編碼胞嘧啶脫氨酶的雙向選擇標記物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種編碼胞嘧啶脫氨酶的雙向選擇標記物，以及使用該標記物的方法。
【專利說明】編碼胞嘧啶脫氨酶的雙向選擇標記物
[0001]對序列表的引用
[0002]本申請含有計算機可讀形式的序列表。該計算機可讀形式通過引用的方式并入本文。
【技術領域】
[0003]本發(fā)明涉及編碼胞嘧啶脫氨酶的雙向選擇標記物以及使用該標記物的方法。
【背景技術】
[0004]在分子生物學中對于新的工具有著持續(xù)的需求，即便是簡單的工具例如新的選擇標記物即處于需要中，特別是適合用于絲狀真菌宿主細胞的雙向標記物。
[0005]胞嘧啶脫氨酶(EC 3.5.4.1)催化胞嘧啶和5_氟胞嘧啶(5FC)的脫氨，以分別形成尿嘧啶和有毒的5-氟尿嘧啶(5FU)。當遺傳修飾的包含胞嘧啶脫氨酶的細胞與5FC混合時，5FC轉化為毒性5FU，因此編碼胞嘧啶脫氨酶的基因是潛在的且有效的陰性選擇標記物。
[0006]已經(jīng)顯示出，嘧啶的從頭合成通路中的抑制劑可以用來創(chuàng)建一種條件，其中細胞依賴于嘧啶補充物經(jīng)由胞嘧啶脫氨酶到尿嘧啶的轉化。因此，在陽性選擇培養(yǎng)基中，僅有表達胞嘧啶脫氨酶基因的細胞 可以獲救(Wei and Huber, 1996, J Biol Chem271 (7):3812)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]在第一個方面，本發(fā)明提供一種分離的編碼具有胞嘧啶脫氨酶活性的多肽的多核苷酸，該多肽選自:
[0008](a)與SEQ ID NO: 60的多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列同一1丨生的多肽；
[0009](b)由在中等嚴格條件、中高度嚴格條件、高度嚴格條件或極高度嚴格條件下與(i)SEQ ID N0:59的多肽編碼序列、(ii)其cDNA序列、或(iii) (i)或(ii)的全長互補物進行雜交的多核苷酸所編碼的多肽；
[0010](C)由與SEQ ID NO:59的多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的多核苷酸所編碼的多肽；
[0011](d)SEQ ID NO:60的多肽在一個或多個位置處包含替換、缺失和/或插入的變體；以及
[0012](e)具有胞嘧啶脫氨酶活性的(a)、(b)、(c)或(d)多肽的片段。
[0013]在第二個方面，本發(fā)明涉及一種核酸構建體或表達載體，包含與一個或多個控制序列可操作地連接的第一個方面的多核苷酸，其中該控制序列在表達宿主細胞中介導胞嘧啶脫氨酶多肽的產(chǎn)生。
[0014]本發(fā)明的第三個方面是使用第一個方面的多核苷酸作為陰性選擇標記物的方法，包括以下步驟:
[0015](a)提供包含一個或多個第一個方面的編碼胞嘧啶脫氨酶的多核苷酸的宿主細胞；
[0016](b)用整合性核酸構建體轉化宿主細胞，其中該構建體在位點特異性地整合到宿主基因組中時，使至少一個編碼胞嘧啶脫氨酶的多核苷酸失活，從而與步驟(a)的宿主細胞相比，所得的宿主細胞產(chǎn)生較少的胞嘧啶脫氨酶或不產(chǎn)生胞嘧啶脫氨酶；
[0017](C)在包含足量5-氟胞嘧啶的選擇性介質(zhì)中培養(yǎng)所轉化的宿主細胞，其中5-氟胞嘧啶經(jīng)由胞嘧啶脫氨酶轉化成抑制性濃度的毒性5-氟尿嘧啶；以及
[0018](d)選擇能夠在選擇性介質(zhì)中生長并具有降低的或不可測出的胞嘧啶脫氨酶活性的所得宿主細胞。
[0019]在第四個方面，本發(fā)明涉及一種使用第一個方面的多核苷酸或第二個方面的核酸構建體或表達載體作為陽性選擇標記物的方法，包括以下步驟:
[0020](a)提供不具有可測出的胞嘧啶脫氨酶活性的宿主細胞；
[0021](b)用包含至少一個可表達的第一個方面的編碼胞嘧啶脫氨酶的多核苷酸的核酸構建體來轉化宿主細胞；
[0022](C)在有益于胞嘧啶脫氨酶的表達的條件下，在包含嘧啶從頭合成抑制劑以及肌苷和胞嘧啶的介質(zhì)中，培養(yǎng)所轉化的宿主細胞；以及
[0023](d)選擇生長中的包含至少一個編碼胞嘧啶脫氨酶的多核苷酸的宿主細胞。
[0024]本發(fā)明的一個方面涉`及一種制備親本宿主細胞的突變體的方法，包括使第一個方面的多核苷酸失活，得到生產(chǎn)出比親本細胞少的所編碼胞嘧啶脫氨酶多肽的突變體。
[0025]本發(fā)明的另一方面涉及一種重組宿主細胞，其包含至少一個染色體整合的第一個方面的多核苷酸，該多核苷酸與一個或多個介導所編碼的胞B密唳脫氨酶的產(chǎn)生的控制序列可操作地連接。
[0026]本發(fā)明的最后一個方面涉及在第一方面中定義的多核苷酸或者在第二方面中定義的核酸構建體或載體作為微生物轉化過程中的選擇標記物的用途，其中將目標多核苷酸轉化到合適的微生物宿主細胞中，然后微生物宿主細胞在陽性或陰性選擇壓力的條件下培養(yǎng)，來選擇該選擇標記物的存在或不存在。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1示出以pyrG作為雙向選擇標記物而示例的實驗中的FRT/FLP系統(tǒng)的基本方案。
[0028]圖2 示出 pHUda981 的質(zhì)粒圖譜(Pgpd、HSVltk, TtrpC 如 W007045248 中所述)。
[0029]圖3示出pHUdal019的質(zhì)粒圖譜。
[0030]圖4示出pHUdalOOO的質(zhì)粒圖譜。
[0031]圖5示出將pHUdalOOO正確引入NN059183中之后的示意性NAl (上)和酸穩(wěn)定性淀粉酶基因座(下)。
[0032]圖6示出pHUda801的質(zhì)粒圖譜。
[0033]圖7示出pHUdal043的質(zhì)粒圖譜。
[0034]圖8示出pHUdal078的質(zhì)粒圖譜。[0035]圖9示出pHUdal067的質(zhì)粒圖譜。
[0036]圖10示出NN059208中的示意性NAl基因座(上)、NA2基因座(中)和酸穩(wěn)定性淀粉酶基因座(下)。
[0037]圖11示出pRikal47的質(zhì)粒圖譜。
[0038]圖12示出將pRikal47正確整合到NN059208之后的示意性NAl (上)、NA2 (中)和酸穩(wěn)定性淀粉酶基因座(下)。
【具體實施方式】
[0039]定義
[0040]胞嘧啶脫氨酶:胞嘧啶脫氨酶(EC3.5.4.1)催化胞嘧啶和5_氟胞嘧啶(5FC)的脫氨，以分別形成尿嘧啶和有毒的5-氟尿嘧啶(5FU)。當遺傳上修飾的包含胞嘧啶脫氨酶的細胞與5FC混合時，5FC轉化為有毒5FU，從而編碼胞嘧啶脫氨酶的基因潛在地為有效的陰性選擇標記物。
[0041]已經(jīng)顯示出，嘧啶的從頭合成通路中的抑制劑可以用來創(chuàng)建一種條件，其中細胞依賴于經(jīng)由胞嘧啶脫氨酶的嘧啶補充物到尿嘧啶的轉化。因此，在陽性選擇培養(yǎng)基中，僅有表達胞嘧啶脫氨酶基因的細胞能夠在包含嘧啶從頭合成抑制劑以及肌苷和胞嘧啶的陽性選擇介質(zhì)中獲救(參見Wei and Huber, 1996, J Biol Chem271 (7):3812中的圖1)。抑制劑優(yōu)選為N-(膦乙酰基)-L-天冬氨酸(PALA)，其抑制天冬氨酸氨甲酰轉移酶。
[0042]如果必要，胞嘧啶脫氨酶活性可以通過遺傳檢定進行定量(Frederico L.A.等人，1990,Biochemistry29:2532-2537)。
[0043]等位基因變體:術語 “等位基因變體”是指占據(jù)相同染色體基因座的基因的任意兩種或更多種可替代形式。等位基因變異通過突變而自然產(chǎn)生，并且可以引起種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在所編碼的多肽中沒有變化)，或者可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體所編碼的多肽。
[0044]催化結構域:術語“催化結構域”是指包含酶的催化體系的酶區(qū)域。
[0045]cDNA:術語“cDNA”是指可以從得自真核細胞或原核細胞的成熟的、已剪接的mRNA分子通過逆轉錄而制備出的DNA分子。cDNA缺少存在于相應基因組DNA中的內(nèi)含子序列。在呈現(xiàn)為成熟的已剪接的mRNA之前，最初的初級RNA轉錄本是通過一系列步驟包括剪接進行加工的mRNA的前體。
[0046]編碼序列:術語“編碼序列”是指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。編碼序列的邊界通常由開放閱讀框決定，通常起始于例如ATG、GTG或TTG的起始密碼子，并結束于例如TAA、TAG或TGA的終止密碼子。編碼序列可以是基因組DNA、cDNA、合成DNA或其組
八
口 ο
[0047]控制序列:術語“控制序列”是指編碼本發(fā)明成熟多肽的多核苷酸進行表達所必需的核酸序列。各個控制序列對于編碼多肽的多核苷酸可以是內(nèi)源的(即來自相同基因)或外源的(即來自不同基因)，或彼此是內(nèi)源的或外源的。這些控制序列包括，但不限于，前導序列、多腺苷酸序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉錄終止子。在最低的程度，控制序列包含啟動子以及轉錄和翻譯終止信號。為引入能促進控制序列與編碼多肽的多核苷酸編碼區(qū)進行連接的特異性酶切位點，控制序列可以設有接頭。[0048]表達:術語“表達”包括任何參與多肽產(chǎn)生中的步驟，包括，但不限于，轉錄、轉錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。
[0049]表達載體:術語“表達載體”是指包含編碼多肽的多核苷酸并與為其表達而提供的控制序列可操作地連接的線性或環(huán)狀DNA分子。
[0050]片段:術語“片段”是指成熟多肽或結構域的氨基端和/或羧基端缺失一個或多個(例如數(shù)個)氨基酸的多肽或催化結構域；其中片段具有胞嘧啶脫氨酶活性。
[0051]宿主細胞:術語“宿主細胞”是指任何對轉化、轉染和轉導等敏感并具有包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構建體或表達載體的細胞類型。術語“宿主細胞”包括由于在復制過程中發(fā)生突變而與親本細胞不同的親本細胞的任何子代。 [0052]分離的或純化的:術語“分離的”或“純化的”是指從與其天然相關的至少一種成分中移除的多肽或多核苷酸。例如，多肽可以為至少1%純，例如，至少5%純、至少10%純、至少20%純、至少40%純、至少60%純、至少80%純、至少90%純或至少95%純，如SDS-PAGE所測定的，并且多核苷酸可以為至少1%純，例如，至少5%純、至少10%純、至少20%純、至少40%純、至少60%純、至少80%純、至少90%純或至少95%純，如瓊脂糖電泳所測定的。
[0053]核酸構建體:術語“核酸構建體”是指單鏈或雙鏈的核酸分子，其從天然存在的基因中分離出，或者以自然界不存在的方式修飾成含有核酸片段，或者是合成的，包含一個或多個控制序列。
[0054]可操作地連接:術語“可操作地連接”是指一種結構，其中，相對于多核苷酸的編碼序列，控制序列位于適當?shù)奈恢锰?，使得控制序列可以介導編碼序列的表達。
[0055]序列同一性:兩個氨基酸序列之間或者兩個核苷酸序列之間的相關性通過參數(shù)“序列同一性”來描述。出于本發(fā)明的目的，使用在EMBOSS軟件包(EMBOSS:The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite (歐洲分子生物學開放軟件包)，Rice 等人，2000，Trends Genet.16:276-277)(優(yōu)選5.0.0或更新版本)的Needle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch 算法(Needleman and Wunsch, 1970，J.Mol.Biol.48:443-453),來確定兩個氨基酸序列之間的序列同一性。所使用的參數(shù)是，空位開放罰分為10，空位擴展罰分為0.5，以及EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本)替換矩陣。Needle標記的“最長同一性”的輸出(使用-nobrief選項得到的)被用作百分比同一性并計算如下:
[0056](相同殘基X100) / (比對長度-比對中的空位總數(shù))。
[0057]出于本發(fā)明的目的，使用在EMBOSS軟件包(EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite (歐洲分子生物學開放軟件包)，Rice等人，2000,同上)(優(yōu)選5.0.0或更新版本)的Needle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman andWunsch, 1970，同上)，來確定兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的序列同一性。所使用的參數(shù)是，空位開放罰分為10，空位擴展罰分為0.5，以及EDNAFULUNCBI NUC4.4的EMBOSS版本)替換矩陣。Needle標記的“最長同一性”的輸出(使用-nobrief選項得到的)被用作百分比同一性并計算如下:
[0058](相同的脫氧核糖核苷酸X100) / (比對長度-比對中的空位總數(shù))。
[0059]子序列:術語“子序列”是指有一個或多個(例如數(shù)個)核苷酸從成熟多肽編碼序列的5’端和/或3’端缺失的多核苷酸；其中子序列編碼具有胞嘧啶脫氨酶活性的片段。
[0060]變體:術語“變體”是指在一個或多個位置處包含一個或多個(例如數(shù)個)氨基酸殘基的變更，即替換、插入和/或缺失并具有胞嘧啶脫氨酶活性的多肽。替換是指將占據(jù)一個位置的氨基酸替換為不同的氨基酸；缺失是指去除占據(jù)一個位置的氨基酸；以及插入是指緊鄰占據(jù)一個位置的氨基酸來增加氨基酸。
[0061]本發(fā)明的第一個方面涉及一種分離的編碼具有胞嘧啶脫氨酶活性的多肽的多核苷酸，該多肽選自:
[0062](a)與SEQ ID NO: 60的多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列同一1丨生的多肽；
[0063](b)由在中等嚴格條件、中高度嚴格條件、高度嚴格條件或極高度嚴格條件下與(i)SEQ ID N0:59的多肽編碼序列、(ii)其cDNA序列、或(iii) (i)或(ii)的全長互補物進行雜交的多核苷酸所編碼的多肽；
[0064](c)由與SEQ ID NO: 59的多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的多核苷酸所編碼的多肽；
[0065](d) SEQ ID NO:60表示的多肽在一個或多個位置處包含替換、缺失和/或插入的變體；以及
[0066](e)具有胞嘧啶脫氨酶活性的(a)、(b)、(C)或(d)多肽的片段。
[0067]在一個實施方式中，本發(fā)明涉及一種分離的編碼胞嘧啶脫氨酶多肽的多核苷酸，該多肽與SEQ ID NO: 60具有至少60%，例如，至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性。在一方面，多肽與SEQ ID NO: 60的區(qū)別不多于十個氨基酸，例如，九個氨基酸、八個氨基酸、七個氨基酸、六個氨基酸、五個氨基酸、四個氨基酸、三個氨基酸、兩個氨基酸或一個氨基酸。
[0068]本發(fā)明的所編碼的胞嘧啶脫氨酶多肽優(yōu)選地包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列或其等位基因變體，或由SEQ ID NO:60的氨基酸序列或其等位基因變體組成；或者是其具有胞嘧啶脫氨酶活性的片段。在另一方面，多肽包含SEQ ID NO:60的多肽，或由SEQ ID NO:60的多肽組成。
[0069]在另一實施方式中，本發(fā)明涉及一種分離的編碼胞嘧啶脫氨酶多肽的多核苷酸，該胞嘧啶脫氨酶多肽由在非常低等嚴格條件、低等嚴格條件、中等嚴格條件、中高度嚴格條件、高度嚴格條件或極高度嚴格條件下與(i) SEQ ID N0:59的多肽編碼序列、(ii)其cDNA序列、或(iii) (i)或(ii)的全長互補物進行雜交的多核苷酸所編碼(Sambrook等人，1989，Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor, NewYork)。
[0070]SEQ ID NO:59表示的多核苷酸或其子序列，以及SEQ ID N0:60表示的多肽或其片段可以用于設計核酸探針，以根據(jù)本領域公知的方法從不同屬或種的菌株中識別并克隆出對具有胞嘧啶脫氨酶活性的多肽進行編碼的DNA。具體而言，遵循標準DNA印跡法，這些探針可以用于與目標細胞的基因組DNA或cDNA雜交，以識別并分離其中的相應基因。這些探針可以顯著短于整個序列，但是長度應當至少為15個核苷酸，例如，至少25個、至少35個或至少70個核苷酸。優(yōu)選地，核酸探針的長度為至少100個核苷酸，例如，長度為至少200個核苷酸、至少300個核苷酸、至少400個核苷酸、至少500個核苷酸、至少600個核苷酸、至少700個核苷酸、至少800個核苷酸或至少900個核苷酸。DNA和RNA探針均可以使用。通常對探針進行標記，用以檢測相應的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白進行標記)。這些探針均包含在本發(fā)明中。
[0071]可以對由這些其他菌株制備的基因組DNA或cDNA文庫篩選與上述探針雜交并對具有胞嘧啶脫氨酶活性的多肽進行編碼的DNA。來自這些其他菌株的基因組或其他DNA可以通過瓊脂糖電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他分離技術來分離。來自文庫的DNA或分離的DNA可以轉移至并固定在硝化纖維素或其他合適的載體材料上。為識別與SEQ ID NO: 59或其子序列同源的克隆或DNA，載體材料優(yōu)選用在DNA印跡中。
[0072]出于本發(fā)明的目的，雜交表示，在非常低至非常高的嚴格條件下，多核苷酸與對應于⑴SEQ ID N0:59 ；(ii)SEQ ID NO: 59的多肽編碼序列；(iii )其cDNA序列；(iv)其全長互補物；或(0其子序列的所標記核酸探針進行雜交。在這些條件下與核酸探針雜交的分子可以使用例如X光膠片進行檢測。
[0073]對于長度為至少100個核苷酸的探針，非常低等嚴格條件定義為:在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和25%甲酰胺中于42°C預雜交和雜交，遵循標準DNA印跡法步驟進行12~24小時為最佳。最后，在45°C下使用2XSSC、0.2%SDS將載體材料洗滌3次，每次15分鐘。
[0074]對于長度為至少100個核苷酸的探針來說，低等嚴格條件定義為:在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和25%甲酰胺中于42°C預雜交和雜交，遵循標準DNA印跡法步驟進行12~24小時為最佳。最后，在50°C下使用2XSSC、0.2%SDS將載體材料洗滌3次，每次15分鐘。
[0075]對于長度為至少100個核苷酸的探針來說，中等嚴格條件定義為:在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和35%甲酰胺中于42°C預雜交和雜交，遵循標準DNA印跡法步驟進行12~24小時為最佳。最后，在55°C下使用2XSSC、0.2%SDS將載體材料洗滌3次，每次15分鐘`。
[0076]對于長度為至少100個核苷酸的探針來說，中高度嚴格條件定義為:在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和35%甲酰胺中于42°C預雜交和雜交，遵循標準DNA印跡法步驟進行12~24小時為最佳。最后，在60°C下使用2XSSC、0.2%SDS將載體材料洗滌3次，每次15分鐘。
[0077]對于長度為至少100個核苷酸的探針來說，高度嚴格條件定義為:在5XSSPE、
0.3%SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和50%甲酰胺中于42°C預雜交和雜交，遵循標準DNA印跡法步驟進行12~24小時為最佳。最后，在65°C下使用2XSSC、0.2%SDS將載體材料洗滌3次，每次15分鐘。
[0078]對于長度為至少100個核苷酸的探針來說，極高度嚴格條件定義為:在5XSSPE、
0.3%SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和50%甲酰胺中于42°C預雜交和雜交，遵循標準DNA印跡法步驟進行12~24小時為最佳。最后，在70°C下使用2XSSC、0.2%SDS將載體材料洗滌3次，每次15分鐘。
[0079]在另一實施方式中，本發(fā)明涉及一種分離的編碼胞嘧啶脫氨酶的多核苷酸，該多核苷酸與SEQ ID NO: 59的多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少60%，例如，至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性。
[0080] 在另一實施方式中，本發(fā)明涉及一種分離的對在一個或多個(例如數(shù)個)位置處包含替換、缺失和/或插入的SEQ ID N0:60的胞嘧啶脫氨酶多肽的變體進行編碼的多核苷酸。優(yōu)選地，氨基酸改變極少涉及性質(zhì)，即，不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的保守氨基酸替換或插入；小的缺失，通常為I~約30個氨基酸；小的氨基端或羧基端延伸，例如氨基端的甲硫氨酸殘基；至多約20~25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其他功能而促進純化的小的延伸，例如多組氨酸序列(polyhistidine tract)、抗原表位或結合結構域。
[0081]保守替換的例子是在堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)的組內(nèi)。通常不改變特定活性的氨基酸替換為本領域已知，并例如在
H.Neurath and R.L.Hill, 1979年，In, The Proteins, Academic Press, New York 中有過描述。常見的替換是 Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 和 Asp/Gly。
[0082]或者，氨基酸變化的性質(zhì)是，改變多肽的物化特性。例如，氨基酸變化可以改善多肽的熱穩(wěn)定性、改變底物特異性、改變最佳PH等。
[0083]多肽中的必需氨基酸可以根據(jù)本領域已知的方法進行識別，例如點誘變或丙氨酸掃描變異(Cunningham and Wells, 1989，Science244:1081-1085)。在后一種技術中，在分子的各個殘基處引入單個丙氨酸突變，并且對所得的突變分子進行胞嘧啶脫氨酶活性的測試，以識別出對于分子活性重要的氨基酸殘基。也請參見Hilton等人，1996，J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶或其他生物相互作用的活性位點也可以通過結構的物理分析來確定，如通過例如核磁共振、晶體學、電子衍射或光親和標記的技術，并結合推定的接觸位點氨基酸的突變來確定。參見，例如，de Vos等人，1992，Science255:306-312 ;Smith等人，1992, J.Mol.Biol.224:899-904 ;Wlodaver 等人，1992, FEBS Lett.309:59-64。必需氨基酸的識別也可以從與相關多肽的比對來進行推斷。
[0084]使用已知的突變、重組和/或改組方法，然后通過相關的篩選步驟，例如由Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science241:53-57 ；Bowie and Sauer,1989, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:2152-2156 ；W0 95/17413 ;或冊 95/22625 公開的那些，可以進行單個或多個氨基酸的替換、缺失和/或插入，并對其進行測試。其他可以使用的方法包括易錯PCR、卩遼菌體展不(例如，Lowman等人，1991，Biochemistry30:10832-10837 ;美國專利第5，223，409 號；W0 92/06204)和區(qū)域定向誘變(Derbyshire 等人，1986，Gene46:145 ;Ner 等人，1988，DNA7:127)
[0085]誘變/改組方法可以與高通量自動篩選方法組合，以檢測由宿主細胞表達的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness等人，1999, Nature Biotechnologyl7:893-896)。編碼活性多肽的誘變DNA分子可以使用本領域標準方法從宿主細胞中回收，并快速測序。這些方法使得可以迅速確定多肽中單個氨基酸殘基的重要性。[0086]在一個實施方式中，引入到SEQ ID NO:60多肽中的氨基酸替換、缺失和/或插入的數(shù)目不多于10個，例如，1、2、3、4、5、6、7、8或9個。多肽可以是一種多肽的區(qū)域融合在另一多肽區(qū)域的N-端或C-端的雜交多肽。
[0087]在最后的方面，本發(fā)明涉及一種重組宿主細胞，包含至少一個染色體整合的根據(jù)第一個方面的多核苷酸，該多核苷酸與一個或多個介導所編碼的胞嘧啶脫氨酶的產(chǎn)生的控制序列可操作地連接。
[0088]具有胞嘧啶脫氨酶活性的多肽的來源
[0089]本發(fā)明的對具有胞嘧啶脫氨酶活性的多肽進行編碼的多核苷酸可以得自任何屬的微生物。出于本發(fā)明的目的，本文中與指定來源結合使用的術語“得自”是指，由多核苷酸所編碼的多肽由已經(jīng)插入有該來源的多核苷酸的來源或菌株所產(chǎn)生。
[0090]胞嘧啶脫氨酶多肽可以是真菌多肽。例如，多肽可以是酵母多肽，例如假絲酵母屬(Candida)、克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces )、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或耶羅威亞酵母屬(Yarrowia)多肽；或者絲狀真菌多肽，例如枝頂孢屬(Acremonium)、傘菌屬(Agaricus)、鏈格孢屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、葡萄座腔菌(Botryospaeria)、擬錯菌屬(Ceriporiopsis)、毛 _ 殼屬(Chaetomidium)、金孢屬(Chrysosporium)、麥角菌屬(Claviceps)、旋孢腔菌屬(Cochliobolus)、擬鬼傘屬(Coprinopsis)、乳白蟻屬(Coptotermes)、棒囊殼(Corynascus)、隱叢赤殼屬(Cryphonectria)λ 隱球菌屬(Cryptococcus)、色二抱屬(Diplodia)、黑耳屬(Exidia)、線黑粉酵母屬(Filibasidium)、鐮孢菌屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、全鞭毛蟲屬(Holomastigotoides)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、把齒菌屬(Irpex)、香燕屬(Lentinula)、小球腔菌屬(Leptospaeria)、巨座殼屬(Magnaporthe)、Melanocarpus、亞灰樹花菌屬(Meripilus)、毛菌霉(Mucor)、毀絲菌屬(Myceliophthora)、新美鞭菌屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉菌屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)Λ 梨囊鞭菌屬(Piromyces)、Poitrasia、假暗盤菌屬(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉屬(Rhizomucor)、裂糟菌屬(SchizophylIum)、節(jié)格孢屬(Scytalidium)、籃狀菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭抱殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、木霉屬(Trichoderma)、長毛盤菌屬(Trichophaea)、輪枝孢屬(Verticillium)、小包腳燕屬(Volvariella)或炭角菌屬(Xylaria)多肽。
[0091]在另一方面，多妝是卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomycesdouglasi1、克魯維酵母(Saccharomyces kluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)或 Saccharomyces oviformis 多月太。
[0092]在另一方面，多肽為解纖維枝頂孢霉(Acremonium celIulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori )、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、Chrysosporium inops、 嗜毛金色抱(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、類狀金抱(Chrysosporium merdarium)、Chrysosporiumpannicola、Chrysosporium queenslandicum、熱帶金抱菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium zonatum、桿抱狀德抱(Fusarium bactridioides)、谷類德抱(Fusariumcereal is)、克魯克威爾德抱菌(Fusarium crookwellense)、黃色德抱菌(Fusariumculmorum)、禾谷德刀菌(Fusarium graminearum)、禾赤德抱(Fusarium graminum)、異抱德抱(Fusarium heterosporum)、合歡木德抱(Fusarium negundi)、尖德抱菌(Fusarium oxysporum)、多枝德抱(Fusarium reticulatum)、粉紅德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusarium sambucinum)、膚色德抱(Fusarium sarcochroum)、擬枝抱德抱菌(Fusarium sporotrichioides)、硫色德抱(Fusarium sulphureum)、圓德抱(Fusarium torulosum)、擬絲抱德抱(Fusarium trichothecioides)、德抱霉(Fusariumvenenatum)、灰腐質(zhì)霉(Humicola grisea)、特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)、柔毛腐質(zhì)霉(Humicola lanuginosa)、白囊奉巴齒菌(Irpex lacteus)、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)、粗糖脈胞菌(Neurospora crassa)、繩狀青霉(Penicillium funiculosum)、產(chǎn)紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黃抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、無色梭抱殼(Thielavia achromatica)、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭抱殼(Thielavia australeinsis)、Thielavia fimet1、小抱梭抱殼(Thielavia microspora)、卵抱梭抱殼(Thielaviaovispora) λ Thielavia peruviana、毛梭抱殼(Thielavia setosa)、瘤抱梭抱殼(Thielaviaspededonium)、耐熱梭抱殼(Thielavia subthermophila)、太瑞斯梭抱殼(Thielaviaterrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康氏木霉(Trichoderma koningii )、長梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或綠色木霉(Trichoderma viride)多妝。[0093]應當理解，對于前述物種，本發(fā)明包括完好和不完好的狀態(tài)，以及其他的分類學等同物，例如無性型，無論它們被知曉的物種名是什么。
[0094]本領域技術人員將容易地識別出適當?shù)牡韧锏纳矸荨＿@些物種的菌株很容易從若干培養(yǎng)物保藏中公開取得，例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)、德國國家菌種保藏中心(DSMZ)、荷蘭菌種保藏中心(CBS)和農(nóng)業(yè)研究服務專利保藏中心北區(qū)研究中心(NRRL)。
[0095]多肽可以使用前述探針從包括分離于自然界(例如，土壤、堆肥、水等)的微生物的其他來源處進行識別并獲得。用于從天然棲息地分離微生物的技術為本領域公知。然后可以通過類似地篩選另一微生物或DNA混合樣本的基因組DNA或cDNA文庫，得到編碼多肽的多核苷酸。一旦使用探針檢測到編碼多肽的多核苷酸，多核苷酸可以釆用本領域普通技術人員公知的技術來分離或克隆(參見，例如，Sambrook等人，1989，同上)。
[0096]核酸構建體
[0097]在第二個方面，本發(fā)明還涉及核酸構建體或表達載體，包含與一個或多個介導胞嘧啶脫氨酶在合適表達宿主中表達的控制序列可操作地連接的第一個方面的多核苷酸。
[0098]多核苷酸可以以多種方式操作，以提供多肽的表達。取決于表達載體，在插入到載體之前對多核苷酸的操作可能是所希望的或必需的。釆用重組DNA方法來修飾多核苷酸的技術為本領域公知。
[0099]控制序列可以是啟動子序列，即被宿主細胞識別以用于表達本發(fā)明所編碼多肽的多核苷酸的多核苷酸。啟動子序列含有介導多肽表達的轉錄調(diào)控序列。啟動子可以是在所選擇的宿主細胞中表現(xiàn)出轉錄活性的任何多核苷酸，包括突變的、截短的和雜交的啟動子，并且可以得自編碼對宿主細胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因。
[0100]合適的用于介導本發(fā)明核酸構建體在絲狀真菌宿主細胞中的轉錄的啟動子例子是得自構巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖異構酶、尖鐮孢菌胰蛋白酶樣蛋白酶(W0 96/00787)、鐮孢霉淀粉葡糖苷酶(W0 00/56900)、鐮孢霉 Daria (W0 00/56900)、鐮孢霉 Quinn (W0 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β -葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶1、里氏木霉纖維二糖水解酶I1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶
I1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶1、里氏木霉木聚糖酶I1、里氏木霉β-木糖苷酶的基因的啟動子，以及NA2-tpi啟動子(來自編碼中性α-淀粉酶的曲霉基因的修飾啟動子，其中非翻譯的前導序列已經(jīng)被編碼磷酸丙糖異構酶的曲霉基因的非翻譯前導序列所取代；非限定性例子包括編碼中性α-淀粉酶的黑曲霉基因的修飾啟動子，其中非翻譯的前導序列已經(jīng)被編碼磷酸丙糖異構酶的構巢曲霉或米曲霉基因的非翻譯前導序列所取代)；以及其突變的、截短的和雜交的啟動子。
[0101]在酵母宿主中，可用的啟動子得自釀酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸酯脫氫酶(ADH1、ADH2/GAP)、釀酒酵母磷酸丙糖異構酶(ΤΡΙ)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUPl)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因。其他可用的酵母宿主細胞的啟動子由Romanos等人，1992，Yeast8:423-488記載。
[0102]控制序列也可以是合適的轉錄終止子序列，其被宿主細胞識別以終止轉錄。終止子序列與編碼多肽的多核苷酸的3’端可操作地連接。任何在所選擇的宿主細胞中起作用的終止子可以用在本發(fā)明中。
[0103]優(yōu)選的用于絲狀真菌宿主細胞的終止子得自構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α -葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖鐮孢菌胰蛋白酶樣蛋白酶的基因。
[0104]優(yōu)選的用于酵母宿主細胞的終止子得自釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸酯脫氫酶的基因。其他可用于酵母宿主細胞的終止子由Romanos等人,1992,同上記載。
[0105]控制序列也可以是合適的前導序列，是對于轉錄時宿主細胞的翻譯較為重要的mRNA的非翻譯區(qū)。前導序列與編碼多肽的多核苷酸的5’端可操作地連接?？梢允褂萌魏卧谒x擇的宿主細胞中起作用的前導序列。
[0106]優(yōu)選的用于絲狀真菌宿主細胞的前導序列得自米曲霉TAKA淀粉酶和構巢曲霉磷酸丙糖異構酶的基因。
[0107]合適的用于酵母宿主細胞的前導序列得自釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α -因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)的基因。
[0108]控制序列也可以是多腺苷酸化序列，即與多核苷酸的3’端可操作地連接并且在轉錄時被宿主細胞識別為在所轉錄的mRNA上添加多腺苷殘基的信號的序列?？梢允褂萌魏卧谒x擇的宿主細胞中起作用的多腺苷酸化序列。
[0109]優(yōu)選的用于絲狀真菌宿主細胞的多腺苷酸化序列得自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合成酶、尖鐮孢菌胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶的基因。
[0110]可用于酵母宿主細胞的多腺苷酸化序列由Guo and Serman, 1995, Mol.CellularBiol.15:5983-5990 記載。
[0111]控制序列也可以是信號肽編碼區(qū)，其編碼與多肽的N端連接的信號肽并介導多肽進入細胞的分泌通路。多核苷酸的編碼序列的5’端可以固有地包含與具有編碼多肽的編碼序列片段的翻譯讀框天然連接的信號肽編碼序列。或者，編碼序列的5’端可以含有對編碼序列外源的信號肽編碼序列。當編碼序列并未天然地包含信號肽編碼序列時，可能需要外源的信號肽編碼序列。或者，外源信號肽編碼序列可以簡單地取代天然信號肽編碼序列，以提高多肽的分泌。但是，可以使用任何介導所表達多肽進入所選擇宿主細胞的分泌途徑的信號肽編碼序列。
[0112]用于絲狀真菌宿主細胞的有效信號肽編碼序列是得自黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V、柔毛腐質(zhì)霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的信號肽編碼序列。
[0113]可用于酵母宿主細胞的信號肽得自釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉化酶的基因。其他可用的信號肽編碼序列由Romanos等人，1992，同上記載。
[0114]控制序列還可以是編碼位于多肽N端的前肽的前肽編碼序列。所得的多肽稱為酶原或多肽原(或在某些情況下為酵素原)。多肽原通常沒有活性，可以從多肽原通過前肽的催化或自催化切割而轉化為活性多肽。
`[0115]當信號肽和前肽序列二者均存在于多肽的N端時，前肽序列的位置緊接著多肽的N端，且信號肽序列的位置緊接著前肽序列的N端。
[0116]添加相對于宿主細胞的生長來調(diào)節(jié)多肽表達的調(diào)控序列也可能是合意的。調(diào)控系統(tǒng)的例子是響應于化學或物理刺激(包括調(diào)控化合物的存在)而引起基因表達的開始或結束的系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)控系統(tǒng)包括lac、tac和trp丨呆縱子系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GALl系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子、米曲霉TAKA α -淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子。調(diào)控序列的其他例子是使得基因擴增的調(diào)控序列。在真核系統(tǒng)中，這些調(diào)控序列包括在氨甲喋呤的存在下擴增的二氫葉酸還原酶基因以及利用重金屬來擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的多核苷酸將與調(diào)控序列可操作地連接。
[0117]在第二個方面的優(yōu)選實施方式中，核酸構建體還包含編碼目標蛋白的多核苷酸，優(yōu)選目標蛋白是酶，優(yōu)選水解酶、異構酶、連接酶、裂解酶、氧化還原酶或轉移酶，例如，氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β_半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、植酸酶、多酹氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉谷氨酰胺酶、木聚糖酶或木糖苷酶。[0118]表汰載體
[0119]本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多核苷酸、啟動子、以及轉錄和翻譯終止信號的重組表達載體。多種核苷酸和控制序列可以結合在一起，以制備可以包含一個或多個方便的限制性內(nèi)切酶位點以使得可以在這些位點處插入或替換編碼多肽的多核苷酸的重組表達載體。或者，可以通過在適當?shù)谋磉_載體內(nèi)插入包含序列的多核苷酸或核酸構建體來表達多核苷酸。在創(chuàng)建表達載體時，編碼序列位于載體中，從而使得編碼序列與用于表達的適當控制序列可操作地連接。
[0120]重組表達載體可以是任何能夠方便地進行重組DNA方法并能夠引起多核苷酸的表達的載體(例如質(zhì)?；虿《?。載體的選擇通常取決于載體與載體將要引入的宿主細胞的相容性。載體可以是線性質(zhì)?；蜷]環(huán)質(zhì)粒。
[0121]載體可以是自主復制的載體，即，作為染色體外實體存在的載體，其復制不依賴于染色體復制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微染色體或人工染色體。載體可以含有任何確保自身復制的工具?；蛘?，載體可以是在引入到宿主細胞時整合到基因組中并與其已經(jīng)整合入的染色體一起復制的載體。而且，可以使用單個載體或質(zhì)粒，或兩個或更多個共同含有將要引入到宿主細胞的基因組中的全DNA的載體或質(zhì)粒。
[0122]載體優(yōu)選包含一個或多個使得可以簡單選擇所轉化的、轉染的、轉導的等細胞的可選擇標記物?？蛇x擇標記物是其產(chǎn)物提供對生物滅殺劑或病毒的耐性、對重金屬的耐性、原養(yǎng)型到營養(yǎng)缺陷型等的基因。
[0123]用于酵母宿主細胞的合適標記物為ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRPl和URA3。用于絲狀真菌宿主細胞的可選擇標記物包括，但不限于，amdS (乙酰胺酶)、argB (鳥氨酸氨甲?；D移酶)、bar (草胺膦乙酰轉移酶)、hph (潮霉素磷酸轉移酶)、niaD (硝酸鹽還原酶)、pyrG (乳清酸核苷-5’ -磷酸脫羧酶)、sC (硫酸腺苷轉移酶)和trpC (鄰氨基苯甲酸合成酶)以及其等同物。優(yōu)選用于曲霉細胞的是構巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus) bar 基因。
[0124]載體優(yōu)選地含有使得載體可以整合到宿主細胞基因組中或使得載體可以在細胞中獨立于基因組而自主復制的元件。
[0125]對于向宿主細胞基因組中的整合，載體可以依賴于多核苷酸的編碼多肽的序列或載體的用于通過同源重組或非同源重組整合到基因組中的任何其他元件。或者，載體可以含有用于介導經(jīng)同源重組在染色體精確位置處整合至宿主細胞的基因組中的其他多核苷酸。為提高在精確位置處整合的可能性，整合元件應當含有充分量的核酸，例如100~10，000個堿基對、400~10，000個堿基對以及800~10，000個堿基對，其與相應的靶標序列具有高度的序列同一性，以提高同源重組的概率。整合元件可以是任何與宿主細胞基因組中的靶標序列同源的序列。而且，整合元件可以是非編碼多核苷酸或編碼多核苷酸。在另一方面，載體可以通過非同源重組整合到宿主細胞的基因組中。
[0126]對于自主復制，載體還可以包含使得載體能夠在所討論的宿主細胞中自主復制的復制起點。復制起點可以是任何在細胞中發(fā)揮作用的介導自主復制的質(zhì)粒復制子。術語“復制起點”或“質(zhì)粒復制子”是指使得質(zhì)?；蜉d體能夠在體內(nèi)復制的多核苷酸。
[0127]用在酵母宿主細胞中的復制起點的例子為2微米的復制起點ARS1、ARS4、ARS1與CEN3的組合以及ARS4與CEN6的組合。[0128]用在絲狀真菌細胞中的復制起點的例子為AMAl和ANSI (Gems等人，1991，Gene98:61-67 ;Cullen 等人，1987，Nucleic Acids Res.15:9163-9175 ；W000/24883)。AMAl基因的分離以及包含該基因的質(zhì)?；蜉d體的構建可以根據(jù)WO 00/24883中公開的方法來完成。
[0129]多于一個拷貝的本發(fā)明多核苷酸可以插入到宿主細胞中，以提高多肽的產(chǎn)生。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可以通過將至少一個額外拷貝的序列整合到宿主細胞基因組中而獲得，或者可以通過包含帶有多核苷酸的可擴增選擇標記物基因而獲得，其中含有擴增拷貝的選擇標記物基因以及額外拷貝的多核苷酸的細胞可以通過在適當選擇試劑的存在下培養(yǎng)細胞而進行選擇。
[0130]用于連接上述元件以構建本發(fā)明的重組表達載體的步驟為本領域技術人員所公知(參見，例如，Sambrook等人，1989,同上)。
[0131]宿主細胞
[0132]在第六個方面，本發(fā)明還涉及重組宿主細胞，其包含至少一個如本發(fā)明第一個方面中定義的染色體整合的多核苷酸，該多核苷酸與一個或多個介導所編碼胞嘧啶脫氨酶的產(chǎn)生的控制序列可操作地連接。
[0133]這些重組宿主細胞適合用包含目標多核苷酸的整合性核酸構建體進行轉化，該目標多核苷酸的兩側為分別與宿主細胞基因組中胞嘧啶脫氨酶基因或者該基因的上下游區(qū)域同源的區(qū)域，該區(qū)域通過位點特異性雙同源重組來介導染色體整合，從而目標多核苷酸整合到宿主細胞的基因組中并且胞嘧啶脫氨酶編碼基因被部分或完全切除，從而失活。原有的胞嘧啶脫氨酶編碼基因的成功失活可以在含有5-氟胞嘧啶的介質(zhì)中進行選擇，其中5-氟胞嘧啶被胞嘧啶脫氨酶轉化成有毒的5-氟尿嘧啶。因此，在這種轉化方法中，胞嘧啶脫氨酶編碼基因起到陰性選擇標記物的作用，如在本發(fā)明第三個方面的方法中所列出的。
[0134]本發(fā)明的第五個方面涉及一種制備親本宿主細胞的突變體的方法，包括使第一個方面的多核苷酸失活，導致突變體產(chǎn)生比親本細胞要少的所編碼胞嘧啶脫氨酶多肽，或者甚至沒有可測出的胞嘧啶脫氨酶活性。沒有可測出的胞嘧啶脫氨酶活性的宿主細胞適合于轉化方法，其中宿主細胞中轉化有含有至少一個第一個方面的可表達胞嘧啶脫氨酶的編碼多核苷酸的核酸構建體，該核酸構建體在之后用作在有利于胞嘧啶脫氨酶的表達的條件下在含有嘧啶從頭合成抑制劑的生長介質(zhì)中的陽性選擇標記物，如本發(fā)明第四個方面所定義的。優(yōu)選地，嘧啶從頭合成抑制劑為N-(膦乙?；?-L-天冬氨酸(PALA)，其抑制天冬氨酸氨甲酰轉移酶。
[0135]術語“宿主細胞”包括親本細胞的由于在復制過程中發(fā)生突變而與親本細胞不同的任何子代。宿主細胞的選擇將在很大程度上取決于編碼多肽的基因及其來源。
[0136]宿主細胞可以是真菌細胞。本文所用的“真菌”包括子囊菌門、擔子菌門、壺菌門和接合菌門(如Hawksworth等人，In, Ainsworth and Bisbyj s Dictionary of The Fungi,第八版，1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK 中所定義)和卵菌門(如Hawksworth等人1995，同上，第171頁所引用的)以及所有的有絲分裂孢子真菌(Hawksworth 等人，1995,同上)。
[0137]真菌宿主細胞可以是酵母細胞。本文所用的“酵母”包括產(chǎn)子囊孢子酵母(內(nèi)孢霉目)、產(chǎn)擔子酵母和屬于半知菌的酵母(芽孢綱)。由于酵母的分類在未來可能會變化，出于本發(fā)明的目的，酵母應當如Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M.and Davenport, R.R., eds, Soc.App.Bacteriol.Symposium SeriesN0.9，1980)中記載般進行定義。
[0138]酵母宿主細胞可以是假絲酵母屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維氏酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或子囊菌酵母屬，例如乳酸克魯維氏酵母(Kluyveromyceslactis)、卡氏酵母、釀酒酵母、糖化酵母、Saccharomyces douglasi1、克魯維酵母、諾地酵母、Saccharomyces oviformis 或解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica)細胞。
[0139]真菌宿主細胞可以是絲狀真菌細胞?！敖z狀真菌”包括真菌門和卵菌門分支的所有絲狀形式(如Hawksworth等人，1995,同上所定義)。絲狀真菌通常的特征在于，由殼質(zhì)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖和其他復合多糖組成的菌絲體壁。營養(yǎng)生長是通過菌絲伸長，碳分解必須是需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營養(yǎng)生長是通過單細胞菌體的出芽，碳分解可以是發(fā)酵性的。
[0140]絲狀真菌宿主細胞可以是枝頂孢屬、曲霉屬、短梗霉屬、黑管菌屬(Bjerkandera)、擬臘霉屬、金孢屬、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬、線黑粉酵母屬、鐮孢菌屬、腐質(zhì)霉屬、巨座殼屬、毛霉屬、毀絲菌屬、新美鞭菌屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、白腐菌屬(Phlebia)、梨囊鞭菌屬、側耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬、籃狀菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬(Trametes)或木霉屬細胞。
[0141]例如，絲狀真菌宿主細胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、煙曲霉、日本曲霉、構巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、煙管菌(Bjerkandera adusta)、干擬臘菌(Ceriporiopsisaneirina)、 Ceriporiopsis caregiea、淺黃擬臘菌(Ceriporiopsis gilvescens)、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、蟲擬臘菌(Ceriporiopsis subvermispora)、Chrysosporium inops、嗜毛金色抱、Chrysosporiumlucknowense、幾狀金抱(Chrysosporium merdarium)、Chrysosporium pannicola、Chrysosporium queenslandicum、熱帶金抱菌、Chrysosporium zonatum、灰蓋鬼傘(Coprinus cinereus)、粗毛云芝(Coriolus hirsutus)、桿孢狀鐮孢、谷類鐮孢、克魯克威爾鐮孢菌、黃色鐮孢菌、禾谷鐮`孢菌、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢菌、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬枝孢鐮孢菌、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鐮孢霉、特異腐質(zhì)霉、柔毛腐質(zhì)霉、米赫毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈胞菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢原毛平革菌、脈射菌(Phlebia radiata)、刺療側耳(Pleurotus eryngii)、太瑞斯梭孢殼、長絨毛栓菌(Trametes villosa)、變色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康氏木霉、長梗木霉、里氏木霉或綠色木霉細胞。
[0142]真菌細胞可以通過涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉化和細胞壁再生的方法以本質(zhì)上已知的方式進行轉化。合適的用于曲霉屬和木霉屬宿主細胞的轉化的方法記載在 EP 238023、Yelton 等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:1470-1474 以及Christensen 等人,1988, Bio/Technology6:1419-1422 中。用于轉化鍵抱菌屬物種的適當方法由Malardier等人，1989，Gene78:147-156和WO 96/00787記載。酵母可以由 Becker and Guarente, In Abelson, J.N.and Simon, Μ.1., editors, Guide to YeastGenetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volumel94, ppl82-187, Academic Press, Inc., New York ；Ito 等人,1983, J.Bacteriol.153:163 ；以及 Hinnen 等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA75:1920 記載的方法來轉化。
[0143]胞嘧啶脫氨酶活性的去除或降低
[0144]在第五個方面，本發(fā)明還涉及制備親本細胞的突變體的方法，其包括使第一個方面的編碼胞嘧啶脫氨酶的多核苷酸或其片段失活、破壞或缺失，導致在相同條件下培養(yǎng)時，與親本細胞相比，突變體細胞產(chǎn)生 更少的所編碼胞嘧啶脫氨酶或不產(chǎn)生所編碼的胞嘧啶脫氨酶。
[0145]突變細胞可以使用本領域公知的方法，例如插入、破壞、取代或缺失，通過減少或消除多核苷酸的表達來進行構建。在優(yōu)選的方面，使多核苷酸失活。將要修飾或失活的多核苷酸可以是，例如，活性所必需的編碼區(qū)或其一部分，或者是編碼區(qū)的表達所需的調(diào)控元件。這種調(diào)控序列或控制序列的例子可以是啟動子序列或其功能部分，即足以影響多核苷酸的表達的部分。其他用于可能的修飾的控制序列包括，但不限于，前導序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、信號肽序列、轉錄終止子和轉錄激活因子。
[0146]多核苷酸的修飾或失活可以通過使親本細胞進行誘變并選擇其中多核苷酸的表達已經(jīng)降低或消除的突變體細胞來進行。例如，可以是特異性的或隨機的誘變，可以通過使用合適的物理或化學誘變劑，通過使用適當?shù)墓押塑账幔蛘咄ㄟ^使DNA序列進行PCR產(chǎn)生的誘變來進行。而且，誘變可以通過使用這些誘變劑的任意組合來進行。
[0147]適用于當前目的的物理或化學誘變劑的例子包括紫外(UV)輻射、羥胺、N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、0-甲基羥胺、亞硝酸、甲基磺酸乙酯(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸和核苷酸類似物。
[0148]當使用這些試劑時，誘變的進行通常是通過將要誘變的親本細胞在適當?shù)臈l件下在所選擇的誘變劑的存在下進行孵育，并篩選和/或選擇表現(xiàn)出降低的基因表達或沒有基因表達的突變細胞。
[0149]多核苷酸的修飾或失活可以通過在基因或其轉錄或翻譯所需的調(diào)控元件中插入、替換或缺失一個或多個核苷酸而進行。例如，可以插入或去除核苷酸，以引起終止密碼子的引入、起始密碼子的去除或開放閱讀框的變化。這些修飾或失活可以根據(jù)本領域已知的方法通過點誘變或PCR產(chǎn)生的誘變而完成。盡管在原則上，修飾可以在體內(nèi)進行，即直接在將要修飾的表達多核苷酸的細胞上進行，但優(yōu)選修飾在體外進行，如下文所例示。
[0150]消除或減少多核苷酸的表達的方便方式的例子基于基因取代、基因缺失或基因破壞的技術。例如，在基因破壞法中，將與內(nèi)源多核苷酸對應的核酸序列在體外誘變，以產(chǎn)生有缺陷的核酸序列，然后將其轉化到親本細胞中，產(chǎn)生有缺陷的基因。通過同源重組，有缺陷的核酸序列取代內(nèi)源多核苷酸。可能會希望，有缺陷的多核苷酸也編碼可用于選擇多核苷酸已經(jīng)被修飾或破壞的轉化子的標記物。在一方面，多核苷酸被例如本文所述的可選擇標記物所破壞。
[0151]本發(fā)明還涉及抑制細胞中具有胞嘧啶脫氨酶活性的多肽的表達的方法，包括對細胞施用雙鏈RNA (dsRNA)分子或者在細胞中表達雙鏈RNA (dsRNA)分子，其中dsRNA包含本發(fā)明的多核苷酸的子序列。在優(yōu)選的方面，dsRNA的長度為約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25個或更多個雙核苷酸。
[0152]dsRNA優(yōu)選為小干擾RNA (siRNA)或微RNA (miRNA)。在優(yōu)選的方面，dsRNA是用于抑制轉錄的小干擾RNA。在另一優(yōu)選方面，dsRNA是用于抑制翻譯的微RNA。[0153]本發(fā)明還涉及這些雙鏈RNA (dsRNA)分子，包含用于抑制細胞中多肽表達的多肽編碼序列SEQ ID N0:59的一部分。盡管本發(fā)明不受任何具體作用機制的限制，dsRNA可以進入細胞，并導致類似序列或相同序列的單鏈RNA (ssRNA)(包括內(nèi)源mRNA)的降解。當細胞暴露于dsRNA時，來自同源基因的mRNA通過稱作RNA干擾(RNAi)的過程而選擇性地降解。 [0154]本發(fā)明的dsRNA可以用于基因沉默。在一方面，本發(fā)明提供使用本發(fā)明的dsRNAi來選擇性地降解RNA的方法。該方法可以在體外、先體外后體內(nèi)或在體內(nèi)實施。在一方面，dsRNA分子可以用于在細胞、器官或動物中產(chǎn)生功能缺失的突變。用于制造并使用dsRNA分子以選擇性地降解RNA的方法為本領域公知；參見，例如，美國專利第6，489，127 ；6，506，559 ;6，511，824 ;和 6，515，109 號。
[0155]本發(fā)明還涉及親本細胞的突變細胞，其包含編碼胞嘧啶脫氨酶多肽的多核苷酸或其控制序列或編碼該多肽的沉默基因的破壞或缺失，導致與親本細胞相比，突變細胞產(chǎn)生更少的胞嘧啶脫氨酶或不產(chǎn)生胞嘧啶脫氨酶。
[0156]胞嘧啶脫氨酶缺失的突變細胞特別可用作使用編碼天然和異源目標蛋白的基因進行轉化的宿主細胞。因此，本發(fā)明還涉及制備自然或異源多肽的方法，包括:(a)在有利于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)突變細胞；和6)回收多肽。術語“異源多肽”是指對于宿主細胞來說并非天然的多肽，例如，天然蛋白的變體。宿主細胞可以包含多于一個拷貝的編碼天然或異源多肽的多核苷酸。
[0157]用于培養(yǎng)和純化目標產(chǎn)物的方法可以通過本領域已知的方法來實施。
[0158]實施例
[0159]分子克隆技術記載于Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T.(1989)Molecularcloning:a laboratory manual (第二版)Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SpringHarbor, New York。
[0160]塵
[0161]用于DNA操作的酶(例如限制性內(nèi)切酶、連接酶等)可得自New EnglandBiolabs, Inc.,并根據(jù)制造商的說明書進行使用。
[0162]培養(yǎng)基和試劑
[0163]用于緩沖液的化學品和底物均為分析級的市售產(chǎn)品。
[0164]Cove:342.3g/L鹿糖、20ml/L COVE鹽溶液、IOmM乙酰胺、30g/L純化(noble)瓊脂。
[0165]Cove頂層瓊脂:342.3g/L蔗糖、20ml/L COVE鹽溶液、IOmM乙酰胺、10g/L低熔點瓊脂糖。
[0166]Cove-2:30g/L 蔗糖、20ml/L COVE 鹽溶液、IOmM 乙酰胺、30g/L 純化瓊脂。
[0167]Cove-N (tf)平板由 342.3g 鹿糖、20mlCove 鹽溶液、3g NaNOjP 30g 純化瓊脂組成，加水至I升。
[0168]Cove-N平板由30g鹿糖、20mlCove鹽溶液、3g NaNO3和30g純化瓊脂組成,加水至I升°
[0169]COVE 鹽溶液由 26g KCl、26g MgSO4.7H20、76g KH2PO4 和 50mlCove 痕量金屬組成，加水至I升。
[0170]用于COVE 的痕量金屬溶液由 0.04g NaB4O7.10Η20、0.4gCuS04.5Η20、1.2gFeSO4.7Η20、1.0g MnSO4.H2O,0.8g 中性淀粉酶 II MoO2.2H20 和 10.0g ZnSO4.7H20 組成，加水至I升。
[0171]Cove-N頂層瓊脂由342.3g鹿糖、20ml Cove鹽溶液、3g NaNO3和IOg低熔點瓊脂糖組成，加水至I升。
[0172]淀粉葡糖苷酶痕量金屬溶液由6.8g ZnCl2.7Η20、2.5gCuS04.5Η20、0.24gNiCl2.6Η20、13.9g FeSO4.7Η20、13.5g MnSO4.H2O 和 3g 檸檬酸組成，加水至 I 升。
[0173]YPG 由 4g 酵母提取物、Ig ΚΗ2Ρ04、0.5g MgSO4.7H20 和 15g 葡萄糖(ρΗ6.0)組成，加水至I升。
[0174]STC緩沖液由0.8Μ山梨糖醇、25mM Tris (pH8)和25mM CaCl2組成，加水至I升。
[0175]STPC緩沖液由STC緩沖液中40%PEG4000組成。
[0176]MLC由40g葡萄糖、50g大豆粉、4g檸檬酸(pH5.0)組成,加水至I升。
[0177]MSS由70g鹿糖、100g大豆粉(ρΗ6.0)組成,加水至I升。
[0178]MU-1 由 260g 麥芽糊精、3g MgSO4 *7H20,5g KH2PO4,6g K2S04、淀粉葡糖苷酶痕量金屬溶液0.5ml和尿素2g (ρΗ4.5)組成，加水至I升。
[0179]KCl平板由0.6Μ KCl、20ml Cove鹽溶液、3g NaNO3和30g純化瓊脂組成，加水至I升。
[0180]5-氟胞嘧啶儲備液`:1000mg5-氟胞嘧啶，溶解于Iml0.9INaCl溶液。
[0181]購買的材料(大腸桿菌(E.coli)、質(zhì)粒和試劑盒)
[0182]將大腸桿菌DH5-a (Toyobo)用于質(zhì)粒構建和擴增。市售的質(zhì)粒/載體TOPO克隆試劑盒(Invitrogen)和 pBluescript II SK- (Stratagene#212206)用于 PCR 片段的克隆。擴增的質(zhì)粒用Qiagen?質(zhì)粒試劑盒(Qiagen)回收。連接用DNA連接試劑盒(Takara)或T4DNA連接酶(Boehringer Mannheim)進行。聚合酶鏈式反應(PCR)用Expand TM PCR系統(tǒng)(Boehringer Mannheim)進行。使用QIAquickTM凝膠提取試劑盒(Qiagen)來純化PCR片段并從瓊脂糖凝膠中提取DNA片段。
[0183]菌株
[0184]米曲霉BECh-2記載于丹麥專利申請PA 1999 01726中。使用構巢曲霉菌株NRRL1092作為供體菌株。
[0185]表達宿主菌株黑曲霉NN059095通過Novozymes分離，并且是分離自土壤的黑曲霉NN049184的衍生種。對NN059095進行遺傳修飾，以破壞淀粉葡糖苷酶活性的表達。
[0186]米曲霉ToC1512記載于W02005/070962實施例11中。
[0187]質(zhì)粒
[0188]表達質(zhì)粒pHUda440和來自瓣環(huán)栓菌(Trametes cingulata)的淀粉葡糖苷酶的核苷酸序列記載于專利申請W02006/069289。
[0189]質(zhì)粒pJaL574以及單純皰疹病毒(HSV)胸苷激酶基因(TK)、構巢曲霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子(Pgpd)和構巢曲霉色氨酸合成酶終止子(TtrpC)的核苷酸序列記載于W007045248的實施例9中。
[0190]表達盒質(zhì)粒pJaL790以及中性淀粉酶II啟動子(Pna2)的核苷酸序列記載于專利公開 W02005070962 中。
[0191]JA126淀粉酶表達載體記載于專利申請10729.0OO-US中。[0192]質(zhì)粒pDV8記載于專利WO 2001/068864實施例8中。
[0193]質(zhì)粒pJaL504記載于實施例10中。
[0194]質(zhì)粒P JaL504_ δ -Bgl 11記載于實施例10中。
[0195]質(zhì)粒pJaL554記載于專利W02000/050567A1實施例1中。
[0196]質(zhì)粒pJaL574記載于實施例10中。
[0197]質(zhì)粒pJaL835記載于實施例10中。
[0198]質(zhì)粒pJaL955記載于實施例10中。
[0199]質(zhì)粒pJaL1022記載于實施例10中。
[0200]質(zhì)粒pJaL1025記載于實施例10中。
[0201 ] 質(zhì)粒pJaL1027記載于實施例10中。
[0202]質(zhì)粒pJaL1029記載于實施例10中。
[0203]質(zhì)粒pJaLl 120記載于實施例10中。
[0204]質(zhì)粒pJaL1123記載于實施例10中。
[0205]質(zhì)粒pJaL1183記載于實施例10中。
[0206]質(zhì)粒pJaL1194記載于 實施例10中。
[0207]質(zhì)粒pJaL1202記載于實施例10中。
[0208]質(zhì)粒pToC65記載于專利WO 91/17243中。
[0209]質(zhì)粒pUC19:構建體記載于 Vieira 等人，1982，Genel9:259-268 中。
[0210]質(zhì)粒pCR?4BluntTOPO? 得自 Invitrogen0
[0211]曲霉的轉化
[0212]曲霉物種的轉化可以使用酵母轉化的通常方法來實現(xiàn)。本發(fā)明優(yōu)選的方法描述如下。
[0213]將黑曲霉宿主菌株接種到補充有IOmM尿苷的100ml YPG培養(yǎng)基中，于32°C在80rpm下孵育16小時。收集球塊，用0.6M KCl洗滌，并再懸浮于以20mg/ml的最終濃度含有市售 β _ 葡聚糖酶產(chǎn)品(GLUCANEX?, Novozymes A/S, Bagsvaerd，Denmark)的 20ml0.6ΜKCl中。將懸浮液于32°C在振動下(SOrpm)孵育，直至形成原生質(zhì)體，然后用STC緩沖液洗滌兩次。將原生質(zhì)體用血球計進行計數(shù)，在8:2:0.1的STC: STPC:DMS0溶液中再懸浮，并調(diào)節(jié)至2.5 X IO7個原生質(zhì)體/ml的最終濃度。將約4 μ g質(zhì)粒DNA加入到100 μ I原生質(zhì)體懸浮液中，輕輕混合，并在冰上孵育30分鐘。加入Iml SPTC，將原生質(zhì)體懸浮液在37°C下孵育20分鐘。在加入10ml50°C Cove或Cove-N頂層瓊脂之后,將反應物倒在Cove或Cove-N (tf)瓊脂平板上，將平板在32°C下孵育5天。
[0214]PCR 擴增
[0215]5x PCR 緩沖液(包含 MgCl2) 20 μ?
【權利要求】
1.一種分離的編碼具有胞嘧啶脫氨酶活性的多肽的多核苷酸，所述多肽選自: (a)與SEQ ID NO: 60的多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的多肽； (b )由在中等嚴格條件、中高度嚴格條件、高度嚴格條件或極高度嚴格條件下與(i ) SEQID NO:59的多肽編碼序列、(ii)其cDNA序列、或(iii) (i)或(ii)的全長互補物雜交的多核苷酸所編碼的多肽； (c)由與SEQID NO: 59的多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的多核苷酸所編碼的多肽； (d)SEQID N0:60的多肽的在一個或多個位置包含替換、缺失和/或插入的變體；以及 Ce)具有胞嘧啶脫氨酶活性的(a)、(b)、(c)或(d)的多肽片段。
2.根據(jù)權利要求1所述的多核苷酸，其編碼具有與SEQID NO:60至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的氨基酸序列的多肽。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的多核苷酸，其在中等嚴格條件、中高度嚴格條件、高度嚴格條件或極高度嚴格條件下與(i) SEQ ID NO:59的多肽編碼序列、(ii)其cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全長互補物進行雜交。
4.根據(jù)權利要求1~3中任一項所述的多核苷酸，其與SEQID NO:59的多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性。
5.根據(jù)權利要求1~4中任一項所述的多核苷酸，其編碼具有SEQID N0:60氨基酸序列的多肽的片段，其中該片段具有胞嘧啶脫氨酶活性。
6.根據(jù)權利要求1~4中任一項所述的多核苷酸，其編碼具有SEQID N0:60氨基酸序列的胞嘧啶脫氨酶多肽。
7.—種核酸構建體或表達載體,包含權利要求1~6中任一項所述的多核苷酸,所述多核苷酸與一個或多個介導胞嘧啶脫氨酶多肽在合適表達宿主細胞中生產(chǎn)的控制序列可操作地連接。
8.一種使用權利要求1~6中任一項所述的多核苷酸作為陰性選擇標記物的方法，包括以下步驟: (a)提供包含一個或多個權利要求1~6中任一項所述的編碼胞嘧啶脫氨酶的多核苷酸的宿主細胞； (b)用整合性核酸構建體轉化所述宿主細胞，所述整合性核酸構建體在位點特異性地整合到宿主基因組中時，使至少一個編碼 胞嘧啶脫氨酶的多核苷酸失活，從而與步驟(a)的宿主細胞相比，所得的宿主細胞產(chǎn)生更少的胞嘧啶脫氨酶或不產(chǎn)生胞嘧啶脫氨酶； (C)在包含足量5-氟胞嘧啶的選擇性介質(zhì)中培養(yǎng)所轉化的宿主細胞，5-氟胞嘧啶通過胞嘧啶脫氨酶轉化為抑制性濃度的有毒5-氟尿嘧啶；以及 (d)選擇可以在所述選擇性介質(zhì)中生長并具有減少的胞嘧啶脫氨酶活性或具有不可測出的胞嘧啶脫氨酶活性的所得宿主細胞。
9.一種使用權利要求1~6中任一項所述的多核苷酸作為陽性選擇標記物的方法,包括以下步驟: (a)提供不具有可測出的胞嘧啶脫氨酶活性的宿主細胞； (b)用包含至少一種可表達的權利要求1~6中任一項所述的編碼胞嘧啶脫氨酶的多核苷酸的核酸構建體轉化所述宿主細胞； (C)在有益于胞嘧啶脫氨酶的表達的條件下，在包含嘧啶從頭合成抑制劑的介質(zhì)中培養(yǎng)所轉化的宿主細胞； (d)選擇生長中的包含至少一種編碼胞嘧啶脫氨酶的多核苷酸的宿主細胞。
10.根據(jù)權利要求8或9所述的方法，其中所述核酸構建體還包含編碼目標蛋白的多核苷酸。
11.根據(jù)權利要求10所述的方法，其中所述目標蛋白是酶，優(yōu)選為水解酶、異構酶、連接酶、裂解酶、氧化還原酶或轉移酶，例如，氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、α -半乳糖苷酶、β -半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α -葡糖苷酶、β -葡糖苷酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β -木糖苷酶。
12.—種制備親本宿主細胞的突變體的方法，包括使權利要求1~6中任一項所述的多核苷酸失活，得到比所述親本細胞產(chǎn)生更少的所編碼的胞嘧啶脫氨酶多肽的突變體。
13.根據(jù)權利要求8~12中任一項所述的方法，其中所述宿主細胞是真菌宿主細胞；優(yōu)選為絲狀真菌宿主細胞；更優(yōu)選為枝頂孢屬、曲霉屬、短梗霉屬、黑管菌屬、擬蠟菌屬、金孢屬、鬼傘屬、革蓋菌屬、隱球菌屬、線黑粉酵母屬、鐮孢菌屬、腐質(zhì)霉屬、巨座殼屬、毛菌霉、毀絲菌屬、新美鞭菌屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉菌屬、平革菌屬、白腐菌屬、梨囊鞭菌屬、側耳屬、裂褶菌屬、籃狀菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬、或木霉屬細胞，或最優(yōu)選為泡盛曲霉、臭曲霉、煙曲霉、日本曲霉、構巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、煙管菌、干擬臘菌、Ceriporiopsis caregiea、淺黃擬臘菌、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsis subrufa、蟲擬臘菌、Chrysosporium inops、嗜毛金色抱、Chrysosporium Iucknowense> 幾狀金抱、Chrysosporium pannicola、Chrysosporiumqueenslandicum、熱帶金孢菌、Chrysosporium zonatum、灰蓋鬼傘、粗毛云芝、桿孢狀鐮孢、谷類鐮孢、克魯克威爾鐮孢菌、黃色鐮孢菌、禾谷鐮刀菌、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢菌、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬枝孢鐮孢菌、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鐮孢霉、特異腐質(zhì)霉、柔毛腐質(zhì)霉、米赫毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈胞菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢原毛平革菌、脈射菌、刺芹側耳、太瑞斯梭孢殼、長絨毛栓菌、變色栓菌、哈茨木霉、康氏木霉、長梗木霉、里氏木霉或綠色木霉細胞。
14.一種重組宿主細胞，包含至少一個染色體整合的權利要求1~6中任一項所述的多核苷酸，所述多核苷酸與一個或多個介導所編碼的胞嘧啶脫氨酶的產(chǎn)生的控制序列可操作地連接。
15.根據(jù)權利要求14所述的重組宿主細胞，其為真菌宿主細胞；優(yōu)選為絲狀真菌宿主細胞；更優(yōu)選為枝頂孢屬、曲霉屬、短梗霉屬、黑管菌屬、擬蠟菌屬、金孢屬、鬼傘屬、革蓋菌屬、隱球菌屬、線黑粉酵母屬、鐮孢菌屬、腐質(zhì)霉屬、巨座殼屬、毛菌霉、毀絲菌屬、新美鞭菌屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉菌屬、平革菌屬、白腐菌屬、梨囊鞭菌屬、側耳屬、裂褶菌屬、籃狀菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬、或木霉屬細胞，或最優(yōu)選為泡盛曲霉、臭曲霉、煙曲霉、日本曲霉、構巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、煙管菌、干擬臘菌、Ceriporiopsiscaregiea、淺黃擬臘菌、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、蟲擬臘菌、Chrysosporium inops、嗜毛金色抱、Chrysosporiumlucknowense、！^狀金抱、Chrysosporium pannicola、Chrysosporium queenslandicum、熱帶金孢菌、Chrysosporium zonatum、灰蓋鬼傘、粗毛云芝、桿孢狀鐮孢、谷類鐮孢、克魯克威爾鐮孢菌、黃色鐮孢菌、禾谷鐮刀菌、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢菌、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬枝孢鐮孢菌、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鐮孢霉、特異腐質(zhì)霉、柔毛腐質(zhì)霉、米赫毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈胞菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢原毛平革菌、脈射菌、刺芹側耳、太瑞斯梭孢殼、長絨毛栓菌、變色栓菌、哈茨木霉、康氏木霉、長梗木霉、里氏木霉或綠色木霉細胞。
16.權利要求1~6中任一項所述的多核苷酸或權利要求7中所述的核酸構建體或載體作為微生物轉化過程中的選擇標記物的用途，其中將目標多核苷酸轉化到合適的微生物宿主細胞中，然后將所述微生物宿主細胞在陽性或陰性選擇壓力條件下進行培養(yǎng)，來選擇所述選擇標記物的存在或不存在。
【文檔編號】C12N9/78GK103562385SQ201280025319
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2012年5月23日 優(yōu)先權日:2011年5月23日
【發(fā)明者】宇田川裕晃 申請人:諾維信公司