不含衣殼的aav載體、組合物以及制備載體和基因遞送的方法【專利摘要】一種分離的線性核酸分子，其以這樣的順序包含：第一腺伴隨病毒(AAV)反向末端重復(fù)(ITR)、感興趣的核苷酸和第二AAV?ITR，其中所述核酸分子沒(méi)有AAV衣殼蛋白編碼序列。所述核酸分子可以重復(fù)應(yīng)用于宿主而不引發(fā)免疫應(yīng)答。還提供制備和純化這種核酸分子的方法以及這種核酸分子用于治療目的的用途?！緦＠f(shuō)明】不含衣殼的AAV載體、組合物以及制備載體和基因遞送的方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及將外源的，特別是異源的DNA序列遞送至靶標(biāo)，特別是靶細(xì)胞、組織、器官或生物體的方法。具體地，本發(fā)明涉及用于將異源DNA序列遞送至靶標(biāo)的新的沒(méi)有病毒衣殼蛋白的裸腺伴隨病毒(AAV)載體(此后“AAV0”)。本發(fā)明的重組AAVO載體可以用于將外源DNA序列體外、離體或體內(nèi)遞送至靶標(biāo)。本發(fā)明還提供制備和純化AAVO載體的方法?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]基因治療的目的是糾正有缺陷的基因，所述有缺陷的基因構(gòu)成疾病發(fā)展的基礎(chǔ)。解決這個(gè)問(wèn)題的常見(jiàn)方法包括將正常基因遞送至細(xì)胞核。這個(gè)基因然后可以插入靶細(xì)胞的基因組，或者可以保持游離。將矯正基因遞送至對(duì)象的靶細(xì)胞可以通過(guò)許多方法進(jìn)行，包括使用病毒載體。在許多可用的病毒載體中(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒等)，腺伴隨病毒(AAV)作為多功能載體在基因治療中越來(lái)越受歡迎。[0003]腺伴隨病毒(AAV)是細(xì)小病毒家族的成員。AAV基因組由線性單鏈DNA分子組成，其包含約4.7千堿基(kb)，并且由編碼非結(jié)構(gòu)性R印(復(fù)制)和結(jié)構(gòu)性Cap(衣殼)蛋白的兩個(gè)主要開(kāi)放閱讀框組成。AAV編碼區(qū)的側(cè)翼是兩個(gè)起順式作用的核苷酸反向末端重復(fù)(ITR)序列，長(zhǎng)度為約145個(gè)核苷酸，具有可以折疊為發(fā)夾結(jié)構(gòu)的中斷的回文序列，在DNA復(fù)制起始期間作為引物發(fā)揮功能。除了它們?cè)贒NA復(fù)制中的作用，據(jù)證實(shí)ITR序列是病毒整合、從宿主基因組拯救以及病毒核酸衣殼化為成熟病毒粒子所必需的(Muzyczka，(1992)Curr.Top.Micr0.Tmmunol.158:97-129)。[0004]來(lái)源于AAV的載體對(duì)于遞送遺傳物質(zhì)特別有吸引力，這是因?yàn)?⑴它們能夠感染(轉(zhuǎn)導(dǎo))各種非分裂和分裂細(xì)胞類型，包括肌肉纖維和神經(jīng)元；(ii)它們沒(méi)有病毒結(jié)構(gòu)基因，從而消除了對(duì)病毒感染的天然宿主細(xì)胞應(yīng)答，例如干擾素介導(dǎo)的應(yīng)答；(iii)野生型病毒從未與人的任何病理關(guān)聯(lián)；(iv)與能夠整合入宿主細(xì)胞基因組的野生型AAV相比，復(fù)制缺陷的AAV載體一般保持游離，因此限制插入誘變或激活癌基因的風(fēng)險(xiǎn)；以及(V)與其他載體系統(tǒng)相比，AAV載體不觸發(fā)顯著的免疫應(yīng)答(見(jiàn)ii)，因此允許治療性轉(zhuǎn)基因的長(zhǎng)期表達(dá)(只要它們的基因產(chǎn)物未被排斥)。還可以以高滴度制備AAV載體，并且至少在嚙齒動(dòng)物中，動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)或腹腔內(nèi)注射允許基因通過(guò)單次注射轉(zhuǎn)移至顯著的肌肉區(qū)域(Goyenvalleetal.,2004;Fougerousseetal.,2007;Koppanatietal.,2010;Wangetal.，2009)。關(guān)于遞送遺傳物質(zhì)，與質(zhì)粒DNA相比，AAV載體還具有多個(gè)優(yōu)勢(shì)。例如，從質(zhì)粒表達(dá)異源基因是短期的，質(zhì)粒通常具有較大的大小，并且質(zhì)粒需要物理操作以遞送入細(xì)胞(例如，顯微注射、轉(zhuǎn)染、電穿孔)。此外，基因如肌養(yǎng)蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移引發(fā)宿主的免疫應(yīng)答并且與低效率相關(guān)(Romeroetal.,2004)。[0005]但是，使用常規(guī)AAV作為基因遞送載體也有許多缺點(diǎn)。首先，這種治療的大部分潛在接受者已經(jīng)對(duì)給定類型的AAV載體是血清反應(yīng)陽(yáng)性的(Boutinetal.，2010)。第二，在一些對(duì)象中，AAV載體可以引發(fā)溫和的宿主免疫應(yīng)答，這可能是由病毒衣殼或加工雜質(zhì)引發(fā)的。在這種情況下，使用免疫抑制劑控制免疫應(yīng)答僅為臨時(shí)措施，因?yàn)橐坏?duì)象脫離這些免疫抑制劑，免疫應(yīng)答復(fù)發(fā)(Lorainetal.，2008)。可能與AAV相關(guān)的主要缺點(diǎn)是其有限的病毒包裝能力，僅為約4.5kb異源DNA(Dongetal.,1996;Athanasopoulosetal.,2004;Laietal.,2010)。[0006]使用雙載體策略的不同方法試圖擴(kuò)大AAV載體包裝能力，例如設(shè)計(jì)為向靶細(xì)胞遞送大治療基因的反式剪接(ts)和重疊(Ov)AAV載體系統(tǒng)。例如，Lostal等人通過(guò)在外顯子28/29連接處分拆dysferlincDNA并將其克隆入兩個(gè)獨(dú)立的攜帶適當(dāng)剪接序列的AAV載體來(lái)繞過(guò)關(guān)于dysferlincDNA的大小限制,所述限制使得dysferlincDNA不可以直接整合入AAV載體用于基因轉(zhuǎn)移至肌肉。然而，即使這些方法仍有固有的效率低下。因此，小的包裝能力仍是AAV基因治療中的主要限制。尚未考慮去除衣殼(通過(guò)這種方式可以克服包裝能力)，因?yàn)閾?jù)認(rèn)為衣殼對(duì)于允許載體進(jìn)入細(xì)胞是必要的。[0007]另一顯著的缺點(diǎn)是AAV介導(dǎo)的基因表達(dá)相對(duì)較慢，因?yàn)樵诋愒椿虮磉_(dá)之前單鏈AAVDNA必須轉(zhuǎn)化為雙鏈DNA。雖然已嘗試通過(guò)構(gòu)建雙鏈DNA載體來(lái)規(guī)避這個(gè)問(wèn)題，但是這種策略進(jìn)一步限制可以整合入AAV載體的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒的大小(McCarty,2008;Varenikaetal.,2009;Foustetal.，2009)。此外，在生長(zhǎng)器官中，高效的AAV介導(dǎo)的基因治療可能由于分裂細(xì)胞中的游離DNA稀釋而喪失其效果(Cunninghametal.，2009)。[0008]本發(fā)明通過(guò)提供用于向細(xì)胞、組織、器官或?qū)ο篌w外、離體或體內(nèi)遞送外源DNA的重組AAVO(“rAAVO”)載體來(lái)解決與AAV載體相關(guān)的一些或全部上述缺點(diǎn)。[0009]發(fā)明概沭[0010]本發(fā)明是基于這樣的發(fā)現(xiàn)，可以將外源DNA整合入沒(méi)有衣殼的AAV基因組(或載體)(即，AAV0)并遞送入靶細(xì)胞、組織、器官或?qū)ο?，以高效表達(dá)感興趣的蛋白或核糖核苷酸(RNA)或脫氧核糖核苷酸(DNA)而無(wú)需病毒衣殼介導(dǎo)的吸收過(guò)程。在本發(fā)明之前，據(jù)認(rèn)為衣殼對(duì)于病毒載體高效吸收入細(xì)胞是必需的，并且不愿意免去它。事實(shí)上，純化AAV載體的方法主要基于針對(duì)衣殼的抗體，這會(huì)拋棄未衣殼化的DNA，或者基于使用DNAase，DNAase會(huì)降解任何未衣殼化的DNA。[0011]將本發(fā)明的rAAVO載體與基于質(zhì)粒的表達(dá)載體區(qū)分開(kāi)的結(jié)構(gòu)特征包括在rAAVO載體中缺少原始(即未插入)細(xì)菌DNA，rAAVO載體缺少原核復(fù)制起點(diǎn)，rAAVO載體是自足(self-containg)的(即它們不需要除兩個(gè)ITR以外的任何序列)，包括Rep結(jié)合位點(diǎn)和末端分辨位點(diǎn)(terminalresolutionsite)(RBS和TRS),以及在ITR之間的外源序列,存在形成發(fā)夾的ITR序列，事實(shí)上rAAVO具有真核起點(diǎn)(即，它們?cè)谡婧思?xì)胞中制備)，并且不存在細(xì)菌類型的DNA甲基化或哺乳動(dòng)物宿主認(rèn)為異常的任何其他甲基化。一般來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的載體優(yōu)選不含任何原核DNA，但是考慮一些原核DNA可以作為外源序列插入。將rAAVO載體與質(zhì)粒表達(dá)載體區(qū)分開(kāi)的另一重要特征是rAAVO載體由單鏈或雙鏈線性DNA組成，而質(zhì)粒通常是雙鏈DNA。[0012]本發(fā)明的rAAVO載體與基于質(zhì)粒的表達(dá)載體相比的一些優(yōu)勢(shì)包括但不限于:1)質(zhì)粒包含細(xì)菌DNA序列并進(jìn)行原核特異性甲基化，即嘌呤堿甲基化,而rAAVO載體序列具有真核起點(diǎn)；2)質(zhì)粒在制備過(guò)程中需要存在抗性基因，但是rAAVO載體不需要；3)環(huán)狀質(zhì)粒在引入細(xì)胞時(shí)未被遞送至細(xì)胞核并需要過(guò)量裝載以繞過(guò)細(xì)胞核酸酶的降解，但是rAAVO載體包含賦予對(duì)核酸酶的抗性的病毒順式元件，即ITR，并且可以設(shè)計(jì)為靶向并遞送至細(xì)胞核。假設(shè)ITR功能的不可缺少的最小限定元件為R印-結(jié)合位點(diǎn)(RBS;對(duì)于AAV2為5’-GCGCGCTCGCTCGCTC-3’)和末端分辨位點(diǎn)(TRS;對(duì)于AAV2為5’-AGTTGG-3’)加上允許形成發(fā)夾的可變回文序列。[0013]rAAVO載體與常規(guī)AAV載體相比的優(yōu)勢(shì)包括但不限于:1)常規(guī)AAV載體具有引起宿主免疫應(yīng)答的衣殼，而無(wú)衣殼的rAAVO載體不會(huì)觸發(fā)這樣的應(yīng)答；2)常規(guī)AAV載體具有有限的載物能力(約4.5kb)，而rAAVO載體不受這個(gè)限制，即它們可以整合入非常短的序列到比野生型AAV基因組的載物能力長(zhǎng)超過(guò)10%的序列，即約5k堿基直至8、10或甚至15kb；3)常規(guī)AAV載體的制備是不均質(zhì)的(即，包含完整AAV載體和空衣殼的混合物)，而rAAVO載體在本質(zhì)上基本是均質(zhì)的；以及4)常規(guī)AAV載體的組合物甚至在純化之后仍是異質(zhì)的，而rAAVO載體可以完全利用標(biāo)準(zhǔn)DNA分析技術(shù)來(lái)表征，允許獲得均質(zhì)且完全表征的終產(chǎn)物。此外，考慮到rAAVO載體缺少免疫原性，可以將不同rAAVO載體的混合物通過(guò)相同或不同途徑向細(xì)胞、器官或?qū)ο蠊步o藥。[0014]通常，本發(fā)明提供rAAVO載體以及它們?cè)诶缂?xì)胞、器官、組織和對(duì)象中表達(dá)蛋白或RNA或DNA中的用途。這樣的表達(dá)并不限于一種蛋白或RNA分子，而是可以包括通過(guò)遞送入宿主的多種不同rAAVO載體表達(dá)多種蛋白和/或RNA。這樣的轉(zhuǎn)導(dǎo)可以是瞬時(shí)的或永久的。例如，可以將編碼旨在引發(fā)宿主基因組的永久性修飾或修正(例如，通過(guò)大范圍核酸酶或鋅指核酸酶)的產(chǎn)物的rAAVO載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主。在其他方面，rAAVO載體可以遞送可以影響基因編輯如外顯子跳躍(skipping)的編碼或非編碼DNA。本發(fā)明的rAAVO載體還可以用于疫苗接種，這通過(guò)肌肉內(nèi)注射來(lái)遞送編碼蛋白或者蛋白/DNA混合物的rAAVO載體，然后進(jìn)行第二次注射，優(yōu)選肌肉內(nèi)注射，兩次注射帶來(lái)不被宿主(本身)的免疫系統(tǒng)全部識(shí)別的相同抗原(蛋白)的表達(dá)。本發(fā)明的rAAVO載體用于轉(zhuǎn)基因遞送入胚胎干細(xì)胞(ESC)或卵細(xì)胞以產(chǎn)生遺傳敲除或敲入的動(dòng)物模型。本發(fā)明的rAAVO載體還可以用于通過(guò)在新生兒期應(yīng)用來(lái)誘導(dǎo)對(duì)基因產(chǎn)物的免疫耐受，以便為隨后的替代療法如酶療法的免疫耐受鋪平道路(Sun,B,etalAm.J.Hum.Genet.2007;81:1042-1049)。例如，Balb/c小鼠對(duì)GFP敏感且引發(fā)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。通過(guò)在出生時(shí)向它們注射少量攜帶GFP基因的rAAVO，可以誘導(dǎo)耐受，從而隨后注射較大量的rAAVO或其他GFP攜帶載體不會(huì)引發(fā)顯著的免疫應(yīng)答。[0015]在一方面，本發(fā)明提供分離的線性核酸分子，其以這樣的順序包含:第一腺伴隨病毒(AAV)反向末端重復(fù)(ITR)、感興趣的核苷酸序列(例如外源DNA的表達(dá)盒)和第二AAVITR，其中所述核酸分子沒(méi)有AAV衣殼蛋白編碼序列。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子沒(méi)有病毒衣殼蛋白編碼序列(即其沒(méi)有AAV衣殼基因，也沒(méi)有其他病毒的衣殼基因)。此外，在一具體實(shí)施方案中，所述核酸分子也沒(méi)有AAVRep蛋白編碼序列。因此，在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子沒(méi)有功能性AAV帽和AAVrep基因。[0016]因此，本發(fā)明提供最小rAAVO載體，其具有兩個(gè)AAV反向末端重復(fù)(ITR)和感興趣的核苷酸序列(例如表達(dá)盒)，每個(gè)所述ITR均具有中斷(或不連續(xù))的回文序列，即，由3個(gè)片段組成的序列:在5’一3’閱讀時(shí)相同但在相對(duì)放在一起時(shí)雜交的第一片段和最后一個(gè)片段，以及分隔所述相同的片段的一個(gè)不同片段。這樣的序列，尤其是ITR形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。感興趣的核苷酸序列具體地可以是包含可操作地連接至外源DNA序列的至少一個(gè)啟動(dòng)子的表達(dá)盒，并且每一端的側(cè)翼均有一個(gè)ITR。rAAVO載體不編碼衣殼蛋白，并且rAAVO載體沒(méi)有衣殼化。rAAVO載體可以是單鏈、雙鏈或一端或兩端通過(guò)ITR回文序列共價(jià)連接的雙鏈體。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，rAAVO載體是單鏈的。[0017]在一實(shí)施方案中，外源DNA序列編碼治療性蛋白，例如肌養(yǎng)蛋白；LARGE(Barresietal.,2004);dysferlin;鈣激活中性蛋白酶3;Dux4;LAMA2;α-、β-、y-和δ-肌聚糖(sarcoglycan);FKRP、fukutin、WASP、因子VII1、因子IX、SMNUU7、修飾的U7(美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/314，830和W02006/021724，兩者均整體援引加入本文)、Ul、RdCVF(L6veillardetal.，2010)、α-葡糖苷酶、大范圍核酸酶或鋅指核酸酶、以及肌動(dòng)蛋白。但是，原則上認(rèn)為編碼蛋白或多肽的任何基因均在本發(fā)明的范圍內(nèi)，所述蛋白或多肽由于突變而減少或不存在，或者在過(guò)量表達(dá)時(shí)帶來(lái)治療益處。在其他實(shí)施方案中，外源DNA序列編碼反義寡核苷酸(“AON”)或RNA(編碼或非編碼)如siRNA、shRNA、micro-RNA，以及它們的反義對(duì)應(yīng)物(例如，antagoMiR)。在這類情況下，可以將在表達(dá)時(shí)引起有害表型的突變基因沉默以提供治療益處。在另一實(shí)施方案中，rAAVO載體包含模板核苷酸序列,其在大范圍核酸酶-或鋅指核酸酶提供的雙鏈斷裂之后用作待插入的正確DNA鏈。[0018]本發(fā)明的rAAVO載體可以包含期望的來(lái)自病毒外來(lái)源的其他引入序列。例如，可以引入所謂的自殺基因以消除轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。但是，不存在非插入的細(xì)菌DNA，并且優(yōu)選完全不存在細(xì)菌DNA。[0019]本發(fā)明的rAAVO載體還可以用于將感興趣的核苷酸序列遞送至靶細(xì)胞的方法。所述方法具體地可以是將感興趣的治療基因遞送至有需要的對(duì)象的細(xì)胞的方法。本發(fā)明允許在對(duì)象的細(xì)胞中體內(nèi)表達(dá)治療性外源DNA序列編碼的多肽、蛋白或寡核苷酸，從而表達(dá)治療水平的多肽、蛋白或寡核苷酸。在rAAVO載體遞送的體內(nèi)和體外模式中均觀察到這些結(jié)果。例如通過(guò)體內(nèi)肌肉內(nèi)給藥將外源DNA序列遞送至肌肉細(xì)胞的能力提供更有效和方便的基因轉(zhuǎn)移方法。因此在一實(shí)施方案，本發(fā)明涉及將所選的基因遞送入細(xì)胞、器官或組織如骨骼肌或心肌的方法。[0020]但是，本發(fā)明并不限于僅在肌肉細(xì)胞中遞送和表達(dá)所選的基因，而是還可應(yīng)用于其中期望表達(dá)治療性多肽、蛋白或寡核苷酸的其他細(xì)胞類型，例如神經(jīng)細(xì)胞。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及rAAVO載體介導(dǎo)的通過(guò)體內(nèi)顱內(nèi)或鞘內(nèi)給藥將期望的外源DNA序列遞送至神經(jīng)細(xì)胞。[0021]關(guān)于遞送方法，不應(yīng)當(dāng)認(rèn)為本發(fā)明受到限制。例如，遞送可以是局部的、組織內(nèi)的(例如，肌肉內(nèi)的、心內(nèi)的、肝內(nèi)的、腎內(nèi)的、大腦內(nèi)的)、結(jié)膜的(例如，眶外的、眶內(nèi)的、眶后的、視網(wǎng)膜內(nèi)的、視網(wǎng)膜下的)、粘膜的(例如，口服的、直腸的、鼻的、肺部的)、鞘內(nèi)的、膀胱內(nèi)的、顱內(nèi)的、全身性的、腹腔內(nèi)的、皮下的、皮膚的、血管內(nèi)的(例如靜脈內(nèi)的、動(dòng)脈內(nèi)的)以及淋巴內(nèi)的。在其他方面，還考慮通過(guò)高壓血管內(nèi)輸液(例如靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)輸液)和細(xì)胞內(nèi)注射(例如細(xì)胞核內(nèi)顯微注射或胞漿內(nèi)注射)的被動(dòng)組織轉(zhuǎn)導(dǎo)。[0022]此外，遞送并不限于一種rAAVO載體。因此，在另一方面，可以將包含不同外源DNA序列的多種rAAVO載體同時(shí)或順序遞送至靶細(xì)胞、組織、器官或?qū)ο蟆Ｒ虼?，這種策略可以允許表達(dá)多種基因。遞送還可以多次進(jìn)行，并且在臨床情況下對(duì)于基因治療重要的是可以以隨后增加或減少的劑量進(jìn)行，這是因?yàn)橛捎诓淮嬖诓《疽職ざ鄙倏挂職さ乃拗髅庖邞?yīng)答。預(yù)期不會(huì)出現(xiàn)抗衣殼的應(yīng)答，因?yàn)闆](méi)有衣殼。如果期望，這可以通過(guò)實(shí)施例5的沿線多次注射(圖7)以及通過(guò)測(cè)量抗體應(yīng)答或者特異性T細(xì)胞激活或增殖來(lái)證實(shí)。此外，預(yù)期如果通過(guò)單鏈rAAVO遞送，甚至針對(duì)轉(zhuǎn)基因的蛋白產(chǎn)物的免疫原性會(huì)減少，因?yàn)閱捂淎AV載體與雙鏈AAV載體相比，比較不能引發(fā)很強(qiáng)的先天免疫應(yīng)答(Wuetal，2011)。[0023]在另一方面，本發(fā)明提供一種制備無(wú)衣殼的rAAVO載體的方法，尤其是具有足夠高產(chǎn)率的方法以提供足夠的載體用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。所述方法包括提供細(xì)胞，所述細(xì)胞包含兩個(gè)AAVITR、位于所述ITR之間的感興趣的核苷酸(例如除了遞送純DNA模板，通常包含可操作地連接至外源DNA的至少一個(gè)啟動(dòng)子的表達(dá)盒)。感興趣的核苷酸的每一端的側(cè)翼有一個(gè)ITR且不編碼AAV衣殼蛋白，并且細(xì)胞不表達(dá)AAV衣殼蛋白。細(xì)胞已包含R印，或者用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)以包含R印，然后在允許包含ITR和表達(dá)盒的DNA復(fù)制和釋放并組成rAAVO載體的條件下生長(zhǎng)。然后作為游離釋放的rAAVO載體或者作為外來(lái)體(exosome)或微粒，收集并從細(xì)胞或上清純化rAAVO載體。[0024]在另一方面，本發(fā)明提供已經(jīng)將rAAVO基因組穩(wěn)定整合入它們自己的基因組的宿主細(xì)胞系。在一實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞系為無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞系，優(yōu)選昆蟲(chóng)Sf9細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞系為哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，優(yōu)選293細(xì)胞。雖然使用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染將用于擴(kuò)增的AAVO骨架引入生產(chǎn)細(xì)胞并不適合體內(nèi)應(yīng)用于哺乳動(dòng)物(例如，人)，但是在Sf9細(xì)胞的情況下，可以設(shè)想使用第二載體如皰疹病毒來(lái)將Rep蛋白引入細(xì)胞，允許rAAVO的切除和擴(kuò)增。在另一方面，可以將Rep編碼基因穩(wěn)定地整合入宿主細(xì)胞系(例如，Sf9細(xì)胞)。引入Rep基因的方法是多樣的:例如，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、感染表達(dá)Rep的載體、表達(dá)Rep的穩(wěn)定細(xì)胞系。在另一實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞分離自患有疾病的對(duì)象。自體宿主細(xì)胞優(yōu)選分離自這樣的組織，其直接受疾病影響并且不能表達(dá)正常水平的基因產(chǎn)物，表達(dá)突變且沒(méi)有功能或功能不良的基因產(chǎn)物，或者異常地過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致疾病的基因產(chǎn)物。[0025]在一方面，宿主細(xì)胞為干細(xì)胞。因此，rAAVO轉(zhuǎn)導(dǎo)可以導(dǎo)致例如給定干細(xì)胞群體的瞬時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中轉(zhuǎn)移的游離基因或非編碼RNA在隨后的細(xì)胞世代中被稀釋?；蛘撸瑀AAVO介導(dǎo)的工程化大范圍核酸酶的轉(zhuǎn)移可以導(dǎo)致干細(xì)胞中的持續(xù)遺傳修飾(Silvaetal.，2011)。在這種情況下，雖然大范圍核酸酶本身會(huì)隨著隨后的細(xì)胞分裂被稀釋，但是rAAVO-大范圍核酸酶介導(dǎo)的遺傳修飾會(huì)在隨后的細(xì)胞分裂中以孟德?tīng)柗绞奖焕^承。這可以矯正大范圍核酸酶使用的主要缺點(diǎn)。[0026]在另一方面，本發(fā)明提供從rAAVO基因組穩(wěn)定整合入它們自己的基因組的宿主細(xì)胞系純化rAAVO載體的方法。值得注意的是，質(zhì)粒骨架并不適合rAAVO制備，這是因?yàn)槠湓藖?lái)源，具有明顯的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。rAAVO制備進(jìn)行兩個(gè)步驟:第一，通過(guò)Rep蛋白從載體骨架切除(“拯救”)，第二，通過(guò)Rep蛋白擴(kuò)增切除的載體基因組。僅轉(zhuǎn)染包含AAVO的質(zhì)粒會(huì)主要導(dǎo)致拯救的rAAVO，沒(méi)有或很少擴(kuò)增。這突出了攜帶AAVO載體的質(zhì)粒的另一缺點(diǎn):很少或沒(méi)有擴(kuò)增。在一實(shí)施方案中，將rAAVO載體純化為DNA分子。在另一實(shí)施方案中，將rAAVO載體純化為外來(lái)體或微粒。[0027]本發(fā)明還提供一種治療對(duì)象的疾病的方法，所述方法包括向所述對(duì)象的有需要的靶細(xì)胞(特別是肌肉細(xì)胞或組織)引入治療有效量的rAAVO載體，任選使用藥學(xué)可接受的載體(carrier)。雖然可以在載體(carrier)的存在下引入rAAVO載體,但是這樣的載體(carrier)不是必需的。使用的rAAVO載體包含可用于治療疾病的感興趣的核苷酸序列。具體地，rAAVO載體可以包含可操作地連接至控制元件的期望的外源DNA序列，所述控制元件能夠在引入對(duì)象時(shí)指導(dǎo)外源DNA序列編碼的期望的多肽、蛋白或寡核苷酸的轉(zhuǎn)錄。rAAVO載體可以通過(guò)上文以及本文其他地方提供的任何合適的途徑給藥。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述疾病為杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD)，并且轉(zhuǎn)基因?yàn)榧○B(yǎng)蛋白或編碼優(yōu)化的U7的rAAVO，所述優(yōu)化的U7包含允許mdx小鼠模型中外顯子23跳躍的適當(dāng)?shù)姆戳x序列(參見(jiàn)Goyenvalleetal.,2004)?這種rAAV0_U7載體可以例如通過(guò)注射部位近端的絞扼止血器造成的平行的靜脈血流淤塞下的股動(dòng)脈的動(dòng)脈內(nèi)注射來(lái)給藥。向轉(zhuǎn)導(dǎo)的肌肉組織給藥后4周可以觀察到所得的外顯子跳躍和肌養(yǎng)蛋白恢復(fù)。[0028]本發(fā)明還提供一種治療對(duì)象的遺傳或獲得性肌肉疾病或病癥(或者簡(jiǎn)單地添加基因或抑制基因)的方法，所述方法通過(guò):(I)從患有疾病的對(duì)象的肌肉活檢物建立成肌細(xì)胞培養(yǎng)物(Bigotetal.,2008;Benchaouiretal.,2007)；(2)將rAAVO載體遞送至成肌細(xì)胞或肌肉組織，所述載體包含可操作地連接至控制元件的期望的外源DNA序列，所述控制元件能夠指導(dǎo)外源DNA序列編碼的期望的多肽、蛋白或寡核苷酸的轉(zhuǎn)錄；(3)從培養(yǎng)物收集包含具有外源DNA序列的載體的外來(lái)體或微粒，或者收集DNA形式的rAAVO載體；以及(4)將收集的裝有rAAVO的外來(lái)體或微?；蛘逥NA形式的rAAVO載體遞送入所述對(duì)象。外來(lái)體或微?？梢跃哂刑囟ǖ南蛐?例如，肌肉細(xì)胞特異性的)，從而具有轉(zhuǎn)導(dǎo)相鄰細(xì)胞的能力。[0029]在另一實(shí)施方案中，可以離體轉(zhuǎn)導(dǎo)分離自患者的干細(xì)胞以糾正宿主中基因產(chǎn)物的突變所引起的缺陷，或者利用rAAVO編碼的DNA切割酶如鋅指核酸酶糾正遺傳缺陷(Connellyetal.，2010)。在另一實(shí)施方案中，所述DNA切割酶為大范圍核酸酶(Silvaetal.，2011)。在另一實(shí)施方案中，所述DNA切割酶為TAL效應(yīng)核酸酶(Silvaetal.，2012)。[0030]對(duì)于遺傳和獲得性病癥的潛在的細(xì)胞和基因治療，干細(xì)胞如間充質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞和iPS細(xì)胞是用rAAVO載體離體修飾的有吸引力的靶標(biāo)。使得這些細(xì)胞類型對(duì)于治療很理想的某些優(yōu)點(diǎn)包括它們分化為多種譜系的能力，它們?cè)鲋澈妥晕腋?、遷移至損傷部位的能力，以及在離體轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)它們是低免疫原性的(hypoimmunogenic),允許在糾正潛在缺陷時(shí)移植回宿主(Lietal.,2009;Benchaouiretal.，2007)。重要的是，雖然許多干細(xì)胞類型用包括AAV(Id)在內(nèi)的病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低，但是rAAVO載體可以繞過(guò)這個(gè)缺點(diǎn)，這是由于對(duì)于細(xì)胞進(jìn)入，它們不依賴于病毒衣殼，特別是在與微?；蛲鈦?lái)體介導(dǎo)的遞送組合時(shí)°參見(jiàn)High-EfficiencyTransductionofFibroblastsandMesenchymalStemCellsbyTyrosine-MutantAAV2VectorsforTheirPotentialUseinCellularTherapy.LiMjJayandharanGRjLiB，LingC，MaWjSrivastavaA，ZhongL，HumGeneTher.2010;21:1527-1543.[0031]可以用rAAVO治療的其他疾病包括但不限于DMD、脊髓型肌萎縮、龐帕病、帕金森病、亨廷頓病、阿爾茨海默病、ALS、癲癇、中風(fēng)、囊性纖維化和實(shí)體瘤。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述疾病為DMD。特別有趣的應(yīng)用是在癌癥治療中使用AAV0,這是因?yàn)橹貜?fù)治療直至腫瘤減小或消除的能力，預(yù)期用本發(fā)明的rAAVO載體沒(méi)有免疫應(yīng)答。[0032]本公開(kāi)的這些和其他實(shí)施方案、特征和優(yōu)點(diǎn)從下文所示的詳細(xì)描述和所附的權(quán)利要求書會(huì)變得顯而易見(jiàn)。【專利附圖】【附圖說(shuō)明】[0033]圖1為常規(guī)AAV(包含衣殼)與rAAVO的原理比較。常規(guī)AAV載體(上部)具有兩個(gè)組分，衣殼和基因組，而rAAVO載體(底部)是無(wú)衣殼的。[0034]圖2為rAAVO載體合成和下游應(yīng)用的方案。圖2a示出5L生物反應(yīng)器(B.BraunMedicalInc.)，其可以用來(lái)擴(kuò)增Sf9細(xì)胞中的AAVO；以及Akta純化器100(B.BraunMedicalInc.)，其可以用于下游AAVO純化過(guò)程。圖2b為詳述使用Sf9細(xì)胞系統(tǒng)的AAVO擴(kuò)增過(guò)程和下游純化過(guò)程的示意圖。[0035]圖3a為AAVO-GFP質(zhì)粒的示意圖，其基于pFBGR質(zhì)粒并用來(lái)在宿主細(xì)胞中制備AAVO0來(lái)自AAV2的ITR位于GFP表達(dá)盒兩端的側(cè)面。按照轉(zhuǎn)錄的方向，GFP表達(dá)盒包含巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、plO啟動(dòng)子、編碼GFP的DNA序列和轉(zhuǎn)錄終止序列。[0036]在包括兩個(gè)ITR和其間所夾的區(qū)域之外是殺稻瘟素S抗性基因，其可操作地連接至黃杉毒蛾(Orgyiapseudotsugata)立即早期-1(OpIE-1)啟動(dòng)子。[0037]圖3b為AAV基因組擴(kuò)增的一般過(guò)程的示意圖。在R印存在下，從宿主基因組去除AAV基因組并擴(kuò)增(Bernsetal.,2007;Nashetal.，2007)。[0038]圖4是未消化的rAAVO載體或用SnaBI酶消化的rAAVO載體的瓊脂糖凝膠。瓊脂糖凝膠上的條帶反映在制備過(guò)程結(jié)束時(shí)DNA回收后rAAVO的各種構(gòu)象(在右邊的示意圖中示出)。瓊脂糖凝膠的第一泳道中的條帶為DNA大小標(biāo)記。標(biāo)記“Ctrl”的第二泳道是來(lái)自未消化的rAAVO的DNA。指出對(duì)應(yīng)于rAAVO串聯(lián)體的條帶。字母“A”和“A’”顯示右邊示意圖所示的DNA產(chǎn)物。絕大多數(shù)rAAVO為單體形式(雙鏈或轉(zhuǎn)化的~2.5kb)。標(biāo)記“SnaBI”的第三泳道中的條帶是來(lái)自用SnaBI酶消化的rAAVO的DNA。字母“B”和“C”顯示右邊示意圖所示的DNA產(chǎn)物。SnaBI消化釋放包含ITR的380bp片段(條帶“C”)。[0039]圖5a是使用聚乙烯亞胺(PEI)作為轉(zhuǎn)染試劑用rAAV0_GFP載體轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞的熒光顯微圖。將IxlO6個(gè)細(xì)胞用5yg(左圖)和9yg(右圖)的rAAVO-GFP轉(zhuǎn)染48小時(shí)。圖5b是通過(guò)使用Xenoworks顯微注射系統(tǒng)(SutterInstruments)用AAV0-GFP載體的溶液(0.02mg/ml)顯微注射入細(xì)胞核(上圖)或細(xì)胞質(zhì)(下圖)的C2C12成肌細(xì)胞的熒光顯微圖。還將四甲基羅丹明70，000MW賴氨酸-可固定的葡聚糖(Sigma)共同顯微注射作為顯微注射的區(qū)域標(biāo)記。顯微注射后2天，將肌管用多聚甲醛3.7%(Sigma)固定并在進(jìn)一步的突光染色之前用0.5%triton透化。左圖示出DAPI(Sigma)染色的細(xì)胞核。中間的圖示出GFP熒光。右圖示出葡聚糖染色，允許確認(rèn)顯微注射部位(細(xì)胞核比細(xì)胞質(zhì))。利用裝有CoolSNAPHQ2照相機(jī)(RoperScientific)的NikonTi顯微鏡，使用40xLONAPLAPO油浸物鏡，通過(guò)(MolecularDevices)驅(qū)動(dòng)獲得熒光圖像。[0040]圖6a是用AAVO-GFP(Iml的PBS中的100μg的AAV0-GFP)動(dòng)脈內(nèi)注射的小鼠腿的方案。圖6b是已注射的小鼠腿(兩個(gè)左圖)和尚未注射的小鼠腿(兩個(gè)右圖)的熒光顯微圖；其顯示沒(méi)有動(dòng)脈內(nèi)注射AAV0-GFP，則GFP信號(hào)不可見(jiàn)(右圖)。左圖顯示動(dòng)脈內(nèi)注射AAVO-GFP兩周后導(dǎo)致腿中GFP的高效表達(dá)。圖6c示出動(dòng)脈內(nèi)注射腿之后肌肉組織的冷凍切片中的GFP表達(dá)(橫向(左圖)和縱向(右圖)IOym肌肉切片)。將細(xì)胞核用DAPI復(fù)染(藍(lán)色)。[0041]圖7是以I周的間隔進(jìn)行兩次動(dòng)脈內(nèi)注射后小鼠腿的熒光顯微圖。如上圖的方案所示，在左腿中進(jìn)行第一次注射(Iml的PBS中的100μg的AAV0-GFP)，而在右腿中進(jìn)行第二次注射(Iml的PBS中的100μg的AAV0-GFP)。分析之前允許小鼠在第二次注射后恢復(fù)8周。下圖中的熒光顯微圖顯示兩條腿均等效轉(zhuǎn)導(dǎo)，表明第一次注射對(duì)第二次注射沒(méi)有負(fù)面影響。[0042]圖8是未消化的rAAVO載體(在CMV啟動(dòng)子下編碼GFP)的瓊脂糖凝膠(1%)(中間泳道300ng，而右邊泳道1，5μg)。瓊脂糖凝膠上的條帶(2.6k堿基)反映在制備過(guò)程結(jié)束時(shí)DNA回收后rAAVO的線性單體單鏈結(jié)構(gòu)。瓊脂糖凝膠的左邊泳道中的條帶為DNA大小標(biāo)記。[0043]圖9是在SSB(單鏈結(jié)合蛋白)存在下的AAVo的電子顯微鏡顯微圖。AAVo表現(xiàn)為線性結(jié)構(gòu)，通過(guò)SSB方式顯示為單鏈。[0044]圖10為4-12%梯度SDS-聚丙烯酰胺凝膠，其顯示通過(guò)商業(yè)DNA純化裝置(QiagenPlasmidPlusMaxi試劑盒，QiagenAAVo)或我們的色譜系統(tǒng)(純化的AAVo)純化后的AAVo樣品中的蛋白含量。將不同量的編碼GFP或U7的AAVo上樣至4-12%梯度SDS-聚丙烯酰胺凝膠并通過(guò)電泳分離。通過(guò)銀染顯示蛋白。注意到通過(guò)使用我們的色譜方法純化后不能檢測(cè)到蛋白污染。[0045]發(fā)明詳沭[0046]本發(fā)明提供分離的線性核酸分子，其以這樣的順序包含:第一腺伴隨病毒(AAV)反向末端重復(fù)(ITR)、外源DNA的表達(dá)盒和第二AAVITR，其中所述核酸分子沒(méi)有AAV衣殼蛋白編碼序列。本發(fā)明的核酸分子是沒(méi)有衣殼蛋白的rAAV載體(rAAVO)，并且可以用于體外、離體或體內(nèi)遞送期望的外源DNA序列。[0047]無(wú)論上文或下文，本文引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)均整體援引加入本文。[0048]除非另有說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施會(huì)采用本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的病毒學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)和重組DNA技術(shù)的常規(guī)方法。這類技術(shù)在文獻(xiàn)中充分解釋。參見(jiàn)，例如，Sambrook,etal.MolecularCloning:ALaboratoryManual(CurrentEdition);DNACloning:APracticalApproach,vol.1&II(D.Glover,ed.);01igonucleotideSynthesis(N.Gait,ed.,CurrentEdition);NucleicAcidHybridization(B.Hames&S.Higgins,eds.,CurrentEdition);TranscriptionandTranslation(B.Hames&S.Higgins,eds.,CurrentEdition);CRCHandbookofParvoviruses,vol.1&II(P.Tijssen,ed.);FundamentalVirology,2ndEdition,vol.1&II(B.N.FieldsandD.M.Knipe,eds.)[0049]下文詳述本發(fā)明的各種組合物和方法。雖然本文舉例了具體組合物和方法，但是應(yīng)當(dāng)理解許多可選的組合物和方法中的任一種均可應(yīng)用并適合用于實(shí)施本發(fā)明。[0050]定義[0051]除非另有說(shuō)明，本文所用的所有術(shù)語(yǔ)均具有本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的相同含義，并且本發(fā)明的實(shí)施會(huì)采用微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)的常規(guī)技術(shù)，這在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)之內(nèi)。[0052]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“AAV0”指無(wú)衣殼的AAV載體構(gòu)建體，其包含ITR和任何期望的載荷，例如外源基因或其他多核苷酸和啟動(dòng)子，但是沒(méi)有衣殼。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，無(wú)衣殼的AAV載體構(gòu)建體不含編碼AAVRep蛋白的序列。因此，如本文所用，術(shù)語(yǔ)“AAV0載體”或“重組AAVO載體(“rAAVO”)”指無(wú)衣殼的AAV構(gòu)建體，作為最小組分，其包含兩個(gè)ITR和待轉(zhuǎn)移至宿主的外源DNA序列，所述外源DNA序列可操作地連接或未連接至控制元件。不要求所有ITR均源自一種類型的AAV。術(shù)語(yǔ)“AAV0載體”、“rAAVO載體”和“本發(fā)明的核酸分子”在本文中可互換使用。[0053]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“AAV0-質(zhì)?！敝妇幋arAAVO載體的環(huán)狀雙鏈DNA，其能夠在細(xì)菌細(xì)胞中擴(kuò)增(即，具有允許已用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌生長(zhǎng)的選擇標(biāo)記)，為了產(chǎn)生rAAVO載體本身的目的將其引入宿主細(xì)胞，其為線性單鏈或最終雙鏈DNA。[0054]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“反向末端重復(fù)”或“ITR”指因?yàn)樗鼈兊膶?duì)稱性這樣命名的AAV病毒順式元件。這些元件對(duì)于AAV基因組的高效擴(kuò)增非常重要。假設(shè)ITR功能的不可缺少的最小限定元件為R印-結(jié)合位點(diǎn)(RBS;對(duì)于AAV2為5’-GCGCGCTCGCTCGCTC-3’)和末端分辨位點(diǎn)(TRS;對(duì)于AAV2為5’-AGTTGG-3’)加上允許形成發(fā)夾的可變回文序列。根據(jù)本發(fā)明，ITR包含至少這3個(gè)元件(RBS、TRS和允許形成發(fā)夾的序列)。此外，在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“ITR”指已知的天然AAV血清型的ITR(例如血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或IlAAV的ITR)、通過(guò)融合來(lái)源于不同血清型的ITR元件形成的嵌合ITR以及它們的功能變體。ITR的功能變體指這樣的序列，其表現(xiàn)出與已知的ITR的至少80%、85%、90%，優(yōu)選至少95%序列相同性，允許在Rep蛋白的存在下擴(kuò)增包含所述ITR的序列，并且允許轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞而不需要轉(zhuǎn)染輔助(如實(shí)施例所示)。[0055]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“給藥”、“引入”或“遞送”指將用于重組蛋白或核苷酸表達(dá)的本發(fā)明的質(zhì)?；蜉d體遞送至細(xì)胞或者遞送至對(duì)象的細(xì)胞和/或組織和/或器官。這樣的給藥、引入或遞送可以在體內(nèi)、體外或離體進(jìn)行?？梢酝ㄟ^(guò)以下方式將用于重組蛋白或多肽表達(dá)的質(zhì)粒引入細(xì)胞:轉(zhuǎn)染，這通常表示通過(guò)化學(xué)方法將異源DNA插入細(xì)胞(例如，磷酸鈣轉(zhuǎn)染、聚乙烯亞胺(PEI)或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染)；物理方法(電穿孔或顯微注射)；感染，這通常指通過(guò)感染性物質(zhì)，即病毒(例如，表達(dá)AAVRep基因的桿狀病毒)引入；或者轉(zhuǎn)導(dǎo)，這在微生物學(xué)中指用病毒穩(wěn)定感染細(xì)胞，或者通過(guò)病毒性物質(zhì)(例如，噬菌體)將遺傳物質(zhì)從一種微生物轉(zhuǎn)移至另一種微生物。用于重組多肽、蛋白或寡核苷酸表達(dá)的本發(fā)明的載體可以通過(guò)物理方式遞送(例如，磷酸鈣轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染)，或者通過(guò)與藥學(xué)可接受的載體(carrier)—起制備本發(fā)明的載體用于體外、離體或體內(nèi)遞送至細(xì)胞、組織、器官或?qū)ο?。此外，本發(fā)明的AAVO載體可以在沒(méi)有物理方式或載體(carrier)的輔助下進(jìn)入細(xì)胞。[0056]術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”和“多核苷酸”通常分別指一般較小的具有4-約100堿基的核酸片段或一般更大的(例如，超過(guò)100個(gè)堿基且長(zhǎng)達(dá)30千堿基)核酸分子以及與信使RNA(mRNA)或miRNA片段或分子的序列互補(bǔ)(反義)或相同(正義)的序列。但是，在本說(shuō)明書中，所述術(shù)語(yǔ)可互換使用。寡核苷酸還可以指轉(zhuǎn)錄或非轉(zhuǎn)錄的DNA或RNA分子。[0057]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“中樞神經(jīng)系統(tǒng)”或“CNS”指該術(shù)語(yǔ)在本領(lǐng)域中公認(rèn)的用法。CNS涉及腦、視神經(jīng)、顱神經(jīng)和脊髓。CNS還包含填充腦室和脊髓中央管的腦脊液。腦的區(qū)域包括但不限于紋狀體、海馬、皮質(zhì)、基底核、底丘腦核(STN)、腳橋核(PPN)、黑質(zhì)(SN)、丘腦、殼或腦的尾狀區(qū)域以及小腦、脊髓或者它們的組合。[0058]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“多連體化(concatamerize)”或“多連體化(concatemerize)”指通過(guò)連接重復(fù)序列形成多核苷酸分子。[0059]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“控制元件”指在遞送入對(duì)象的細(xì)胞、組織和/或器官時(shí)能夠指導(dǎo)或調(diào)控外源DNA序列的轉(zhuǎn)錄的DNA序列。[0060]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化的雙鏈形式”指在宿主中使用的最終rAAVO形式。[0061]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“外源DNA序列”指不來(lái)源于其所處的宿主的核酸分子。其可以與宿主的DNA相同或者是異源的。實(shí)例為插入載體的感興趣的序列。這類外源DNA序列可以源自各種來(lái)源，包括DNA、cDNA、合成DNA和RNA。這類外源DNA序列可以包含基因組DNA，所述基因組DNA可以或可以不包括天然存在或人工的內(nèi)含子。此外，這樣的基因組DNA可以與啟動(dòng)子區(qū)域或polyA信號(hào)序列聯(lián)合獲得。本發(fā)明中的外源DNA序列可以是cDNA。外源DNA序列包括但不限于任何DNA序列，其表達(dá)產(chǎn)生有待在宿主細(xì)胞中表達(dá)的基因產(chǎn)物。所述基因產(chǎn)物可以影響宿主細(xì)胞的生理。外源DNA序列還涵蓋編碼反義寡核苷酸的DNA序列。[0062]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“外來(lái)體(exosome)”指由一種或多種細(xì)胞膜蛋白產(chǎn)生囊泡。囊泡通常在細(xì)胞的內(nèi)吞-溶酶體系統(tǒng)中產(chǎn)生，然后被細(xì)胞排出、分泌或“脫落”。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“微粒(miroparticle)”指攜帶特異性蛋白和RNA載荷的膜包裹的細(xì)胞片段(參見(jiàn)EP申請(qǐng)10306226.1)。[0063]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)盒”指可操作地連接至啟動(dòng)子或足以指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄的其他調(diào)控序列的外源DNA序列。合適的啟動(dòng)子包括例如組織特異性啟動(dòng)子。啟動(dòng)子還可以是AAV來(lái)源的。[0064]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基因遞送”或“基因轉(zhuǎn)移”指將外源核酸序列如DNA可靠地插入宿主細(xì)胞的方法或系統(tǒng)。這類方法可以導(dǎo)致非整合轉(zhuǎn)移的DNA的瞬時(shí)表達(dá)、轉(zhuǎn)移的復(fù)制子(例如，附加體)的染色體外復(fù)制和表達(dá)、或者將轉(zhuǎn)移的遺傳物質(zhì)整合入宿主細(xì)胞的基因組DNA?；蜣D(zhuǎn)移為獲得性或遺傳性疾病的治療提供了獨(dú)特的方法。[0065]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“遺傳性肌肉病癥”是指但不限于神經(jīng)肌肉或肌肉骨骼疾病或病癥，包括但不限于顯性突變、隱性突變、X-連鎖的核DNA突變或線粒體DNA突變引起的神經(jīng)肌肉疾?。贿€包括大范圍染色質(zhì)缺失，其可以或可以不包含基因但影響基因編輯。實(shí)例包括顯性或隱性肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良、Duchenne和BeckerMD、強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良、面-肩-肱型肌營(yíng)養(yǎng)不良等。[0066]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”指例如可以或已經(jīng)用作rAAV載體的受體的微生物、酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。該術(shù)語(yǔ)包括已轉(zhuǎn)導(dǎo)的原始細(xì)胞的子代。因此，如本文所用，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”一般指已用外源DNA序列轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解由于天然的、偶然或人為的突變，單個(gè)親代細(xì)胞的子代可以不必在形態(tài)學(xué)上完全相同，或者在基因組或總DNA中與原始的親代互補(bǔ)。[0067]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“神經(jīng)細(xì)胞”指分離自腦、脊髓的細(xì)胞，或者來(lái)自中樞神經(jīng)系統(tǒng)的任何區(qū)域的細(xì)胞，以及存在于對(duì)象的腦、脊髓或中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的任何細(xì)胞。神經(jīng)細(xì)胞的實(shí)例包括神經(jīng)元細(xì)胞，例如將神經(jīng)或化學(xué)信號(hào)傳輸至腦或者從腦傳輸神經(jīng)或化學(xué)信號(hào)的神經(jīng)細(xì)胞(nervecell),如從身體的感覺(jué)感受器(眼、耳等)攜帶信號(hào)至CNS的感覺(jué)神經(jīng)元或雙極神經(jīng)元；從肌肉和腺體攜帶信號(hào)至CNS的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元或多極神經(jīng)元(例如，脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、椎體神經(jīng)元、浦肯野細(xì)胞)；在0吧內(nèi)形成神經(jīng)布線(neuralwiring)的中間神經(jīng)元或假極性細(xì)胞。這些具有兩個(gè)軸突(而不是一個(gè)軸突和一個(gè)樹(shù)突)。術(shù)語(yǔ)神經(jīng)細(xì)胞還意圖包括組成90%的腦細(xì)胞的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是不攜帶神經(jīng)沖動(dòng)的神經(jīng)細(xì)胞。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的類型包括但不限于施萬(wàn)細(xì)胞、衛(wèi)星細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、少突神經(jīng)膠質(zhì)和星形膠質(zhì)。[0068]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“神經(jīng)變性病癥”或“神經(jīng)學(xué)病癥”指引起神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞群體的形態(tài)學(xué)和/或功能異常的病癥。神經(jīng)變性病癥可以導(dǎo)致對(duì)象中正常神經(jīng)功能的障礙或不存在或者存在異常的神經(jīng)功能。例如，神經(jīng)變性病癥可以是疾病、損傷和/或老化的結(jié)果。形態(tài)學(xué)和功能異常的非限制性實(shí)例包括神經(jīng)細(xì)胞的物理惡化和/或死亡、神經(jīng)細(xì)胞的異常生長(zhǎng)模式、神經(jīng)細(xì)胞之間的物理連接的異常、神經(jīng)細(xì)胞過(guò)少或過(guò)多產(chǎn)生物質(zhì)或多種物質(zhì)如神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)細(xì)胞不能產(chǎn)生其正常產(chǎn)生的物質(zhì)或多種物質(zhì)、以異常模式或在異常時(shí)間產(chǎn)生物質(zhì)如神經(jīng)遞質(zhì)和/或傳送電沖動(dòng)。神經(jīng)變性可以在對(duì)象的腦的任何區(qū)域發(fā)生，并且在許多病癥中觀察到，所述病癥包括例如頭部創(chuàng)傷、中風(fēng)、ALS、多發(fā)性硬化、亨廷頓病、帕金森病和阿爾茨海默病。[0069]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”對(duì)于rAAVO載體表示rAAVO載體的核苷酸組分互相在功能上相關(guān)用于所選的編碼序列的有效控制。一般來(lái)說(shuō)，“可操作地連接”的核酸序列是連續(xù)的，并且在分泌型前導(dǎo)的情況下，是連續(xù)和符合閱讀框的。但是，增強(qiáng)子不必是連續(xù)的。[0070]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“包裝”在rAAVO的上下文中表示包括基因組或其他編碼序列加上控制元件(啟動(dòng)子)，或者兩個(gè)ITR元件之間的正義或反義寡核苷酸。在大多數(shù)情況下，載體會(huì)具有控制元件，例如以便驅(qū)動(dòng)U7或RNAi或shRNA的轉(zhuǎn)錄。但是，在其他情況下，rAAVO載體可以用來(lái)遞送不必轉(zhuǎn)錄的DNA，因此缺少控制元件(例如，用于鋅指或TAL核酸外切酶或者大范圍核酸酶介導(dǎo)的基因修復(fù)的糾正基質(zhì))。[0071]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)可接受的”指在向人給藥時(shí)，生理上可耐受并且通常不產(chǎn)生毒性或者過(guò)敏或相似的不良反應(yīng)如胃部不適、頭暈等的分子實(shí)體和組合物。優(yōu)選地，如本文所用，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)可接受的”表示聯(lián)邦或州政府的監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)或者美國(guó)藥典或其他公認(rèn)的藥典列出可用于動(dòng)物，更特別是用于人。[0072]術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白”在本文中可互換使用，指氨基酸的聚合物，并且包括全長(zhǎng)蛋白及其片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，本發(fā)明還包括編碼與已知的氨基酸序列相比在氨基酸序列或其他特性中具有輕微變化的那些多肽的核酸?？梢酝ㄟ^(guò)中性的已知參數(shù)選擇氨基酸取代，并且可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法如誘導(dǎo)的點(diǎn)突變、缺失突變、插入突變或取代突變將其引入編碼的核酸序列。一般優(yōu)選氨基酸序列中的細(xì)小改變，例如保守的氨基酸替代、小的內(nèi)部缺失或插入以及分子末端的添加或缺失。這些修飾可以導(dǎo)致氨基酸序列的改變，提供沉默突變，修改限制性位點(diǎn)，或者提供其他特異性突變。此外，它們可以導(dǎo)致所編碼的蛋白的有益改變。[0073]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“純化的”指在一定條件下分離的物質(zhì)，所述條件減少或消除不相關(guān)的物質(zhì)即雜質(zhì)(包括從中獲得該物質(zhì)的天然物質(zhì))的存在。例如，純化的rAAVO載體DNA優(yōu)選基本上不含細(xì)胞或培養(yǎng)組分，包括組織培養(yǎng)組分、污染物等。可以利用選擇小到80μm或甚至60μm的顆粒的專門的細(xì)胞分選機(jī)純化外來(lái)體或微粒。參見(jiàn)EP10306226.1。[0074]在物質(zhì)的分析測(cè)試的上下文中，操作上使用術(shù)語(yǔ)“基本上不含”。優(yōu)選地，基本上不含雜質(zhì)的純化的物質(zhì)是至少50%純的；更優(yōu)選地，至少90%純，并且更優(yōu)選地，至少99%純。可以通過(guò)色譜、凝膠電泳、免疫測(cè)定、組成分析、生物測(cè)定和本領(lǐng)域已知的其他方法評(píng)價(jià)純度。[0075]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“重組”指利用DNA重組(克隆)方法產(chǎn)生并可與天然或野生型核酸、載體、多肽或蛋白區(qū)分的核酸、載體、多肽或蛋白。[0076]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“拯救”指從雙鏈分子形式釋放AAVO基因組，例如包含在質(zhì)粒、異源病毒基因組(例如，桿狀病毒)中，或者細(xì)胞基因組中的前病毒。通常一起考慮釋放和復(fù)制過(guò)程以包含拯救。從體外測(cè)定推斷出復(fù)制和釋放途徑的幾個(gè)步驟(WardandBerns,1991;Hongetal,1992;Hongetal.，1994)。簡(jiǎn)單地說(shuō),重組事件發(fā)生在擠壓出的雙鏈ITR之間，導(dǎo)致共價(jià)封閉式的復(fù)制中間體，以前稱為“沒(méi)有末端”的DNA(Nietal.，1994)。AAVp5R印蛋白(Itep78或R印68)中的任一種均具有序列特異性DNA結(jié)合和產(chǎn)生切口的活性，并且作用于封閉式的底物。Rep蛋白結(jié)合至ITR的莖區(qū)并解開(kāi)雙鏈DNA以暴露單鏈切口位點(diǎn)，末端分辨位點(diǎn)(trs)。Rep蛋白或細(xì)胞的解旋酶活性解開(kāi)ITR，從而提供5’-突出，ca.125nt，以及細(xì)胞聚合酶復(fù)合物延伸的游離的3’-OH基團(tuán)。線性雙分子雙鏈分子是沒(méi)有末端的中間體的任一端上的末端分辨事件的產(chǎn)物。雙分子雙鏈DNA現(xiàn)在相當(dāng)于退火的AAV基因組，并且對(duì)于拯救的前病毒DNA或來(lái)源于病毒粒子的DNA，復(fù)制可以無(wú)差別地進(jìn)行。[0077]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“選擇標(biāo)記”指引入細(xì)胞的基因，其賦予適合選擇的特征，以便指示轉(zhuǎn)染或者意圖將外源DNA引入細(xì)胞的其他方法的成功。一般來(lái)說(shuō)，可以用作檢測(cè)信號(hào)的直接或間接的任何物質(zhì)均考慮為本發(fā)明范圍內(nèi)的選擇標(biāo)記。實(shí)例包括但不限于熒光標(biāo)記如GFP、允許通過(guò)細(xì)胞分選來(lái)選擇的標(biāo)記膜肽以及允許通過(guò)抗性選擇的抗生素。[0078]抗生素和代謝選擇標(biāo)記通常用于產(chǎn)生穩(wěn)定的真核細(xì)胞系。例如，抗生素G418對(duì)于真核細(xì)胞是致死的，但是被原核酶新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶失活。相似地，潮霉素對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞是有毒的，但是被潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶失活。已開(kāi)發(fā)缺少二氫葉酸還原酶(DHFR)的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系。這些細(xì)胞的存活依賴于外源甘氨酸、次黃嘌呤和胸苷。因此，可以通過(guò)轉(zhuǎn)染順式的期望的轉(zhuǎn)基因和DHFR并在HAT選擇培養(yǎng)來(lái)中培養(yǎng)來(lái)產(chǎn)生穩(wěn)定的CHO細(xì)胞系(在HackerandWurn,2007中綜述)。[0079]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“對(duì)象”包括但不限于人、非人靈長(zhǎng)類如黑猩猩以及其他猿和猴物種；農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物如牛、綿羊、豬、山羊和馬；馴養(yǎng)的哺乳動(dòng)物如狗和貓；實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物，包括嚙齒動(dòng)物如小鼠、大鼠和豚鼠等。該術(shù)語(yǔ)并不表示特定年齡或性別。因此，旨在涵蓋成年和新生對(duì)象以及胎兒，無(wú)論雄性或雌性。[0080]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“治療基因”指這樣的基因，在表達(dá)時(shí)，其賦予該基因所在的細(xì)胞或組織或者表達(dá)該基因的哺乳動(dòng)物有益效果。有益效果的實(shí)例包括減輕疾病狀況或疾病的跡象或癥狀，預(yù)防或抑制疾病狀況或疾病，或者賦予期望的特征。治療基因包括部分或完全糾正細(xì)胞或哺乳動(dòng)物中的遺傳缺陷的基因。[0081]術(shù)語(yǔ)“治療有效量”指在劑量和必需的時(shí)間有效實(shí)現(xiàn)期望的治療結(jié)果的量。重組載體的治療有效量可以根據(jù)以下因素變化，例如對(duì)象的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重，以及載體在對(duì)象中引發(fā)期望的應(yīng)答的能力。治療有效量還是其中治療的有益效果超過(guò)任何有毒或有害的效果的量。[0082]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“組織特異性啟動(dòng)子”指在特定器官或組織如中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的細(xì)胞中可操作的啟動(dòng)子。CNS的啟動(dòng)子的非限制性實(shí)例包括但不限于神經(jīng)元特異性的啟動(dòng)子(例如，神經(jīng)絲啟動(dòng)子；ByrneandRuddle(1989)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:5473-5477)和神經(jīng)膠質(zhì)特異性的啟動(dòng)子(Moriietal.(1991)Biochem.BiophysRes.Commun.175:185-191)。優(yōu)選地，啟動(dòng)子是組織特異性的，并且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)之外基本上不活化，或者啟動(dòng)子的活性在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中比其他系統(tǒng)中高。例如，脊髓、腦干、(髓質(zhì)、腦橋和中腦)、小腦、間腦(丘腦、下丘腦)、端腦(紋狀體、大腦皮質(zhì)，在皮質(zhì)內(nèi)，枕骨、顳、頂葉或額葉)、底丘腦核(STN)、黑質(zhì)(SN)或它們的組合特異性的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的其他實(shí)例為雞β肌動(dòng)蛋白(CBA)啟動(dòng)子、神經(jīng)元特異性的烯醇化酶(NSE)啟動(dòng)子、肌酸激酶啟動(dòng)子、結(jié)蛋白啟動(dòng)子、CAG啟動(dòng)子(由雞b-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和CMV增強(qiáng)子組成)(J.Miyazaki,1989)、肝特異性的TBG啟動(dòng)子(2個(gè)拷貝的α-1微珠蛋白/尿抑胰酶素增強(qiáng)子和甲狀腺激素結(jié)合球蛋白啟動(dòng)子)(Yang，1997;8611，2011)、偶聯(lián)至1'社011/1'的(^€盒的CAG啟動(dòng)子(CMV增強(qiáng)子/雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)(Lh6riteauE，2010)、天然的人U7啟動(dòng)子(美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/314，830和冊(cè)2006/021724，兩者均整體援引加入本文)、細(xì)胞特異性的G蛋白偶聯(lián)受體激酶I的啟動(dòng)子(KhaniSC,2007)等。[0083]肌肉細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子也是已知的(Himedaetal.，2011)。非限制性實(shí)例為肌肉特異性的肌酸激酶啟動(dòng)子、結(jié)蛋白啟動(dòng)子(Lietal.，1993)、肌球蛋白輕鏈啟動(dòng)子(Coxetal.，1992)、嵌合的肌肉特異性啟動(dòng)子(Fraulietal.,2003)以及肌鈣蛋白C啟動(dòng)子-增強(qiáng)子(心肌)。[0084]術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”在本文中用來(lái)指細(xì)胞攝入外源核酸分子。當(dāng)已將外源核酸分子引入細(xì)胞膜內(nèi)時(shí)，細(xì)胞已被“轉(zhuǎn)染”。許多轉(zhuǎn)染技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。參見(jiàn)例如Grahametal.(1973)Virology,52:456,Sambrooketal.(1989)MolecularCloning,alaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratories,NewYork,Davisetal.(1986)BasicMethodsinMolecularBiology,Elsevier,andChuetal.(1981)Genel3:197。這類技術(shù)可以用來(lái)將一個(gè)或多個(gè)外源核酸分子引入合適的宿主細(xì)胞。[0085]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“載體”指任何非質(zhì)粒的遺傳元件，例如病毒、rAAV0、AAV、細(xì)小病毒、病毒粒子等。[0086]如本文所用，“離體給藥”指這樣的過(guò)程，其中從對(duì)象收獲原代細(xì)胞或整個(gè)器官，將rAAVO載體遞送入所述細(xì)胞，并且將所述細(xì)胞重新給予相同或不同對(duì)象。[0087]在本說(shuō)明書中，除非另有說(shuō)明，任何濃度范圍、百分比范圍、比例范圍或整數(shù)范圍應(yīng)當(dāng)理解為包括所列舉的范圍內(nèi)的任何整數(shù)值，并且在適當(dāng)時(shí)，包括其分?jǐn)?shù)(例如整數(shù)的十分之一和百分之一)。而且，除非另有說(shuō)明，本文所列舉的關(guān)于任何物理特征如聚合物亞基、大小或厚度的任何數(shù)量范圍應(yīng)當(dāng)理解為包括所列舉的范圍內(nèi)的任何整數(shù)。[0088]術(shù)語(yǔ)“約”或“大約”表示在值的統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義的范圍內(nèi)。這樣的范圍可以在一個(gè)數(shù)量級(jí)內(nèi)，優(yōu)選在給定值或范圍的50%內(nèi)，更優(yōu)選在20%內(nèi)，更優(yōu)選在10%內(nèi)，并且甚至更優(yōu)選在5%內(nèi)。術(shù)語(yǔ)“約”或“大約”所涵蓋的允許偏差取決于研究的具體系統(tǒng)，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地理解。[0089]在下面的章節(jié)中描述本發(fā)明的進(jìn)一步的細(xì)節(jié):[0090]1.AAV質(zhì)粒構(gòu)建和rAAVO載體制備[0091]病毒衣殼對(duì)AAV載體的有限包裝能力有部分責(zé)任。AAVO載體缺少衣殼而繞過(guò)了這個(gè)限制，并且允許將期望的外源DNA序列，甚至大小基本上超過(guò)AAV的包裝能力的外源DNA序列整合入AAVO載體并在引入靶細(xì)胞、組織、器官或?qū)ο髸r(shí)表達(dá)。例如，考慮利用本發(fā)明的核酸分子(或rAAVO載體)會(huì)成功地轉(zhuǎn)染5、8、10或15kb大的插入物。許多AAV血清型的基因組的核苷酸序列是已知的(NCB1:NC002077;NC001401;NC001729;NC001829;NC006152;NC006260;NC006261;KotinandSmith,TheSpringerIndexofViruses,http://oesys.springer,de/viruses/database/mkchapter.asp?virID=42.04)。本發(fā)明的AAVO骨架可以來(lái)源于任何AAV血清型的基因組。優(yōu)選地，AAV血清型為AAV2。[0092]到目前為止，AAV基因組本身從未作為基因治療的載體使用或純化。即，到目前為止，AAV病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的所有已知的實(shí)施方式包括轉(zhuǎn)移AAV衣殼蛋白中包裹的AAV病毒顆粒(例如，Doeneckeetal.，2010;Wangetal.,2011;Stiegeretal.,2010;vanderMarelSetal.,2011;Jiminezetal.，2011;Whiteetal.,2011)?雖然Doenecke等人報(bào)道質(zhì)粒AAV介導(dǎo)的基因表達(dá)；但是這涉及將AAV序列整合入細(xì)菌質(zhì)粒。(然而，如上所述，質(zhì)粒骨架并不適合rAAVO制備，這是因?yàn)槠湓藖?lái)源，具有明顯的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。此外，轉(zhuǎn)染包含AAVO的質(zhì)粒會(huì)主要導(dǎo)致拯救的rAAVO，沒(méi)有或很少擴(kuò)增)。網(wǎng)站:http://www.ncb1.nlm.nih.gov/sutils/gmap.cgi?result=map&acc=NC_002077&organism=2397也引用AAV的各種序列，但是不包括沒(méi)有衣殼的序列。這與尚未考慮無(wú)衣殼的AAVO的觀點(diǎn)一致。[0093]因此，本發(fā)明涉及分離的不含衣殼的AAV基因組，其包含外源DNA的表達(dá)盒但沒(méi)有衣殼編碼序列。這對(duì)應(yīng)于分離的線性核酸分子，其以這樣的順序包含:第一AAVITR、外源DNA的表達(dá)盒和第二ITR。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子為線性的單鏈或雙鏈核酸。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子是單鏈的。在這一優(yōu)選實(shí)施方案的第一變體中，第一ITR位于核酸分子的5’端。在這一優(yōu)選實(shí)施方案的第二變體中，第二ITR位于核酸分子的3’端。在這一優(yōu)選實(shí)施方案的第三變體中，第一ITR位于5’端，并且第二ITR位于核酸分子的3’端。在一具體實(shí)施方案中，分離的核酸分子骨架來(lái)源于已知AAV基因組，例如在上述數(shù)據(jù)庫(kù)中找到的AAV基因組。但是，本發(fā)明的分離的線性核酸分子還可以通過(guò)遺傳工程來(lái)制備，通過(guò)提供構(gòu)建載體所必需的每個(gè)元件，即通過(guò)提供外源DNA表達(dá)盒兩側(cè)的兩個(gè)ITR。[0094]值得注意的是，本發(fā)明涉及載體，其為線性的核酸分子。因此，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不對(duì)應(yīng)于AAV質(zhì)粒。實(shí)際上，質(zhì)粒是細(xì)菌來(lái)源的環(huán)狀核酸分子。因此，在目前的情況下，根據(jù)主題的結(jié)構(gòu)(具體地，線性對(duì)環(huán)狀)，還根據(jù)用于制備和純化這些不同對(duì)象的方法(見(jiàn)下文)，并且還鑒于它們的DNA甲基化(對(duì)于質(zhì)粒是原核類型的，而對(duì)于rAAVO是真核類型的)，本發(fā)明與質(zhì)粒不同。[0095]還值得注意的是，rAAVO載體(本發(fā)明的核酸分子)與工程化入不同的病毒衣殼(如重組腺病毒的衣殼)的AAV基因組(參見(jiàn)例如W096/18727)不同，因?yàn)槠洳缓魏尾《疽職?，并且具有被直接攝入宿主細(xì)胞的能力(沒(méi)有衣殼蛋白對(duì)宿主細(xì)胞表面的干擾)，以及從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核的能力(沒(méi)有衣殼蛋白的干擾)。此外，本文所述的rAAVO載體在宿主中不引發(fā)由腺病毒衣殼或?qū)嶋H上用來(lái)包裝AAV基因組的任何其他病毒衣殼引發(fā)的免疫應(yīng)答。[0096]在一實(shí)施方案中，AAVO骨架來(lái)源于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAVll基因組。在一具體實(shí)施方案中，AAVO骨架來(lái)源于AAV2基因組。在另一具體實(shí)施方案中，AAVO骨架是遺傳工程化的合成骨架，其在5’和3’端包括來(lái)源于這些AAV基因組中的一個(gè)或多個(gè)的ITR。存在于本發(fā)明的核酸分子中(即rAAVO中)的兩個(gè)ITR可以相同或不同。具體地，它們可以來(lái)源于相同的AAV基因組。在一具體實(shí)施方案中，存在于本發(fā)明的核酸分子中的兩個(gè)ITR相同，并且具體地可以是AAV2ITR。[0097]利用已知的技術(shù)構(gòu)建rAAVO質(zhì)粒(即，用于制備rAAVO線性載體的質(zhì)粒-參見(jiàn)上文提供的定義)以至少提供按照轉(zhuǎn)錄的方向可操作地連接的以下組分:5’ITR;包括啟動(dòng)子在內(nèi)的控制元件，感興趣的外源DNA序列；轉(zhuǎn)錄終止區(qū)；以及3’ITR0值得注意的是，ITR內(nèi)的核苷酸序列基本上代替rep和cap編碼區(qū)。雖然rep序列理想地由輔助質(zhì)?；蜉d體編碼，但是其可以可選地由rAAVO質(zhì)粒本身攜帶。在這類情況下，序列優(yōu)選位于ITR之間所夾的區(qū)域之外，但是也可以位于ITR之間所夾的區(qū)域之內(nèi)。將期望的外源DNA序列可操作地連接至在細(xì)胞、組織、器官或?qū)ο笾?即，體外、離體或體內(nèi))指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄或表達(dá)其編碼的多肽、蛋白或寡核苷酸的控制元件。這類控制元件可以包含通常與所選基因相關(guān)的控制序列?？蛇x地，可以采用異源控制序列?？捎玫漠愒纯刂菩蛄幸话惆▉?lái)源于編碼哺乳動(dòng)物或病毒基因的序列的控制序列。實(shí)例包括但不限于啟動(dòng)子如SV40早期啟動(dòng)子；小鼠乳腺瘤病毒LTR啟動(dòng)子；腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(AdMLP);單純皰疹病毒(HSV)啟動(dòng)子；巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子如CMV立即早期啟動(dòng)子區(qū)(CMVIE);勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子；合成啟動(dòng)子；雜合啟動(dòng)子等。此外，來(lái)源于非病毒基因如小鼠金屬硫蛋白基因的序列也可以在本文中使用。這類啟動(dòng)子序列可商購(gòu)自例如Stratagene(SanDiego,Calif.)?？蛇x地,啟動(dòng)子可以是組織特異性的啟動(dòng)子。來(lái)自任何AAV血清型的ITR均適合用作本發(fā)明的rAAVO質(zhì)粒中的5’和3’ITR，并且來(lái)自不同AAV血清型的ITR可以用于每個(gè)5’和3’ITR0許多AAV血清型的ITR序列是已知的。例如，SEQIDN0:1和2是AAV2的ITR序列。SEQIDNO:3-6分別提供AAV1、3、4和5的基因組序列。這些血清型的ITR序列在本領(lǐng)域是已知的。參見(jiàn)例如Chiorini,JAetal,1997，J.Virol.71(9):6823-6833Vol.71,N0.9，其公開(kāi)了AAV2、AAV3和AAV4的ITR序列。[0098]rAAVO質(zhì)粒還可以包括可選擇的標(biāo)記或選擇標(biāo)記用于建立宿主細(xì)胞rAAVO載體產(chǎn)生細(xì)胞系。將選擇標(biāo)記可操作地連接至啟動(dòng)子，例如，黃杉毒蛾立即早期-1啟動(dòng)子(OpIE-1)。在一實(shí)施方案中，可以將選擇標(biāo)記插入3’ITR的下游(即，3’)ο在另一實(shí)施方案中，可以將選擇標(biāo)記插入5’ITR的上游(即，5’)。適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記包括例如賦予藥物抗性的那些選擇標(biāo)記。選擇標(biāo)記可以是例如殺稻瘟素S-抗性基因、卡那霉素、遺傳霉素等。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，藥物選擇標(biāo)記為殺稻瘟素S-抗性基因。[0099]由于沒(méi)有病毒衣殼帶來(lái)的包裝限制，用于rAAVO質(zhì)粒和載體的合適的外源DNA序列的大小不受限制。因此，在一些實(shí)施方案中，外源DNA序列可以超過(guò)5000bp，并且在其他實(shí)施方案中，外源DNA序列可以超過(guò)lOOOObp。換句話說(shuō)，可以將超過(guò)AAV包裝能力至少10%，事實(shí)上20%且15kb大的外源DNA序列容易地整合入AAVO載體。對(duì)用于本發(fā)明的外源DNA序列的性質(zhì)沒(méi)有具體要求。外源DNA序列包括例如編碼受體對(duì)象缺陷或缺失的蛋白的基因，或者編碼具有期望的生物學(xué)或治療效果(例如，抗細(xì)菌、抗病毒或抗腫瘤功能)的蛋白的基因。在其他實(shí)施方案中，外源DNA序列編碼可以發(fā)揮功能以糾正缺陷基因或轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)的基因產(chǎn)物(例如，修飾的U7，大范圍核酸酶，反式剪接盒，或者調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后的加工機(jī)制(例如，剪接))。外源DNA序列優(yōu)選編碼與給藥的組織相關(guān)的蛋白。外源DNA序列還可以編碼糾正的DNA鏈，編碼多肽、正義或反義寡核苷酸或者RNA(編碼或非編碼的；例如siRNA,shRNA、微小RNA以及它們的反義對(duì)應(yīng)物(例如，antagoMiR))。[0100]合適的外源DNA序列包括但不限于編碼多肽、蛋白或寡核苷酸的外源DNA序列，所述多肽、蛋白或寡核苷酸用于治療內(nèi)分泌、代謝、血液、肝臟、心血管、神經(jīng)、肌肉骨骼、泌尿系統(tǒng)、肺部和免疫病癥，包括這類病癥如炎性疾病，自身免疫、慢性、傳染性和遺傳疾病，例如杜興肌肉綜合征、脊髓型肌萎縮(SMA)、AIDS、癌癥(特別是實(shí)體瘤)、高膽固醇血癥(hypercholestemia)、胰島素病癥如糖尿病、生長(zhǎng)病癥、各種血液病癥(包括各種貧血、地中海貧血和血友病)；遺傳缺陷如囊性纖維化、戈謝病、赫爾勒病、腺苷脫氨酶(ADA)缺陷、氣腫、龐帕病、早衰、帕金森病、亨廷頓病、阿爾茨海默病、ALS、癲癇、中風(fēng)等。[0101]rAAVO載體編碼的合適的轉(zhuǎn)基因包括例如肌養(yǎng)蛋白；LARGE(Barresietal.,2004);dysferlin;鈣激活中性蛋白酶3;Dux4;LAMA2;α-、β-、y-和δ-肌聚糖；FKRP、fukutin、WASP、因子VII1、因子IX、SMN1、U7、Ul、RdCVF(L6veillardetal.，2010)、a-葡糖苷酶、LAMINA/C、ZMPSTE4和肌動(dòng)蛋白。原則上認(rèn)為編碼蛋白或多肽的任何基因均在本發(fā)明的范圍內(nèi)，所述蛋白或多肽由于突變而減少或不存在，或者在過(guò)量表達(dá)時(shí)帶來(lái)治療益處。[0102]在本發(fā)明的范圍內(nèi)還考慮使用U7技術(shù)以跳過(guò)框外的基因(Pietr1-Rouxel等人，2010;美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/314，830和W02006/021724，整體援引加入本文。這樣，可以調(diào)控任何基因的表達(dá)。在這上下文中，可以通過(guò)U7系統(tǒng)減少基因的表達(dá)，其中已知突變的版本引起疾病，但是對(duì)于生物體或器官的正常功能不是必需的(例如，S0D1、DM1)。U7系統(tǒng)還可以用于通過(guò)反式剪接進(jìn)行基因糾正(美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/249，702號(hào)，其整體援引加入本文，以及EP2010/065142，其也適合與rAAVO載體系統(tǒng)一起使用。重要的是，rAAVO技術(shù)還允許基因(例如，攜帶顯性突變的基因)的平行(即，分離)下調(diào)以及相同基因的取代(以恢復(fù)其生理特性)。通過(guò)這種方式，一rAAVO載體用來(lái)關(guān)閉基因，而另一rAAVO載體用來(lái)引入正?？截惖南嗤颍瑴p少或消除一個(gè)對(duì)另一個(gè)的干擾并允許兩種干預(yù)的獨(dú)立劑量給藥。這樣的方法可以使用例如讀框外外顯子跳躍用于基因沉默(Id.)，使用編碼外顯子跳躍誘導(dǎo)AON的一rAAVO載體并用第二rAAVO載體引入正常的基因拷貝，其中密碼子優(yōu)化使得正?；蚩截悓?duì)引入外顯子跳躍的寡反義序列不敏感(參見(jiàn)例如Dominquezetal.,2010andMillington-Wardetal.,2011)?在這個(gè)上下文中，還很重要的是兩個(gè)載體可以以獨(dú)立的方式劑量給藥并重復(fù)，從而允許調(diào)整靶組織中期望的表達(dá)水平。在另一實(shí)施方案中，可以平行引入不同的rAAVO載體以同時(shí)或連續(xù)取代基因的不同同種型。[0103]本發(fā)明進(jìn)一步提供制備rAAVO載體的方法，所述方法包括:[0104]-向宿主細(xì)胞提供如上文所述的rAAVO質(zhì)粒，其中宿主細(xì)胞和質(zhì)粒均沒(méi)有衣殼蛋白編碼基因，[0105]-在允許產(chǎn)生AAVO基因組的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，[0106]-收獲細(xì)胞并分離從所述細(xì)胞產(chǎn)生的AAVO基因組。[0107]在上述方法中，允許產(chǎn)生AAVO基因組的條件特別是如下文提供的包含誘導(dǎo)Rep蛋白表達(dá)的條件。[0108]利用針對(duì)細(xì)胞的量適當(dāng)規(guī)?；馁|(zhì)粒純化試劑盒已成功地分離rAAVO載體。例如,QiagenEndoFree質(zhì)粒試劑盒已用來(lái)從Sf9細(xì)胞分離和純化rAAVO。為質(zhì)粒分離開(kāi)發(fā)的其他方法可以適合rAAVO，因?yàn)樵硎窍嗤?，即將低分子量DNA與細(xì)胞基因組DNA分級(jí)分離,并且從產(chǎn)物去除蛋白和RNA。[0109]本領(lǐng)域已知的用于產(chǎn)生AAV載體的任何細(xì)胞系均可以用作宿主rAAVO載體生成細(xì)胞系。具體地，考慮其中AAV-REP蛋白可以用于AAVO基因組動(dòng)員的細(xì)胞類型(例如，Sf9,293等)。還可以使用已知被AAV感染的其他細(xì)胞系，例如Huh-7、HeLa、!fepG2、!feplA、911、CH0、COS、MeWo、NIH3T3、A549、HTl180、單核細(xì)胞以及成熟和未成熟的樹(shù)突細(xì)胞。僅為了示例的目的，下文我們描述了利用Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞產(chǎn)生rAAVO載體的過(guò)程。[0110]可以利用本領(lǐng)域已知的試劑(例如，脂質(zhì)體、磷酸鈣)或物理方式(例如，電穿孔)通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染將rAAVO質(zhì)粒引入Sf9細(xì)胞。可選地，可以建立穩(wěn)定的Sf9細(xì)胞系，其已將rAAVO質(zhì)粒穩(wěn)定地整合入它們的基因組。可以通過(guò)將選擇標(biāo)記并入如上文所述的rAAVO質(zhì)粒來(lái)建立這類穩(wěn)定細(xì)胞系。[0111]通常,通過(guò)引入編碼rAAV基因組、Rep蛋白和Cap蛋白的質(zhì)?；蚨喾N質(zhì)粒廣生具有衣殼的AAV病毒粒子。在反式引入這些輔助質(zhì)粒時(shí)，從宿主基因組“拯救”(即，釋放并隨后恢復(fù))AAV基因組并進(jìn)一步衣殼化以產(chǎn)生傳染性AAV。但是，據(jù)發(fā)現(xiàn)這類衣殼化的AAV病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)某些細(xì)胞或組織類型的效率低。相比之下，本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)用無(wú)衣殼的AAVO載體轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)于難以用常規(guī)AAV病毒粒子轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞或組織類型效率高。本發(fā)明與這類常規(guī)方法的區(qū)別在于僅需要反式的AAVR印編碼載體。AAVRep編碼載體可以是例如表達(dá)R印蛋白的桿狀病毒的形式。如上文所述，可以通過(guò)不同方式引入Rep，例如通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)或穩(wěn)定整合入細(xì)胞系，其中在啟動(dòng)子激活時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)。因此，一旦將AAVRep編碼載體引入Sf9細(xì)胞系(已將rAAVO質(zhì)粒穩(wěn)定整合入其基因組)，rAAVO載體從宿主基因組拯救，但是不進(jìn)一步衣殼化為病毒顆粒。對(duì)于rAAVO質(zhì)粒,還可能加入AAVRep蛋白編碼核苷酸序列。[0112]可以利用本領(lǐng)域已知的方法或利用可商購(gòu)的試劑盒(例如，Qiagenminiprep試劑盒)純化DNA形式的所拯救的rAAVO載體。[0113]拯救的rAAVO載體還可以以外來(lái)體或微粒的形式純化。本領(lǐng)域已知許多細(xì)胞類型不僅釋放可溶性蛋白，而且還通過(guò)膜微泡脫落釋放復(fù)雜的蛋白/核酸載荷(Cocuccietal,2009;EP10306226.1)。這類小泡包括微泡(也稱為微粒)和外來(lái)體(也稱為納囊泡(nanovesicle))，兩者均包含蛋白和RNA作為載荷。微泡從質(zhì)膜的直接出芽產(chǎn)生，而外來(lái)體在多泡核內(nèi)體與質(zhì)膜融合時(shí)釋放入細(xì)胞外環(huán)境。因此，可以從已用rAAVO載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞分離包含rAAVO載體的微泡和/或外來(lái)體。可以通過(guò)將培養(yǎng)基過(guò)濾或以20000g超速離心來(lái)分離微泡，并且以1000OOg超速離心分離外來(lái)體。超速離心的最佳持續(xù)時(shí)間可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定，并且取決于分離小泡的具體細(xì)胞類型。優(yōu)選地，首先通過(guò)低速離心(例如，以2000g離心5-20分鐘)使培養(yǎng)基澄清，并且利用例如Amicon離心柱(Millipore，Watford,UK)進(jìn)行自旋濃縮。微泡和外來(lái)體可以通過(guò)FACS或MACS進(jìn)一步純化，通過(guò)使用識(shí)別微泡和外來(lái)體上存在的特異性表面抗原的特異性抗體。其他微泡和外來(lái)體純化方法包括但不限于免疫沉淀、親和層析、過(guò)濾以及用特異性抗體或適配體包被的磁珠。在純化時(shí)，用例如磷酸緩沖鹽水洗滌小泡。使用微泡或外來(lái)體遞送rAAVO小泡的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是這些小泡可以通過(guò)在它們的膜上包括各細(xì)胞類型上的特異性受體識(shí)別的蛋白來(lái)靶向各種細(xì)胞類型。(還參見(jiàn)EP10306226.1)[0114]如上文所述，用于rAAVO載體制備的宿主細(xì)胞并不限于Sf9細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，分離自患有疾病的對(duì)象的細(xì)胞可以用作rAAVO載體制備的宿主。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞可以分離自受疾病具體影響的組織。例如，肌肉細(xì)胞可以分離自患有肌營(yíng)養(yǎng)不良的對(duì)象。在某些情況下，rAAVO載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞(例如，培養(yǎng)的成肌細(xì)胞)會(huì)主動(dòng)脫落包含rAAVO載體的外來(lái)體和/或微粒。然后這些外來(lái)體和/或微?？梢宰鳛榻M織培養(yǎng)上清收獲并用于隨后的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。在一實(shí)例中，包含外來(lái)體和/或微粒的培養(yǎng)上清可以用來(lái)將rAAVO載體遞送入視網(wǎng)膜細(xì)胞以治療例如RPGRIP1缺陷(Lh6riteauetal.,2009)或色素性視網(wǎng)膜炎(Ji_jingPangetal.，2008)。綜述參見(jiàn)Rollingetal.，2010。[0115]在一具體實(shí)施方案中，制備rAAVO載體的方法包括以下步驟:[0116]-用包含AAVO構(gòu)建體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞(特別是Sf9細(xì)胞)，[0117]-任選地，利用質(zhì)粒上存在的選擇標(biāo)記建立克隆細(xì)胞系，[0118]-將Rep編碼基因引入(通過(guò)用攜帶所述基因的桿狀病毒轉(zhuǎn)染或感染)所述昆蟲(chóng)細(xì)胞，[0119]-收獲細(xì)胞并純化rAAVO載體。[0120]純化具體可以這樣完成，使細(xì)胞沉淀進(jìn)行堿裂解，離心裂解物并將上清裝在保留核酸的離子交換柱(例如SartobindQ)上。然后將物質(zhì)洗脫(例如用1.2MNaCl溶液)并裝在凝膠過(guò)濾柱(例如6快速流動(dòng)GE)上。然后通過(guò)沉淀回收AAVO載體。[0121]通過(guò)本發(fā)明的制備方法，可以制備大量rAAVO載體。[0122]在另一實(shí)例中，rAAVO載體可以用來(lái)體外轉(zhuǎn)染干細(xì)胞。這些可以是任何種類的干細(xì)胞，例如胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞、成體干細(xì)胞以及循環(huán)或組織常駐性干細(xì)胞。實(shí)例包括但不限于0)133+細(xì)胞、mesangioblast和ALDH+干細(xì)胞?？梢詫⑦@些干細(xì)胞離體培養(yǎng)并用rAAVO載體轉(zhuǎn)導(dǎo)以引發(fā)基因表達(dá)的瞬時(shí)或永久改變。瞬時(shí)改變可以通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠誘導(dǎo)、沉默或修改基因表達(dá)的DNA或RNA序列來(lái)完成，通過(guò)引入偶聯(lián)至功能性啟動(dòng)子的基因，或者通過(guò)引入偶聯(lián)至能夠誘導(dǎo)外顯子跳躍事件(讀框內(nèi)或讀框外)的反義序列的Ul或U7基因，或者通過(guò)賦予反式沉默序列。如果在細(xì)胞培養(yǎng)的早期世代階段進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，rAAVO載體會(huì)通過(guò)隨后的傳代稀釋并最終丟失，即，這會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)的瞬時(shí)改變。相比之下，如果DNA切割酶由轉(zhuǎn)移的基因如鋅指核酸酶或大范圍核酸酶或TAL核酸外切酶編碼，則這可以導(dǎo)致受體細(xì)胞的永久性(孟德?tīng)?基因改變。在這個(gè)上下文中，AAVO技術(shù)的一個(gè)具體優(yōu)勢(shì)是由于加入比常規(guī)AAV載體所允許的更大的序列的能力以及用包含互補(bǔ)載荷的一種或多種AAVO載體轉(zhuǎn)染的可能性，可以將糾正DNA基質(zhì)同時(shí)轉(zhuǎn)移入這些細(xì)胞。[0123]I1.rAAVO載體的給藥[0124]向其遞送rAAVO載體的細(xì)胞可以來(lái)源于人以及其他哺乳動(dòng)物如靈長(zhǎng)類、馬、綿羊、山羊、豬、狗、大鼠和小鼠。可以將rAAVO載體遞送至任何細(xì)胞類型、組織或器官，沒(méi)有限制。可以向其遞送rAAVO的細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的細(xì)胞、外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)的細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、成骨細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等?？梢韵蚱溥f送rAAVO載體的組織和器官的實(shí)例包括肌肉、心肌、平滑肌、腦、骨、結(jié)締組織、心臟、腎、肝、肺、淋巴結(jié)、乳腺、髓鞘、前列腺、睪丸、胸腺、甲狀腺、氣管等。優(yōu)選的細(xì)胞類型為肌肉細(xì)胞、CNS的細(xì)胞和PNS的細(xì)胞。優(yōu)選的組織和器官為肌肉、心臟、眼和腦。[0125]根據(jù)靶細(xì)胞所位于的具體組織，感興趣的DNA、RNA、多肽、蛋白或AON的組織特異性表達(dá)可以通過(guò)在rAAVO載體中加入驅(qū)動(dòng)外源DNA序列的轉(zhuǎn)錄的組織特異性啟動(dòng)子來(lái)實(shí)現(xiàn)。組織特異性啟動(dòng)子的實(shí)例如上文所示。[0126]可以通過(guò)任何方式將本發(fā)明的rAAVO載體遞送至細(xì)胞，包括使rAAVO載體與細(xì)胞接觸。即，rAAVO載體并不絕對(duì)需要轉(zhuǎn)染試劑用于細(xì)胞進(jìn)入。這是非常意外的特性，因?yàn)楦鶕?jù)本領(lǐng)域的經(jīng)典假設(shè)，通過(guò)AAV顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)包括AAV顆粒的內(nèi)吞作用，其胞內(nèi)運(yùn)輸至細(xì)胞核及其入核(參見(jiàn)例如Dingetal.,2005)0然后在細(xì)胞核中從AAV顆粒釋放衣殼化的AAV基因組。根據(jù)這個(gè)觀點(diǎn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員預(yù)期使用無(wú)衣殼的AAV基因組會(huì)導(dǎo)致沒(méi)有細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)，因?yàn)椴荒苓M(jìn)入細(xì)胞或易位入細(xì)胞核，或者基因組可能被核酸內(nèi)切酶或核酸外切酶降解。與這個(gè)教導(dǎo)相反，本發(fā)明人證實(shí)無(wú)衣殼的AAVO基因組能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，并且以功能形式到達(dá)細(xì)胞核，由此可以實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)。[0127]因此本發(fā)明還涉及將感興趣的核酸遞送入細(xì)胞的方法，所述方法包括在轉(zhuǎn)染試劑或額外的物理手段的存在下使至少一種rAAVO載體與細(xì)胞表面接觸以促進(jìn)所述rAAVO載體進(jìn)入細(xì)胞。其還涉及在細(xì)胞中引起期望的基因產(chǎn)物或寡核苷酸的表達(dá)的方法，所述方法包括在轉(zhuǎn)染試劑或額外的物理手段不存在的情況下使至少一種rAAVO載體與細(xì)胞表面接觸以促進(jìn)所述rAAVO載體進(jìn)入細(xì)胞。[0128]rAAVO載體可以作為基于轉(zhuǎn)染試劑的將遺傳物質(zhì)遞送入細(xì)胞的一種替代。但是，在一些實(shí)施方案中，rAAVO載體可以與轉(zhuǎn)染試劑或物理手段聯(lián)用以促進(jìn)進(jìn)入細(xì)胞。在體外，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的將DNA遞送入細(xì)胞的方法將rAAVO載體遞送入細(xì)胞。例如，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染方法(例如，轉(zhuǎn)染試劑如脂質(zhì)體、醇、富含多聚賴氨酸的化合物、富含精氨酸的化合物和磷酸鈣)、顯微注射等將rAAVO載體引入細(xì)胞。引入細(xì)胞的其他方法包括例如綴合至蛋白、納米顆?；蛘甙b入細(xì)胞來(lái)源的微泡(例如，微粒、外來(lái)體)(參見(jiàn)EP10306226.1)。[0129]對(duì)于體內(nèi)遞送至對(duì)象細(xì)胞、組織或器官，可以將rAAVO載體加入適合向?qū)ο蠼o藥的藥物組合物。通常，所述藥物組合物包含rAAVO載體和藥學(xué)可接受的載體(carrier)。如本文所用，“藥學(xué)可接受的載體(carrier)”包括生理上相容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。藥學(xué)可接受的載體(carrier)的實(shí)例包括水、鹽水、磷酸緩沖鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等中的一種或多種，或者它們的組合。包含rAAVO載體的藥物組合物可以作為例如藿香、噴霧劑、口服混懸劑、栓劑、滴眼液和可注射的混懸劑遞送。[0130]可以將本發(fā)明的rAAVO載體加入適合局部、全身、羊膜內(nèi)、鞘內(nèi)、顱內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、淋巴內(nèi)、腹腔內(nèi)、皮下、氣管、組織內(nèi)(例如,肌肉內(nèi)、心內(nèi)、肝內(nèi)、腎內(nèi)、大腦內(nèi))、鞘內(nèi)、膀胱內(nèi)、結(jié)膜(例如，眶外、眶內(nèi)、眶后、視網(wǎng)膜內(nèi))和粘膜(例如，口服、直腸、鼻部)給藥的藥物組合物中。還考慮通過(guò)高壓靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)輸液以及細(xì)胞內(nèi)注射如細(xì)胞核內(nèi)顯微注射或胞漿內(nèi)注射的被動(dòng)組織轉(zhuǎn)導(dǎo)。[0131]用于治療目的的藥物組合物通常在制備和儲(chǔ)存條件下必須是無(wú)菌的和穩(wěn)定的。組合物可以配制為溶液劑、微乳劑、分散劑、脂質(zhì)體或適合高rAAVO載體濃度的其他有序結(jié)構(gòu)。無(wú)菌的可注射的溶液可以這樣制備，將需要量的rAAVO載體化合物與需要的上文所列的一種成分或多種成分的組合加入適當(dāng)?shù)木彌_液，然后過(guò)濾除菌。[0132]對(duì)于rAAVO載體的體內(nèi)給藥，rAAVO載體的廣泛分布可以通過(guò)例如靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)注射或流體動(dòng)力局部灌注在肌肉中實(shí)現(xiàn)。根據(jù)劑量和遞送模式，可以轉(zhuǎn)導(dǎo)給定靶肌肉中20-95%的肌纖維。rAAVO載體的廣泛分布還可以通過(guò)將rAAVO載體例如通過(guò)腰椎穿刺注射入腦脊液來(lái)在CNS或PNS中實(shí)現(xiàn)(例如，Kapadiaetal.，1996)?？蛇x地，將載體精確遞送入腦的特定部位以祀向神經(jīng)細(xì)胞可以利用立體定向顯微注射技術(shù)來(lái)進(jìn)行(Snyder-Kelleretal.，2010)。特別優(yōu)選的遞送方法是將rAAVO載體遞送至需要表達(dá)rAAVO載體編碼的多肽、蛋白或寡核苷酸的腦或肌肉的特定區(qū)域的方法。無(wú)論皮下、顱內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮內(nèi)，rAAVO載體的直接注射可以利用標(biāo)準(zhǔn)針頭和注射器方法或者通過(guò)無(wú)針技術(shù)進(jìn)行。上述方法可以用包含藥學(xué)可接受的載體(carrier)或媒介物的藥物組合物形式的rAAVO載進(jìn)行。還考慮有或無(wú)細(xì)胞的局部施用，后者在皮膚上直接使用局部制劑的AAVO用于大皰性表皮松解的隱性形式(參見(jiàn)例如Yanetal.，2010)。[0133]用于遞送核酸分子如本公開(kāi)的rAAVO載體的其他方法描述于例如Boadoetal.,J.Pharm.Sc1.87:1308-1315(1998);Tyleretal.,FEBSLett.421:280-284(1999);Pardridgeetal.,Proc.Nat'IAcad.Sc1.USA92:5592-5596(1995);Boado,Adv.DrugDeliveryRev.15:73-107(1995);Aldrian-Herradaetal.,NucleicAcidsRes.26:4910-4916(1998);TyIeretal.,Proc.Nat'IAcad.Sc1.USA96:7053-7058(1999);Akhtaretal.,TrendsCellBi0.2:139(1992);"DeliveryStrategiesforAntisenseOligonucleotideTherapeutics,〃(ed.Akhtar,1995);Maureretal.,Mol.Membr.Biol.16:129-140(1999);HoflandandHuang,Handb.Exp.Pharmacol137:165-192(1999);以及Leeetal.,ACSSymp.Ser.752:184-192(2000)?這些方案可以用來(lái)補(bǔ)充或完成本公開(kāi)內(nèi)考慮的幾乎任何rAAVO載體的遞送。[0134]適當(dāng)?shù)膭┝咳Q于具體細(xì)胞類型、組織、器官或治療的對(duì)象。當(dāng)向?qū)ο蠼o藥時(shí)，劑量會(huì)取決于治療的具體哺乳動(dòng)物(例如，人或非人靈長(zhǎng)類或其他哺乳動(dòng)物)，待治療的對(duì)象的年齡和一般疾病狀況，治療的疾病狀況的嚴(yán)重程度，有問(wèn)題的具體的治療性多肽、蛋白或寡核苷酸，其給藥模式等。[0135]本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定適當(dāng)?shù)挠行Я?。[0136]“治療有效劑量”會(huì)落在相對(duì)廣泛的范圍內(nèi)，所述范圍可以通過(guò)臨床試驗(yàn)確定，并且取決于具體應(yīng)用(神經(jīng)細(xì)胞會(huì)需要非常少的量，而全身注射會(huì)需要大量)。例如，對(duì)于直接體內(nèi)注射入人類對(duì)象的骨骼肌或心肌，治療有效劑量會(huì)在約Iμg-100g的rAAVO載體的數(shù)量級(jí)上。如果外來(lái)體或微粒用來(lái)遞送rAAVO載體，則治療有效劑量可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定，但是預(yù)期遞送Iμg-約100g的載體。[0137]對(duì)于體外轉(zhuǎn)染，遞送至細(xì)胞(IxlO6個(gè)細(xì)胞)的rAAVO載體的有效量在1-20μgrAAVO載體，優(yōu)選5-15μg，并且更優(yōu)選8_10μg的數(shù)量級(jí)上。較大的rAAV載荷會(huì)需要較高的劑量。如果使用外來(lái)體或微粒，有效的體外劑量可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定，但是計(jì)劃一般遞送相同量的載體。[0138]治療可以包括單一劑量或多劑量的給藥?？梢韵?qū)ο蠼o藥超過(guò)一個(gè)劑量，事實(shí)上根據(jù)需要給藥多劑量，因?yàn)閞AAVO載體不引發(fā)抗衣殼的宿主免疫應(yīng)答，這是由于不存在病毒衣殼。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定適當(dāng)數(shù)量的劑量。給藥的劑量的數(shù)量可以例如在1-100，優(yōu)選2-20個(gè)劑量的數(shù)量級(jí)上。[0139]II1.rAAVO載體的治療用途[0140]本發(fā)明的rAAVO載體特別適合將編碼多肽、蛋白的外源DNA序列或者非編碼的DNA、RNA或寡核苷酸遞送至例如患有肌肉或CNS疾病的對(duì)象的肌肉和CNS的細(xì)胞。[0141]本發(fā)明的rAAVO載體特別用于許多神經(jīng)學(xué)或神經(jīng)變性疾病，所述疾病可以受益于在疾病或病癥中缺陷的肽或蛋白的表達(dá)，從而所述肽或蛋白的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致與疾病或病癥相關(guān)的癥狀的改善。可應(yīng)用的疾病的一些實(shí)例包括但不限于杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良、脊髓型肌萎縮、AIDS、龐帕病、帕金森病、亨廷頓病、阿爾茨海默病、戈謝病、赫爾勒病、腺苷脫氨酶(ADA)缺陷、氣腫、早衰、ALS、癲癇、中風(fēng)、高膽固醇血癥、胰島素病癥(例如，糖尿病)、生長(zhǎng)病癥、各種血液病癥(例如，貧血、地中海貧血和血友病)、遺傳缺陷(例如，囊性纖維化)、癌癥(特別是實(shí)體瘤)等。[0142]在一些實(shí)施方案中，rAAVO載體可以用來(lái)糾正異常蛋白的表達(dá)，這通過(guò)靶向產(chǎn)生負(fù)責(zé)疾病發(fā)展的異常蛋白的潛在缺陷機(jī)制。肌養(yǎng)蛋白基因的異常剪接可以利用包含例如編碼AON、U7或反式剪接盒的核苷酸序列的rAAVO載體來(lái)糾正以影響肌肉組織(參見(jiàn)例如Goyenvalleetal.,2004；Lorainetal.，2010;以及專利申請(qǐng)W02006/021724、美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/314，830、美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/249，702號(hào)和EP2010/065142，全部援引加入本文)。在其他實(shí)施方案中，可以遞送包含全長(zhǎng)肌養(yǎng)蛋白基因的rAAVO載體以影響肌肉組織。[0143]涉及異?；虍a(chǎn)物的表達(dá)的許多疾病是AAVO介導(dǎo)的基因治療的候選。例如，證實(shí)由于缺陷的肌養(yǎng)蛋白基因產(chǎn)物的杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD)的基因治療涉及用功能性肌養(yǎng)蛋白基因代替缺陷的肌養(yǎng)蛋白基因，從而可以治療對(duì)象體內(nèi)受影響的肌肉。肌養(yǎng)蛋白基因中的突變導(dǎo)致在橫紋肌中不能產(chǎn)生肌養(yǎng)蛋白。但是，突變的程度不與表型的嚴(yán)重程度直接相關(guān)。產(chǎn)生提前終止密碼子和隨后的翻譯停止的讀框外缺失或無(wú)義突變導(dǎo)致特征為嚴(yán)重表型的肌養(yǎng)蛋白缺陷。讀框內(nèi)缺失通常負(fù)責(zé)已知為Becker肌營(yíng)養(yǎng)不良(BMD)的較輕的肌病。[0144]AAVO載體介導(dǎo)的治療的效力可以通過(guò)將表達(dá)感興趣的轉(zhuǎn)基因的rAAVO載體引入分離自患者或本領(lǐng)域可用的動(dòng)物模型的細(xì)胞來(lái)證實(shí)。有兩個(gè)良好表征的DMD的遺傳動(dòng)物模型。mdx小鼠在肌養(yǎng)蛋白基因的外顯子23中包含無(wú)義突變，其妨礙全長(zhǎng)的野生型肌養(yǎng)蛋白的合成。mdx小鼠表現(xiàn)出抵消變性的補(bǔ)償機(jī)制，其可以維持再生過(guò)程以修復(fù)機(jī)械損傷。mdx小鼠不表現(xiàn)出DMD的癥狀，并且其壽命幾乎是正常的。GRMD(黃金獵犬肌營(yíng)養(yǎng)不良)狗缺少功能性肌養(yǎng)蛋白，這是因?yàn)閮?nèi)含子6中的剪接位點(diǎn)突變，其破壞讀框。在GRMD中，如人DMD，纖維的逐步退化不可避免地導(dǎo)致骨骼肌萎縮，具有顯著的肌內(nèi)膜和肌束膜纖維化。因?yàn)槠銬MD樣表型，GRMD是評(píng)價(jià)DMD的潛在治療的最佳可用模型。[0145]遞送本發(fā)明的rAAVO載體的方法一般與用于常規(guī)病毒載體的方法相同(參見(jiàn)例如Goyenvalleetal.,2004;Toromanoffetal.,2010;Loweryetal.,2010;Duqueetal.,2009)0盡管沒(méi)有衣殼，AAVO載體不需要轉(zhuǎn)導(dǎo)輔助以進(jìn)入細(xì)胞或細(xì)胞核。因此，本發(fā)明還提供將外源DNA遞送入細(xì)胞、組織或器官的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞、組織或器官與本發(fā)明的rAAVO載體接觸，不使用轉(zhuǎn)導(dǎo)輔助。[0146]在另一實(shí)例中，rAAVO載體可以用來(lái)通過(guò)在癌癥的背景中選擇性基因轉(zhuǎn)移來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡(參見(jiàn)例如Gruberetal.,2011)?[0147]此外，本發(fā)明提供將感興趣的核酸遞送入有需要的對(duì)象的細(xì)胞的方法，其中所述方法是非免疫原性的，或者具有減少的免疫原性，所述方法包括向所述對(duì)象給藥包含感興趣的核酸的本發(fā)明的rAAVO載體。此外，本發(fā)明提供將感興趣的核酸遞送入有需要的對(duì)象的細(xì)胞的方法，所述方法包括多次給藥包含感興趣的核酸的本發(fā)明的rAAVO載體。因?yàn)楸景l(fā)明的rAAVO載體不誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，所以與用衣殼化的載體所觀察到的相反，這樣的多次給藥策略不會(huì)受到針對(duì)本發(fā)明的rAAVO載體的宿主免疫系統(tǒng)應(yīng)答的損害。[0148]上述公開(kāi)一般描述本公開(kāi)，其通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步描述。這些具體實(shí)施例僅為了說(shuō)明目的提供，并不是為了限制本公開(kāi)的范圍。雖然本文已采用具體靶標(biāo)、術(shù)語(yǔ)和值，但是這類靶標(biāo)、術(shù)語(yǔ)和值同樣應(yīng)理解為示例性的，并不限制本公開(kāi)的范圍。實(shí)施例[0149]實(shí)施例1:用于制備rAAVO載體的rAAVO質(zhì)粒的構(gòu)建[0150]AAVO-GFP質(zhì)粒(“pFBGR/Blas”)如下構(gòu)建。利用引物序列5’-ATAAGCTTACGCTCAGTGGAAVGAAAAC-3’(SEQIDNO:7)和5’-ATAAGCTTGACGTGTCAGTGTCAGTCCTGCTCCT-3’(SEQIDN0:8),通過(guò)高保真PCR,擴(kuò)增pIB/V5_His/CAT質(zhì)粒(InvitrogenInc.)中的殺稻瘟素S基因(2784-3183bp)以及黃杉毒蛾立即早期_1啟動(dòng)子(OpIE-1;240l_2692bp)(Invitrogen,Inc.)和EM7啟動(dòng)子(2707_2765bp)。HindIII消化后，將865bpPCR產(chǎn)物克隆入AAV2包裝質(zhì)粒，pFBGR(Urabeetal.,2002)的HindIII位點(diǎn)。進(jìn)行限制性圖譜和DNA測(cè)序以證實(shí)正確的質(zhì)粒構(gòu)建。[0151]實(shí)施例2:制備和純化rAAVO載體[0152]針對(duì)pFBGR/Blas質(zhì)粒建立克隆Sf9細(xì)胞系。利用Cellfectin(Invitrogen),用pFBGR/Blas質(zhì)粒轉(zhuǎn)染秋粘蟲(chóng)(Spodopterafrugiperda,Sf-9)細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后,將細(xì)胞在昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基(HyCloneInc.)中于27°C下培養(yǎng)3天。然后添加殺稻瘟素SHCl(50μg/ml)以選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子。兩周的選擇期后，將稀釋克隆和直接菌落轉(zhuǎn)移技術(shù)用于獲得獨(dú)立的克隆細(xì)胞系。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在10%FBSHyQ生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)并擴(kuò)增以在殺稻瘟素SHCl選擇(10μg/ml)下形成獨(dú)立的菌落。[0153]將殺稻瘟素抗性克隆細(xì)胞系單獨(dú)地用表達(dá)AAVRep78和R印52(“R印-Bac”)蛋白的重組桿狀病毒感染(M0I=5)，并篩選GFP表達(dá)。R印-Bac描述于Urabeetal.，2002。如Viragetal.，2009所述制備重組桿狀病毒以產(chǎn)生足以用于動(dòng)物研究的量。R印-Bac感染后，在熒光顯微鏡下并且通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(GuavaEasyCyte)發(fā)現(xiàn)許多細(xì)胞系表達(dá)GFP。從Rep-Bac細(xì)胞提取染色體外DNA并且同瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。Rep-Bac感染后2.6kb條帶的存在表明，從染色體DNA“釋放”了“前病毒”rAAVO-GFP基因組并且作為AAVDNA以高拷貝數(shù)復(fù)制。[0154]為了分離和純化AAVO載體，在用Rep-Bac感染時(shí)擴(kuò)增克隆Sf9細(xì)胞系并且以2xl06細(xì)胞/mL接種(Μ0Ι=1-3)。每天監(jiān)控細(xì)胞活力和大小(Cellometer)。細(xì)胞直徑的增加表示成功的桿狀病毒感染。一旦平均細(xì)胞直徑達(dá)到17-20μm就收獲AAVO載體。通過(guò)熒光顯微鏡和GuavaEasyCyte(Millipore)證實(shí)GFP表達(dá)表明Sf9/ITR_GFP細(xì)胞的有效R印桿狀病毒感染。用Qiagenminiprep試劑盒從培養(yǎng)的細(xì)胞(ImL)提取AAVO-GFP載體DNA以證實(shí)AAVO-GFP載體DNA的存在。更大水平的DNA提取可以用Qiagengigaprep試劑盒進(jìn)行。[0155]實(shí)施例3:rAAVO載體介導(dǎo)的體外基因表達(dá)[0156]利用Xenoworks微注射系統(tǒng)(SutterInstruments),將rAAVO-GFP載體微注射入293細(xì)胞和C2C12細(xì)胞的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中。共微注射四甲基羅丹明70000MW賴氨酸可固定葡聚糖作為微注射的區(qū)域標(biāo)記物。細(xì)胞核用DAPI染色。[0157]此外，為了證實(shí)rAAVO與常規(guī)質(zhì)粒-DNA相比額外的性質(zhì)，當(dāng)微注射入細(xì)胞質(zhì)時(shí)測(cè)試rAAVO轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的能力。實(shí)際上，質(zhì)粒-DNA需要直接遞送入細(xì)胞核中，細(xì)胞質(zhì)微注射并不是有效的。這里，使C2C12成肌細(xì)胞生長(zhǎng)并分化2天。利用Xenoworks微注射系統(tǒng)(SutterInstruments)，將AAV0-GFP載體的溶液(0.02mg/ml)微注射入C2C12肌管的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中。共微注射四甲基羅丹明70000MW賴氨酸可固定葡聚糖(Sigma)作為微注射的區(qū)域標(biāo)記物。微注射后48小時(shí),利用聚甲醒3.7%(Sigma)固定肌管,并用0.5%Triton透化。所有突光染色固定在FluoromontG(SouthernBiotech)中。細(xì)胞核用DAPI(Sigma)染色。不于圖5中的熒光圖用配有CoolSNAPHQ2相機(jī)(RoperScientific)的NikonTi顯微鏡獲得，利用40x1.0NAPLAPO油鏡，通過(guò)Metamorph(MolecularDevices)驅(qū)動(dòng)。參見(jiàn)圖5b。[0158]圖5b中的結(jié)果(左邊)證實(shí)，細(xì)胞核被熒光染料染色，這又表明構(gòu)建體被遞送入細(xì)胞核中。GFP熒光證實(shí)GFP表達(dá)，這又表明從轉(zhuǎn)導(dǎo)的rAAVO-GFP載體的轉(zhuǎn)錄。[0159]實(shí)施例4:通過(guò)動(dòng)脈內(nèi)注射的rAAVO載體介導(dǎo)的體內(nèi)基因表達(dá)[0160]通過(guò)麻醉C57BL/6小鼠，分離右后肢用于單手動(dòng)高壓注射，或者兩肢用于雙手動(dòng)高壓注射來(lái)將AAVO-GFP載體動(dòng)脈內(nèi)注射入股動(dòng)脈中。箝住股靜脈和兩根側(cè)支血管后，將導(dǎo)管引入股動(dòng)脈中，并以lOOml/s的速率注射Iml磷酸緩沖鹽水(PBS)中的100μgAAV0_GFP載體制品。灌注后I分鐘，放開(kāi)結(jié)扎的股靜脈以打開(kāi)循環(huán)。灌注后2周分析肢的GFP表達(dá)。[0161]實(shí)施例5:rAAVO載體介導(dǎo)的體內(nèi)基因表達(dá)不引起免疫應(yīng)答[0162]小鼠以I周的間隔接受兩次高動(dòng)力股動(dòng)脈內(nèi)AAVO-GFP注射。第一次注射在左腿(lmlPBS中的IOOygAAV0-GFP)上進(jìn)行，并且一周后的第二次注射在右腿上進(jìn)行(1mlPBS中的100μgAAV0-GFP)。第二次注射后，在用常規(guī)Zeiss熒光顯微鏡分析之前，使小鼠恢復(fù)8周。通常，>48h后再給藥rAAV是不可能的，因?yàn)榇嬖谥泻涂贵w(Lorainetal.，2008)。I周后再注射導(dǎo)致未減少的對(duì)側(cè)腿轉(zhuǎn)導(dǎo)表明不存在針對(duì)rAAVO載體的免疫應(yīng)答。[0163]實(shí)施例6:通過(guò)視網(wǎng)膜下注射的rAAVO載體介導(dǎo)的基因表達(dá)[0164]對(duì)于眼窩注射，將動(dòng)物麻醉，并利用諸如胰島素注射器向眼窩竇注射含有400μLPBS中的ZOOygAAVO-GFP載體的溶液。通常，標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以用于小鼠或大鼠(Timmersetal.,2001)或犬或非人靈長(zhǎng)類(Weberetal.,2003)的視網(wǎng)膜下注射。rAAVO載體會(huì)含有組織特異性啟動(dòng)子如細(xì)胞特異性G蛋白偶聯(lián)受體激酶I(GRKl)，其能夠在視桿和視錐細(xì)胞光受體中建立穩(wěn)健的轉(zhuǎn)基因表達(dá)(Khanietal.，2007)。另一啟動(dòng)子實(shí)例為廣譜(ubiquitous)smCBA啟動(dòng)子，其有效地祀向神經(jīng)視網(wǎng)膜(Haireetal.，2006)。這些啟動(dòng)子可以作為控制元件連接至期望的轉(zhuǎn)基因，其在要治療的疾病中缺少表達(dá)，例如鳥(niǎo)氨酸環(huán)化酶-1基因，其突變導(dǎo)致Leber先天性黑朦(LeberCongenitalAmaurosis)(Boyeetal.，2010);或者連接至RPE65基因，其也導(dǎo)致Leber先天性黑朦(Lh6riteauetal.,2010);或者連接至RDlO基因，其如果突變會(huì)導(dǎo)致隱性遺傳視網(wǎng)膜色素變性(Pangetal.,2011)0對(duì)于可通過(guò)基因療法修復(fù)的視網(wǎng)膜疾病的綜述,參見(jiàn)StiegerandLorenz,2010。通常，在一般麻醉下，以小鼠中0.5-2μI或者犬或非人靈長(zhǎng)類中50-600μI的物種適應(yīng)體積,視網(wǎng)膜下注射5xl0e9-5X10ell載體顆粒。在較大的動(dòng)物中，這種方法可以與玻璃體切除術(shù)組合。典型地，對(duì)于犬，將44號(hào)套管(Corneal)連接至粘性流體注射(VFI)系統(tǒng)(D.0.R.C.1nternational,Netherlands),通過(guò)在顯微術(shù)控制下,在鞏膜切開(kāi)術(shù)后將套管通過(guò)玻璃體插入并靶向絨氈層中央視網(wǎng)膜下的視網(wǎng)膜下空間，以遞送受控且自動(dòng)的視網(wǎng)膜下注射(Weberetal.，2003)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(如，PCR、蛋白印記、免疫熒光)，根據(jù)疾病特異性視覺(jué)功能測(cè)試功能性且生物化學(xué)地研究轉(zhuǎn)基因表達(dá)。利用本領(lǐng)域人員已知的技術(shù)(例如視覺(jué)測(cè)試、空間定位測(cè)試、視網(wǎng)膜電圖、視覺(jué)誘發(fā)電位)，測(cè)定效率作為視力恢復(fù)的量度。預(yù)期獲得可測(cè)量程度的恢復(fù)。[0165]實(shí)施例7:通過(guò)全身注射的rAAVO載體介導(dǎo)的體內(nèi)基因表達(dá)[0166]如實(shí)施例2和圖1所述，通過(guò)尾靜脈注射向小鼠(C57BL/6)給藥rAAVO-GFP。AAVO-GFP制品由0.5ml磷酸緩沖鹽水(PBS)中的100-200μgrAAVO-GFP。在注射開(kāi)始后2周，在不同時(shí)間點(diǎn)分析組織(如，肌肉、心臟、腦、肝、腎)的GFP表達(dá)。預(yù)期，如果不是所有器官，許多器官會(huì)被轉(zhuǎn)導(dǎo)。[0167]實(shí)施例8:外來(lái)體和/或微粒介導(dǎo)的rAAVO載體的遞送[0168]本發(fā)明還提供通過(guò)以下步驟治療患有杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良的對(duì)象的方法:(I)從患有DMD的患者的肌肉活檢建立成肌細(xì)胞培養(yǎng)物；(2)用編碼感興趣DNA的rAAVO載體轉(zhuǎn)導(dǎo)所述成肌細(xì)胞培養(yǎng)物；(3)從所述培養(yǎng)物收集外來(lái)體或微粒；以及(4)將收集的外來(lái)體或微粒引入對(duì)象。[0169]用編碼感興趣DNA的rAAVO載體轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)自患有DMD的對(duì)象的肌肉活檢的成肌細(xì)胞培養(yǎng)物。實(shí)驗(yàn)確定持續(xù)時(shí)間后(其反映最優(yōu)的含rAAVO的外來(lái)體或微粒從宿主細(xì)胞脫落)，收集培養(yǎng)物上清并首先在例如2000g下20分鐘澄清。然后利用離心管(例如Amiconspincolumn;Millipore,Watford,UK)將預(yù)離心的上清在20000g下離心70分鐘(對(duì)于微粒)和1000OOg下70分鐘(對(duì)于外來(lái)體)。超速離心的最優(yōu)時(shí)間可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)確定。在用例如PBS洗滌超速離心的含微粒或外來(lái)體的沉淀時(shí)，可以直接使用懸浮的沉淀或者通過(guò)例如FACS、MACS、免疫沉淀、親和力層析或用特異性抗體或適配體包衣非磁珠利用抗體進(jìn)行額外的純化步驟，所述抗體針對(duì)已知在囊泡表面上表達(dá)的蛋白。[0170]然后將純化的含rAAVO的微?；蛲鈦?lái)體直接注射入患有DMD的對(duì)象的受影響的肌肉組織，或者可以用分離自患有DMD的對(duì)象的培養(yǎng)的干細(xì)胞溫育。在后一種情況中，可以將已經(jīng)內(nèi)化微粒或外來(lái)體的培養(yǎng)的干細(xì)胞再引入患者的受影響的組織。[0171]預(yù)期帶有rAAVO載體的微粒或外來(lái)體會(huì)被內(nèi)化,載體會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核并表達(dá)外源DNA。[0172]實(shí)施例9:產(chǎn)生rAAV0_U7質(zhì)粒和載體[0173]以和實(shí)施例1所述基本上相同的方式產(chǎn)生rAAV0_U7質(zhì)粒和載體。簡(jiǎn)言之，通過(guò)PCR從小鼠基因組DNA利用以下引物擴(kuò)增全長(zhǎng)U7snRNA基因(445bp):5'-TAACAACATAGGAGCTGTG-3'(SEQIDNO:9)和5'-CAGATACGCGTTTCCTAGGA-3'(SEQIDNO:10)。如所述(SI)，將Sm結(jié)構(gòu)域(AATTTGTCTAG;SEQIDNO:11)變?yōu)閟mOPT(AATTTTTGGAG;SEQIDNO:12)，并且將組蛋白前體-mRNA(pre-mRNA)配對(duì)區(qū)域用與以下序列互補(bǔ)的44bp代替:a)穿過(guò)肌養(yǎng)蛋白基因的外顯子23的分支點(diǎn)上游的序列(BP22:5/-AAATAGAAGTTCATTTACACTAAC-3';SEQIDNO:13)和b)緊接在外顯子23供體剪接位點(diǎn)的序列(SD23:5'-GGCCAAACCTCGGCTTACCT-3';SEQIDN0:14)。然后將所得的U7sm0PT-SD23/BP22片段引入pFBGR/Blas質(zhì)粒以產(chǎn)生rAAVO-U7-smOPT_SD23/BP22質(zhì)粒。U7snRNA構(gòu)建體的進(jìn)一步細(xì)節(jié)可以在2010年3月17日提交的共有臨時(shí)專利申請(qǐng)61/314，830中找到,該申請(qǐng)整體援引加入本文。還參見(jiàn)Goyenvalleetal.，2004。[0174]實(shí)施例10:肌養(yǎng)蛋白的外顯子跳躍的rAAV0_U7載體的體內(nèi)治療用途[0175]本發(fā)明還提供通過(guò)如實(shí)施例4所述將rAAV0_U7動(dòng)脈內(nèi)注射入股動(dòng)脈或者如實(shí)施例6所述全身遞送來(lái)治療患有杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良的對(duì)象的方法。如實(shí)施例5所述，缺少針對(duì)rAAVO骨架的免疫應(yīng)答還允許重復(fù)治療脂質(zhì)靶組織中的U7水平臨床上相關(guān)。在mdx小鼠中評(píng)價(jià)治療用途，這是一種公知的DMD的小鼠模型，已經(jīng)對(duì)其開(kāi)發(fā)了U7工具，其通過(guò)跳躍肌養(yǎng)蛋白前體mRNA而允許有效的肌養(yǎng)蛋白拯救(rescue)(Goyenvalleetal.，2004)。在處理后，在不同的時(shí)間點(diǎn)處死處理的動(dòng)物，并通過(guò)RT-PCR(即，確定跳躍水平)、蛋白印跡和組織冰凍切片上的免疫熒光(如Goyenvalleetal.，2004所述)分析和肌養(yǎng)蛋白拯救以確定蛋白合成和定位。[0176]實(shí)施例11=AAVO載體的結(jié)構(gòu)表征[0177]將如之前所述制備的rAAVO載體利用瓊脂糖凝膠(1%)電泳進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析(圖8)。瓊脂糖凝膠上的條帶(2.6kb)反映了在制備過(guò)程結(jié)束時(shí)DNA回收后rAAVO的線性單體單鏈結(jié)構(gòu)。[0178]還在SSB(單鏈結(jié)合蛋白)的存在下進(jìn)行rAVVO載體的電子顯微鏡檢查以證實(shí)rAAVO載體的單鏈結(jié)構(gòu)。將AAV樣品在IXTE(IOmMTris,ImMEDTA,pH8)中以約15ng/yI稀釋。然后將30μI稀釋的樣品用IPI的10mg/mlT4Gene32蛋白(一種SSB蛋白)在37°C下溫育15分鐘。然后將樣品在預(yù)先于IXTE緩沖液中平衡的Super0se6過(guò)濾柱上純化以除去過(guò)量的蛋白。然后將樣品沉積在碳酸銅網(wǎng)格上并用戊胺官能化。將它們用乙酸鈾酰(陽(yáng)性染色)形成反差并在暗視野投射電子顯微鏡(ZeiSS902)下觀察。如圖9所示，rAAVO表現(xiàn)出線性結(jié)構(gòu)，其為通過(guò)SSB結(jié)合所揭示的單鏈結(jié)構(gòu)。[0179]為了評(píng)價(jià)通過(guò)層析或Qiagen試劑盒純化的AAVo中的蛋白污染物，在4-12%SDS-PAGE(NuPAGETris-AcetateMiniGels,Invitrogen)上分離rAAVo樣品，并對(duì)蛋白進(jìn)行銀染(SilverStainPlus,BioRad)。[0180]測(cè)試兩種類型的rAAVo載體:編碼CMV啟動(dòng)子下的GFP的AAVo(GFP)和帶有U7snRNA的表達(dá)盒的AAVo(U7)。對(duì)于每種樣品，在凝膠上上樣不同量的DNA:[0181]1:15μI，200ng/mlAAVo(U7)-純化[0182]2:15μI，350ng/mlAAVo(GFP)-純化[0183]3:15μI,700ng/mlAAVo(U7)-Qiagen[0184]4:5μI,3300ng/mlAAVo(GFP)-Qiagen[0185]5:15μI，350ng/mlAAVo(GFP)-純化[0186]6:7.5μI,700ng/mlAAVo(U7)-Qiagen[0187]7:1.6μl,3300ng/mlAAVo(GFP)-Qiagen。[0188]凝膠示于圖10。在純化的rAAVO樣品中沒(méi)有鑒定污染蛋白。因此，本文鑒定的性質(zhì)僅僅歸因于rAAVO載體自身，而不是已經(jīng)存在于樣品中的輔助蛋白。[0189]氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺[0190]雖然在每種實(shí)施方案中描述了本公開(kāi)，但是預(yù)期本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)其進(jìn)行某些修飾和改變而不偏離之前的說(shuō)明書所示和所附權(quán)利要求書中進(jìn)一步體現(xiàn)的公開(kāi)的實(shí)質(zhì)精神和范圍。本公開(kāi)并不限于本文所述的具體實(shí)施方案的范圍。實(shí)際上，除了本文所述的那些以外，通過(guò)前述說(shuō)明書和附圖，本公開(kāi)的各種修飾對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的。這樣的修飾也意圖落在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。還應(yīng)當(dāng)理解，所有的值都是約數(shù)，并且為說(shuō)明而提供。[0191]本說(shuō)明書中所指的美國(guó)專利、美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)、美國(guó)專利申請(qǐng)、外國(guó)專利、外國(guó)專利申請(qǐng)、非專利公開(kāi)、圖、表格和網(wǎng)站明確地整體援引加入本文。[0192]各種實(shí)施方案[0193]1.不含衣殼的腺伴隨病毒載體(AAV0載體)，其包含兩個(gè)AAV反向末端重復(fù)(ITR)和表達(dá)盒，每個(gè)所述ITR具有形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的中斷的回文序列，所述盒包含至少一個(gè)可操作地連接至外源DNA的啟動(dòng)子，其中:[0194]所述表達(dá)盒每一端的側(cè)翼均有一個(gè)反向末端重復(fù)，[0195]所述載體不編碼AAV衣殼蛋白，并且所述載體沒(méi)有衣殼化。[0196]2.實(shí)施方案I的AAVO載體，其中所述外源DNA包含約4200-約15000個(gè)核苷酸。[0197]3.實(shí)施方案I的AAVO載體，其中所述外源DNA的長(zhǎng)度超過(guò)衣殼化的AAV載體的包裝能力。[0198]4.實(shí)施方案I的AAVO載體，其中所述外源DNA序列編碼蛋白。[0199]5.實(shí)施方案I的AAVO載體，其中所述外源DNA序列編碼正義或反義寡核苷酸。[0200]6.一種制備不含衣殼的腺伴隨病毒(AAVO)載體的方法，所述方法包括:[0201](a)提供包含兩個(gè)AAVITR、位于所述ITR之間的表達(dá)盒的細(xì)胞，所述表達(dá)盒包含至少一個(gè)可操作地連接至外源DNA的啟動(dòng)子；其中[0202]所述表達(dá)盒的每一端的側(cè)翼均有一個(gè)反向末端重復(fù)且不編碼AAV衣殼蛋白，并且所述細(xì)胞不表達(dá)AAV衣殼蛋白；[0203](b)如果所述細(xì)胞中不存在AAVRep基因或蛋白，則任選地向所述細(xì)胞提供AAVRep基因或蛋白，但不提供AAVCap基因或蛋白；[0204](c)使所述細(xì)胞在允許包含ITR和表達(dá)盒的DNA復(fù)制和釋放并構(gòu)成AAVO載體的條件下生長(zhǎng)；[0205](d)從所述細(xì)胞收集拯救的AAVO載體。[0206]7.實(shí)施方案6的方法，其中步驟(a)的細(xì)胞還包含選擇標(biāo)記。[0207]8.實(shí)施方案6的方法，其中所述細(xì)胞系為Sf9。[0208]9.實(shí)施方案7的方法，其中所述選擇標(biāo)記為殺稻瘟素S-抗性基因。[0209]10.實(shí)施方案6的方法，其中拯救的AAVO載體以裸DNA或者摻入在外來(lái)體或微粒中收集。[0210]11.實(shí)施方案10的方法，其中所述載體以純化的裸DNA收集。[0211]12.實(shí)施方案10的方法，其中以微粒或外來(lái)體的形式收集并純化所述載體。[0212]13.一種介導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中外源DNA的表達(dá)的方法，所述方法包括以下步驟:[0213](a)向所述細(xì)胞遞送有效量的不含衣殼的腺伴隨病毒(AAVO)載體，所述載體包含兩個(gè)AAV反向末端重復(fù)(ITR)和表達(dá)盒，每個(gè)所述ITR均具有形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的中斷的回文序列，所述盒包含至少一個(gè)可操作地連接至外源DNA的啟動(dòng)子，其中(i)所述表達(dá)盒的每一端的側(cè)翼均有一個(gè)反向末端重復(fù)，(ii)所述載體不編碼AAV衣殼蛋白，并且(iii)所述載體沒(méi)有衣殼化；并且(iv)所述載體沒(méi)有免疫原性。[0214](b)使所述細(xì)胞在允許細(xì)胞表達(dá)外源DNA的條件下生長(zhǎng)；[0215]其中所述有效量足以允許細(xì)胞表達(dá)期望水平的外源DNA。[0216]14.實(shí)施方案13的方法，其中所述外源DNA的長(zhǎng)度超過(guò)包含衣殼的常規(guī)AAV載體的包裝能力。[0217]15.實(shí)施方案13的方法，其中所述遞送包括簡(jiǎn)單地引入胞外培養(yǎng)基中的AAVO載體，并且不包括使用任何其他轉(zhuǎn)導(dǎo)手段。[0218]16.實(shí)施方案14的方法，其中所述外源DNA的長(zhǎng)度為約4.2_約15kb。[0219]17.實(shí)施方案14的方法，其中所述外源DNA長(zhǎng)達(dá)約5kb。[0220]18.實(shí)施方案14的方法，其中所述外源DNA長(zhǎng)達(dá)約5kb。[0221]19.實(shí)施方案14的方法，其中所述外源DNA長(zhǎng)達(dá)約8kb。[0222]20.實(shí)施方案14的方法，其中所述外源DNA長(zhǎng)達(dá)約10kb。[0223]21.一種介導(dǎo)哺乳動(dòng)物的器官或組織中的外源DNA表達(dá)的方法，所述方法包括以下步驟:[0224](a)向所述哺乳動(dòng)物遞送有效量的不含衣殼的腺伴隨病毒(AAVO)載體，所述載體包含兩個(gè)AAV反向末端重復(fù)(ITR)和表達(dá)盒，每個(gè)所述ITR均具有形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的中斷的回文序列，所述盒包含至少一個(gè)可操作地連接至外源DNA的啟動(dòng)子，其中(i)所述表達(dá)盒的每一端的側(cè)翼均有一個(gè)反向末端重復(fù)，(ii)所述載體不編碼AAV衣殼蛋白，并且(iii)所述載體沒(méi)有衣殼化；(b)等待所述器官或組織內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行外源DNA的表達(dá)；[0225]其中所述有效量足以允許細(xì)胞表達(dá)期望水平的外源DNA。[0226]22.實(shí)施方案21的方法，其中所述遞送步驟包括全身遞送至所述哺乳動(dòng)物。[0227]23.實(shí)施方案21的方法，其中所述外源DNA的長(zhǎng)度超過(guò)包含衣殼的常規(guī)AAV載體的包裝能力。[0228]24.實(shí)施方案23的方法，其中所述外源DNA的長(zhǎng)度為約4.2kb_約15kb。[0229]25.實(shí)施方案22的方法，其中所述全身遞送包括動(dòng)脈內(nèi)或肌肉內(nèi)注射。[0230]26.實(shí)施方案21的方法，其中所述遞送步驟包括視網(wǎng)膜下注射。[0231]27.實(shí)施方案25的方法，其中所述AAVO載體包含指導(dǎo)所述外源DNA優(yōu)先或完全在特異性器官或組織中表達(dá)的啟動(dòng)子。[0232]28.實(shí)施方案13或21的方法，其中所述外源DNA編碼U7snRNA。[0233]29.實(shí)施方案13或21的方法，其中所述外源DNA編碼RNAi或siRNA。[0234]30.實(shí)施方案13的方法，其中所述遞送包括使用轉(zhuǎn)染試劑或物理手段以促進(jìn)進(jìn)入細(xì)胞。[0235]31.實(shí)施方案13的方法，其中所述遞送在不存在促進(jìn)所述rAAVO載體進(jìn)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)染試劑或額外的物理手段的情況下進(jìn)行。[0236]32.一種治療有需要的對(duì)象的疾病的方法，所述疾病涉及由于減少或終止的多肽表達(dá)或者表達(dá)所述多肽的無(wú)功能或功能較差的類似物而表現(xiàn)出癥狀的遺傳缺陷，所述方法包括向所述對(duì)象遞送有效量的實(shí)施方案I的載體，其中所述外源DNA包含跳躍、糾正、沉默或掩蓋該缺陷的寡核苷酸或多核苷酸，導(dǎo)致與疾病或病癥相關(guān)的癥狀的改善。[0237]33.實(shí)施方案32的方法，其包括向所述對(duì)象遞送有效量的實(shí)施方案I的載體，其中所述外源DNA編碼RNAi或siRNA或者反義寡核苷酸或多核苷酸。[0238]34.實(shí)施方案32的方法，其包括向所述對(duì)象遞送有效量的實(shí)施方案I的載體，其中所述外源DNA編碼寡核苷酸或多核苷酸，其表達(dá)會(huì)通過(guò)修復(fù)所述多肽的至少部分功能而導(dǎo)致與所述疾病相關(guān)的癥狀的改善。[0239]35.一種在細(xì)胞中引起期望的基因產(chǎn)物或寡核苷酸的表達(dá)的方法，所述方法包括在轉(zhuǎn)染試劑或額外的物理手段不存在的情況下使至少一種rAAVO載體與細(xì)胞表面接觸以促進(jìn)所述rAAVO載體進(jìn)入細(xì)胞。[0240]36.用一種或多種rAAVO載體向相同宿主重復(fù)給藥期望的編碼或不編碼具體蛋白的DNA或RNA序列而不引發(fā)針對(duì)所述rAAVO載體的宿主的免疫應(yīng)答的方法。[0241]37.實(shí)施方案I的AAVO載體，其中單鏈線性DNA序列具有通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞以及從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜的能力，不受病毒衣殼蛋白的干擾。[0242]參考文獻(xiàn)[0243]AthanasopoulosT，GrahamIR，F(xiàn)osterH，DicksonG.Recombinantadeno-associatedviral(rAAV)vectorsastherapeutictoolsforDuchennemusculardystrophy(DMD).GeneTher.20040ct;IISuppl1:S109-21.[0244]BarresiR，MicheleDEjKanagawaMjHarperHAjDovicoSAjSatzJSjMooreSA，ZhangWjSchachterH，DumanskiJP，CohnRD，NishinoI，CampbellKP.LARGEcanfunctionallybypassalpha-dystroglycanglycosylationdefectsindistinctcongenitalmusculardystrophies.NatMed.2004Jul;10(7):696-703.[0245]BellP，GaoG，HaskinsME,WangLjSleeperMM，WangH，CalcedoRjVandenbergheLjWeisseCjWithnallE，WilsonJM，ChenSJ.EvaluationofAAVVectorsforLiver-directedGeneTransferinDogs.HumGeneTher.2011Jan4.[Epubaheadofprint][0246]BenchaouirR，MeregalliM，F(xiàn)ariniA，D’AntonaG，BelicchiMjGoyenvalleA，BattistelliM，BresolinN，BottinelliR，GarciaL，TorrenteY.Restorationofhumandystrophinfollowingtransplantationofexon-skipping-engineeredDMDpatientstemcellsintodystrophicmice.CellStemCell.2007Decl3;I(6):646-57.[0247]BernsjK.1.，andC.R.Parrish.Parvoviridaejp.2437-2477.1nD.M.KnipeandP.M.Howley(ed.),FieldsVirology,Fifthed.LippincottWilliamsandWilkins,NewYork;2007.[0248]BigotA，JacqueminVjDebacq-ChainiauxFjButler-BrowneGSjToussaint0，F(xiàn)urlingDjMoulyV.Replicativeagingdown-regulatesthemyogenicregulatoryfactorsinhumanmyoblasts.BiolCell.2008Mar;100(3):189-99.[0249]BoutinS，MonteilhetVjVeronPjLeborgneC，Benveniste0，MontusMFjMasurierC.PrevalenceofserumIgGandneutralizingfactorsagainstadeno-associatedvirus(AAV)types1，2，5，6，8，and9inthehealthypopulation:1mplicationsforgenetherapyusingAAVvectors.HumGeneTher.2010Jun;21(6):704-12.[0250]BoyeSE,BoyeSLjPangJjRyalsRjEverhartD，UminoYjNeeleyAWjBesharseJjBarlowR，HauswirthWW.Functionalandbehavioralrestorationofvisionbygenetherapyintheguanylatecyclase-1(GCl)knockoutmouse.PLoSOne.2010Jun25;5(6):ell306.[0251]CocucciE，RacchettiG，etal.Sheddingmicrovesicles:artefactsnomore.TrendsCellBiol.2009Feb;19(2):43-51.[0252]ConnellyJPjBarkerJCjPruett-MillerSjPorteusMH.Genecorrectionbyhomologousrecombinationwithzincfingernucleasesinprimarycellsfromamousemodelofagenericrecessivegeneticdisease.MolTher.2010Jun;18(6):1103-10.[0253]CoxRDjBuckinghamME.Actinandmyosingenesaretranscriptionallyregulatedduringmouseskeletalmuscledevelopment.DevBiol.1992Jan;149(I):228-34.[0254]CunninghamSC，SpinoulasA，CarpenterKHjWilckenB，KuchelPWjAlexanderIE.AAV2/8-mediatedcorrectionofOTCdeficiencyisrobustinadultbutnotneonatalSpf(ash)mice.MolTher.2009Aug;17(8):1340-6.[0255]DingW，ZhangL，YanZ，EngelhardtJF.1ntracellulartraffickingofadeno—associatedviralvectors.GeneTherapy2005,12:873-880.[0256]DominguezE，MaraisT，ChatauretNjBenkhelifa-ZiyyatS，DuqueSjRavassardP，CarcenacR，AstordS，deMouraAPjVoitT，BarkatsM.1ntravenousscAAV9deliveryofacodon-optimizedSMNlsequencerescuesSMAmice.HumMolGenet.2011Febl5;20(4):681-93.[0257]DoeneckeA，KromcrA,SchererMN，SchlittHJjGeisslerEK.AAVplasmidDNAsimplifiesliver-directedinvivogenetherapy:comparisonofexpressionlevelsafterplasmidDNA-，adeno—associatedvirus-andadenovirus-mediatedlivertransfection.JGeneMed.20IOOct;12(10):810-7.[0258]DongJY，F(xiàn)anPD,FrizzelIRA.Quantitativeanalysisofthepackagingcapacityofrecombinantadeno—associatedvirus.HumGeneTher.1996;7(17):2102-12.[0259]DuqueS，JoussemetBjRiviereC，MaraisT，DubreilL，DouarAM,FyfeJ，MoullierP，ColleMA，BarkatsM.1ntravenousadministrationofself-complementaryAAV9enablestransgenedeliverytoadultmotorneurons.MolTher.2009Jul;17(7):1187-96.[0260]EggenhoferE，DoeneckeA,RennerPjSlowikPjPisoP，GeisslerEK，SchlittHJjDahlkeMHjPoppFC.[0261]HighvolumenakedDNAtail-veininjectionrestoresliverfunctioninFah-knockoutmice.JGastroenterolHepatol.2010May;25(5):1002-8.[0262]FougerousseF，BartoliMjPoupiotJ，ArandelL，DurandM，GuerchetNjGicquelE，Danos0，Richard1.Phenotypiccorrectionofalpha-sarcoglycandeficiencybyintra—arterialinjectionofamuscle-specificserotypeIrAAVvector.MolTher.2007Jan;15(I):53-61.[0263]FoustKDjNurreE，MontgomeryCL，HernandezA，ChanCM，KasparBK.1ntravascularAAVOpreferentiallytargetsneonatalneuronsandadultastrocytes.NatBiotechnol.2009Jan;27(I):59-65.[0264]FrauliM，RibaultSjNeuvillePjAugeF，CalendaV.Adenoviral-mediatedskeletalmuscletranscriptionaltargetingusingchimerictissue-specificpromoters.MedSciMonit.2003Feb;9(2):BR78_84.[0265]GoninP，GaillardC.Genetransfervectorbiodistribution:pivotalsafetystudiesinclinicalgenetherapydevelopment.GeneTherapy.2004;11:S98-108.[0266]GoyenvalleA,VulinA,FougerousseF，LeturcqF，KaplanJC，GarciaL，Danos0.RescueofdystrophicmusclethroughU7snRNA_mediatedexonskipping.Science.2004Dec3;306(5702):1796-9.[0267]GrimmD，etal.NovelToolsforProductionandPurificationofRecombinantAdenoassociatedVirusVectors.HumanGeneTherapy.1998;9:2745-2760.[0268]GruberCjGratzIK，MurauerEMjMayrE，KollerUjBruckner-TudermanLjMeneguzziG，HintnerH，BauerJW.Spliceosome-mediatedRNAtrans-splicingfacilitatestargeteddeliveryofsuicidegenestocancercells.MolCancerTher.2011Feb;10(2):233-41.[0269]HackerandWurn.ENCYCLOPEDIAOFLIFESCIENCES,2007[0270]HaireSE，PangJjBoyeSLjSokalI,CraftCM,PalczewskiKjHauswirthWWjSemple-RowlandSL.Light-drivenconearrestintranslocationinconesofpostnatalguanylatecyclase-lknockoutmouseretinatreatedwithAAV-GC1.1nvestOphthalmolVisSc1.2006Sep;47(9):3745-53.[0271]HimedaCL，ChenX，HauschkaSD.Designandtestingofregulatorycassettesforoptimalactivityinskeletalandcardiacmuscles.MethodsMolBiol.2011;709:3-19.[0272]HongG，WardP，BernsK1.1nvitroreplicationofadeno-associatedvirusDNA.PNAS.1992Mayl5;89(10):4673-7.[0273]HongGjWardP，BernsK1.1ntermediatesofadeno-associatedvirusDNAreplicationinvitr0.JVirol.1994Mar;68(3):2011-5.[0274]111CR，YangCQjBidlingmaierSM,GonzalesJNjBurnsDSjBartholomewRMjScuderiP.0ptimizationofthehumanfactorVIIIcomplementaryDNAexpressionplasmidforgenetherapyofhemophiliaA.BloodCoagulFibrinolysis.1997Dec;8Suppl2:S23-30.[0275]JimenezVjAyusoE，MallolC，AgudoJ，CasellasA，ObachM，MunozSjSalavertA，BoschF.1nvivogeneticengineeringofmurinepancreaticbetacellsmediatedbysingle-strandedadeno-associatedviralvectorsofserotypes6,8and9.Diabetologia.2011Febll.Epubaheadofprint.[0276]KapadiaFNandJhaAN.Simultaneouslumbarandintraventricularmanometrytoevaluatetheroleandsafetyoflumbarpunctureinraisedintracranialpressurefollowingsubarchnoidhaemorrhage.BrJNeurosurg.1996Dec;I(6):585-7.[0277]KhaniSC,PawlykBS，BulgakovOVjKasperekE，YoungJEjAdamianM，SunX，SmithAJjAliRRjLiT.AAV-mediatedexpressiontargetingofrodandconephotoreceptorswithahumanrhodopsinkinasepromoter.1nvestOphthalmolVisSc1.2007Sep;48(9):3954-61[0278]KoppanatiBMjLiJjReayDPjWangB，DaoodM，ZhengH，XiaoXjWatchkoJFjClemensPR.1mprovementofthemdxmousedystrophicphenotypebysystemicinuteroAAV8deliveryofaminidystrophingene.GeneTher.2010Junl0.[0279]LaiY，YueY，DuanD.Evidenceforthefailureofadeno-associatedvirusserotype5topackageaviralgenome>or=8.2kb.MolTher.2010Jan;18(1):75-9.[0280]LeveiIlardT，SahelJA.Rod-derivedconeviabilityfactorfortreatingblindingdiseases:fromclinictoredoxsignaling.SciTranslMed.2010Apr7;2(26):26psl6.[0281]LheriteauE，LibeauL，StiegerK，DeschampsJYjMendes-MadeiraA,ProvostN，LemoineF，MellershCjEllinwoodNM，CherelY，MoullierP，RollingF.TheRPGRIPl—deficientdog,apromisingcaninemodelforgenetherapy.MolVis.2009;15:349-61.[0282]LheriteauE，LibeauLjMendes-MadeiraA，DeschampsJYjWeberM，LeMeurGjProvostN，GuihalC，MoullierP，RollingF.RegulationofretinalfunctionbutnonrescueofvisioninRPE65_deficientdogstreatedwithdoxycycline-regulatableAAVvectors.MolTher.2010Jun;18(6):1085-93.[0283]LiMjJayandharanGRjLiB，LingC，MaWjSrivastavaA,ZhongLHigh-EfficiencyTransductionofFibroblastsandMesenchymalStemCellsbyTyrosine-MutantAAV2VectorsforTheirPotentialUseinCellularTherapy.HumGeneTher.2010May27.[0284]LiZ，MarchandP，HumbertJ，BabinetC，PaulinD.Desminsequenceelementsregulatingskeletalmuscle-specificexpressionintransgenicmice.Development.1993Mar;117(3):947-59.[0285]LorainSjGrossDAjGoyenvalleA,Danos0,DavoustJ，GarciaL.TransientimmunomoduIationallowsrepeatedinjectionsofAAVlandcorrectionofmusculardystrophyinmultiplemuscles.MolTher.2008Mar;16(3):541-7.[0286]LostaljW.etal,HumanMol.Gen.，2010，19(10):1897—1907.[0287]LoweryRLjMajewskaAK.1ntracranialinjectionofadeno-associatedviralvectors.JVisExp.2010Novl7;(45):pii2140.[0288]McCartyDM.Self-complementaryAAVvectors;advancesandapplications.MolTher.20080ct;16(10):1648-56.Epub2008Aug5.[0289]Millington-WardSjChaddertonN，O’ReillyM，PalfiA，GoldmannTjKiltyC，HumphriesMjWolfrumU，BennettJ，HumphriesP，KennaPFjFarrarG.SuppressionandReplacementGeneTherapyforAutosomalDominantDiseaseinaMurineModelofDominantRetinitisPigmentosa.MolTher.2011Janll[0290]MiyazakiJ，TakakiS，ArakiK，TashiroF，TominagaA，TakatsuK，YamamuraK.Expressionvectorsystembasedonthechickenbeta-actinpromoterdirectsefficientproductionofinterleukin-5.Gene.1989;79:269-77.[0291]NashK，ChenWjMcDonaldWFjZhouXjMuzyczkaN.Completeinvitroreconstitutionofadeno-associatedvirusDNAreplicationrequiresthe【權(quán)利要求】1.一種分離的線性核酸分子，其以這樣的順序包含:第一腺伴隨病毒(AAV)反向末端重復(fù)(ITR)、感興趣的核苷酸序列和第二AAVITR，其中所述核酸分子沒(méi)有AAV衣殼蛋白編碼序列。2.權(quán)利要求1的分離的線性核酸分子，其中所述感興趣的核苷酸序列為外源DNA的表達(dá)盒。3.權(quán)利要求1或2的分離的線性核酸分子，其中所述核酸分子是單鏈的。4.權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的分離的線性核酸分子，其沒(méi)有AAVrep蛋白編碼序列。5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的分離的線性核酸分子，其中所述感興趣的核苷酸序列包含約4200-約15000個(gè)核苷酸。6.權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)的分離的線性核酸分子，其中所述外源DNA序列編碼蛋白或者正義寡核苷酸或反義寡核苷酸。7.權(quán)利要求2-6中任一項(xiàng)的分離的線性核酸分子，其包含指導(dǎo)所述外源DNA優(yōu)先或完全地以組織或器官特異性方式表達(dá)的啟動(dòng)子。8.權(quán)利要求2-7中任一項(xiàng)的分離的線性核酸分子，其中所述外源DNA編碼U7snRNA、RNAi或siRNA。9.一種制備權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的分離的線性核酸分子的方法，所述方法包括:(a)提供包含核酸序列的細(xì)胞，所述核酸序列包含兩個(gè)AAVITR和位于所述ITR之間的感興趣的核苷酸序列；其中所述核酸序列沒(méi)有AAV衣殼蛋白編碼基因，并且所述細(xì)胞不表達(dá)AAV衣殼蛋白；(b)如果所述細(xì)胞中不存在AAVRep基因或蛋白，則任選地向所述細(xì)胞提供AAVRep基因或蛋白，但不提供AAVCap基因或蛋白；(c)使所述細(xì)胞在允許包含ITR和表達(dá)盒的DNA復(fù)制和釋放并構(gòu)成AAVO載體的條件下生長(zhǎng);(d)從所述細(xì)胞收集拯救的AAVO載體。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述細(xì)胞系為Sf9。11.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的分離的線性核酸分子，其可以通過(guò)權(quán)利要求9或10的方法獲得，或者通過(guò)權(quán)利要求9或10的方法獲得。12.—種介導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中外源DNA的表達(dá)的體外方法，所述方法包括以下步驟:(a)向所述細(xì)胞遞送有效量的權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)或權(quán)利要求11的分離的線性核酸分子;(b)使所述細(xì)胞在允許細(xì)胞表達(dá)所述外源DNA的條件下生長(zhǎng)；其中所述有效量足以允許細(xì)胞表達(dá)期望水平的所述外源DNA。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述遞送包括簡(jiǎn)單地引入胞外培養(yǎng)基中的分離的線性核酸分子，并且不包括使用任何其他轉(zhuǎn)導(dǎo)手段。14.一種在細(xì)胞中引起期望的基因產(chǎn)物或寡核苷酸表達(dá)的體外方法，所述方法包括在不存在轉(zhuǎn)染試劑或額外的物理手段的情況下使至少一種權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)或權(quán)利要求10的分離的線性核酸分子與細(xì)胞表面接觸以促進(jìn)所述rAAVO載體進(jìn)入所述細(xì)胞。15.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)或權(quán)利要求11的分離的線性核酸分子，其用于將介導(dǎo)外源DNA表達(dá)的感興趣的核苷酸序列遞送入對(duì)象的細(xì)胞、器官或組織的方法。16.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)或權(quán)利要求11的分子，其用于介導(dǎo)對(duì)象，特別是哺乳動(dòng)物的細(xì)胞、器官或組織中的外源DNA表達(dá)的方法。17.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)或權(quán)利要求11的分離的線性核酸分子，其用于治療有需要的對(duì)象中的疾病的方法，所述疾病涉及由于減少或終止的多肽表達(dá)或者表達(dá)所述多肽的無(wú)功能或功能較差的類似物而表現(xiàn)出癥狀的遺傳缺陷，其中所述外源DNA包含跳躍、糾正、沉默或掩蓋該缺陷的寡核苷酸或多核苷酸，導(dǎo)致與疾病或病癥相關(guān)的癥狀的改善。18.權(quán)利要求17的分離的線性核酸分子，其中所述外源DNA編碼RNAi或siRNA或者反義寡核苷酸或多核苷酸。19.權(quán)利要求17的分離的線性核酸分子，其中所述外源DNA編碼寡核苷酸或多核苷酸，所述寡核苷酸或多核苷酸的表達(dá)會(huì)通過(guò)恢復(fù)所述多肽的至少部分功能而導(dǎo)致與所述疾病相關(guān)的癥狀的改善。20.權(quán)利要求15-17中任一項(xiàng)的分離的線性核酸分子，其中所述遞送步驟包括全身遞送至所述哺乳動(dòng)物，特別是通過(guò)動(dòng)脈內(nèi)或肌肉內(nèi)注射遞送至所述哺乳動(dòng)物。21.權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)的方法，或者權(quán)利要求15-19中任一項(xiàng)的分離的線性核酸分子，其中所述遞送包括使用轉(zhuǎn)染試劑或物理手段以促進(jìn)進(jìn)入細(xì)胞。22.權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)的方法，或者權(quán)利要求15-19中任一項(xiàng)的分離的線性核酸分子，其中所述遞送在不存在促進(jìn)所述rAAVO載體進(jìn)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)染試劑或物理手段的情況下進(jìn)行。【文檔編號(hào)】C12N15/864GK103764831SQ201280022523【公開(kāi)日】2014年4月30日申請(qǐng)日期:2012年3月12日優(yōu)先權(quán)日:2011年3月11日【發(fā)明者】L·加西亞,C·貝萊,T·福伊特,R·M·科廷申請(qǐng)人:肌肉學(xué)研究協(xié)會(huì),皮埃爾-瑪麗-居里大學(xué)(巴黎第六大學(xué)),國(guó)立科學(xué)研究中心,國(guó)家健康與醫(yī)學(xué)研究院,美國(guó)衛(wèi)生與人類服務(wù)署國(guó)立衛(wèi)生研究院