植物調(diào)控元件及其用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了可用于調(diào)節(jié)植物和植物細(xì)胞中的基因表達(dá)的新的DNA分子和構(gòu)建體，包括它們的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了包含可操作地與異源可轉(zhuǎn)錄多核苷酸連接的DNA分子的轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞、植物部分、種子和商品，以及它們的使用方法。
【專利說(shuō)明】植物調(diào)控元件及其用途
[0001]相關(guān)申請(qǐng)參考
[0002]本申請(qǐng)要求2011年3月25日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)N0.61/467，875的權(quán)益，通過(guò)引用將其全部并入本文中作為參考。
[0003]序列表的引入
[0004]通過(guò)電子提交在此一起提交了序列表，其包含在2012年3月21日生成的347kb (如在 Microsoft Windows? 中測(cè)量的)的文件名為 “M0NS282W0_seq.txt” 的文件中，并通過(guò)引用將其并入本文中。
發(fā)明領(lǐng)域
[0005]本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)和植物遺傳工程的領(lǐng)域，并且涉及可用于調(diào)節(jié)植物中的基因表達(dá)的DNA分子。
【背景技術(shù)】
[0006]調(diào)控元件是通過(guò)調(diào)節(jié)可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)控基因活性的遺傳元件。這樣的元件包括啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和3’非翻譯區(qū)域，并且可用于植物分子生物學(xué)和植物遺傳工程領(lǐng)域中。
[0007]發(fā)明概述
[0008]本發(fā)明提供了用于植物中的新基因調(diào)控元件。本發(fā)明還提供了包含所述調(diào)控元件的DNA構(gòu)建體。本發(fā)明還提供了包含所述調(diào)控元件的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物和種子?？梢蕴峁┛刹僮鞯嘏c可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子連接的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子相對(duì)于本文中提供的調(diào)控序列可以是異源的。因此，在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的調(diào)控元件序列可以限定為可操作地與異源可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子連接。本發(fā)明還提供了制備和使用該調(diào)控元件、包含該調(diào)控元件的DNA構(gòu)建體以及包含可操作地與可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子連接的調(diào)控元件的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物和種子的方法。
[0009]因此，在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種包含DNA序列的DNA分子，所述DNA序列選自:a)與SEQ ID NO:1-158和180-183中任一個(gè)具有至少約85%序列同一性的序列；b)包含 SEQ ID NO:1-158 和 180-183 中任一個(gè)的序列；和 c) SEQ ID NO:1-158 和 180-183 中任一個(gè)的片段，其中該片段具有基因調(diào)控活性；其中該序列可操作地與異源可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子連接。在特定的實(shí)施方案中，DNA分子包括與SEQ ID NO:1-158和180-183中任一個(gè)的DNA序列至少約90%、至少約95%、至少約98%或至少約99%的同一性。在DNA分子的某些實(shí)施方案中，所述DNA序列包括調(diào)控元件。在一些實(shí)施方案中,所述調(diào)控元件包含啟動(dòng)子。在特定的實(shí)施方案中，所述異源可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子包含具有農(nóng)藝學(xué)意義的基因，如能夠在植物中提供除草劑抗性的基因， 或能夠在植物中提供植物抗蟲性的基因。
[0010]本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明提供的異源DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，所述DNA構(gòu)建體包括SEQ ID NO:1-158和180-183中任一個(gè)的序列或其片段或變體，其中所述序列可操作地與異源可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子連接。在某些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞是單子葉植物細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞是雙子葉植物細(xì)胞。
[0011]本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含本文中提供的DNA分子的轉(zhuǎn)基因植物或其部分，所述DNA分子包括選自以下的DNA序列:a)與SEQ ID NO: 1-158和180-183中任一個(gè)具有至少85%序列同一性的序列；b)包含SEQ ID NO:1-158和180-183中任一個(gè)的序列；和c) SEQID NO:1-158和180-183中任一個(gè)的片段，其中該片段具有基因調(diào)控活性；其中所述序列可操作地與異源可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子連接。在特定的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物可以是，相對(duì)于包含所述DNA分子的起始轉(zhuǎn)基因植物，包含所述DNA分子的任一代的后代植物。再進(jìn)一步提供了包含根據(jù)本發(fā)明的DNA分子的轉(zhuǎn)基因種子。
[0012]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)商品的方法，其包括獲得根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物或其部分并從其生產(chǎn)商品。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的商品是蛋白質(zhì)濃縮物、蛋白質(zhì)分離物、籽粒、淀粉、種子、粗粉(meal)、面粉(flour)、生物質(zhì)或種子油。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了使用上述方法生產(chǎn)的商品。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含本文中提供的DNA分子的商品，所述DNA分子包括選自以下的DNA序列:a)與SEQ ID NO:1-158和180-183中任一個(gè)具有至少85%序列同一性的序列；b)包含SEQ ID NO:1-158和180-183中任一個(gè)的序列；和c) SEQ ID NO: 1-158和180-183中任一個(gè)的片段，其中該片段具有基因調(diào)控活性；其中所述序列可操作地與異源可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子連接。
[0013]還是在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種表達(dá)可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的方法，其包括獲得根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物，如包含本文中所述的DNA分子的植物，并且栽培植物，其中DNA分子中的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸被表達(dá)。
[0014]在整個(gè)說(shuō)明書和權(quán)利要求中，除非上下文另外要求，詞語(yǔ)“包含(comprise)”及其變變型，如“包括(comprises) ”和“包含著(comprising) ”,將理解為意味著包括所陳述的組合物、步驟和/或值，或其組，但并不排除任何其他組合物、步驟和/或值，或其組。
[0015]附圖簡(jiǎn)述
[0016]圖1a-1h描繪了對(duì)應(yīng)于分離自草類物種須芒草(Andropogon gerardii)的啟動(dòng)子元件的啟動(dòng)子大小變異體的比對(duì)。特別地，圖1a-1h顯示了在轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)元件組EXP-ANDge.Ubpl:1:9(SEQ ID NO:1)中發(fā)現(xiàn)的 2603bp 啟動(dòng)子序列 P-ANDge.Ubpl-1:1:
11(SEQ ID NO:2)與通過(guò)P-ANDge.Ubpl-1:1:11的刪除分析得到的啟動(dòng)子序列的比對(duì)。例如，P-ANDge.Ubpl-1:1:11 的 5，端刪除產(chǎn)生了啟動(dòng)子 P-ANDge.Ubpl-1:1:9(SEQ ID NO:6)，其是在EXP-ANDge.Ubpl:1:7 (SEQ ID NO:5)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的2114bp序列。圖1中的其他啟動(dòng)子序列包括 P-ANDge.Ubpl-1:1: 10 (SEQ ID NO:9)，包含在 EXP-ANDge.Ubpl:1:8 (SEQID NO:8)內(nèi)的 1644bp 序列;P_ANDge.Ubpl-1:1: 12 (SEQ ID NO:11)，包含在 EXP-ANDge.Ubpl: I:10 (SEQ ID NO:10)內(nèi)的 1472bp 序列；P-ANDge.Ubpl-1:1:8 (SEQ ID N0:13)，包含在 EXP-ANDge.Ubpl:1:6(SEQ ID NO:12)內(nèi)的 1114bp 序列；P-ANDge.Ubpl-1:1: 13 (SEQID NO:15)，包含在 EXP-ANDge.Ubpl:1: 11 (SEQ ID NO:14)內(nèi)的 771bp 序列；和 P-ANDge.Ubpl-1:1:14(SEQ ID NO: 17)，包含在 EXP-ANDge.Ubpl:1: 12 (SEQ ID NO:16)內(nèi)的 482bp序列。
[0017]圖2a_2g 描繪了分離自草類沙生鹿茅(Saccharum ravennae (Erianthusravennae))的啟動(dòng)子變體的比對(duì)。特別地，圖2a_2g顯示了 2536bp啟動(dòng)子序列P-ERIra.Ubql-1:1: 10 (SEQ ID NO:19)(例如，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)元件組 EXP-ERIra.Ubql (SEQ ID NO:18)中發(fā)現(xiàn)的)與源自P-ERIra.Ubql-1:1:10的刪除分析的啟動(dòng)子序列的比對(duì):2014bp啟動(dòng)子序列 P-ERIra.Ubql-1:1:9(SEQ ID NO:23) ；1525bp 啟動(dòng)子序列 P-ERIra.Ubql-1:1:
11(SEQ ID NO:26) ; 1044bp 啟動(dòng)子序列 P-ERIra.Ubql-1:1:8 (SEQ ID NO:28) ;769bp 序列P-ERIra.Ubql-1:1: 12 (SEQ ID NO:30)和 51 Ibp 序列 P-ERIra.Ubql-1:1: 13 (SEQ ID NO:32)。
[0018] 圖3a_3c描繪了對(duì)應(yīng)于分離自草類物種狗尾草(Setaria viridis)的啟動(dòng)子元件的啟動(dòng)子大小變體的比對(duì)。特別地，圖3a_3c顯示了 1493bp啟動(dòng)子序列P_Sv.Ubql-1:1:I (SEQ ID NO:34)與源自P_Sv.Ubql-1:1:1的5’端的刪除分析的啟動(dòng)子的比對(duì):1035bp大小的啟動(dòng)子P-Sv.Ubql-1:1:2(SEQ ID NO:38)和 681bp 啟動(dòng)子序列 P_Sv.Ubql-1:1:3 (SEQID NO:40)。
[0019]圖4a_4e描繪了源自草類墨西哥玉米(Zea mays subsp.mexicana)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)元件組變體的比對(duì)。特別地，圖4a-4e比較了稱為EXP-Zm.UbqMl:1:2 (SEQ ID NO:49)的2005bp轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)元件組與等位基因變體EXP-Zm.UbqMl:1:5(SEQ ID NO:53)，以及與大小變體 EXP-Zm.UbqMl:1:1 (SEQ ID NO:41)(其是 1922bp 長(zhǎng))和 EXP-Zm.UbqMl:1:4 (SEQID NO:45)(其是 1971bp 長(zhǎng))。
[0020]圖5a_5b描繪了分離自草類高粱(Sorghum bicolor)的啟動(dòng)子大小變體的比對(duì)。特別地，圖5a_5b顯示了包含在轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)元件組EXP-Sb.Ubq6 (SEQ ID NO:59)內(nèi)的791bp 大小的啟動(dòng)子元件 P-Sb.Ubq6-l:1:2 (SEQ ID NO:60)與包含在 EXP-Sb.UbqM6:1:I (SEQ ID NO:63)內(nèi)的 855bp 啟動(dòng)子元件 P_Sb.Ubq6_l:1:1 (SEQ ID NO:64)的比對(duì)。
[0021]圖6a_6c描繪了對(duì)應(yīng)于分離自草類小米(Setaria italica)的啟動(dòng)子元件的啟動(dòng)子大小變體的比對(duì)。特別地，圖6a_6c顯示了 1492bp啟動(dòng)子變體P-SETit.Ubql-1:1:1(SEQID NO:70)與 1492bp 啟動(dòng)子變體 P-SETit.Ubql-1:1:4 (SEQ ID NO:74)、1034bp 啟動(dòng)子元件 P-SETit.Ubql-1:1:2 (SEQ ID NO:76)和 680bp 啟動(dòng)子元件 P-SETit.Ubql-1:1:3 (SEQID NO:78)的比對(duì)。
[0022]圖7a_7b描繪了啟動(dòng)子大小變體和對(duì)應(yīng)于分離自草類物種薏苡(Coixlachryma-jobi)的啟動(dòng)子元件的增強(qiáng)子元件的比對(duì)。特別地，圖7a和7b顯示了在轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)元件組 EXP-Cl.Ubql:1:1(SEQ ID NO:79)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的 837bp 啟動(dòng)子變體 P-Cl.Ubql-1:1: I (SEQ ID NO:80)與 798bp 長(zhǎng)的源自 P_C1.Ubql-1:1:1 的增強(qiáng)子片段(稱為 E_C1.Ubql:I:1) ( SEQ ID NO:89)以及與P_C1.Ubql-1:1:1的三個(gè)5’端刪除變體的比對(duì)，所述三個(gè)5’端刪除變體為:742bp 元件P-Cl.Ubql-1:1:4(SEQ ID NO:84) ;401bp 元件P_C1.Ubql-1:
I:3 (SEQ ID NO:86)和 54bp 最小啟動(dòng)子元件 P_C1.Ubql-1:1:5 (SEQ ID NO:88)。
[0023]圖8描繪了本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因盒構(gòu)造。
[0024]序列簡(jiǎn)述
[0025]SEQ ID NO:1、5、8、10、12、14、16、18、22、25、27、29、31、33、37、39、41、45、49、53、
55、59、63、65、69、73、75、77、79、83、85、87、90、93、95、97、98、99、100、102、104、106、108、110、112、114、115、116、117、119、121、123、124、125、126、128、130、132、133、134、136、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、180、181 和 183 是轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)元件組的序
列或包含可操作地5’連接于前導(dǎo)序列的啟動(dòng)子序列的EXP序列，所述前導(dǎo)序列可操作地5’連接于內(nèi)含子序列。[0026]SEQ ID NO:2、6、9、11、13、15、17、19、23、26、28、30、32、34、38、40、42、46、50、56、
60、64、66、70、74、76、78、80、84、86、88、91、96 和 135 是啟動(dòng)子序列。
[0027]SEQ ID NO:3、20、35、43、47、51、57、61、67、71 和 81 是前導(dǎo)序列。
[0028]SEQ ID NO:4、7、21、24、36、44、48、52、54、58、62、68、72、82、92、94、101、103、105、107、109、111、113、118、120、122、127、129、131、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158和182是內(nèi)含子序列。
[0029]SEQ ID NO:89是增強(qiáng)子的序列。
[0030]發(fā)明詳述
[0031]本文所公開的本發(fā)明提供了來(lái)自植物物種的具有有益基因調(diào)控活性的多核苷酸分子。本發(fā)明提供了這些多核苷酸分子的設(shè)計(jì)、構(gòu)建和用途。在SEQ ID NO:1-158和180-183中提供了這些多核苷酸分子的核苷酸序列。這些多核苷酸分子例如能夠影響植物組織中可操作連接的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的表達(dá)，并且因此選擇性地調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因植物中的基因表達(dá)或所編碼的基因產(chǎn)物的活性。本發(fā)明還提供了修飾、產(chǎn)生和使用這些多核苷酸分子的方法。本發(fā)明還提供了含有該啟動(dòng)子和/或其他公開的核苷酸序列的組合物、轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物和種子，以及用于制備和使用這些的方法。
[0032]提供了以下的定義和方法來(lái)更好地限定本發(fā)明以及在本發(fā)明的實(shí)施中指導(dǎo)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員。除非另外指出，術(shù)語(yǔ)根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的常規(guī)使用方式來(lái)理解。
[0033]DNA 分子
[0034]如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)“DNA”或“DNA分子”指的是基因組或合成來(lái)源的雙鏈DNA分子，即，脫氧核糖核苷酸堿基的聚合物或多核苷酸分子，從5’ (上游)端至3’ (下游)端閱讀。如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)“DNA序列“指的是DNA分子的核苷酸序列。本文中所用的命名法對(duì)應(yīng)于 United States Code of Federal Regulations § 1.882 的標(biāo)題 37,并且列于WIPO Standard ST.25(1998)，附錄2、表1和3的表格中的命名。
[0035]如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)“分離的DNA分子”指的是至少部分地與在天然或自然狀態(tài)中通常與其相關(guān)聯(lián)的其他分子分離的DNA分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“分離的”指的是至少部分地與在其天然或自然狀態(tài)中通常側(cè)鄰所述DNA分子的一些核酸分離的DNA分子。因此，例如，作為重組技術(shù)的結(jié)果而與通常不相關(guān)的調(diào)控或編碼序列融合的DNA分子在本文中被認(rèn)為是分離的。當(dāng)整合至宿主細(xì)胞的染色體中或存在于含有其他DNA分子的核酸溶液中時(shí)，認(rèn)為這樣的分子是分離的，因?yàn)樗鼈兾刺幱谄渥匀粻顟B(tài)中。
[0036]本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種方法可以用來(lái)分離和操縱本發(fā)明中公開的DNA分子或其片段。例如，PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)可以用于擴(kuò)增特定的起始DNA分子和/或用于產(chǎn)生原始分子的變體。DNA分子或其片段也可以通過(guò)其他技術(shù)獲得，如通過(guò)化學(xué)方法直接合成該片段，如通常通過(guò)使用自動(dòng)化寡核苷酸合成儀來(lái)實(shí)施的。
[0037]如本文中所用 的，術(shù)語(yǔ)“序列同一性”指的是兩個(gè)最佳比對(duì)的多核苷酸序列或兩個(gè)最佳比對(duì)的多肽序列相同的程度。通過(guò)人工比對(duì)兩個(gè)序列(例如，參比序列和另一序列)來(lái)形成最佳序列比對(duì)以最大化帶有合適的內(nèi)部核苷酸插入、刪除或空隙的序列比對(duì)中核苷酸匹配的數(shù)目。如本文中所用的,術(shù)語(yǔ)“參比序列”指的是SEQ ID NO:1-158和180-183的多核苷酸序列所提供的序列。[0038]如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)“百分序列同一性”或“百分同一性”或“ ％同一性”是同一性分?jǐn)?shù)乘以100。對(duì)于與參比序列最佳比對(duì)的序列，“同一性分?jǐn)?shù)”是最佳比對(duì)中核苷酸匹配的數(shù)目除以參比序列中的核苷酸總數(shù)，例如，整個(gè)參比序列的全長(zhǎng)中的核苷酸總數(shù)。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是包含與參比序列(本文中以SEQ ID NO:1-158和180-183提供)最佳比對(duì)時(shí)具有與參比序列的至少約85%同一性、至少約90%同一性、至少約95%同一性、至少約96%同一性、至少約97%同一性、至少約98%同一性或至少約99%同一性的序列的DNA分子。在特定的實(shí)施方案中，這樣的序列可以定義為具有基因調(diào)控活性。
[0039]調(diào)控元件
[0040]調(diào)控元件是具有基因調(diào)控活性的DNA分子，即，具有影響可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的能力的DNA分子。因此，術(shù)語(yǔ)“基因調(diào)控活性”指的是通過(guò)影響可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯來(lái)影響該可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的表達(dá)模式的能力。如本文中所用的，轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)元件組或“EXP”序列可以由可操作地連接的表達(dá)元件組成，如增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列和內(nèi)含子。因此，例如，轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)元件組可以由可操作5’連接于前導(dǎo)序列(其隨后可操作地5’連接于內(nèi)含子序列)的啟動(dòng)子組成。內(nèi)含子序列可以由在天然序列的第一內(nèi)含子/外顯子剪接接合點(diǎn)開始的序列組成，并且可以進(jìn)一步由小的前導(dǎo)序列片段組成，所述片段包含第二內(nèi)含子/外顯子剪接接合以便提供正確的內(nèi)含子/外顯子加工，以促進(jìn)所得到的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄和正確加工。前導(dǎo)序列和內(nèi)含子可能正向地影響可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄以及所得到的轉(zhuǎn)錄的RNA的翻譯。加工前的RNA分子包含前導(dǎo)序列和內(nèi)含子，其可以影響轉(zhuǎn)錄的RNA的轉(zhuǎn)錄后加工和/或轉(zhuǎn)錄的RNA分子從細(xì)胞核至細(xì)胞質(zhì)中的輸出。在轉(zhuǎn)錄的RNA分子的轉(zhuǎn)錄后加工后，前導(dǎo)序列可以保留作為最終信使RNA的部分，并且可以正向地影響信使RNA分子的翻譯。
[0041]調(diào)控元件，如啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)(或3’UTR)是具有基因調(diào)控活性的DNA分子并且是活細(xì)`胞的基因整體表達(dá)的有機(jī)部分。術(shù)語(yǔ)“調(diào)控元件”指的是具有基因調(diào)控活性的DNA分子，即具有影響可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的能力的DNA分子。因此，在植物中起作用的分離的調(diào)控序列，如啟動(dòng)子和前導(dǎo)序列，可用于通過(guò)遺傳工程的方法來(lái)改變植物表型。
[0042]可以通過(guò)其表達(dá)模式效應(yīng)(定性地和/或定量地)，例如，正或負(fù)效應(yīng)和/或組成型的或其他的效應(yīng)，如，通過(guò)其時(shí)間、空間、發(fā)育、組織、環(huán)境、生理、病理、細(xì)胞周期和/或化學(xué)響應(yīng)表達(dá)模式及其任意組合，以及通過(guò)定量或定性指標(biāo)，來(lái)表征調(diào)控元件。啟動(dòng)子可用作用于調(diào)控可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的表達(dá)的調(diào)控元件。
[0043]如本文中所用的，“基因表達(dá)模式”是可操作地連接的DNA分子轉(zhuǎn)錄成轉(zhuǎn)錄的RNA分子的任何模式。轉(zhuǎn)錄的RNA分子可以翻譯以產(chǎn)生蛋白質(zhì)分子或可以提供反義或其他調(diào)控RNA 分子，如 dsRNA、tRNA、rRNA、miRNA 等。
[0044]如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)表達(dá)”是轉(zhuǎn)錄的RNA分子翻譯成蛋白質(zhì)分子的任何翻譯模式。蛋白質(zhì)表達(dá)可以通過(guò)其時(shí)間、空間、發(fā)育或形態(tài)學(xué)性質(zhì)以及通過(guò)定量或定性指標(biāo)來(lái)表征。
[0045]如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”通常指的是參與RNA聚合酶II和其他蛋白質(zhì)(反式作用轉(zhuǎn)錄因子)的識(shí)別和結(jié)合以啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的DNA分子。啟動(dòng)子最初可以從基因的基因組拷貝的5’非翻譯區(qū)(5’ UTR)分離?；蛘撸瑔?dòng)子可以是合成地產(chǎn)生或操縱的DNA分子。啟動(dòng)子還可以是嵌合的，即通過(guò)兩個(gè)或更多個(gè)異源DNA分子的融合產(chǎn)生的啟動(dòng)子。本發(fā)明實(shí)施中有用的啟動(dòng)子包括SEQ ID NO:2、6、9、11、13、15、17、19、23、26、28、30、32、34、38、40、42、46、50、56、60、64、66、70、74、76、78、80、84、86、88、91、96 和 135，或其片段或變體。在本
發(fā)明的特定實(shí)施方案中，本文中描述的這些分子及其任何變體或衍生物進(jìn)一步定義為包含啟動(dòng)子活性，即，能夠在宿主細(xì)胞(如，在轉(zhuǎn)基因植物中)中作為啟動(dòng)子發(fā)揮作用。在更進(jìn)一步的特定實(shí)施方案中，可以將片段定義為呈現(xiàn)出其所來(lái)源的起始啟動(dòng)子具有的啟動(dòng)子活性，或片段可以包含“最小啟動(dòng)子”(其提供基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平，并且由TATA盒或用于RNA聚合酶II復(fù)合物的識(shí)別和結(jié)合以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的等同序列組成)。
[0046]在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了本文中公開的啟動(dòng)子序列的片段。啟動(dòng)子片段可以包含如上所述的啟動(dòng)子活性，并且可以單獨(dú)地使用或結(jié)合其他啟動(dòng)子和啟動(dòng)子片段一起使用，如在構(gòu)建的嵌合啟動(dòng)子中。在特定的實(shí)施方案中，提供了包含具有本文中公開的啟動(dòng)子活性的多核苷酸分子的至少約50、95、150、250、500、750或至少約1000個(gè)連續(xù)核苷酸或更長(zhǎng)的啟動(dòng)子片段。
[0047]可以使用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)生產(chǎn)源自如SEQ ID NO:2、6、9、11、13、15、17、19、23、26、28、30、32、34、38、40、42、46、50、56、60、64、66、70、74、76、78、80、84、86、88、91、96 和135中呈現(xiàn)的任一個(gè)啟動(dòng)子的組合物，如內(nèi)部或5’刪除，以提高或改變表達(dá)，包括通過(guò)去除對(duì)表達(dá)具有正或負(fù)效應(yīng)的元件；使對(duì)表達(dá)具有正或負(fù)效應(yīng)的元件重復(fù)；和/或使對(duì)表達(dá)具有組織或細(xì)胞特異性效應(yīng)的元件重復(fù)或去除?？梢允褂迷醋許EQ ID N0:2、6、9、ll、13、15、
17、19、23、26、28、30、32、34、38、40、42、46、50、56、60、64、66、70、74、76、78、80、84、86、88、91、96和135中呈現(xiàn)的任一個(gè)啟動(dòng)子的包含3’刪除的組合物以例如制備增強(qiáng)子元件，其中去除了 TATA盒元件或其等同序列及下游序列?？梢赃M(jìn)行進(jìn)一步的刪除以除去對(duì)表達(dá)具有正或負(fù)效應(yīng)、組織特異性效應(yīng)、細(xì)胞特異性效應(yīng)或時(shí)間特異性效應(yīng)(如，但不限于，晝夜節(jié)律)的任何元件。SEQ ID NO:2、6、9、11、13、15、17、19、23、26、28、30、32、34、38、40、42、46、50、56、60、64、66、70、74、76、78、80、84、86、88、91、96 和 135 中呈現(xiàn)的任一啟動(dòng)子以及源自其的片段或增強(qiáng)子可以用來(lái)制備嵌合轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件組合物，其由可操作地與其他增強(qiáng)子和啟動(dòng)子連接的 SEQ ID NO:2、6、9、11、13、15、17、19、23、26、28、30、32、34、38、40、42、46、50、
56、60、64、66、70、74、76、78、80、84、86、88、91、96和135中呈現(xiàn)的任一啟動(dòng)子以及源自其的片段或增強(qiáng)組成?？梢栽诜€(wěn)定的和瞬時(shí)的植物分析中，如本文中的工作實(shí)施例中所述的那些，經(jīng)驗(yàn)地測(cè)試本文中所述的修飾、重復(fù)或刪除對(duì)特定轉(zhuǎn)基因的所需表達(dá)方面的效力，以驗(yàn)證結(jié)果(其可能隨所進(jìn)行的改變和起始分子中改變的目標(biāo)而不同)。
[0048]如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)“前導(dǎo)序列”指的是從基因的基因組拷貝的5’非翻譯區(qū)(5’UTR)分離的并且通常限定為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)和蛋白編碼序列起始位點(diǎn)之間的核苷酸片段的DNA分子?；蛘?，前導(dǎo)序列可以是合成產(chǎn)生或操縱的DNA元件。前導(dǎo)序列可以用作5’調(diào)控元件，其用于調(diào)節(jié)可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的表達(dá)。前導(dǎo)序列分子可以與異源啟動(dòng)子或與其天然啟動(dòng)子一起使用。因此，本發(fā)明的啟動(dòng)子分子可以可操作地與其天然的前導(dǎo)序列連接或可以可操作地與異源前導(dǎo)序列連接。實(shí)施本發(fā)明中有用的前導(dǎo)序列包括SEQ ID N0:3、20、35、43、47、51、57、61、67、71和81或者其片段或變體。在特定的實(shí)施方案中，可以提供這樣的序列，其限定為能夠宿主細(xì)胞中作為前導(dǎo)序列發(fā)揮作用，所述宿主細(xì)胞包括，例如，轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，將這樣的序列譯解為包含前導(dǎo)序列活性。
[0049]作為SEQ ID NO:3、20、35、43、47、51、57、61、67、71 和 81 呈現(xiàn)的前導(dǎo)序列(5，UTR)可以由調(diào)控元件組成或可以采取對(duì)轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯具有作用的二級(jí)結(jié)構(gòu)。根據(jù)本發(fā)明可以使用作為SEQ ID NO:3、20、35、43、47、51、57、61、67、71和81呈現(xiàn)的前導(dǎo)序列，以形成影響轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯的嵌合 調(diào)控元件。此外，作為SEQ ID NO:3、20、35、43、47、51、57、
61、67、71和81呈現(xiàn)的前導(dǎo)序列可以用于形成影響轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯的嵌合前導(dǎo)序列。
[0050]將外源基因引入新的植物宿主中不總是導(dǎo)致引入基因的高表達(dá)。此外，如果是處理復(fù)雜的性狀，有時(shí)需要調(diào)節(jié)幾個(gè)在空間或時(shí)間上具有不同表達(dá)模式的基因。內(nèi)含子可以主要地提供這樣的調(diào)節(jié)。然而，已經(jīng)表明相同內(nèi)含子在一個(gè)植物中的多重應(yīng)用呈現(xiàn)出缺陷。在那些情況中，需要具有用于構(gòu)建合適的重組DNA元件的基礎(chǔ)控制元件的集合。由于本領(lǐng)域已知的具有表達(dá)增強(qiáng)特性的可用內(nèi)含子集合是有限的，因此需要替換方案。
[0051]源自于以SEQ ID NO:4、7、21、24、36、44、48、52、54、58、62、68、72、82、92、94、101、103、105、107、109、111、113、118、120、122、127、129、131、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158和182呈現(xiàn)的任一個(gè)內(nèi)含子的組合物由順式調(diào)控元件的內(nèi)部缺失或重復(fù)構(gòu)成；和/或當(dāng)可操作地與啟動(dòng)子+前導(dǎo)序列或嵌合啟動(dòng)子+前導(dǎo)序列和編碼序列連接時(shí)，包含內(nèi)含子/外顯子剪接點(diǎn)的5’和3’序列的改變可以用于提高表達(dá)或表達(dá)的特異性。還可以形成包含內(nèi)含子/外顯子剪接點(diǎn)的5’和3’區(qū)的改變以降低引入假起始和終止密碼子的可能，所述假起始和終止密碼子是在信使RNA的加工和剪接后所得到的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中產(chǎn)生的?？梢园凑展ぷ鲗?shí)施例中所述的，經(jīng)驗(yàn)地測(cè)試內(nèi)含子以確定內(nèi)含子對(duì)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的作用。
[0052]根據(jù)本發(fā)明，可以分析啟動(dòng)子或啟動(dòng)子片段中已知啟動(dòng)子元件的存在，即DNA序列特征，如TATA-盒和其他已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)基序。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用這些已知啟動(dòng)子元件的確認(rèn)以設(shè)計(jì)具有與原始啟動(dòng)子相似的表達(dá)模式的啟動(dòng)子變體。
[0053]如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)“增強(qiáng)子”或“增強(qiáng)子元件”指的是順式作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，也稱為順式-元件，其賦予可操作連接的多核苷酸序列的整體表達(dá)模式的一個(gè)方面，但通常單獨(dú)不足以啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。與啟動(dòng)子不同，增強(qiáng)子元件通常不包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)或TATA盒或等同序列。啟動(dòng)子可以天然地包含一個(gè)或多個(gè)影響可操作地連接的多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子元件。分離的增強(qiáng)子元件也可以與啟動(dòng)子融合以產(chǎn)生嵌合啟動(dòng)子順式-元件，其賦予基因表達(dá)的整體調(diào)節(jié)的一個(gè)方面。啟動(dòng)子或啟動(dòng)子片段可以包含一個(gè)或多個(gè)影響可操作地連接的基因的轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子元件。據(jù)認(rèn)為許多啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件結(jié)合DNA-結(jié)合蛋白和/或影響DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生選擇性地允許或限制RNA聚合酶訪問(wèn)DNA模板或促進(jìn)雙螺旋在轉(zhuǎn)錄啟始位點(diǎn)選擇性打開的局部構(gòu)象。增強(qiáng)子元件可以起到結(jié)合調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子的作用。一些增強(qiáng)子元件結(jié)合超過(guò)一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，并且轉(zhuǎn)錄因子可以以不同的親和性與超過(guò)一個(gè)的增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)域相互作用。可以通過(guò)多種技術(shù)鑒定增強(qiáng)子元件，所述技術(shù)包括刪除分析，即從啟動(dòng)子的5’端或內(nèi)部刪除一個(gè)或多個(gè)核苷酸；使用DNase I足跡法、甲基化干涉、電泳遷移率-變動(dòng)試驗(yàn)、通過(guò)連接介導(dǎo)的PCR的體內(nèi)基因組足跡法和其他常規(guī)試驗(yàn)的DNA結(jié)合蛋白質(zhì)分析；或通過(guò)使用常規(guī)DNA序列比較方法，如BLAST，利用已知的順式-元件基序或增強(qiáng)子元件作為目標(biāo)序列或目標(biāo)基序的DNA序列相似性分析?？梢酝ㄟ^(guò)一個(gè)或多個(gè)核苷酸的誘變(或取代)或通過(guò)其他常規(guī)方法來(lái)進(jìn)一步研究增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)域的精細(xì)結(jié)構(gòu)?？梢酝ㄟ^(guò)化學(xué)合成或通過(guò)從包括這些元件的調(diào)控元件分離來(lái)獲得增強(qiáng)子元件，并且可以用含有有用的限制酶位點(diǎn)的其他側(cè)翼核苷酸來(lái)合成以利于后續(xù)操作。因此，本發(fā)明包括根據(jù)本文中公開的方法的增強(qiáng)子元件的設(shè)計(jì)、構(gòu)建和使用，以用于調(diào)節(jié)可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的表達(dá)。[0054]在植物中，在基因構(gòu)建體中包含一些內(nèi)含子導(dǎo)致相對(duì)于缺少內(nèi)含子的構(gòu)建體提高的mRNA和蛋白積聚。
[0055]該效應(yīng)已經(jīng)被稱為基因表達(dá)的“內(nèi)含子介導(dǎo)的增強(qiáng)”(ME) (Mascarenhas等，(1990) PlantMol.Biol.15:913-920)。在玉米基因(例如，tubAl、Adhl、ShUUbil (Jeon 等(2000)Plant Physiol.123:1005-1014 ；Callis 等，(1987)Genes Dev.1:1183-1200 ；Vasil等(1989)Plant Physiol.91:1575-1579 ;Christiansen 等(1992)Plant Mol.Biol.18:675-689)和水稻基因(例如，鹽，tp1:McElroy 等，Plant Cell2:163-171 (1990) ;Xu 等，Plant Physiol.106:459-467(1994))中已經(jīng)鑒定已知在植物中刺激表達(dá)的內(nèi)含子。相似地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)來(lái)自雙子葉植物基因的內(nèi)含子，如來(lái)自矮牽牛(例如，rbcS)、馬鈴薯(例如，st-lsl)和來(lái)自擬南芥(Arabidopsis thaliana)(例如，ubq3和patl)的那些,其升高基因表達(dá)率(Dean 等，(1989)Plant Celll:201-208 ;Leon 等(1991)Plant Physiol.95:968-972 ；Norris 等(1993)Plant Mol Biol21:895-906 ；Rose 和 Last(1997)Plant J.11:455-464)。已經(jīng)表明了內(nèi)含子的剪接位點(diǎn)內(nèi)的缺失或突變降低了基因表達(dá)，表明剪接對(duì)于 IME 可能是需要的(Mascarenhas 等(1990)Plant Mol Biol.15:913-920 ；Clancy和 Hannah(2002)Plant Physiol.130:918-929)。然而，通過(guò)來(lái)自擬南芥的 patl 基因的剪接位點(diǎn)內(nèi)的點(diǎn)突變表明對(duì)于雙子葉植物中的特定IME，剪接本身是不需要的(Rose和Beliakoff(2000)Plant Physiol.122:535-542)。
[0056]通過(guò)內(nèi)含子增強(qiáng)基因表達(dá)不是普遍現(xiàn)象，因?yàn)橐恍﹥?nèi)含子插入重組表達(dá)盒中不能增強(qiáng)表達(dá)(例如，來(lái)自雙子葉植物基因的內(nèi)含子(來(lái)自豌豆的rbcS基因、來(lái)自豆類的菜豆蛋白基因和來(lái)自馬鈴薯(Solanum tuberosum)的stls_l基因)和來(lái)自玉米基因的內(nèi)含子(adhl基因第九個(gè)內(nèi)含子，hsp81基因第一個(gè)內(nèi)含子))(Chee等(1986)Gene41:47-57 ；Kuhlemeier 等(1988)Mol Gen Genet212:405-411 ；Mascarenhas 等(1990) Plant Mol.Biol.15:913-920 ；Sinibaldi 和 Mettler (1992) WE Cohn, K Moldave 編輯，Progress inNucleic Acid Research and Molecular Biology, Vol.42.Academic Press, New York,pp229-257 ；Vancanneyt 等，1990Mol.Gen.Genet.220:245-250)。因此，為了操縱轉(zhuǎn)基因植物中非內(nèi)源性基因或內(nèi)源性基因的基因表達(dá)水平，不是每一種內(nèi)含子都可以使用。為了增強(qiáng)給定基因的表達(dá)率哪個(gè)特征或特定的序列特征必須存在于內(nèi)含子序列中是現(xiàn)有技術(shù)中未知的，并且因此從現(xiàn)有技術(shù)不可能預(yù)測(cè)給定的植物內(nèi)含子在異源性地使用時(shí)是否將引起DNA水平或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平的表達(dá)增強(qiáng)(ME)。
[0057]如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)“嵌合的”指的是通過(guò)將第一 DNA分子與第二 DNA分子融合產(chǎn)生的單一 DNA分子，其中第一或第二 DNA分子通常都不是以該構(gòu)造存在，即與另一個(gè)融合。因此，嵌合DNA分子是通常在自然界未發(fā)現(xiàn)的新分子。如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)“嵌合啟動(dòng)子”指的是通過(guò)這樣的DNA分子操作產(chǎn)生的啟動(dòng)子。嵌合啟動(dòng)子可以組合兩個(gè)或更多個(gè)DNA片段；一個(gè)實(shí)例是啟動(dòng)子與增強(qiáng)子元件的融合。因此，本發(fā)明包括根據(jù)本文中公開的方法的嵌合啟動(dòng)子的設(shè)計(jì)、構(gòu)建和使用，以用于調(diào)節(jié)可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的表達(dá)。[0058]如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)“變體”指的是在組成上與第一 DNA分子相似但不相同的第二 DNA分子，并且第二 DNA分子仍然保持第一 DNA分子的總體功能性，即相同或相似的表達(dá)模式。變體可以是第一 DNA分子的較短或截?cái)嗟男问胶?或第一 DNA分子的序列的改變形式，如具有不同限制酶位點(diǎn)和/或內(nèi)部缺失、取代和/或插入的變體。“變體”還可以包括調(diào)控元件，所述調(diào)控元件的核苷酸序列包含參考序列的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失和/或插入，其中衍生的調(diào)控元件與相應(yīng)的親本調(diào)控分子相比具有更多或更少或等同的轉(zhuǎn)錄或翻譯活性。調(diào)控元件“變體”還包括從細(xì)菌和植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化中天然發(fā)生的突變產(chǎn)生的變體。在本發(fā)明中，作為SEQ ID NO:1-158和180-183提供的多核苷酸序列可以用于形成組成上與原始調(diào)控元件的多核苷酸序列相似但不相同的變體，其同時(shí)仍然保持原始調(diào)控元件的總體功能性，即相同或相似表達(dá)模式。根據(jù)本公開的內(nèi)容，本發(fā)明的這些變體的產(chǎn)生在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)，并且包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。嵌合調(diào)控元件“變體”包含與參考序列相同的組成元件，但包含嵌合調(diào)控元件的組成元件可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的各種方法來(lái)可操作地連接，所述方法如限制酶消化和連接、連接無(wú)關(guān)性克隆、擴(kuò)增過(guò)程中PCR產(chǎn)物的模塊組裝或調(diào)控元件的直接化學(xué)合成以及本領(lǐng)域已知的其他方法。所得到的嵌合調(diào)控元件“變體”可以由參考序列的相同組成元件或相同組成元件的變體組成，但在包含一個(gè)或多個(gè)連接序列的一個(gè)或多個(gè)序列方面不同，所述一個(gè)或多個(gè)連接序列使得組成部分可以可操作地連接。在本發(fā)明中，作為SEQ ID NO:1-158和180-183提供的多核苷酸序列提供了參考序列，其中包含參考序列的組成部分可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法連結(jié)，并且可以包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失和/或插入或在細(xì)菌和植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化中天然發(fā)生的突變。
[0059]構(gòu)建體
[0060]如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)“構(gòu)建體”意思是源自任何來(lái)源的能夠基因組整合或自主復(fù)制的任何重組多核苷酸分子，如質(zhì)粒、粘粒、病毒、自主復(fù)制的多核苷酸分子、噬菌體或者線狀或環(huán)狀單鏈或雙鏈DNA或RNA多核苷酸分子，包括其中一個(gè)或多個(gè)多核苷酸分子已經(jīng)以功能操作的方式連接(即，可操作地連接)的多核苷酸分子。如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)“載體”意思是可以用于轉(zhuǎn)化(即，將異源DNA引入宿主細(xì)胞中)目的的任何重組多核苷酸構(gòu)建體。該術(shù)語(yǔ)包括從上述任何分子分離的表達(dá)盒。
[0061]如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”指的是第一分子接合第二分子，其中分子排列以使得第一分子影響第二分子的功能。兩個(gè)分子可以是或不是單一連續(xù)分子的部分，并且可以是或不是鄰接的。例如，如果啟動(dòng)子在細(xì)胞中調(diào)節(jié)目標(biāo)可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄，則啟動(dòng)子可操作地連接該可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子。例如，當(dāng)前導(dǎo)序列能夠作為用于編碼序列所編碼的多肽的前導(dǎo)序列時(shí)，前導(dǎo)序列可操作地連接該編碼序列。
[0062]在一個(gè)實(shí)施方案中，可以作為雙Ti質(zhì)粒邊界DNA構(gòu)建體提供本發(fā)明的構(gòu)建體，所述構(gòu)建體具有從根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)分離的Ti質(zhì)粒的右邊界(RB或AGRtu.RB)和左邊界(LB或AGRtu.LB)區(qū)，連同根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞提供的轉(zhuǎn)移分子，允許T-DNA整合至植物細(xì)胞的基因組中(參見，例如，US專利6，603，061)。構(gòu)建體還可以含有質(zhì)粒骨架DNA片段，其提供在細(xì)菌細(xì)胞中的復(fù)制功能和抗生素選擇，例如，大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)(如ori322)、廣宿主范圍的復(fù)制起點(diǎn)(如oriV或oriRi)以及用于選擇標(biāo)記的編碼區(qū),如編碼賦予對(duì)壯觀霉素或鏈霉素抗性的Tn7氨基糖苷腺苷酰轉(zhuǎn)移酶(aadA)的Spec/Strp，或慶大霉素(Gm，Gent)選擇標(biāo)記基因。對(duì)于植物轉(zhuǎn)化，宿主細(xì)菌菌株常常是根癌農(nóng)桿菌AB1、C58或LBA4404 ;然而，植物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知的其他菌株可以用于本發(fā)明中。
[0063]以使可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子轉(zhuǎn)錄成功能性mRNA分子的方式裝配構(gòu)建體并將其引入細(xì)胞中的方法是本領(lǐng)域已知的，所述mRNA分子翻譯并表達(dá)為蛋白質(zhì)產(chǎn)物。對(duì)于本發(fā)明的實(shí)施，用于制備和使用構(gòu)建體和宿主細(xì)胞的常規(guī)組合物和方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，參見，例如，Molecular Cloning..A Laboratory Manual (分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，第 3 版，Vol.1、2 和 3 (2000) J.Sambrook, D.ff.Russell 和 N.1rwin, Cold Spring HarborLaboratory Press。用于制備特別適于植物轉(zhuǎn)化的重組載體的方法包括但不限于U.S.專利N0.4，971，908 ;4，940，835 ;4，769，061和4，757，011全文中描述的那些。這些類型的載體在科學(xué)文獻(xiàn)中已經(jīng)有綜述(參見，例如，Rodriguez等，Vectors..A Survey of MolecularCloning Vectors and Their Uses (載體:分子克隆載體及其使用概述)，Butterworths，Boston(1988)和Glick等，Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology (植物分子生物學(xué)和生物技術(shù)中的方法)，CRC Press, Boca Raton FL.(1993))。用于在高等植物中的核酸表達(dá)的典型載體是本領(lǐng)域公知的，并且包括源自根癌農(nóng)桿菌的腫瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒的載體(Rogers 等，Methods in Enzymologyl53:253-277 (1987))?？捎糜谥参镛D(zhuǎn)化的其他重組載體，包括PCaMVCN轉(zhuǎn)移控制載體，也已經(jīng)在科學(xué)文獻(xiàn)中有描述(參見，例如，F(xiàn)romm 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA82:5824-5828 (1985))。
[0064]可以在構(gòu)建體中包括各種調(diào)控元件，包括本文中提供的那些中的任何一個(gè)。任何這樣的調(diào)控元件可以結(jié)合其他調(diào)控元件來(lái)提供?？梢栽O(shè)計(jì)或修改這樣的組合以產(chǎn)生所需的調(diào)控特征。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的構(gòu)建體包含至少一個(gè)可操作地連接可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的調(diào)控元件，所述可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子可操作地連接3’ UTR0
[0065]本發(fā)明的構(gòu)建體可以包括本文中提供的或本領(lǐng)域已知的任何啟動(dòng)子或前導(dǎo)序列。例如，本發(fā)明的啟動(dòng)子可以可操作地連接異源非翻譯5’前導(dǎo)序列，如源自熱休克蛋白基因的前導(dǎo)序列(參見，例如，U.S.專利N0.5，659，122和5，362，865)?；蛘撸景l(fā)明的前導(dǎo)序列可以可操作地連接異源啟`動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒35S轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子(參見，U.S.專利N0.5，352，605)。
[0066]如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)“內(nèi)含子”指的是可以從基因的基因組拷貝中分離或鑒定的DNA分子，并且通常限定為在翻譯之前的mRNA加工過(guò)程中剪接出來(lái)的區(qū)域?；蛘撸瑑?nèi)含子可以是合成產(chǎn)生的或操作的DNA元件。內(nèi)含子可以含有影響可操作連接的基因的轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子元件。內(nèi)含子可以用作調(diào)控元件以用于調(diào)節(jié)可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的表達(dá)。DNA構(gòu)建體可以包含內(nèi)含子，并且內(nèi)含子相對(duì)于可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子序列可以是或不是異源的。本領(lǐng)域中的內(nèi)含子實(shí)例包括水稻肌動(dòng)蛋白內(nèi)含子(U.S.專利N0.5，641，876)和玉米HSP70內(nèi)含子(U.S.專利N0.5，859，347)。本發(fā)明實(shí)施中有用的內(nèi)含子包括SEQ IDNO:4、7、21、24、36、44、48、52、54、58、62、68、72、82、92、94、101、103、105、107、109、111、113、118、120、122、127、129、131、138、140、142、144、146、148、150、152、154、158 和 182。此外，當(dāng)修飾內(nèi)含子/外顯子邊界序列時(shí)，可能優(yōu)選的是，避免緊接在剪接位點(diǎn)(GT)的5’端前使用核苷酸序列AT或核苷酸A，和分別避免緊接在剪接位點(diǎn)(AG)的3’端后使用核苷酸G或核苷酸序列TG，以消除在信使RNA加工成最終轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的過(guò)程中形成不需要的起始密碼子的可能。因此可以以這種方式修飾內(nèi)含子的5’或3’端剪接位點(diǎn)周圍的序列。[0067]如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)“3’轉(zhuǎn)錄終止分子”或“3’UTR”指的是在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中為產(chǎn)生mRNA分子的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)使用的DNA分子。可以通過(guò)特定的切割和3’多腺苷酸化(也稱為，多A尾)來(lái)產(chǎn)生mRNA分子的3’非翻譯區(qū)。3’UTR可以可操作地連接可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子并且位于可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的下游，并且可以包括提供多腺苷酸化信號(hào)的多核苷酸和能夠影響轉(zhuǎn)錄、mRNA加工或基因表達(dá)的其他調(diào)控信號(hào)的多核苷酸。據(jù)認(rèn)為多A尾在mRNA穩(wěn)定性和翻譯啟動(dòng)中起作用。本領(lǐng)域中3’轉(zhuǎn)錄終止分子的實(shí)例是胭脂堿合成酶3，區(qū)域(參見，F(xiàn)raley 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 80:4803-4807 (1983))、小麥 hspl73，區(qū)域、豌豆 rubisco 小亞基 3，區(qū)域、棉花 E63，區(qū)(U.S.專利 N0.6，096，950) ；W00011200A2中公開的 3，區(qū)域和 coixin3’ UTR(U.S.專利 N0.6，635，806)。
[0068]通常發(fā)現(xiàn)3’UTR對(duì)于特定基因的重組表達(dá)具有有益用途。在動(dòng)物系統(tǒng)中，3’ UTR的機(jī)制已經(jīng)非常明確(例如，Zhao 等，Microbiol Mol Biol Rev63:405-445 (1999)；Proudfoot, Nature322:562-565 (1986) ；Kim 等，Biotechnology Progress 19:1620-1622(2003) ；Yonaha 和 Proudfoot，EMBO J.19:3770-3777 (2000) ；Cramer 等，F(xiàn)EBSLetters498:179-182 (2001) ；Kuerstem 和 Goodwin, Nature Reviews Genetics4:626-637(2003))。需要RNA轉(zhuǎn)錄的有效終止以防止不需要的性狀不相關(guān)(下游)序列的轉(zhuǎn)錄，其可能干擾性狀性能。與獨(dú)立的插入相比，多個(gè)基因表達(dá)盒彼此位置接近的排列(例如，在一個(gè)T-DNA中)會(huì)引起所述構(gòu)建體中一個(gè)或多個(gè)基因的基因表達(dá)的抑制(Padidam和Cao,BioTechniques31:328-334 (2001))。這可能干擾獲得足夠水平的表達(dá)，例如，在需要來(lái)自所有表達(dá)盒的強(qiáng)基因表達(dá)的情況中。
[0069]在植物中，清楚限定的多腺苷酸化信號(hào)序列是未知的。Hasegawa等,Plant J.33:1063-1072, (2003)未能在林煙草(Nicotiana sylvestris)的體外和體內(nèi)系統(tǒng)中鑒定出保守的多腺苷酸化信號(hào)序列，也未能確定初始(非-多腺苷酸化的)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的實(shí)際長(zhǎng)度。弱的3’UTR具有產(chǎn)生連讀(read-through)的可能,其可能影響位于鄰近表達(dá)盒中的基因的表達(dá)(Padidam和Cao,BioTe chniques31:328-334 (2001))。轉(zhuǎn)錄終止的適當(dāng)控制可以防止連讀到位于下游的序列(例如，其他表達(dá)盒)中并且可以進(jìn)一步允許RNA聚合酶有效再循環(huán)，以提高基因表達(dá)。轉(zhuǎn)錄的有效終止(從DNA釋放RNA聚合酶II)是轉(zhuǎn)錄重新啟動(dòng)必需的，并且因此直接影響整體的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平。轉(zhuǎn)錄終止后，成熟的mRNA從合成位點(diǎn)和模板釋放至細(xì)胞質(zhì)中。真核mRNA作為多(A)形式在體內(nèi)累積，使得難以通過(guò)常規(guī)方法來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。然而，通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)功能性和有效的3’ UTR是困難的，因?yàn)椴淮嬖谠试S容易地預(yù)測(cè)有效3’ UTR的保守序列。
[0070]從實(shí)踐觀點(diǎn)看，在轉(zhuǎn)基因盒中使用的3’UTR具有以下特征通常是有益的。3’UTR應(yīng)當(dāng)能夠有效地和高效地終止轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄并且防止轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物連讀到任何鄰近的DNA序列(如在一個(gè)T-DNA中存在多個(gè)盒的情況中，所述的鄰近DNA序列可以由另一個(gè)轉(zhuǎn)基因盒組成)中或T-DNA已經(jīng)插入的鄰近染色體DNA中。3’UTR不應(yīng)當(dāng)引起由用于驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列和內(nèi)含子導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄活性的降低。在植物生物技術(shù)中，3’UTR常常用于引發(fā)從轉(zhuǎn)化的植物提取的反轉(zhuǎn)錄RNA的擴(kuò)增反應(yīng)，并且用于(I)評(píng)價(jià)一旦整合至植物染色體中的轉(zhuǎn)基因盒的轉(zhuǎn)錄活性或表達(dá)；⑵評(píng)價(jià)植物DNA內(nèi)插入的拷貝數(shù)；和(3)評(píng)價(jià)育種后得到的種子的接合性。3’ UTR還用于從轉(zhuǎn)化的植物提取的DNA的擴(kuò)增反應(yīng)中，以表征插入盒的完整性。[0071]可以基于從種子、花和其他組織分離的信使RNA制得的cDNA文庫(kù)中表達(dá)的序列標(biāo)記(EST)的表達(dá)來(lái)鑒定用于提供轉(zhuǎn)基因在植物中的表達(dá)的3’UTR，所述種子、花和其他組織源自大須芒草(Andropogon gerardii)、沙生鹿茅(Saccharum ravennae (Erianthusravennae))、狗尾草(Setaria viridis)、墨西哥玉米(Zea mays subsp.mexicana)、小米(Setaria italica)或薏該(Coix lacryma-jobi)。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法,從選定植物物種的花組織、種子、葉和根分離的組織制得cDNA文庫(kù)。使用本領(lǐng)域已知的各種測(cè)序方法將所得到的cDNA測(cè)序。使用生物信息學(xué)軟件,如clc_ref_assemble_complete版本
2.01.37139 (CLC bio USA, Cambridge，Massachusetts02142)，將所得到的 EST 裝配成簇。通過(guò)計(jì)數(shù)各個(gè)簇的cDNA讀數(shù)的數(shù)目來(lái)確定各個(gè)簇的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物豐度。鑒定的3’ UTR可以由源自cDNA序列的序 列以及源自基因組DNA的序列組成。將cDNA序列用于設(shè)計(jì)引物，其然后用于按照制造商的方案構(gòu)建的 GenomeWalker?(Clontech Laboratories, Inc, MountainView, CA)文庫(kù)以克隆相應(yīng)基因組DNA序列的3’區(qū)域，來(lái)提供較長(zhǎng)的終止序列。通過(guò)對(duì)各個(gè)組織文庫(kù)所觀察到的序列讀數(shù)的直接計(jì)數(shù)或標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)數(shù)對(duì)相關(guān)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物豐度的分析可以用于推斷關(guān)于表達(dá)模式的特性。例如，相對(duì)于葉子可以在根組織中以較高豐度看到的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)一些3’ UTR0這表明了轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在根中是高度表達(dá)的，并且根表達(dá)的特性可以歸因于啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、內(nèi)含子或3’ UTR的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。通過(guò)在特定器官、組織或細(xì)胞類型內(nèi)的表達(dá)特性鑒定的3’ UTR的經(jīng)驗(yàn)測(cè)試可以導(dǎo)致增強(qiáng)那些特定器官、組織或細(xì)胞類型內(nèi)的表達(dá)的3’ UTR的鑒定。
[0072]構(gòu)建體和載體也可以包括表達(dá)連接的肽的轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼序列，所述連接肽用于靶向蛋白產(chǎn)物于特別是葉綠體、白色體或其他質(zhì)體細(xì)胞器；線粒體；過(guò)氧化物酶體；液泡或細(xì)胞外位置。對(duì)于使用葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的描述參見U.S.專利N0.5，188，642和U.S.專利N0.5，728，925。許多葉綠體定位的蛋白質(zhì)作為前體由核基因表達(dá)，并且通過(guò)葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(CTP)靶向于葉綠體。這樣的分離的葉綠體蛋白質(zhì)的實(shí)例包括，但不限于，與核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的小亞基(SSU)、鐵氧還蛋白、鐵氧還蛋白氧化還原酶、光捕獲復(fù)合蛋白I和蛋白I1、硫氧還蛋白F、烯醇式丙酮酰莽草酸磷酸合成酶(EPSPS)以及U.S.專利N0.7，193，133中所描述的轉(zhuǎn)運(yùn)肽相關(guān)的那些。已經(jīng)在體內(nèi)和體外證明了非葉綠體蛋白質(zhì)可以通過(guò)使用與異源CTP的蛋白質(zhì)融合來(lái)靶向于葉綠體并且CTP足以將蛋白靶向于葉綠體。已經(jīng)表明了整合合適的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，如擬南芥EPSPS CTP(CTP2)(參見，Klee等，Mol.Gen.Genet.210:437-442(1987))或矮牽牛 EPSPS CTP (CTP4)(參見，della-Cioppa 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA83:6873-6877 (1986))，將異源 EPSPS 蛋白序列靶向于轉(zhuǎn)基因植物中的葉綠體(參見，U.S.專利 N0.5，627，061 ;5，633，435 和 5，312，910 以及 EP0218571 ；EP189707 ；EP508909 和 EP924299)。
[0073]可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子
[0074]如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)“可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子”指的是能夠轉(zhuǎn)錄成RNA分子的任何DNA分子，包括，但不限于，具有蛋白質(zhì)編碼序列的那些和產(chǎn)生具有可用于基因抑制的序列的RNA分子的那些?！稗D(zhuǎn)基因”指的是至少相對(duì)于其在基因組中的位置對(duì)于宿主細(xì)胞異源的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子和/或人工引入目前或任何之前代的細(xì)胞的宿主細(xì)胞基因組中的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子。
[0075]本發(fā)明的啟動(dòng)子可以可操作地連接對(duì)于啟動(dòng)子分子是異源的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子。如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)“異源的”指的是兩個(gè)或多個(gè)多核苷酸分子的組合正常情況下未在自然界中發(fā)現(xiàn)的這種組合。例如，兩個(gè)分子可以源自不同的物種和/或兩個(gè)分子可以源自不同的基因，例如，來(lái)自相同物種的不同基因或來(lái)自不同物種的相同基因。因此，如果這樣的組合正常情況下未在自然界中發(fā)現(xiàn)，那么啟動(dòng)子對(duì)于可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子是異源的，即，該可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子在組合中不是自然發(fā)生地可操作連接該啟動(dòng)子分子。
[0076]可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子通常可以是對(duì)于需要其RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物表達(dá)的任何DNA分子。這樣的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)可以導(dǎo)致所得到的mRNA分子的翻譯，并且因此導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)?；蛘?，例如，可以將可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子設(shè)計(jì)成最終引起降低的特定基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，這可以通過(guò)使用以反義方向定向的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子來(lái)實(shí)現(xiàn)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知這樣的反義技術(shù)的使用。簡(jiǎn)而言之，隨著反義可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子被轉(zhuǎn)錄，RNA產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)與互補(bǔ)RNA分子雜交并將其隔離。這種雙鏈RNA分子不能通過(guò)細(xì)胞的翻譯機(jī)制翻譯成蛋白質(zhì)，并且在細(xì)胞中降解?？梢砸赃@種方式負(fù)調(diào)節(jié)任何基因。
[0077]因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是可操作地連接可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的本發(fā)明的調(diào)控元件，如SEQ ID NO:1-158和180-183中提供的那些，以使得當(dāng)構(gòu)建體整合至植物細(xì)胞的基因組中時(shí)，以所需水平或以所需模式調(diào)節(jié)可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄。在一個(gè)實(shí)施方案中，可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子包含基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)，并且啟動(dòng)子影響翻譯和表達(dá)為蛋白質(zhì)產(chǎn)物的RNA分子的轉(zhuǎn)錄。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子包含基因的反義區(qū)域，并且啟動(dòng)子影響反義RNA分子、雙鏈RNA或其他類似抑制性RNA分子的轉(zhuǎn)錄，以抑制特定的目標(biāo)RNA分子在目標(biāo)宿主細(xì)胞中的表達(dá)。
[0078]具有農(nóng)藝學(xué)意義的基因
[0079]可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子可以是具有農(nóng)藝學(xué)意義的基因。如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)“具有農(nóng)藝學(xué)意義的基因”指的是當(dāng)在特定的植物組織、細(xì)胞或細(xì)胞類型中表達(dá)時(shí)賦予所需特征的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子，所述特征例如與植物形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、生長(zhǎng)、發(fā)育、產(chǎn)量、產(chǎn)物、營(yíng)養(yǎng)特征、抗病性或抗蟲性和`/或環(huán)境或化學(xué)耐受性相關(guān)。具有農(nóng)藝學(xué)意義的基因包括，但不限于，編碼產(chǎn)品蛋白質(zhì)、抗應(yīng)激蛋白、發(fā)育控制蛋白、組織分化蛋白、分生組織蛋白、環(huán)境反應(yīng)性蛋白、衰老蛋白、激素反應(yīng)性蛋白、脫落蛋白(abscission protein)、源蛋白、儲(chǔ)器蛋白(sink protein)、花控制蛋白、種子蛋白、除草劑抗性蛋白、疾病抗性蛋白、脂肪酸生物合成酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶、殺蟲蛋白或任何其他物質(zhì)(如，靶向特定基因用于抑制的反義或RNAi分子)的那些。具有農(nóng)藝學(xué)意義的基因的產(chǎn)物可以在植物內(nèi)起作用以引起對(duì)植物生理學(xué)或代謝的效應(yīng)，或可以作為施加于植物上的昆蟲膳食中的殺蟲劑。
[0080]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的啟動(dòng)子結(jié)合至構(gòu)建體中，以使得啟動(dòng)子可操作地連接作為具有農(nóng)藝學(xué)意義基因的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子。為了賦予農(nóng)藝學(xué)上有益的性狀，具有農(nóng)藝學(xué)意義的基因的表達(dá)是合乎需要的。有益的農(nóng)藝學(xué)性狀可以是，例如,但不限于，除草劑耐受性、昆蟲控制、改變的產(chǎn)量、真菌疾病抗性、病毒抗性、線蟲抗性、細(xì)菌疾病抗性、植物生長(zhǎng)和發(fā)育、淀粉生產(chǎn)、改變的油生產(chǎn)、高油產(chǎn)量、改變的脂肪含量、高蛋白質(zhì)產(chǎn)量、果實(shí)成熟、增強(qiáng)的動(dòng)物和人營(yíng)養(yǎng)、生物聚合物、環(huán)境應(yīng)激抗性、藥物肽和可分泌肽、改善的加工性狀、提高的可消化性、酶產(chǎn)生、風(fēng)味、氮固定、雜種種子產(chǎn)生、纖維產(chǎn)生和生物燃料產(chǎn)生。本領(lǐng)域已知的具有農(nóng)藝學(xué)意義的基因的實(shí)例包括用于除草劑抗性(U.S.專利 N0.6，803，501 ；6, 448，476 ；6, 248，876 ；6, 225，114 ；6, 107，549 ；5, 866，775 ；5，804，425 ；5, 633，435 和 5，463，175)、提高的產(chǎn)量(U.S.專利 N0.USRE38, 446 ；6, 716，474 ；6，663，906 ；6, 476，295 ；6, 441，277 ；6, 423，828 ；6, 399，330 ；6, 372，211 ；6, 235，971 ；6，222，098 和 5，716，837)、昆蟲控制(U.S.專利 N0.6，809，078 ；6, 713，063 ；6, 686，452 ；6，657，046 ；6, 645，497 ；6, 642，030 ；6, 639，054 ；6, 620，988 ；6, 593，293 ；6, 555，655 ；6，538，109 ；6, 537，756 ；6, 521，442 ；6, 501，009 ；6, 468，523 ；6, 326，351 ；6, 313，378 ；6，284，949 ；6, 281，016 ；6, 248，536 ；6, 242，241 ；6, 221，649 ；6, 177，615 ；6, 156，573 ；6，153，814 ；6, 110，464 ；6, 093，695 ；6, 063，756 ；6, 063，597 ；6, 023，013 ；5, 959，091 ；5，942，664 ；5, 942，658，5，880，275 ；5, 763，245 和 5，763，241)、真菌疾病抗性(U.S.專利N0.6，653，280 ；6, 573，361 ；6, 506，962 ；6, 316，407 ；6, 215，048 ；5, 516，671 ；5, 773，696 ；6，121，436 ；6, 316，407 和 6，506，962)、病毒抗性(U.S.專利 N0.6，617，496 ；6, 608，241 ；6，015，940 ；6, 013，864 ；5, 850，023 和 5，304，730)、線蟲抗性(U.S.專利 N0.6，228，992)、細(xì)菌疾病抗性(U.S.專利N0.5，516，671)、植物生長(zhǎng)和發(fā)育(U.S.專利N0.6，723，897和6，518，488)、淀粉產(chǎn)量(U.S.專利 N0.6，538，181 ;6，538，179 ;6，538，178 ;5，750，876 ；6，476，295)、改變的油產(chǎn)生(U.S.專利 N0.6，444，876 ;6，426，447 和 6，380，462)、高油產(chǎn)量(U.S.專利 N0.6，495，739 ;5，608，149 ;6，483，008 和 6，476，295)、改變的脂肪酸含量(U.S.專利 N0.6，828，475 ;6，822，141 ;6，770，465 ;6，706，950 ;6，660，849 ;6，596，538 ；6，589，767 ;6，537，750 ;6，489，461 和 6，459，018)、高蛋白產(chǎn)生(U.S.專利 N0.6，380，466)、果實(shí)成熟(U.S.專利N0.5，512，466)、增強(qiáng)的動(dòng)物和人營(yíng)養(yǎng)(U.S.專利N0.6，723，837 ;6，653，530 ;6，5412，59 ;5，985，605 和 6，171，640)、生物聚合物(U.S.專利 N0.USRE37, 543 ；6，228，623 和 5，958，745 及 6，946，588)、環(huán)境應(yīng)激抗性(U.S.專利 N0.6，072，103)、藥物肽和可分泌肽(U.S.專利 N0.6，812，379 ;6，774，283 ;6，140，075 和 6，080，560)、改善的加工性狀(U.S.專利N0.6，476，295)、提高的可消化性(U.S.專利N0.6，531，648)、低蜜三糖(U.S.專利N0.6，166，292)、工業(yè)酶產(chǎn)生(U.S.專利N0.5，543，114)、改善的風(fēng)味(U.S.專利N0.6，011，199)、氮固定(U.S.專利N0.5，229，114)、雜種種子產(chǎn)生(U.S.專利N0.5，689，041)、纖維產(chǎn)生(U.S.專利 N0.6，576，818 ;6，271，443 ;5，981，834 和 5，869，720)和生物燃料產(chǎn)生(U.S.專利N0.5，998，700)的那些。
[0081] 或者，具有農(nóng)藝學(xué)意義的基因可以通過(guò)編碼引起內(nèi)源基因基因表達(dá)的靶向調(diào)節(jié)的RNA分子來(lái)影響上述植物特征或表型，例如，通過(guò)反義(參見，例如，US專利5，107, 065)、抑制性RNA ( “RNAi”，包括通過(guò)miRNA-、siRNA-、反式作用siRNA-和定相sRNA-介導(dǎo)的機(jī)制來(lái)調(diào)芐基因表達(dá)，例如，如公開的申請(qǐng)US2006/0200878和US2008/0066206以及US專利申請(qǐng)11/974，469中所述的)或共抑制介導(dǎo)的機(jī)制。RNA還可以是經(jīng)工程化來(lái)切割所需內(nèi)源性mRNA產(chǎn)物的催化性RNA分子(例如，核酶或核糖開關(guān)；參見，例如US2006/0200878)。因此，編碼影響農(nóng)藝學(xué)上重要的目標(biāo)表型或形態(tài)學(xué)變化的轉(zhuǎn)錄RNA分子的任何可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子可以用于本發(fā)明的實(shí)施中。以將可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子轉(zhuǎn)錄成能夠引起基因抑制的分子的方式構(gòu)建構(gòu)建體并將其引入細(xì)胞中的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，使用含有反義定向的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的構(gòu)建體來(lái)調(diào)節(jié)植物細(xì)胞中的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后基因抑制公開于U.S.專利N0.5，107，065和5，759，829中，以及使用含有正義定向的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的構(gòu)建體來(lái)調(diào)節(jié)植物中的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后基因抑制公開于U.S.專利N0.5，283，184和5，231，020中。可轉(zhuǎn)錄多核苷酸在植物細(xì)胞中的表達(dá)還可以用于抑制以植物細(xì)胞為食的植物害蟲，例如，從鞘翅目害蟲分離的組合物(U.S.專利公開N0.US20070124836)和從線蟲害蟲分離的組合物(U.S.專利公開N0.US20070250947)。植物害蟲包括，但不限于，節(jié)足害蟲、線蟲害蟲和真菌或微生物害蟲。用于結(jié)合至本發(fā)明的構(gòu)建體中的示例性可轉(zhuǎn)錄多核苷酸包括，例如，來(lái)自目標(biāo)物種以外的物種的DNA分子或基因或源于或存在于相同物種中但通過(guò)傳統(tǒng)繁殖或育種技術(shù)以外的遺傳工程方法整合至受體細(xì)胞中的基因。多核苷酸分子的類型可以包括，但不限于，已經(jīng)存在于植物細(xì)胞中的多核苷酸分子、來(lái)自另一植物的多核苷酸分子、來(lái)自不同生物體的多核苷酸分子或外部產(chǎn)生的多核苷酸分子，如含有基因的反義信息的多核苷酸分子，或編碼人工的、合成的或轉(zhuǎn)基因的其他修飾形式的多核苷酸分子。
[0082]選擇標(biāo)記
[0083]如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”指的是可以以一定的方式篩選或評(píng)價(jià)其表達(dá)或缺失的任何可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子。用于本發(fā)明實(shí)施中的標(biāo)記基因包括，但不限于，編碼葡糖苷酸酶(U.S.專利N0.5，599，670中所述的⑶S)、綠色熒光蛋白及其變體(U.S.專利N0.5，491，084和6，146，826中所述的GFP)、賦予抗生素抗性的蛋白質(zhì)或賦予除草劑耐受性的蛋白的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子。有用的抗生素抗性標(biāo)記，包括編碼賦予卡那霉素(nptll)、潮霉素B(aph IV)、鏈霉素或壯觀霉素(aad, spec/strep)和慶大霉素(aac3和aacC4)抗性的那些，是本領(lǐng)域已知的。對(duì)其已經(jīng)證明了轉(zhuǎn)基因植物耐受性并且可以對(duì)其使用本發(fā)明的方法的除草劑包括，但不限于:氨基-甲基-膦酸、草甘膦、草銨膦、磺脲、咪唑啉酮、溴苯腈、茅草枯、麥草畏、烯己二酮、原卟啉原氧化酶抑制劑和異噁氟草除草劑。編碼涉及除草劑耐受性的蛋白質(zhì)的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子是本領(lǐng)域已知的，并且包括，但不限于，編碼5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(U.S.專利N0.5，627，061 ;5，633，435 ;6，040，497和5，094，945中所述的草甘膦耐受性的EPSPS)的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子；編碼草甘膦氧化還原酶和草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(U.S.專利N0.5，463，175中所述的GOX ；U.S.專利公開N0.20030083480中所述的 GAT和U.S.專利公開N0.20030135879中的麥草畏單加氧酶)的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子；編碼溴苯腈腈水解酶(U.S.專利N0.4，810，648中所述的用于溴苯腈耐受性的Bxn)的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子；編碼Misawa等，Plant Journal4:833-840 (1993)和Misawa等，Plant Journal6:481-489 (1994)中所述的用于氟草敏耐受性的八氫番爺紅素去飽和酶(crtl)的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子；編碼Sathasiivan等，Nucl.Acid.Res.18:2188-2193(1990)中所述的用于磺脲除草劑耐受性的乙酰羥酸合成酶(AHAS，也稱為ALS)的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子JPDeBlock等，EMBO Journal6:2513-2519(1987)中所述的用于草銨膦和雙丙氨磷耐受性的bar基因。本發(fā)明的啟動(dòng)子分子可以表達(dá)連接的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子，所述多核苷酸分子編碼草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶、草甘膦抗性EPSPS、氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶、羥苯基丙酮酸脫氫酶、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、茅草枯脫鹵素酶、溴苯腈抗性腈水解酶、鄰氨基苯甲酸合成酶、芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶、乙酰CoA羧化酶、草甘膦氧化還原酶和草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶。
[0084]包括在術(shù)語(yǔ)“選擇標(biāo)記”內(nèi)的還有編碼其分泌可以檢測(cè)以作為鑒定或選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的一種方式的選擇標(biāo)記的基因。實(shí)例包括編碼可以通過(guò)抗體相互作用鑒定的可分泌抗原或甚至可以催化性地檢測(cè)的可分泌酶的標(biāo)記?？蛇x擇的分泌標(biāo)記蛋白落入多種類別中，包括可檢測(cè)的小的、擴(kuò)散性蛋白(例如，通過(guò)ELISA)、在細(xì)胞外溶液中可檢測(cè)的小的活性酶(例如，α-淀粉酶、β_內(nèi)酰胺酶、草丁膦轉(zhuǎn)移酶)，或插入或封閉在細(xì)胞壁中的蛋白質(zhì)(如，包括前導(dǎo)序列的蛋白，如在延伸的表達(dá)單元或煙草病理相關(guān)蛋白(也稱為煙草PR-S)中發(fā)現(xiàn)的那些)。其他可能的選擇標(biāo)記基因是本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的并且包括在本發(fā)明中。
[0085]細(xì)胞轉(zhuǎn)化
[0086]本發(fā)明還涉及生產(chǎn)包含可操作連接到可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子上的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞和植物的方法。
[0087]術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”指的是將核酸引入受體宿主中。如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)“宿主”指的是細(xì)菌、真菌或植物，包括細(xì)菌、真菌或植物的任何細(xì)胞、組織、器官或后代。特別感興趣的植物組織和細(xì)胞包括原生質(zhì)體、愈傷組織、根、塊莖、種子、莖、葉、幼苗、胚芽和花粉。
[0088]如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化的”指的是其中已經(jīng)引入了外源多核苷酸分子(如，構(gòu)建體)的細(xì)胞、組織、器官或生物體。引入的多核苷酸分子可以整合至受體細(xì)胞、組織、器官或生物體的基因組DNA中，以使得引入的多核苷酸分子被遺傳到隨后的世代?！稗D(zhuǎn)基因”或“轉(zhuǎn)化的”細(xì)胞或生物體還包括細(xì)胞或生物體的后代以及從使用這樣的轉(zhuǎn)基因生物體作為雜交親本的育種程序產(chǎn)生的并且由于外源多核苷酸分子的存在呈現(xiàn)出改變表型的后代。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因的”指的是含有一個(gè)或多個(gè)異源多核酸分子的細(xì)菌、真菌或植物。
[0089]存在許多方法將多核酸分子引入植物細(xì)胞中。該方法通常包括如下步驟:選擇合適的宿主細(xì)胞、用重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞和獲得轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。合適的方法包括細(xì)菌感染(例如，農(nóng)桿菌)、二元細(xì)菌人工染色體載體、DNA的直接傳遞(例如，通過(guò)PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、干燥/抑制-介導(dǎo)的DNA攝取、電穿孔、用碳化硅纖維攪拌和DNA覆蓋顆粒的加速等(綜述于 Potrykus 等，Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.42:205 (1991))中)。
[0090]用于將DNA分子引入細(xì)胞中的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。在本發(fā)明的實(shí)施中通過(guò)將植物DNA構(gòu)建體引入植物基因組中來(lái)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法和材料可以包括公知的和證明的方法中的任何一種。任何轉(zhuǎn)化方法可以用于使用本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子和/或構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是任何細(xì)胞或生物體，如植物細(xì)胞、藻類細(xì)胞、藻類、真菌細(xì)胞、真菌、細(xì)菌細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞。優(yōu)選的宿主和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞包括來(lái)自以下的細(xì)胞:植物、曲霉屬(Aspergillus)、酵母、昆蟲、細(xì)菌和藻類。
[0091]再生的轉(zhuǎn)基因植物可以自花授粉以提供純合的轉(zhuǎn)基因植物。或者，可以將獲自再生的轉(zhuǎn)基因植物的花粉與非轉(zhuǎn)基因植物(優(yōu)選是農(nóng)藝學(xué)上重要物種的近交系)雜交。通常用于不同性狀和作物的育種方法的描述可以在幾本參考書之一中找到，參見，例如，Allard, Principles of Plant Breeding(育種原理)，John ffiley&Sons, NY,U.0fCA, Davis, CA,50-98(1960) ;Simmonds !Principles of crop improvement (作物改進(jìn)原理)，Longman, Inc., NY, 369-399 (1979), Sneep 和 Hendriksen, Plant breedingperspectives (植物育種概覽)，Wageningen (編輯)，Center for AgriculturalPublishing and Documentation(1979) ；Fehr, Soybeans..Improvement, Production andUses (大豆:提高、生產(chǎn)和使用)，第 2 版，Monograph, 16:249 (1987) ；Fehr, Principles ofvariety development, Theory and Technique (品種發(fā)育原理，理論和技術(shù))，(Vol.1)和Crop Species Soybean(作物品種大豆)(Vol2), 1wa State Univ., Macmillan Pub.C0.，NY, 360-376(1987)。相反地，來(lái)自非轉(zhuǎn)基因植物的花粉可以用于對(duì)再生的轉(zhuǎn)基因植物授粉。
[0092]可以分析轉(zhuǎn)化植物的目標(biāo)基因的存在以及通過(guò)本發(fā)明的調(diào)控元件賦予的表達(dá)水平和/或特征。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可用于轉(zhuǎn)化植物分析的多種方法。例如，用于植物分析的方法包括，但不限于，Southern印跡或northern印跡、基于PCR的方法、生物化學(xué)分析、表型篩選方法、田間評(píng)價(jià)和免疫診斷試驗(yàn)?？梢允褂肨aqMan? (Applied Biosystems,Foster City，CA)試劑和方法如制造商描述的來(lái)測(cè)量可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的表達(dá)，并且使用TaqMan? Testing Matrix確定PCR循環(huán)時(shí)間?；蛘?如制造商所述的Invader?(Third Wave Technologies, Madison, WI)試劑和方法可以用于轉(zhuǎn)基因表達(dá)。
[0093]可以從可育的轉(zhuǎn)基因植物收集本發(fā)明的植物的種子，并且用于生長(zhǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物的后代世代，包括包含本發(fā)明的構(gòu)建體并表達(dá)具有農(nóng)藝學(xué)意義基因的雜種植物系。
[0094]本發(fā)明還提供了本發(fā)明的植物的部分。植物部分，非限制地，包括葉、莖、根、塊莖、種子、胚乳、胚珠和花粉。本發(fā)明還包括和提供了包含本發(fā)明核酸分子的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。
[0095]轉(zhuǎn)基因植物可以將轉(zhuǎn)基因多核苷酸分子傳遞給其后代。后代包括包含源自其祖先植物的轉(zhuǎn)基因的任何可再生植物部分或種子。轉(zhuǎn)基因植物優(yōu)選對(duì)轉(zhuǎn)化的多核苷酸分子是純合的并且作為有性繁殖的結(jié)果將該序列傳遞給所有后代?？梢詮霓D(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子種植后代。然后將這些另外的植物自花授粉以產(chǎn)生植物的純育種系。評(píng)價(jià)來(lái)自這些植物的后代，其中特別是評(píng)價(jià)基因表達(dá)?？梢酝ㄟ^(guò)幾種常用的方法，如western印跡、northern印跡、免疫沉淀和ELISA，來(lái)檢測(cè)基因表達(dá)。
[0096]商品
[0097]本發(fā)明提供了包含根據(jù)本發(fā)明的DNA分子的商品。如本文中所用的，“商品”指的是由源自包含本發(fā)明DNA分子的植物、種子、植物細(xì)胞或植物部分的材料組成的任何組合物或產(chǎn)品。商品可以銷售給消費(fèi)者，并且可以是可生存的或不可生存的。不可生存的商品包括但不限于不可生存的種子和籽粒；加工過(guò)的種子、種子部分和植物部分；脫水的植物組織、冷凍的植物組織和加工過(guò)的植物組織；加工用于陸地和/或水生動(dòng)物食用的動(dòng)物飼料的種子和植物部分，油、粗粉、面粉、薄片、麩皮、纖維、奶、干酪、紙張、奶油、酒和用于人消耗的任何其他食品；以及生物質(zhì)和燃料產(chǎn)品?？缮娴纳唐钒ǖ幌抻诜N子和植物細(xì)胞。因此包含根據(jù)本發(fā)明的DNA分子的植物可以用于制造任何通常從植物或其部分獲得的商品。
[0098]現(xiàn)在已經(jīng)概括地描述了本發(fā)明，通過(guò)參考以下實(shí)施例將更容易理解本發(fā)明，所述實(shí)施例是以說(shuō)明的方式提供的并且不是用來(lái)限制本發(fā)明，除非具體說(shuō)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解以下實(shí)施例中公開的技術(shù)代表了發(fā)明人發(fā)現(xiàn)很好地實(shí)施本發(fā)明的技術(shù)。然而，根據(jù)本發(fā)明的公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到在所公開的特定實(shí)施方案中可以進(jìn)行許多變化并且仍然獲得類似或相似的結(jié)果而沒有脫離本發(fā)明的精神和范圍，因此附圖中所列或所示的所有事物解釋為說(shuō)明性的而不是限制意義的。
實(shí)施例
[0099]實(shí)施例1:調(diào)控元件的鑒定和克隆
[0100]從單子葉物種大須芒草(Andropogon gerardii)、沙生鹿茅(Saccharumravennae (Erianthus ravennae))、狗尾草(Setaria viridis)、墨西哥玉米(Zea mayssubsp.mexicana)、小米(Setaria italica)和薏該(Coix lacryma-jobi)的基因組 DNA 鑒別和分離出新的泛素轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)元件組(EXP)序列。
[0101]從以上的各個(gè)物種中確定泛素I轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物序列。將各個(gè)泛素I轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5’非翻譯區(qū)(5’UTR)用于設(shè)計(jì)引物以擴(kuò)增用于確認(rèn)的泛素基因的相應(yīng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其包含啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列(5’UTR)和可操作地連接的第一內(nèi)含子。引物用于按照制造商的方案構(gòu)建的 GenomeWalker?(Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA)文庫(kù)以克隆相應(yīng)的基因組DNA序列的5’區(qū)。使用與玉米(Zea mays)的泛素4、6和7基因同源的公共序列，也從單子葉植物高粱(Sorghum bicolor)分離泛素轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。
[0102]使用鑒定的序列，進(jìn)行了生物信息學(xué)分析來(lái)鑒定擴(kuò)增的DNA中的調(diào)控元件。使用該分析的結(jié)果，在DNA序列內(nèi)限定調(diào)控元件并且設(shè)計(jì)引物來(lái)擴(kuò)增調(diào)控元件。使用標(biāo)準(zhǔn)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件，用含有獨(dú)特限制酶位點(diǎn)和從大須芒草(A.gerardii)、沙生蔗茅(S.ravennae)、狗尾草(S.viridis)、墨西哥玉米(Z.mays subsp.mexicana)、小米(S.1talica)、薏該(C.lacryma-jobi)和高粱(S.bicolor)分離的基因組DNA的引物來(lái)擴(kuò)增用于各個(gè)調(diào)控元件的相應(yīng)DNA分子。將所得到的DNA片段連接至基礎(chǔ)植物表達(dá)載體中并且測(cè)序。然后使用轉(zhuǎn)化的植物原生質(zhì)體進(jìn)行調(diào)控元件TSS和內(nèi)含子/外顯子剪接點(diǎn)的分析。簡(jiǎn)而言之，用包含可操作地連接異源可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的克隆DNA片段的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，并通過(guò)分析由此產(chǎn)生的mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的序列，將用于cDNA端快速擴(kuò)增的5’ RACE 系統(tǒng)，版本 2.0 (Invitrogen, Carlsbad, California92008)用于證實(shí)調(diào)控兀件 TSS和內(nèi)含子/外顯子剪接點(diǎn)。
[0103]鑒定的轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)元件組(“EXP”)的序列本文中作為SEQ ID NO =1,5,8,10,12，14，16，18，22，25，27，29，31，33，37，39，41，45，49，53，55，59，63，65，69，73，75，77，79，83，85，87，90，93，95，97，98，99，100，102，104，106，108，110，112，114，115，116，117，119，121，123，124，125，126，128，130，132，133，134，136，137，139，141，143，145，147，149，151，153，155，157，180，181和183提供，如以下表1中所示。啟動(dòng)子序列本文中作為SEQ ID NO:2，6，9，11，13，15，17，19，23，26，28，30，32，34，38，40，42，46，50，56，60，64，66，70，74，76，78，80，84，86，88，91，96 和 135 提供。前導(dǎo)序列本文中作為 SEQ ID NO:3，20，35，43，47，51，57，61，67，71 和 81 提供 。內(nèi)含子序列本文中作為 SEQ ID NO:4，7，21，24，36，44，48，52，54，58，62，68，72，82，92，94，101，103，105，107，109，111，113，118，120，122，127，129，131，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158 和 182 提供。增強(qiáng)子序列作為 SEQ ID NO:89提供。
【權(quán)利要求】
1.一種DNA分子,其包含選自以下的DNA序列:a)與SEQID NO:1-158和180-183中任一個(gè)具有至少85%序列同一性的序列； b)包含SEQID NO:1-158和180-183中任一個(gè)的序列；和c)SEQID NO:1-158和180-183中任一個(gè)的片段，其中該片段具有基因調(diào)控活性； 其中所述序列可操作地與異源可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子連接。
2.權(quán)利要求1的DNA分子，其中所述序列與SEQID NO:1-158和180-183中任一個(gè)的DNA序列具有至少90%序列同一性。
3.權(quán)利要求1的DNA分子，其中所述序列與SEQID NO:1-158和180-183中任一個(gè)DNA序列具有至少95%序列同一性。
4.權(quán)利要求1的DNA分子，其中所述DNA序列包含基因調(diào)控活性。
5.權(quán)利要求1的DNA分子，其中所述異源可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子包含具有農(nóng)藝學(xué)意義的基因。
6.權(quán)利要求5的DNA分子，其中所述具有農(nóng)藝學(xué)意義的基因賦予植物除草劑耐受性。
7.權(quán)利要求5的DNA分子，其中具有農(nóng)藝學(xué)意義的基因賦予植物抗蟲性。
8.一種包含異源DNA分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，所述DNA分子包含選自以下的序列:a)與SEQID NO:1-158和1 80-183中任一個(gè)具有至少85%序列同一性的序列； b)包含SEQID NO:1-158和180-183中任一個(gè)的序列；和c)SEQID NO:1-158和180-183中任一個(gè)的片段，其中該片段具有基因調(diào)控活性； 其中所述序列可操作地與異源可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子連接。
9.權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞是單子葉植物細(xì)胞。
10.權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞是雙子葉植物細(xì)胞。
11.一種轉(zhuǎn)基因植物或其部分，包含權(quán)利要求1的DNA分子。
12.權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)基因植物的后代植物或其部分，其中所述后代植物或其部分包含所述DNA分子。
13.一種轉(zhuǎn)基因種子，其中所述種子包含權(quán)利要求1的DNA分子。
14.一種生產(chǎn)商品的方法，包括獲得根據(jù)權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)基因植物或其部分并從其生產(chǎn)所述商品。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述商品是蛋白質(zhì)濃縮物、蛋白質(zhì)分離物、籽粒、淀粉、種子、粗粉、面粉、生物質(zhì)或種子油。
16.—種商品,其包含權(quán)利要求1的DNA分子。
17.權(quán)利要求16的商品，其中所述商品是蛋白質(zhì)濃縮物、蛋白質(zhì)分離物、籽粒、淀粉、種子、粗粉、面粉、生物質(zhì)或種子油。
18.—種表達(dá)可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的方法，包括獲得根據(jù)權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)基因植物并栽培所述植物，其中所述可轉(zhuǎn)錄多核苷酸被表達(dá)。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK103534267SQ201280023321
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2012年3月21日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月25日
【發(fā)明者】S·弗拉辛斯基 申請(qǐng)人:孟山都技術(shù)公司