞可以用可篩選標記轉(zhuǎn)化。
這些細胞在異養(yǎng)生長的條件下能夠繁殖和/或積累脂類。任選地，這些細胞可以為專性異養(yǎng)生物的細胞(如微藻原藻屬的細胞)。例如這些細胞可以為桑椹形原藻的那些細胞。在以下實施例中，轉(zhuǎn)化原藻細胞以表達活性木糖代謝途徑。然而應(yīng)注意，本發(fā)明的實施方案適用于很多其它物種。優(yōu)選物種包括植物界、綠色植物亞界、綠藻下界或綠藻門、利藻亞門、四胞藻綱或者小球藻目的那些物種。特定實例包括桑椹形原藻(Prototheca moriformis)和原殼小球藻(Chlorella protothecoides)。
在一個優(yōu)選實施方案中，所獲得的重組生物體在使用葡萄糖作為碳源來培養(yǎng)時能夠積累按干細胞重量計至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%的甘油三酯。另外，所述生物體在純木糖上培養(yǎng)時能夠積累按干細胞重量計至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%的甘油三酯。例如，微生物在作為碳源的葡萄糖上培養(yǎng)時可以能夠積累按干細胞重量計至少50%的甘油三酯并且在純木糖上培養(yǎng)時能夠積累按干細胞重量計至少20%的甘油三酯。在另一個實施方案中，當重組生物體的細胞在氮限制條件下在60%為葡萄糖且40%為木糖的碳源上培養(yǎng)時，如通過同位素示蹤所測量，這些細胞產(chǎn)生其中碳原子的至少5%、10%、20%、30%、40%或50%來源于木糖的碳原子的脂類。在另一個實施方案中，所述重組生物體的細胞在少于或等于35天、28天、21天、14天或7天中在具有2.5%木糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基中能夠消耗至少90%的木糖。
除了引入木糖代謝途徑之外，還可以通過引入可操作以改變由微生物產(chǎn)生的脂類的脂肪酸特性的基因來對所述生物體進行基因工程改造。因此，木糖可以轉(zhuǎn)化成具有改變的脂肪酸特性的?；视王?。例如，這些細胞可具有包含編碼活性?；?ACP硫酯酶、酮脂酰-ACP合成酶或者脂肪酸去飽和酶的一個或多個外源基因的重組修飾?？蛇x地或者除此之外，這些細胞可具有可操作以減少或消除?；?ACP硫酯酶、酮脂酰-ACP合成酶或者脂肪酸去飽和酶的重組修飾。用于執(zhí)行這些基因操作的方法提供于PCT公布W02011/151149、W02010/063032 和 W02011/15040 中。
在一個優(yōu)選實施方案中，在含有木糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些木糖代謝細胞。因此，產(chǎn)生了生物質(zhì)。在一個特定實施方案中，木糖`被轉(zhuǎn)化成細胞生物質(zhì)并且具體地說是甘油三酯。這可以通過同位素示蹤來顯示，例如使用同位素標記的木糖。為了產(chǎn)生甘油三酯，可以在營養(yǎng)物受限的條件下(例如在氮限制下)培養(yǎng)產(chǎn)油微生物。收獲所生成的天然油。收獲可包括用于釋放油的細胞裂解。然后所述油可用于生產(chǎn)油類化學(xué)品、潤滑劑、清潔劑、燃料、食品、化妝品成分或其它產(chǎn)品。例如，所述油可用于生產(chǎn)生物柴油(脂肪酸酯)或者可再生柴油(通過裂化由油產(chǎn)生的燃料)。
在一個實施方案中，所述方法包括在包含多于50%為木糖的碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些細胞。例如，所述碳源可以多于55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%為木糖。
因此，本發(fā)明的一個特定實施方案包括具有質(zhì)體和通過引入和表達外源基因而產(chǎn)生的可操作的木糖代謝途徑的微生物。這些基因具有將木糖轉(zhuǎn)化成木酮糖-5-磷酸并將木酮糖-5-磷酸轉(zhuǎn)運到質(zhì)體中以用于進一步代謝的活性。所述微生物任選地具有將木糖從外部環(huán)境中轉(zhuǎn)運到細胞中的木糖轉(zhuǎn)運體。作為表達外源基因的結(jié)果，所述細胞能夠在純木糖上生長并且在例如21天、14天或7天或更少天數(shù)內(nèi)在具有2.5%木糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基中優(yōu)選可以消耗至少90%的木糖。II1.培養(yǎng)
本發(fā)明大體涉及產(chǎn)油微生物的培養(yǎng),所述微生物包括但不限于微藻、產(chǎn)油酵母、產(chǎn)油真菌以及產(chǎn)油細菌。在一些實施方案中，微藻品種特別是重組小球藻和原藻品種適于生產(chǎn)脂類。為了便于閱讀，本章分為幾節(jié)。第I節(jié)描述了原藻物種和品種，以及如何通過基因組DNA的比較來鑒定新的原藻物種和品種以及相關(guān)微藻。第2節(jié)描述了用于培養(yǎng)的生物反應(yīng)器。第3節(jié)描述了培養(yǎng)基。第4節(jié)描述了依照本發(fā)明的說明性培養(yǎng)方法生產(chǎn)油類。
1.原藻物種和品種
原藻是用于生產(chǎn)脂類的標志性微生物，因為其可以產(chǎn)生大量脂類，特別是適用于生產(chǎn)燃料的脂類。與由其它微藻生產(chǎn)的脂類相比，由原藻生產(chǎn)的脂類具有更短長度和更高飽和度的碳氫鏈。此外，原藻脂類一般不含色素(葉綠素和某些類胡蘿卜素低至不可檢出水平)，而且在任何情況下其色素含量遠遠少于來源于其它微藻的脂類。此外，相對于由其它微藻生產(chǎn)脂類，本發(fā)明中提供的重組原藻細胞基于它們增加的利用木糖作為碳源的能力，其可以以更高產(chǎn)率和效率以及更低成本生產(chǎn)脂類。此外，這種微藻可以異養(yǎng)生長并且可以經(jīng)過基因工程改造。本發(fā)明方法中使用的說明性原藻品種包括魏氏原藻(Protothecawickerhamii)、大型原藻(包括UTEX327)、波多黎各原藻(Prototheca portoricensis)、桑椹形原藻(包括UTEX品種1441，1435)和小型原藻。原藻屬的物種是專性異養(yǎng)型。
可以通過擴增基因組的特定靶區(qū)域來鑒定本發(fā)明中使用的原藻物種。例如，可以通過利用引物和利用基因組任意區(qū)域的方法(例如利用Wu等，Bot.Bull.Acad.Sin.(2001)42:115-121Identification of Chlorella spp.1solates using ribosomal DNAsequences中描述的方法)對核和/或綠葉體DNA進行擴增和測序，來鑒定特定的原藻物種或者品種。本領(lǐng)域技術(shù)人員使用公認的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析方法(例如對核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS1和ITS2rDNA)、23S rRNA、18S rRNA和其它保守的基因組區(qū)域進行擴增和測序)，不僅可以鑒定原藻物種，還可以鑒定具有相似脂類特性和生產(chǎn)能力的生產(chǎn)碳氫化合物和脂類的其它生物體。對藻類進行鑒定和分類的方法實例還可以見于例如Genetics, 2005年8月；170(4):1601-10 和 RNA, 2005 年 4 月；11 (4):361-4。
因此，可以利用基因組DNA比較來鑒定本發(fā)明中使用的適宜微藻物種。可以從微藻物種中擴增基因組DNA的保守區(qū)域(例如但不限于編碼23SrRNA的DNA)，并比較共有序列，用以篩選與本發(fā)明中使用的優(yōu)選微藻在分類學(xué)上相關(guān)的微藻物種。對于原藻屬物種的這種DNA序列比較的實例顯示于下面。基因組DNA比較還可以用于鑒定品種保藏中錯誤鑒定的微藻物種。品種保藏通?；诒硇吞卣骱托螒B(tài)特征鑒定微藻物種。使用這些特征可能導(dǎo)致對微藻屬或者物種進行錯誤分類。使用基因組DNA比較是基于系統(tǒng)發(fā)生學(xué)關(guān)系對微藻物種進行分類的較好方法。
本發(fā)明中使用的微藻通常具有編碼與SEQ ID NO: 1-9中列出的至少一個序列具有至少99%、至少95%、至少90%或者至少85%核苷酸同一性的23S rRNA的基因組DNA序列。
對于使用序列比較來確定核苷酸或者氨基酸同一性，通常以一種序列作為參照序列，測試序列與其進行比較。當使用序列比較算法時，將測試序列和參照序列輸入計算機中，指定子序列坐標(如果需要)，并且指定序列算法的程序參數(shù)。隨后基于指定的程序參數(shù)計算測試序列相對于參考序列的序列同一性百分比。
可以例如通過局部同源性算法(Smith&ffaterman, Adv.App1.Math.2:482 (1981))、同源性比對算法(Needleman&ffunsch, J.Mol.Biol.48:443 (1970))、相似性搜索方法(Pearson&Lipman, Proc.Nat，1.Acad.Sc1.USA85:2444 (1988))、計算機實施的這些方法(GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA, Wisconsin Genetics Software Package, GeneticsComputer Group, 575Science Dr., Madison, WI)或者通過目檢(一般見于上文Ausubel 等)來進行比較序列的最佳比對。
適于確定序列同一性和序列相似性百分比的另外一種算法實例是BLAST算法，其描述于 Altschul 等，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中。進行 BLAST 分析的軟件可以在National Center for Biotechnology Information 上(網(wǎng)址是 www.ncb1.nlm.nih.gov)公開獲得。這種算法包括首先通過鑒定查詢序列中長度為W的短詞來鑒定高分數(shù)序列對(HSPs)，所述短詞在與數(shù)據(jù)庫序列中具有相同長度的詞比對時匹配或滿足某些正值的閾值分數(shù)T。T是指鄰域詞分數(shù)閾值(上文Altschul等)。這些初始鄰域詞命中作為種子啟動搜索，用以尋找含有它們的較長HSP。接著該詞命中沿著每條序列在兩個方向延伸，遠至能夠提高累積比對分數(shù)。對于核苷酸序列，利用參數(shù)M(—對匹配殘基的獎勵分數(shù)，通常>0)和N(非配對殘基的罰分，通?！碠)計算累積分數(shù)。對于氨基酸序列，使用分數(shù)矩陣計算累積分數(shù)。每個方向上詞命中的延伸在下列情況時停止:當累積比對分數(shù)由其達到的最大值降低數(shù)量X ;由于一個或者多個殘基比對負值的積累而使累積分數(shù)降至0或者以下；或者達到任一序列的末端。對于鑒定核酸或者多肽是否在本發(fā)明的范圍內(nèi)，BLAST程序的默認參數(shù)是合適的。BLAST程序(對于核苷酸序列)使用的默認值是詞長(W)為11，期望值(E)為10，M=5，N=-4和進行兩條鏈的比較。對于氨基酸序列，BLASTP程序使用的默認值是詞長(W)為3，期望值(E)為10和BL0SUM62分數(shù)矩陣。TBLATN程序(對于核苷酸序列，利用其蛋白序列)使用的默認值是詞長(W)為3，期望值(E)為10和BL0SUM62分數(shù)矩陣(參見Henikoff&Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10915(1989))。
除了計算序列同一性百分 比之外，BLAST算法還可以進行兩個序列之間相似性的統(tǒng)計學(xué)分析(例如參見 Karlin&Altschul, Proc.Nat，1.Acad.Sc1.USA90:5873-5787 (1993))。BLAST算法提供的一種相似性測定是最小總和概率(P (N))，其表示通過兩個核苷酸或者核酸序列之間偶然發(fā)生配對的概率。例如，如果測試核酸與參照核酸比較的最小總和概率小于約0.1，更優(yōu)選小于約0.01，最優(yōu)選小于約0.001，則認為該核酸與參照序列是相似的。
除了生產(chǎn)合適的脂類或者碳氫化合物以生產(chǎn)油類、燃料和油脂化工產(chǎn)品之外，影響對本發(fā)明中使用的微生物進行選擇的其它考慮因素包括:(I)脂類含量高(以細胞重量計算)；(2)易于生長；(3)易于進行基因工程改造；(4)易于對生物質(zhì)進行處理。在特定的實施方案中，野生型或者經(jīng)基因工程改造的微生物生產(chǎn)具有至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%或者至少70%或者更多的脂類。優(yōu)選生物體是異養(yǎng)生長型(不存在光下生長于糖類中)。
2.生物反應(yīng)器
以進行遺傳學(xué)操作和生產(chǎn)碳氫化合物(例如脂類、脂肪酸、醛、醇和烷烴)二者為目的培養(yǎng)微生物。前面一種類型的培養(yǎng)以小規(guī)模并且最初至少在起始微生物可以生長的條件下進行。以生產(chǎn)碳氫化合物為目的的培養(yǎng)通常以大規(guī)模(例如10，000L.40, 000LU00, 000L或者更大的生物反應(yīng)器)在生物反應(yīng)器中進行。通常利用本發(fā)明的方法在生物反應(yīng)器內(nèi)的含有木糖的液體培養(yǎng)基中對原藻進行培養(yǎng)。在一個實施方案中，在生物反應(yīng)器中使用分批補料法對微藻(如原藻)進行培養(yǎng)。生物反應(yīng)器通常不允許光進入，并且在大致上沒有光的情況下對所述微生物進行異養(yǎng)培養(yǎng)，以代謝固定碳源。
使用生物反應(yīng)器或者發(fā)酵罐來培養(yǎng)微藻細胞，通過其生理周期的多個階段。在異養(yǎng)生長和繁殖方法中使用生物反應(yīng)器提供很多優(yōu)勢。為了生產(chǎn)用于食品中的生物質(zhì)，優(yōu)選在液體中(例如在懸浮培養(yǎng)基中)大量發(fā)酵微藻。生物反應(yīng)器(例如不銹鋼發(fā)酵罐)可以容納非常大的培養(yǎng)體積(本發(fā)明的多個實施方案中使用具有40，000升和更大能力的生物反應(yīng)器)。生物反應(yīng)器通常還使得可以控制培養(yǎng)條件，例如溫度、PH值、氧壓和二氧化碳水平。例如，生物反應(yīng)器通常是可配置的，例如利用與管道連接的接口，以允許氣體組分(例如氧氣或者氮氣)通過液體培養(yǎng)物起泡。利用生物反應(yīng)器還可以更容易地對其它培養(yǎng)參數(shù)(例如培養(yǎng)基的PH值、微量元素的類型和濃度以及其它培養(yǎng)基組分)進行控制。
生物反應(yīng)器可以配置成使培養(yǎng)基在微藻復(fù)制和數(shù)量增加期間流過生物反應(yīng)器。例如在一些實施方案中，可以在接種后但是在細胞達到期望密度之前將培養(yǎng)基注入生物反應(yīng)器中。在其它情況下，培養(yǎng)初始時將培養(yǎng)基充滿生物反應(yīng)器，并且在接種培養(yǎng)物后不再注入培養(yǎng)基。換言之，使微藻生物質(zhì)在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間，其間微藻復(fù)制并且數(shù)量增加；但是，在這期間沒有大量的液體培養(yǎng)基流過生物反應(yīng)器。因此在一些實施方案中，接種后沒有液體培養(yǎng)基流過生物反應(yīng)器。
可以利用裝配有例如旋轉(zhuǎn)刀和旋槳、振蕩器、攪拌棒、用于將氣體增壓注入的裝置等設(shè)備的生物反應(yīng)器使微藻培養(yǎng)物混合。混合可以是連續(xù)性的或者周期性的。例如，在一些實施方案中，沒有維持氣體進入和培養(yǎng)基進入的紊流條件，直至所述微藻數(shù)量的增加達到期望水平。
可以使用生物反應(yīng)器接口引入或者提取氣體、固體、半固體和液體至含有微藻的生物反應(yīng)室中。由于很多生 物反應(yīng)器具有多于一個接口(例如一個用于培養(yǎng)基進入，另一個用于取樣)，僅使一種物質(zhì)進入或者保留一個接口是沒有必要的。例如，可以使用一個接口使培養(yǎng)基流入生物反應(yīng)器中并且隨后用于取樣、進氣、排氣或者其它目的。優(yōu)選可以重復(fù)使用取樣口，不會改變妥協(xié)培養(yǎng)物的無菌性質(zhì)。取樣口可以配置成具有閥門或者具有使樣品停止和開始流動或者提供連續(xù)取樣裝置的其它設(shè)備。通常生物反應(yīng)器具有允許接種培養(yǎng)物的至少一個接口，并且這種接口還可以用于其它目的，例如培養(yǎng)基進入或者氣體進入。
生物反應(yīng)器接口使得可以控制微藻培養(yǎng)物的氣體含量。舉例而言，生物反應(yīng)器的部分體積可以是氣體而非液體，并且生物反應(yīng)器的氣體入口允許將氣體泵入生物反應(yīng)器中。可以有益地泵入生物反應(yīng)器中的氣體包括空氣、空氣/CO2混合物、隋性氣體(例如氬氣)和其它氣體。通常生物反應(yīng)器裝配成使得使用者能夠控制氣體進入生物反應(yīng)器的速率。如上面提到，可以通過增加流入生物反應(yīng)器的氣體來促進培養(yǎng)物混合。
氣體流動增加還影響培養(yǎng)物的濁度。通過在液體培養(yǎng)基層下放置一個進氣口以使進入生物反應(yīng)器的氣體在培養(yǎng)物表面起泡，可以產(chǎn)生紊流。一個或者多個排氣口使氣體可以泄漏，因此防止生物反應(yīng)器中壓力累積。優(yōu)選排氣口通向防止雜質(zhì)微生物進入生物反應(yīng)器的止回管道。
3.培養(yǎng)基
微藻培養(yǎng)基通常含有例如固定氮源、固定碳源、微量元素、任選地維持PH值的緩沖液和磷酸類物質(zhì)(通常以磷酸鹽提供)等組分。其它組分可以包括鹽(例如氯化鈉)，特別是對于海水微藻。氮源包括有機和無機氮源，其例如包括但不限于分子氮、硝酸、硝酸鹽、氨(純氨水或者鹽形式，例如(NH4)2S04和NH40H)、蛋白質(zhì)、大豆粉、玉米漿和酵母提取物。微量元素的實例包括鋅、硼、鈷、銅、錳和鑰，例如分別以ZnCl2,H3BO3^CoCI2.6H20、CuC12.2H20、MnCl2 ? 4H20 和(NH4)6Mo7O24 ? 4H20 的形式提供。
一般可以從多種來源獲得固體和液體生長培養(yǎng)基，而且可以適用于多種微生物品種的特定培養(yǎng)基的制備方法可以在 http://www.utex.0rg/(由 Austin, IUniversity StationA6700, Austin, Texas, 78712-0183 處的 University of Texas 維護的站點)中的藻類培養(yǎng)物保藏中心(UTEX)在線找到。例如，多種淡水和鹽水培養(yǎng)基包括描述于PCT公布號為2008/151149中的培養(yǎng)基，其以引入方式并入本文。
在一個特定的實施例中，Proteose培養(yǎng)基適用于進行無菌培養(yǎng)，并且可以通過將Ig蛋白胨加入到I升Bristol培養(yǎng)基中來制備IL體積的培養(yǎng)基(pH~6.8)。Bristol培養(yǎng)基包含水溶液中的 2.94mM NaN03、0.17mM CaCl2 ? 2H20、0.3mM MgSO4 ? 7H20、0.43mM、l.29mMKH2PO4和1.43mM NaCl。對于1.5%的瓊脂培養(yǎng)基，可以將15g瓊脂加入到IL溶液中。將培養(yǎng)基蓋好并進行高壓滅菌，并且隨后在使用前儲存于冷藏溫度中。另一個實例是原藻分離培養(yǎng)基(P頂)，其包含10g/L苯二甲酸氫鉀(KHP)、0.9g/L氫氧化鈉、0.lg/L硫酸鎂、0.2g/L磷酸氫鉀、0.3g/L氯化銨、10g/L葡萄糖、0.00lg/L鹽酸硫胺素、20g/L瓊脂、0.25g/L5-氟胞嘧啶，pH 值范圍是 5.0 至 5.2 (參見 Pore, 1973，App.Microbiology, 26:648-649)。通過咨詢上面顯示的URL或者通過咨詢保藏微生物培養(yǎng)物的其它組織(例如SAG、CCAP或者CCALA)，可以容易地鑒定適用于本發(fā)明方法中的其它培養(yǎng)基。SAG是指在University
of Gottingen ( Gottingen, Germany)處的 Culture Collection of Algae, CCAP 是指由Scottish Association for Marine Science (Scotland, United Kingdom)管理的藻類和原生動物培養(yǎng)物保藏中心，并且CCALA是指在Institute of Botany ( Tr ebo n，CzechRepublic)處 的藻類培養(yǎng)物保藏實驗室。此外，美國專利號5，900，370描述了適合原藻物種異養(yǎng)發(fā)酵的培養(yǎng)基配方和條件。
對于油類生產(chǎn)，選擇固定碳源十分重要，因為固定碳源的成本必須足夠低，以經(jīng)濟地進行油類生產(chǎn)。在一個實施方案中，固定碳源是木糖。木糖是作為半纖維素的組分發(fā)現(xiàn)的五碳單糖。半纖維素是在幾乎所有的植物細胞壁(包括約30%的全部植物物質(zhì))中發(fā)現(xiàn)的復(fù)合多糖。除木糖之外，也可包括其它碳源，例如乙酸酯、紅藻糖苷、果糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖、鼠李糖、蔗糖和/或木糖時，選擇含有這些化合物(特別是木糖)的原料是本發(fā)明方法中的一個重要方面。
根據(jù)本發(fā)明使用的其它適宜原料包括例如黑液、玉米淀粉、解聚的纖維素材料、奶漿、糖蜜、馬鈴薯、高粱、蔗糖、甜菜、甜菜汁、甘蔗、甘蔗汁、濃甘蔗汁、稻米和小麥。還可以以混合物形式提供碳源，如蔗糖或木糖與解聚的甜菜漿、解聚的纖維素材料等的混合物?？梢栽谝环N或多種外源提供的固定碳源的濃度為至少約50 u M、至少約100 u M、至少約250 u M、至少約500 u M、至少約ImM、至少約2.5mM、至少約5mM、至少約10mM、至少約25mM、至少約50mM、至少約100mM、至少約250mM以及至少約500mM的情況下供應(yīng)所述一種或多種碳源。在一些情況下，可以在外源提供的固定碳源的濃度為至少約100g/L、至少約200g/L、至少約300g/L、至少約400g/L、至少約500g/L、至少約600g/L、至少約700g/L、至少約800g/L或者更大的情況下將作為分批發(fā)酵的原料的一種或多種碳源供應(yīng)到發(fā)酵培養(yǎng)物中。對于本發(fā)明目的特別優(yōu)選的碳源包括木糖、解聚的纖維素材料、甘油、葡萄糖、蔗糖和高粱，下面對其中的每一種進行更加詳細的討論。
根據(jù)本發(fā)明，可以利用解聚的纖維素生物質(zhì)作為原料來培養(yǎng)微生物。纖維素生物質(zhì)(例如干草，如玉米干草)是廉價并且易于獲得的。微藻可以在經(jīng)過加工的纖維素材料上生長，并且本發(fā)明的微藻被特別設(shè)計成高效地利用木糖作為碳源。纖維素材料一般包括約40-60%的纖維素、約20-40%的半纖維素和10-30%的木質(zhì)素。
適宜的纖維素材料包括來源于草本和木本能源作物以及農(nóng)作物的剩余物(不是從主要的食物或者纖維產(chǎn)品田地中取下的)，即植物器官、初生莖和初生葉。實例包括農(nóng)業(yè)廢棄物(例如甘蔗渣、稻米殼、玉米纖維(包括莖、葉、殼和棒)、小麥秸桿、稻米秸桿、甜菜漿、柑橘漿、柑橘皮)、林業(yè)廢棄物(例如硬木和軟木間伐材以及木材處理時的硬木和軟木剩余物)、木材廢棄物(例如鋸木廠廢棄物(木片、鋸末)和紙漿廠廢棄物)、城市廢棄物(例如城市固體廢棄物的紙質(zhì)部分、城市木質(zhì)廢棄物和城市綠色廢棄物(例如城市剪草))和木材建筑廢棄物。其它纖維素材料包括專門的纖維素作物，例如柳枝稷、雜交白楊木和芒草、纖維甘蔗和纖維高粱。從這些材料中生產(chǎn)的五碳糖包括木糖。
可以對纖維素材料進行處理，以增加微生物利用這些物質(zhì)中所含糖類的效率。如上面所討論，木質(zhì)纖維素生物質(zhì)由多種組分組成，包括纖維素(3-1，4連接的葡萄糖(一種六碳糖)的一種晶體多聚物)、半纖維素(較松散連接的多聚物，主要由木糖(一種五碳糖)組成并且含有少量的甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖)、木質(zhì)素(一種復(fù)雜的芳香族多聚物，由芥子醇和其衍生物組成)和果膠(a -1，4連接的直鏈多聚半乳糖醛酸)。由于纖維素和半纖維素具有多聚結(jié)構(gòu)，其中所含糖類(例如單糖葡萄糖和木糖)的形式不能被很多微生物有效利用。對于這些微生物，對纖維素生物質(zhì)進行進一步加工以產(chǎn)生構(gòu)成多聚物的單糖有助于保證纖維素材料作為原料(碳源)能夠被有效利用。
纖維素或纖維素生物質(zhì)可以經(jīng)受被稱為“汽爆”的過程，其中在高溫和高壓下用稀硫酸(或者其它)處理生物質(zhì)。該過程使得生物質(zhì)中的纖維素和半纖維素組分能夠被有效地酶促水解成為葡萄糖和木糖單體。所得到的單`糖被稱為纖維素糖。隨后纖維素糖被微生物利用，產(chǎn)生大量代謝物(例如脂類)。酸汽爆步驟使得半纖維素組分部分水解成為組成其的單糖。進一步處理后，這些糖類可以完全從生物質(zhì)中釋放出來。在一些實施方案中，進一步處理是熱水處理，其包括用熱水對經(jīng)汽爆的材料進行清洗，去除雜質(zhì)(例如鹽)。該步驟對于纖維素乙醇發(fā)酵來說是不必要的，因為該過程中使用較高稀釋度的糖濃度。在其它實施方案中，進一步處理是額外的酸處理。在其它實施方案中，進一步處理是對經(jīng)汽爆的材料進行酶促水解。這些處理還可以結(jié)合使用。處理類型可以影響釋放的糖類型(例如五碳糖對六碳糖)和處理過程中糖類釋放的階段。因此，可以產(chǎn)生不同的糖流，無論其主要是五碳糖或者六碳糖。這些經(jīng)富集的五碳糖或者六碳糖流因而可以針對具有不同碳利用能力的特定微生物。在本發(fā)明的方法的某些實施方案中，優(yōu)選富含五碳木糖的物流。在其它實施方案中，可以組合已糖化的含有五碳糖、六碳糖或者五碳糖/六碳糖的組合的不同糖流，以用于在微生物發(fā)酵中生產(chǎn)高細胞密度的產(chǎn)生脂類的微生物生物質(zhì)。
涉及脂類生產(chǎn)的本發(fā)明的實施方案可包括發(fā)酵以產(chǎn)生高于乙醇發(fā)酵中所達到的細胞密度的細胞密度。由于用于異養(yǎng)纖維素油類生產(chǎn)的培養(yǎng)物密度較高，優(yōu)選固定碳源(例如纖維素來源的糖流)呈濃縮形式。例如，在培養(yǎng)步驟之前在原料中解聚的纖維素材料中的葡萄糖濃度、或木糖濃度或者葡萄糖和木糖的總濃度可以是至少約100g/升、至少約200g/升、至少約300g/升、至少約400g/升、至少約500g/升、至少約600g/升、至少約700g/升、至少約800g/升或者更多的葡萄糖或者木糖或者葡萄糖與木糖的組合，所述培養(yǎng)步驟任選地是分批補料式培養(yǎng)，其中隨著細胞生長和積累脂類的時間將材料供給到細胞中。這些糖化方法的各種方法和用于加工纖維素材料以在微生物發(fā)酵中使用的其它方法描述在美國專利申請公布20100151112中。
纖維素物質(zhì)的汽爆處理過程利用大量的硫酸、熱和壓力，因而釋放碳水化合物的副產(chǎn)物，稱為糠醛和羥甲基糠醛?？啡┖土u甲基糠醛在半纖維素水解過程期間通過木糖降解成為糠醛和水而產(chǎn)生。然而在本發(fā)明的方法的很多實施方案中這種木糖損失是不希望的，這樣使得在使用它們時采用非汽爆過程抑或使糠醛和羥甲基糠醛的產(chǎn)生減至最少，在引入生物反應(yīng)器之前，可以從糖化的木質(zhì)纖維素材料中去除這些副產(chǎn)物(例如糠醛和羥甲基糠醛)，并且通過美國專利申請公布20100151112中描述的方法可以減小由汽爆過程引起的纖維素材料的導(dǎo)電性。
在其它實施方案中，對汽爆過程自身進行改變，以避免產(chǎn)生出乎意料地高水平的鹽。例如，纖維素生物質(zhì)的硫酸(或者其它酸)汽爆的適宜替代步驟是機械漿化，以使纖維素生物質(zhì)能夠進行酶促水解(糖化)。在其它實施方案中，使用能夠抵抗高水平鹽的微生物天然品種或者能夠抵抗高水平鹽的基因工程改造的品種。處理纖維素糖以使得其適合用作本發(fā)明的濃縮原料的方法的一個非限制性實例描述在美國專利申請公布20100151538中，所述申請以引用的方式并入本文。在一個實施方案中，糖化的木質(zhì)纖維素糖經(jīng)過處理以減少毒素(例如，糠醛和羥甲基糠醛)和鹽二者的水平并且然后將其濃縮至濃縮糖流或者固定碳源原料中至少600g/L或更多糖單體的濃度。在其它實施方案中，這些濃縮的糖化木質(zhì)纖維素糖具有小于700mM鈉等同物的鹽水平。在其它實施方案中，這些濃縮的糖化木質(zhì)纖維素糖具有小于IOOmM鈉等同物、小于200mM鈉等同物、小于300mM鈉等同物、小于400mM鈉等同物、小于500mM鈉等同物、小于600mM鈉等同物、小于700mM鈉等同物或者小于1000mM鈉等同物的鹽水平。在其它實施方案中，這種濃縮的糖化木質(zhì)纖維素糖原料具有小于20，000 u S/cm、小于 15，000 u S/cm、小于 10，000 u S/cm、小于 7，500 u S/cm、小于 5，000 u S/cm、小于1000ii S/cm、小于500 y S/cm、小于300 y S/cm或者小于200 y S/cm的導(dǎo)電率的導(dǎo)電性。在其它實施方案中，這種濃縮糖化的木質(zhì)纖維素糖原料富含五碳糖單體或者六碳糖單體或者五碳與六碳糖單體的組合。
在本發(fā)明方法的另一個實施方案中，碳源包括甘油，例如由生物柴油轉(zhuǎn)酯基作用產(chǎn)生的酸化和未酸化的甘油副產(chǎn)物。在一個實施方案中，碳源包括甘油和木糖。在一些情況下，在發(fā)酵開始時將所有的甘油和木糖提供給微生物。在一些情況下，將甘油和木糖以預(yù)定比率同時提供給微生物。在一些情況下，在發(fā)酵過程中將甘油和木糖以預(yù)定比率供給微生物。
一些微藻在甘油存在下比在另一種碳源如葡萄糖存在下的細胞分裂更快(參見PCT公布號2008/151149)。在這對于甘油和木糖確實如此的情況下，兩階段生長方法(其中首先將甘油供給細胞以使其細胞密度快速增長，并且隨后將木糖供給細胞，以積累脂類)可以提高脂類生產(chǎn)的效率。利用轉(zhuǎn)酯基方法的甘油副產(chǎn)物當投回到生產(chǎn)過程中時具有顯著的經(jīng)濟優(yōu)勢。還提供了其它供給方法，例如將甘油和木糖混合。供給這種混合物也具有相同的經(jīng)濟益處。因此，本發(fā)明提供了以替代糖類(如木糖與甘油的各種組合)供給微藻的方法。
在本發(fā)明的方法的各種實施方案中，碳源是木糖，包括含有木糖的復(fù)合原料，如來源于纖維素的材料。在一個實施方案中，培養(yǎng)基進一步包含至少一種木糖利用酶。使用含有木糖的復(fù)合原料可以顯著節(jié)省碳氫化合物和其它油類生產(chǎn)的成本。
4.油類生產(chǎn)
對于根據(jù)本發(fā)明的方法進行油類生產(chǎn)，優(yōu)選在黑暗中(或者在大致上沒有光的情況下)培養(yǎng)細胞，例如當使用不允許光照射培養(yǎng)物的極大(40，OOO升或者更大)發(fā)酵罐時就是如此。專性異養(yǎng)生物物種如原藻物種在含有固定碳源的培養(yǎng)基中且在沒有光的情況下生長和繁殖，以生產(chǎn)油類；已知這種生長是異養(yǎng)生長。
作為實例，將產(chǎn)脂微藻細胞的接種物引入培養(yǎng)基中；細胞開始繁殖前存在延遲期(延遲相)。延遲期后，繁殖速率穩(wěn)定增加，進入對數(shù)期或者指數(shù)期。指數(shù)期后，由于營養(yǎng)物質(zhì)(例如氮)減少、毒性物質(zhì)增加以及群體感應(yīng)機制，繁殖減慢。減慢后，繁殖停止，依賴于向細胞提供的特定環(huán)境，細胞進入靜止期或者平穩(wěn)生長狀態(tài)。為了獲得脂類富集的生物質(zhì)，通常在指數(shù)期結(jié)束之后收集培養(yǎng)基，可以通過使氮或者另一種關(guān)鍵營養(yǎng)物質(zhì)(除了碳之外)耗盡從而迫使細胞將過量存在的碳源轉(zhuǎn)化成為脂類，使指數(shù)期較早終止。可以控制培養(yǎng)條件參數(shù)，以使總體油類生產(chǎn)、所產(chǎn)生的脂類組合物和/或特定油類的生產(chǎn)達到最佳。
如上面所討論，使用生物反應(yīng)器或者發(fā)酵罐，以使細胞進入其生長循環(huán)的多個時期。作為實例，將產(chǎn)脂細胞的接種物引入培養(yǎng)基中，隨后在細胞開始生長前進入延遲時期(延遲期)。延遲期后，繁殖速率平穩(wěn)增加，進入對數(shù)期或者指數(shù)期。指數(shù)期后，由于營養(yǎng)物質(zhì)減少和/或毒性物質(zhì)增加，生長減慢。減慢后，生長停止，依賴于向細胞提供的特定環(huán)境，細胞進入靜止期或者平穩(wěn)狀態(tài)。本文公開的細胞的脂類生產(chǎn)可以發(fā)生于對數(shù)期過程中或者其后，包括靜止期，其中提供或者仍然可獲得營養(yǎng)成分，以使細胞在不分裂的情況下能夠持續(xù)生產(chǎn)脂類。
優(yōu)選地，利用本文中描述且本領(lǐng)域已知的條件生長的微生物包含至少約20%重量的脂類、至少約40%重量、至少約50%重量、至少約60%重量以及至少約70%重量?？梢哉{(diào)整工藝條件，以增加適合特定用途的脂類的產(chǎn)率和/或減少生產(chǎn)成本。例如，在某些實施方案中，在具有限制性濃度的一種或者多種營養(yǎng)物質(zhì)(例如氮、磷或者硫)存在下培養(yǎng)微藻，同時提供過量的固定碳能(例如葡萄糖)。與在過量提供氮的培養(yǎng)物中微生物的脂類產(chǎn)率相比，限制氮傾向于使微生物的脂類產(chǎn)率增加。在特定的實施方案中，脂類產(chǎn)率增加為至少約:大于氮充滿條件下獲得的產(chǎn)率的10%、50%、100%、200%或者500%。可以在總培養(yǎng)期的一部分或者整個時期中在限制量的營養(yǎng)物質(zhì)存在下培養(yǎng)微生物。在特定的實施方案中，在總培養(yǎng)期期間，營養(yǎng)物質(zhì)的濃度在限制性濃度和非限制性濃度之間至少循環(huán)2次。可以通過在延長的時期內(nèi)持續(xù)加入培養(yǎng)基同時提供過量碳但是提供限制性氮或者不提供氮，使細胞的脂類含量增加。
在另一個實施方案中，通過在脂類途徑酶(例如脂肪酸合成酶)的一種或者多種輔助因子存在下培養(yǎng)產(chǎn)脂微生物(例如微藻)，使脂類產(chǎn)率增加。一般來講，輔助因子的濃度足以使微生物脂類(例如脂肪酸)產(chǎn)率與不存在輔助因子時的微生物脂類產(chǎn)率相比增加。在特定的實施方案中，通過將含有編碼輔助因子的外源基因的微生物(例如微藻)加入到培養(yǎng)基中，向培養(yǎng)基提供輔助因子。任選地，可以通過加入含有編碼參與輔助因子合成的蛋白的外源基因的微生物(例如微藻)向培養(yǎng)基提供輔助因子。在某些實施方案中，合適的輔助因子包括脂類途徑酶所需的任何維生素，例如:生物素、泛酸鹽。編碼適用于本發(fā)明中的輔助因子的基因或者參與這些輔助因子合成的基因是已知的，并且可以利用例如上面描述的質(zhì)粒和技術(shù)引入到微生物(例如微藻)中。
可以以任何合適的方式將本文中描述的生物反應(yīng)器、培養(yǎng)條件以及異養(yǎng)生長和繁殖方法的特定實例進行組合，以促進微生物生長以及提高脂類和/或蛋白生產(chǎn)的效率。
利用本領(lǐng)域已知的(參見PCT公布號2008/151149)的不同培養(yǎng)方法已經(jīng)產(chǎn)生了具有按干重計的高比率油類/脂類積累的微藻生物質(zhì)。利用本文中描述的培養(yǎng)方法產(chǎn)生并且根據(jù)本發(fā)明使用的微藻生物質(zhì)包含按干重計至少10%的微藻油。在一些實施方案中,微藻生物質(zhì)包含按干重計至少25%、至少50%、至少55%、至少60%的微藻油、或者至少70%的微藻油。在一些實施方案中，微藻生物質(zhì)含有按干重計10-90%的微藻油、25-75%的微藻油、45-75%的微藻油或者50-70%的微藻油。
用于本發(fā)明的方法和組合物中的本文中描述的生物質(zhì)的微藻油或者從生物質(zhì)中提取的微藻油可以包含具有一個或者多個不同脂肪酸酯支鏈的甘油脂。甘油脂由與一個、兩個或者三個脂肪酸分子發(fā)生酯化的甘油分子組成，所述脂肪酸分子可以具有不同的長度和不同的飽和度。通過如下面第V章更加詳細描述的培養(yǎng)條件或者脂類途徑工程，可以控制脂肪酸分子(和微藻油)的長度和飽和度性質(zhì)，以對本發(fā)明微藻油中的脂肪酸分子的特性或者比例進行修飾。因此，可以通過將來源于兩個或者多個微藻物種的生物質(zhì)或者藻油混合，在單個微藻物種內(nèi)制備特定的藻油混合物，或者通過將本發(fā)明的藻油與其它來源的油類混合來制備特定的藻油混合物，所述其它來源例如大豆、油菜籽、加拿大油菜、棕櫚葉、棕仁、椰子、玉米、廢植物、烏桕油、橄欖、向日葵、棉花籽、雞脂肪、牛脂、微藻、大型藻類、微生物、萼距花、亞麻、花生、精選白色動物油脂、豬油、亞麻芥油、芥菜籽、腰果、燕麥、羽扇豆、洋麻、金盞花、大麻、咖啡豆、亞麻仁(亞麻籽)、榛子、大戟屬、南瓜籽、香菜、山茶、芝麻、紅花、稻米、油桐樹、可 可、干椰子肉、阿片罌粟、蓖麻籽、碧根果、加州希蒙得木、夏威夷果、巴西堅果、鱷梨、石油或者上述油類中任意一種的餾分。
還可以通過將來源于至少兩種不同的微藻物種的生物質(zhì)或者油類混合，來控制油類組成，即甘油脂中脂肪酸成分的性質(zhì)和比例。在一些實施方案中，至少兩種不同的微藻物種具有不同的甘油脂譜。如本文中所描述，優(yōu)選在異養(yǎng)條件下對不同的微藻物種進行共同培養(yǎng)或者分離培養(yǎng)，以產(chǎn)生各自的油類。不同微藻物種細胞的甘油脂中可以含有不同比例的不同脂肪酸成分。
一般來講，野生型原藻品種幾乎沒有或者沒有鏈長度為C8-C14的脂肪酸。例如桑椹形原藻(UTEX1435)、克魯格尼原藻(UTEX329)、大型原藻(UTEX1442)和小型原藻(UTEX1438)不含(或者不可檢出量的)C8脂肪酸，含有0-0.01%之間的ClO脂肪酸、0.03-2.1%之間的C12脂肪酸和1.0-1.7%之間的C14脂肪酸。
微藻油還可以包括由微藻產(chǎn)生的或者培養(yǎng)基中與微藻油混合的其它成分。這些其它成分可以以不同量存在，這取決于培養(yǎng)微藻時使用的培養(yǎng)條件、微藻物種、從生物質(zhì)中回收微藻油時使用的提取方法和可能影響微藻油組合物的其它因素。這些成分的非限制性實例包括以0.1-0.4微克/ml存在的類胡蘿卜素、以0-0.02毫克/千克油存在的葉綠素、以
0.4-0.6毫克/100克油存在的Y-生育酚和以0.2-0.5毫克/克油存在的總生育三烯酚。其它成分可以包括但不限于磷脂、生育酚、生育三烯酚、類胡蘿卜素(例如a-胡蘿卜素、(6-胡蘿卜素、番茄紅素等)、葉黃素(例如葉黃素、玉米黃質(zhì)、a-隱黃質(zhì)和(6-隱黃質(zhì))和多種有機或者無機化合物。
在一些情況下，從原藻物種中提取的油類包含不多于0.02mg/kg的葉綠素。在一些情況下，從原藻物種中提取的油類包含不多于0.4mg/ml的類胡蘿卜素。在一些情況下，每100克原藻油中包含0.40-0.60毫克之間的Y-生育酚。在其它情況下，每克原藻油中包含0.2-0.5暈克之間的總生育三烯酹。
IV.基因工程改造方法和材料
本發(fā)明的實施方案提供了用于對適用于本發(fā)明方法中的細胞和重組宿主細胞進行基因修飾的方法和材料，所述重組宿主細胞包括但不限于重組產(chǎn)油微生物、微藻、和產(chǎn)油微藻，如桑椹形原藻、小型原藻、克魯格尼原藻和大型原藻宿主細胞。為了便于閱讀，對這些方法和材料的描述分為幾節(jié)。在第I節(jié)中描述了轉(zhuǎn)化方法。在第2節(jié)中描述了同源重組方法。在第3節(jié)中描述了表達載體和載體組分。
1.轉(zhuǎn)化方法
可以通過任何合適的技術(shù)轉(zhuǎn)化細胞，所述技術(shù)包括例如基因槍法、電穿孔(參見Maruyama 等，(2004), Biotechnology Techniques8:821-826)、玻璃珠轉(zhuǎn)化法和碳化娃晶須轉(zhuǎn)化法?？梢允褂玫牧硪环N方法涉及形成原生質(zhì)體以及利用CaC12和聚乙二醇(PEG)將重組DNA引入微藻細胞中(參見Kim等，(2002), Mar.Biotechnol.4:63-73，其報道利用這種方法轉(zhuǎn)化Chorella ellipsoidea)?？梢酝ㄟ^共轉(zhuǎn)化微藻將兩種不同的載體分子同時引入細胞中(參見例如 Protist2004Dec; 155 (4): 381-93)。
還可以使用基因槍法(參見例如Sanford, Trends In Biotech.(1988) 6:299302，美國專利號 4，945，050)、電穿孔(Fromm 等，Proc.Nat’1.Acad.Sc1.(USA) (1985)82:58245828)、使用激光束、顯微注射或者能夠?qū)NA引入微藻中的任何其它方法轉(zhuǎn)化原藻細胞。
2.同源重組方法
同源重組是指宿主細胞中的互補DNA序列對準并交換同源區(qū)域的能力。將含有與被靶向的基因組序列(“模板”)同源的序列的轉(zhuǎn)基因DNA( “供體”)引入到宿主細胞中，并接著在相應(yīng)的基因組同源序列位點重組到基因組中。在大多數(shù)情況下，該過程的機械步驟包括:(I)使同源DNA片段配對；(2)使供體DNA分子發(fā)生雙鏈斷裂；(3)使供體DNA的游離末端插入到模板DNA分子中，隨后進行DNA合成；和(4)發(fā)生雙鏈斷裂修復(fù)事件，其產(chǎn)生最終的重組產(chǎn)物。
在宿主生物體中進行同源重組的能力具有許多實踐意義，其可以在分子遺傳學(xué)水平進行并且可以用于制備能夠生產(chǎn)特制油的產(chǎn)油微生物。同源重組本質(zhì)上是精確的基因靶向事件；因此，由相同的靶向序列制備的大多數(shù)轉(zhuǎn)基因株在表型上是基本一致的，需要篩選極少的轉(zhuǎn)化事件。同源重組還將基因插入到宿主染色體中，產(chǎn)生極好的基因穩(wěn)定性，甚至在不存在基因選擇的情況下。由于不同的染色體座位可影響基因表達，甚至是異源啟動子/UTRs介導(dǎo)的基因表達，因此同源重組可以是在未知基因組環(huán)境中查找座位和評估這些環(huán)境對基因表達的影響的方法。
利用同源重組的特別有用的基因工程應(yīng)用是選擇特異的宿主調(diào)控元件(例如啟動子/UTRs)以高度特異的方式驅(qū)動異源基因的表達。例如，預(yù)期用異源C12:0特異性FATB(硫酯酶)基因盒和合適的篩選標記去除內(nèi)源性硬脂酰基ACP去飽和酶基因能夠顯著地降低C18:1脂肪酸的內(nèi)源水平，同時使C12:0脂肪酸的水平增加。參見美國專利公布20100151112。
由于同源重組是精確的基因靶向事件，所以其可以用于對目的基因或者目的區(qū)域內(nèi)的任意核苷酸進行精確修飾，只要已經(jīng)鑒定出足夠的側(cè)翼區(qū)域。因此，可以利用同源重組方法對影響RNA和/或蛋白表達的調(diào)控序列進行修飾。在對酶活性(例如底物特異性、親和性和Km)進行修飾的嘗試中，其還可以用于修飾蛋白編碼區(qū)域，因而使宿主細胞的代謝發(fā)生期望變化。同源重組提供了控制宿主基因組的強效方法，其導(dǎo)致發(fā)生基因靶向、基因轉(zhuǎn)換、基因缺失、基因復(fù)制、基因倒置和基因表達調(diào)控元件(如啟動子、增強子和3’ UTR)的交換。
可以通過利用含有內(nèi)源序列片段的靶向質(zhì)粒靶向宿主細胞內(nèi)源基因組內(nèi)部的目的基因或者目的區(qū)域來達成同源重組。這種靶向序列可以位于目的基因或者目的區(qū)域的5’端、目的基因/區(qū)域的3’端或者可以位于目的基因/區(qū)域的側(cè)翼。這種靶向質(zhì)?？梢砸跃哂蓄~外的載體骨架的超螺旋質(zhì)粒DNA形式或者無載體骨架的PCR產(chǎn)物形式或者線性分子形式轉(zhuǎn)化到宿主細胞中。在一些情況下，首先利用限制性酶使轉(zhuǎn)基因DNA(供體DNA)內(nèi)部的同源序列暴露是有利的。該步驟可以增加重組效率并且減少不期望有的事件的發(fā)生。增加重組效率的其它方法包括利用PCR產(chǎn)生轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因DNA，所述DNA含有與被靶向的基因組序列同源的線性末端。
3.載體和載體組分
根據(jù)本文中公開的內(nèi)容，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的已知技術(shù)制備本發(fā)明中用于轉(zhuǎn)化微生物的載體。載體通常含有一個或者多個基因，其中每個基因編碼期望產(chǎn)物(基因產(chǎn)物)的表達，并且可操作地連接至(或含有)調(diào)控基因表達或者使基因產(chǎn)物靶向重組細胞內(nèi)部特定位點的一個或多個控制序列。為了有助于閱讀，該節(jié)分為幾個小節(jié)。A小節(jié)描述了載體中通常含有的控制序列以及特別用于在微藻如原藻中使用的控制序列。B小節(jié)描述了載體中通常含有的基因以及特別用于在微藻如原藻中使用的密碼子優(yōu)化方法和利用其制備的基因。` A.控制序列
控制序列是調(diào)控編碼序列的表達或者指導(dǎo)基因產(chǎn)物至細胞內(nèi)部或者外部特定位點的核酸。調(diào)控基因的控制序列包括例如調(diào)控編碼序列轉(zhuǎn)錄的啟動子和使編碼序列轉(zhuǎn)錄終止的終止子。另一個控制序列是位于編碼多聚腺苷酸尾鏈信號的編碼序列末端的3’非翻譯序列。指導(dǎo)基因產(chǎn)物至特定位點的控制序列包括編碼信號肽的序列，其指導(dǎo)與其連接的蛋白至細胞內(nèi)部或者外部的特定位點。
因此，設(shè)計用于在微藻中表達外源基因的示例性載體含有期望基因產(chǎn)物(例如可篩選標記、脂途徑修飾酶或者木糖利用酶)的編碼序列，其與在微藻中具有活性的啟動子可操作地連接。任選地，如果載體不含與目的編碼序列可操作地連接的啟動子，可以將編碼序列轉(zhuǎn)化到細胞中，以使其在載體整合點處與內(nèi)源性啟動子可操作地連接。
許多啟動子在微藻中具有活性，包括被轉(zhuǎn)化的微藻的內(nèi)源性啟動子以及被轉(zhuǎn)化的藻類的非內(nèi)源性啟動子(即其它藻類的啟動子、聞等植物的啟動子和植物病毒或者藻類病毒的啟動子)。在微藻中具有活性的說明性外源和/或內(nèi)源啟動子(以及在微藻中具有功能的抗生素抗性基因)描述于PCT公布號2008/151149和其中引用的參考文獻中。也參見美國專利申請公布20100151112。
用于表達外源基因的啟動子可以是與該基因天然連接的啟動子或者可以是異源啟動子。一些啟動子在多于一種微藻物種中具有活性。其它啟動子是物種特異性的。說明性啟動子包括例如下面實施例中使用的萊茵衣藻(6-微管蛋白的啟動子和病毒啟動子，例如已經(jīng)表明在多個微藻物種中具有活性的花椰菜花葉病毒(CMV)啟動子和小球藻病毒啟動子(參見例如 Plant Cell Rep.2005Mar; 23 (10-11): 727-35; J Microbiol.2005Aug; 43 (4):361-5; Mar Biotechnol (NY).2002Jan; 4 (I):63-73)。適用于在原藻中表達外源基因的另一個啟動子是耐熱性小球藻(Chlorella sorokiniana)谷氨酸脫氫酶啟動子/5’ UTR(SEQID NO: 10)。任選地，使用這些序列中含有啟動子的至少10、20、30、40、50或者60個或者更多核苷酸。用于在原藻中表達外源基因的說明性啟動子列于本申請的序列表中，例如小球藻HUPl基因的啟動子(SEQ ID NO: 11)和橢圓形小球藻(Chlorella ellipsoidea)硝酸還原酶啟動子(SEQ ID N0:12)。還可以利用小球藻病毒啟動子在原藻中表達基因，例如美國專利號6，395，965中的SEQ ID NO: 1-7?還可以在例如Biochem Biophys ResCommun.19940ctl4;204(I):187-94、Plant Mol Biol.19940ct;26(I):85-93;Virology.2004Augl5 ;326(1):150-9 和 Virology.2004Jan5; 318 (I):214-23 中發(fā)現(xiàn)在原藻中具有活性的額外的啟動子。
啟動子一般可以表征為組成型或者誘導(dǎo)型。組成型啟動子一般在所有時間(或者在細胞生命周期的某些時間)均具有相同水平的驅(qū)動表達的活性或者功能。相反，誘導(dǎo)型啟動子僅響應(yīng)于刺激物而具有活性(或使其失活)，或者顯著上調(diào)或下調(diào)。這兩種類型的啟動子均可以用于本發(fā)明的方法中。用于本發(fā)明中的誘導(dǎo)型啟動子包括響應(yīng)于刺激物而介導(dǎo)可操作地連接的基因轉(zhuǎn)錄的啟動子，所述刺激物例如外源提供的小分子(例如SEQ ID NO: 11中的葡萄糖)、溫度(熱或者冷)、培養(yǎng)基中缺少氮等。合適的啟動子可以激活基本沉默的基因的轉(zhuǎn)錄，或者優(yōu)選大 幅度上調(diào)低水平轉(zhuǎn)錄的可操作地連接基因的轉(zhuǎn)錄。
任選含有終止區(qū)控制序列，如果使用該序列，那么首先選擇便利的序列，因為終止區(qū)相對可以交叉使用。終止區(qū)可以與轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(啟動子)同源、可以與目標DNA序列同源或者可以從其它來源獲得。參見例如Chen和Orozco, Nucleic Acids Res.(1988) 16:8411。
本發(fā)明還提供了控制序列和重組基因以及含有二者并且使目的基因分隔表達的載體。被靶向的細胞器是葉綠體、質(zhì)體、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。此外，本發(fā)明提供了控制序列和重組基因以及含有二者并且使蛋白分泌到細胞外的載體。
可以利用質(zhì)體靶向信號使原藻核基因組中表達的蛋白靶向質(zhì)體。小球藻內(nèi)源性質(zhì)體靶向序列是已知的，例如小球藻核基因組中編碼靶向質(zhì)粒的蛋白的基因，參見例如GenBank保藏編號AY646197和AF499684。在一個實施方案中，本發(fā)明的載體中使用這種控制序列，以使表達蛋白靶向原藻質(zhì)體。
已經(jīng)描述了使用藻類質(zhì)體靶向序列使異源蛋白靶向宿主細胞中的正確代謝區(qū)。參見美國專利申請公布20100151112的實施例11和12。在一個實施方案中，使用異源蛋白的天然質(zhì)體靶向序列來將異源蛋白運輸?shù)劫|(zhì)體/葉綠體中。在一些實施方案中，將天然質(zhì)體靶向序列置換為異源質(zhì)體靶向序列以便增加重組蛋白或異源蛋白到質(zhì)體/葉綠體中的運輸。在一些實施方案中，將天然質(zhì)體靶向序列置換為微藻蛋白的質(zhì)體靶向序列。對序列進行BLAST比對，并分析與運輸至質(zhì)體/葉綠體中的已知蛋白質(zhì)的同源性。對編碼這些蛋白質(zhì)的cDNA進行克隆，并且從這些cDNA中分離質(zhì)體靶向序列。這些藻類質(zhì)體靶向序列可用于適用于本發(fā)明的細胞和方法中的表達載體。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，使原藻中表達的多肽靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。表達載體中含有合適的滯留或者分選信號確保蛋白滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中，不進入下游的高爾基體。例如，Wageningen UR-Plant Research International 的載體 IMPACTVECT0R1.3 包含熟知的 KDEL滯留或者分選信號。利用該載體使滯留于ER中具有實踐優(yōu)勢，因為已報道其可以使表達水平提高5倍或者更多。主要原因似乎是與細胞質(zhì)相比，ER中含有較低濃度和/或不同的負責已表達蛋白翻譯后降解的蛋白酶。在綠微藻中具有功能的ER滯留信號是已知的。例如參見 Proc Natl Acad Sci U S A.2005Apr26; 102 (17): 6225-30。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，使多肽靶向分泌到細胞外至培養(yǎng)基中。參見例如Hawkins 等,Current Microbiology Vol.38 (1999), pp.335-341 中在小球藻中具有活性的分泌信號，根據(jù)本發(fā)明的方法，其可以在原藻中使用。
B.基因和密碼子優(yōu)化
通?；虬瑔幼印⒕幋a序列和終止控制序列。當通過重組DNA技術(shù)組裝時，基因被稱為表達盒，其側(cè)面具有限制性位點，以便于插入到用于將重組基因引入宿主細胞中的載體中。表達盒側(cè)翼可以具有幫助表達盒通過同源重組穩(wěn)定融入到基因組中的基因組DNA序列或者其它核酸。任選地，載體和其表達盒可以保持未整合狀態(tài)，在這種情況下，載體通常含有能夠使異源載體DNA進行復(fù)制的復(fù)制起點。
載體中存在的共有基因是編碼一種蛋白的基因，所述蛋白的表達使得能夠?qū)⒑性摰鞍椎闹亟M細胞與沒有表達該蛋白的細胞區(qū)別開來。這種基因和其相應(yīng)的基因產(chǎn)物稱為可篩選標記。用于轉(zhuǎn)化原藻的轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒中可以使用可篩選標記。合適的可篩選標記的實例包括G418抗性基因、硝酸還原酶基因(參見Dawson等，(1997)，CurrentMicrobiology35:356-362 )、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(HPT ;參見 Kim 等(2002)，Mar.Biotechnol.4:63-73)、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和賦予脈霉素抗性的ble基因(Huang等(2007)，Appl.Microbiol.Biotechnol.72:197-205)。測定微藻對抗生素的敏感性的方法是已知的。例如，Mol Gen Genet.19960ctl6; 252 (5): 572-9。
出于本發(fā)明的目的，用于制備本發(fā)明的實施方案的重組宿主細胞的表達載體可包含至少2個、并且通常是3個基因，如果其中一個基因是可篩選標記的話。例如，可以通過用本發(fā)明中的載體進行轉(zhuǎn)化來制備本發(fā)明中經(jīng)過基因工程改造的原藻，所述載體除了可篩選標記外還包含一個或多個外源基因，例如像木糖利用基因或者木糖利用基因和酰基ACP硫酯酶基因?？梢岳谜T導(dǎo)型啟動子使一個或者兩個基因表達，所述啟動子允許控制這些基因表達的相對時機，以提高脂類產(chǎn)率和促進其轉(zhuǎn)化成為脂肪酸酯。兩個或更多個外源基因的表達可以處于同一誘導(dǎo)型啟動子的控制下，或者處于不同誘導(dǎo)型(或者組成型)啟動子的控制下。在后者情況下，可以誘導(dǎo)第一外源基因表達持續(xù)第一時間段(其間第二外源基因可以被誘導(dǎo)或者不被誘導(dǎo))并且可以誘導(dǎo)第二外源基因表達持續(xù)第二時間段(其間第一外源基因可以被誘導(dǎo)或者不被誘導(dǎo))。
在其它實施方案中，兩個或更多個外源基因(除了任意可篩選標記之外)是木糖利用基因、脂肪?；?ACP硫酯酶、酮脂酰-ACP合成酶、硬脂酰-ACP去飽和酶、脂肪酸去飽和酶和脂肪?；?CoA/醛還原酶，它們的組合作用能夠產(chǎn)生醇類產(chǎn)物。進一步提供了外源基因的其它組合，除木糖利用酶之外，還包括但不限于脂肪?；?ACP硫酯酶和脂肪?；?Cok還原酶，以產(chǎn)生醛類。在一個實施方案中，載體除木糖利用基因之外還提供脂肪?；?ACP硫酯酶、脂肪?；?CoA還原酶和脂肪醛脫羰基酶的組合，以產(chǎn)生烷烴。在這些實施方案中的每個中，可以利用誘導(dǎo)型啟動子來表達一個或多個外源基因。
表達兩個或更多個外源基因的其它說明性載體包括同時編碼木糖利用酶和可篩選標記的載體。用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化的重組原藻由于具有經(jīng)過工程改造的利用木糖作為碳源的能力，因而可以用于以較低的制造成本生產(chǎn)脂類。插入如上文所述的外源基因可以與通過定向和/或隨機誘變來破壞多糖生物合成相結(jié)合，這使得引導(dǎo)甚至更大的碳流進行脂類生產(chǎn)。個別地和組合地利用營養(yǎng)型轉(zhuǎn)變、改變脂類生產(chǎn)的工程改造和用外源酶進行處理，使得由微生物生產(chǎn)的脂類組合物發(fā)生改變。這種改變可以是所生產(chǎn)的脂類的量、所生產(chǎn)的一種或者多種碳氫化合物的量(相對于其它脂類)和/或微生物中生產(chǎn)的脂類類型的變化。例如，可以對微藻進行工程改造，以生產(chǎn)較高量和/或百分比的TAG。 為了使重組蛋白最佳表達，使用具有被轉(zhuǎn)化宿主細胞優(yōu)先使用的密碼子的產(chǎn)生mRNA的編碼序列是有益的。因此，轉(zhuǎn)基因的適當表達需要轉(zhuǎn)基因的密碼子使用與轉(zhuǎn)基因表達的生物體中的特異性密碼子偏倚性相符。這種作用精確的潛在機制有許多，包括可用的氨基酰tRNA庫與細胞中合成的蛋白之間的適當平衡，以及需要時使轉(zhuǎn)基因信使RNA (mRNA)更加有效地翻譯。當轉(zhuǎn)基因中的密碼子使用未經(jīng)優(yōu)化時，可用的tRNA庫不足以使異源mRNA有效翻譯，導(dǎo)致核糖體中止和終止以及轉(zhuǎn)基因mRNA可能不穩(wěn)定。
本發(fā)明提供了經(jīng)密碼子優(yōu)化的核酸，其使得原藻中的重組蛋白成功表達。通過研究從桑椹形原藻分離的cDNA序列，對原藻物種中的密碼子使用進行分析。該分析對超過24，000密碼子進行查詢，其結(jié)果顯示于下面表1中。
表1.原藻品種中的優(yōu)選密碼子使用
【權(quán)利要求】
1.一種植物界(kingdom Plantae)的微生物,所述微生物包含可操作以產(chǎn)生活性木糖代謝途徑酶的重組核酸。
2.如權(quán)利要求1所述的微生物，其中所述微生物在基本上由木糖組成的碳源上培養(yǎng)時能夠增加細胞數(shù)量或者產(chǎn)生脂類。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的微生物，其中所述微生物將木糖轉(zhuǎn)化成甘油三酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的微生物，其中所述微生物在使用葡萄糖作為碳源來培養(yǎng)時能夠積累按干細胞重量計10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%的甘油三酯。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的微生物，其中所述微生物在純木糖上培養(yǎng)時能夠積累按干細胞重量計至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%的甘油三酯。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述微生物在作為碳源的葡萄糖上培養(yǎng)時能夠積累按干細胞重量計至少50%的甘油三酯并且在純木糖上培養(yǎng)時能夠積累按干細胞重量計至少20%的甘 油三酯。
7.如權(quán)利要求1至6中任一項所述的方法，其中當所述微生物在氮限制條件下在60%為葡萄糖且40%為木糖的碳源上培養(yǎng)時，如通過同位素示蹤所測量，這些細胞產(chǎn)生其中碳原子的至少5%、10%、20%、30%、40%或50%來源于木糖的碳原子的脂類。
8.如權(quán)利要求1至7中任一項所述的方法，其中所述微生物在少于或等于21天、14天或7天中在具有2.5%木糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基中能夠消耗至少90%的所述木糖。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的微生物，其中所述重組核酸可操作以編碼以下一種或多種:活性木糖轉(zhuǎn)運體、木酮糖-5-磷酸轉(zhuǎn)運體、木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶、木糖醇脫氫酶或木糖還原酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的微生物，其中所述重組核酸編碼可操作地連接有質(zhì)體靶向信號序列的活性木酮糖-5-磷酸轉(zhuǎn)運體并且其中所述木酮糖-5-磷酸轉(zhuǎn)運體可操作以將木酮糖-5-磷酸轉(zhuǎn)運到質(zhì)體中。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項所述的微生物，其中所述重組核酸可操作以編碼(a)具有質(zhì)體靶向信號序列以便使木酮糖-5-磷酸轉(zhuǎn)運到質(zhì)體中的木酮糖-5-磷酸轉(zhuǎn)運體蛋白、(b)木酮糖激酶以及(C)木糖異構(gòu)酶抑或木糖醇脫氫酶與木糖還原酶二者。
12.如以上權(quán)利要求中任一項所述的微生物，其中所述微生物屬于綠色植物亞界(subkingdom Viridiplantae)。
13.如以上權(quán)利要求中任一項所述的微生物，其中所述微生物屬于綠藻下界(infrakingdom Chlorophyta)或綠藻門(phyla Chlorophytae)、屬于利藻亞門(subphylum Tetraphytina)、四胞藻綱(class Trebouxiophyceae)或者小球藻目(orderChlorellale)。
14.如以上權(quán)利要求中任一項所述的微生物,其中所述微生物屬于小球藻屬(genusChlorella)或原藻屬(genus Prototheca)。
15.如以上權(quán)利要求中任一項所述的微生物，其中所述微生物屬于桑椹形原藻(Prototheca moriformis)或原殼小球藻(Chlorella protothecoide)種。
16.如以上權(quán)利要求中任一項所述的微生物，其進一步包含可操作以改變由所述微生物產(chǎn)生的脂類的脂肪酸特性的重組修飾。
17.如權(quán)利要求16所述的微生物，其中所述重組修飾包括編碼活性?；?ACP硫酯酶、酮脂酰-ACP合成酶或脂肪酸去飽和酶或者可操作以減少或消除?；?ACP硫酯酶、酮脂酰-ACP合成酶或脂肪酸去飽和酶的外源基因。
18.一種用于生產(chǎn)微生物生物質(zhì)或者生產(chǎn)由所述生物質(zhì)生產(chǎn)的產(chǎn)品的方法，所述方法包括在包含木糖的培養(yǎng)基中異養(yǎng)地培養(yǎng)如權(quán)利要求1至17中任一項所述的重組微生物以便使木糖轉(zhuǎn)化成所述微生物生物質(zhì)。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述微生物生物質(zhì)包括微生物脂類。
20.如權(quán)利要求18或19所述的方法，其中所述脂類用于制備選自由以下組成的組的產(chǎn)品:化學(xué)品、潤滑劑、清潔劑、燃料、食用油以及化妝品成分。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述產(chǎn)品是選自生物柴油或可再生柴油的燃料。
22.如權(quán)利要求18至20中任一項所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含多于50%木糖的碳源。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述碳源的高于55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%為木糖。
24.—種利用權(quán)利要求1至17所述的微生物或權(quán)利要求18至23所述的方法中的任一項生產(chǎn)的天然油。
25.一種由權(quán)利要求24所述的天然油生產(chǎn)的油類化學(xué)品、食用油、燃料或其它產(chǎn)品。
26.—種重組產(chǎn)油微生物，其包含可操作以編碼木糖易位體蛋白的外源基因。
27.如權(quán)利要求26所述的微生物，其選自由以下組成的組:微藻、產(chǎn)油酵母、產(chǎn)油真菌以及產(chǎn)油細菌。
28.如權(quán)利要求27所述的微生物,其為微藻。
29.如權(quán)利要求28所述的微藻，其為原藻屬的物種。
30.如權(quán)利要求29所述的微藻，其為桑椹形原藻。
31.如權(quán)利要求26至30中任一項所述的微生物，其中已對所述外源基因進行了密碼子優(yōu)化以用于在所述重組產(chǎn)油微生物中表達。
32.如權(quán)利要求26所述的微生物，其中所述木糖易位體的天然質(zhì)體靶向序列已置換為來自微藻的質(zhì)體祀向序列。
33.如權(quán)利要求26至32中任一項所述的微生物，其中所述木糖易位體包含來自擬南芥屬(genus Arabidopsis)的XPT蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
34.一種重組產(chǎn)油微生物，其包含一個或多個外源基因，其中所述一個或多個外源基因可操作以編碼以下一種或多種:氧化還原酶途徑蛋白、木糖異構(gòu)酶途徑蛋白或者木糖轉(zhuǎn)運體蛋白。
35.如權(quán)利要求34所述的微生物，其中所述微生物進一步包含至少一個另外的外源基因，其中所述另外的外源基因可操作以編碼選自由以下組成的組的蛋白質(zhì):蔗糖轉(zhuǎn)化酶、月旨肪?；?ACP硫酯酶、脂肪?；?CoA/醛還原酶、脂肪?；?CoA還原酶、脂肪醛還原酶、脂肪醛脫羧酶、?；d體蛋白、去飽和酶、多糖降解酶以及賦予抗生素抗性的蛋白質(zhì)。
36.如權(quán)利要求34或35所述的微生物，其中所述微生物選自由以下組成的組:微藻、產(chǎn)油酵母、產(chǎn)油真菌以及產(chǎn)油細菌。
37.如權(quán)利要求36所述的微生物,其為微藻。
38.如權(quán)利要求37所述的微藻，其為原藻屬的物種。
39.如權(quán)利要求38所述的微藻，其為桑椹形原藻。
40.如權(quán)利要求34至39中任一項所述的微生物，其中所述一個或多個外源基因可操作以編碼選自由以下組成的組的氧化還原酶途徑蛋白:木糖還原酶、木糖醇脫氫酶以及木酮糖激酶。
41.如權(quán)利要求40所述的微生物，其中所述一個或多個外源基因可操作以編碼木酮糖激酶。
42.如權(quán)利要求41所述的微生物,其中所述木酮糖激酶包含來自畢赤酵母屬(genusPichia)的XYL3蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
43.如權(quán)利要求40所述的微生物，其中所述一個或多個外源基團可操作以編碼木糖醇脫氫酶。
44.如權(quán)利要求43所述的微生物，其中所述木糖醇脫氫酶包含來自所述畢赤酵母屬的XYL2蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
45.如權(quán)利要求40所述的微生物，其中所述一個或多個外源基團可操作以編碼木糖還原酶。
46.如權(quán)利要求45所述的微生物，其中所述木糖還原酶包含來自所述畢赤酵母屬的XYLl蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
47.如權(quán)利要求34至39中任一項所述的微生物，其中所述一個或多個外源基因可操作以編碼選自由木糖異構(gòu) 酶和木酮糖激酶組成的組的木糖異構(gòu)酶途徑蛋白。
48.如權(quán)利要求47所述的微生物，其中所述木糖異構(gòu)酶途徑蛋白是木糖異構(gòu)酶。
49.如權(quán)利要求48所述的微生物,其中所述木糖異構(gòu)酶包含來梨囊鞭菌屬(genusPiromyces)的XYLA蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
50.如權(quán)利要求47所述的微生物，其中所述木糖異構(gòu)酶途徑蛋白是木酮糖激酶。
51.如權(quán)利要求50所述的微生物，其中所述木酮糖激酶包含來自所述畢赤酵母屬的所述XYL3蛋白質(zhì)的所述氨基酸序列。
52.如權(quán)利要求34至39中任一項所述的微生物，其中所述一個或多個外源基因可操作以編碼選自由XYLA、XYL2、XYL3和XPT組成的組的蛋白質(zhì)。
53.如權(quán)利要求52所述的微生物，其中所述木糖易位體的天然質(zhì)體靶向序列已置換為來自微藻的質(zhì)體祀向序列。
54.如權(quán)利要求53所述的微生物，其中所述木糖轉(zhuǎn)運體包含來自所述擬南芥屬的所述XPT蛋白質(zhì)的所述氨基酸序列。
55.如權(quán)利要求34至39中任一項所述的微生物，其中所述一個或多個外源基因可操作以編碼木糖轉(zhuǎn)運體。
56.如權(quán)利要求55所述的微生物，其中所述木糖轉(zhuǎn)運體包含來自木霉屬(genusTrichoderma)的XLTl蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
57.一種重組產(chǎn)油微生物，其包含編碼選自GPT-A-XPT (SEQ ID NO:45) ,GPT-F-XPT (SEQID N0:47)或S106SAD-XPT(SEQ ID N0:49)的一種或多種木糖易位體蛋白的第一外源基因、編碼選自 SUTl (SEQ ID NO:37)、GXS1(SEQ ID NO:39)、XLTl (SEQ ID NO:43)或同向轉(zhuǎn)運體(SEQ ID N0:41)的一種或多種木糖轉(zhuǎn)運體蛋白的第二外源基因、編碼選自XylA(SEQ IDNO: 15)或XYL3(SEQ ID NO: 51)的一種或多種氧化還原酶途徑蛋白的第三外源基因以及編碼選自 XYLl (SEQ ID NO:35), XYL2 (SEQ ID NO:50)或 XYL3 (SEQ ID NO:51)的一種或多種木糖異構(gòu)酶途徑蛋白的第四外源基因。
58.如權(quán)利要求57所述的微生物，其包含可操作以編碼XylA、XYL3、SUTl和GPT-F-XPT的外源基因。
59.如權(quán)利要求57所述的微生物，其包含可操作以編碼XylA、XYL2、XYL3、XLTl和S106SAD-XPT的外源基因。
60.如權(quán)利要求57所述的微生物，其包含可操作以編碼XylA、XYLUXYL3、XLTl和S106SAD-XPT的外源基因。
61.如權(quán)利要求57所述的微生物，其包含可操作以編碼XylA、XYLUXYL3、GXSl和GPT-A-XPT的外源基因。
62.如權(quán)利要求57所述的微生物，其包含可操作以編碼XYL1、XYL2、XYL3、同向轉(zhuǎn)運體和GPT-F-XPT的外源基因。
63.如權(quán)利要求57所述的微生物，其包含可操作以編碼XYL1、XYL2、XYL3、GXSl和GPT-F-XPT的外源基因。
64.如權(quán)利要求57所述的微生物，其包含可操作以編碼XYL2、XYL3、同向轉(zhuǎn)運體和S106SAD-XPT的外源基因。
65.如權(quán)利要求57所述的微生物，其包含可操作以編碼XYL2、XYL3、XLTl和S106SAD-XPT的外源基因。
66.如權(quán)利要求57所述的微生物，其包含可操作以編碼XYL2、XYL3、GXS1和GPT-A-XPT的外源基因。
67.如權(quán)利要求26至66中任一項所述的微生物,所述微生物在包含多于50%為木糖的碳源的培養(yǎng)基中能夠生長或產(chǎn)生脂類。
68.如權(quán)利要求67所述的微生物，其中所述微生物在包含多于55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%為木糖的碳源的培養(yǎng)基中能夠生長或產(chǎn)生脂類。
69.如權(quán)利要求68所述的微生物，其中所述微生物在包含木糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基中能夠生長或產(chǎn)生脂類。
70.如權(quán)利要求69所述的微生物，所述微生物能夠產(chǎn)生由在包含葡萄糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)并且缺乏所述一個或多個外源基因的類似微生物細胞所產(chǎn)生的脂類的至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%或至少60%。
71.—種微生物脂類組合物，其是通過繁殖或培養(yǎng)如權(quán)利要求26至66中任一項所述的微生物而產(chǎn)生，包括以下步驟: (a)在包含木糖的培養(yǎng)基中繁殖或培養(yǎng)所述微生物；以及 (b)裂解所述微生物并分離所述微生物脂類組合物。
72.如權(quán)利要求71所述的微生物脂類組合物，其中所述培養(yǎng)基進一步包含葡萄糖。
73.如權(quán)利要求71所述的微生物脂類組合物，其中所述培養(yǎng)基包含多于50%為木糖的碳源。
74.如權(quán)利要求73所述的微生物脂類組合物，其中所述碳源的多于55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95% 為木糖。
75.如權(quán)利要求74所述的微生物脂類組合物，其中所述培養(yǎng)基包含木糖作為唯一碳源。
76.一種微生物脂類組合物，其是通過繁殖或培養(yǎng)如權(quán)利要求26至66中任一項所述的微生物而產(chǎn)生，包括以下步驟: (a)在培養(yǎng)基中提供所述微生物； (b)將解聚的纖維素材料添加到所述培養(yǎng)基中，其中所述纖維素材料包含木糖； (c)繁殖或培養(yǎng)所述微生物直到所述微生物積累其干重的至少約20%作為脂類；以及 (d)裂解所述微生物并分離所述微生物脂類組合物。
77.如權(quán)利要求76所述的微生物脂類組合物，其中所述解聚的纖維素材料的木糖濃度為至少約100g/L。
78.如權(quán)利要求77所述的微生物脂類組合物，其中所述解聚的纖維素材料的木糖濃度為至少約400g/L。
79.如權(quán)利要求77所述的微生物脂類組合物，其中所述解聚的纖維素材料進一步包含葡萄糖。
80.如權(quán)利要求79所述的微生物脂類組合物，其中所述解聚的纖維素材料的葡萄糖濃度為至少約100g/L。
81.如權(quán)利要求79所述的微生物脂類組合物，其中所述解聚的纖維素材料的葡萄糖濃度為至少約400g/L。
82.如權(quán)利要求81所述的微生物脂類組合物，其中所述解聚的纖維素材料的木糖和葡萄糖的總濃度為至少約100g/L。
83.如權(quán)利要求76所述的微生物脂類組合物，其中所述解聚的纖維素材料的木糖和葡萄糖的總濃度為至少約400g/L。
84.如權(quán)利要求76所述的微生物脂類組合物，其中所述解聚的纖維素材料的木糖和葡萄糖的總濃度為至少約600g/L。
85.如權(quán)利要求76所述的微生物脂類組合物，其中所述解聚的纖維素材料的木糖和葡萄糖的總濃度為至少約800g/L。
86.—種生產(chǎn)微生物脂類組合物的方法，其包括繁殖或培養(yǎng)如權(quán)利要求26至66中任一項所述的微生物，包括以下步驟: (a)在包含木糖的培養(yǎng)基中繁殖或培養(yǎng)所述微生物；以及 (b)裂解所述微生物并分離所述微生物脂類組合物。
87.如權(quán)利要求86所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含多于50%為木糖的碳源。
88.如權(quán)利要求87所述的方法，其中所述碳源的多于55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%為木糖。
89.如權(quán)利要求88所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含木糖作為唯一碳源。
90.如權(quán)利要求89所述的方法，其中所述微生物產(chǎn)生由在包含葡萄糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基中進行繁殖或培養(yǎng)并且缺乏所述一個或多個外源基因的類似微生物細胞所產(chǎn)生的脂類的至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%或至少60%。
【文檔編號】C12N1/13GK103608450SQ201280022031
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2012年5月4日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月6日
【發(fā)明者】P·蔡, A·索曼奇 申請人:索拉茲米公司