蛋白酶及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種真菌絲氨酸蛋白酶，所述酶具有絲氨酸蛋白酶活性并具有在SEQ?ID?No:18中定義的畸枝霉屬ALKO4122成熟蛋白酶的氨基酸序列或與SEQ?ID?No:18的氨基酸序列具有至少66%的一致性的氨基酸序列。一種分離的核酸分子也被公開，其包含編碼真菌絲氨酸蛋白酶的多核苷酸序列、編碼所述蛋白酶的核酸序列、宿主細胞以及生產具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽的方法。所述蛋白酶作為酶制劑可在去垢劑組合物中和在處理纖維、毛、發(fā)、皮革或絲、對于處理食品或飼料，或者在任何涉及蛋白質材料的修飾、降解或去除中使用。
【專利說明】蛋白酶及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及絲氨酸蛋白酶，尤其是可在多種應用、特別是在去垢劑中使用的真菌絲氨酸蛋白酶。本發(fā)明涉及編碼所述酶的核酸分子、重組載體、生產所述酶的宿主細胞、包含所述酶的酶組合物，以及制備該組合物的方法。本發(fā)明還涉及所述酶的多種應用和包含所述酶的組合物。
【背景技術】
[0002]微生物蛋白酶是最重要的水解酶之一，并在例如去垢劑、食品、皮革、制藥、診斷、廢物管理和銀回收等多項工業(yè)領域中取得應用。微生物細胞外蛋白酶占據(jù)世界范圍內工業(yè)用酶銷量的主要部分(Cherry和Fidantsef，2003)。大約90%的市售的蛋白酶是去垢劑酶(Gupta等人，2002)。目前使用的市售去垢劑制劑包含自然形成的枯草桿菌蛋白酶家族的堿性絲氨酸蛋白酶(EC3.4.21)或者來源自芽孢桿菌種的枯草桿菌蛋白酶(EC3.4.21.62)，或者是其重組蛋白酶的制劑(Maurer，2004)。
[0003]商業(yè)化蛋白酶的例子有Subtilisin Carlsberg ( Alcalasc? )、Subtilisin309
(Savinase?) 、Subtilisinl47 (Espcrase?)、Karnase?、Everlascii)、Ovozyme象和冷洗蛋白酶 Polarzyme? (丹麥 Novozymes A/S)、Purafect?、Purafcel? Ox、PiiralectS Prime 和Propcrasc? (美國 Genencor 國際公司),以及 BLAP S 和 X series (德國 Henkel)。
[0004]幾種堿性絲氨酸蛋白酶和編碼這些酶的基因也已經從包括酵母和絲狀真菌的真核生物中被分離出來。美國專利N0.3652399和EP519229 (日本Takeda ChemicalIndustries有限公司)公開了一種堿性蛋白酶，它來源于鐮孢菌屬(無性生殖狀態(tài)，有性型)或者赤霉菌屬(有性生殖狀態(tài)，無性型)，尤其是來源于可在去垢劑和其他清潔劑組分的配方中使用的鐮孢菌屬sp.S-19-5 (ATCC20192，IF08884)、尖孢鐮刀菌胡麻?；?IF05880)或者小麥赤霉菌(ATCC20193，IF06608)。W01994025583 (丹麥 Novo Nordisk Α/S)公開了源自于鐮孢菌屬、尤其是一株尖孢鐮刀菌菌株(DSM2672)的活性類胰蛋白酶，以及編碼它的DNA序列。來源于木賊鐮孢菌和銳頂鐮刀菌的絲氨酸蛋白酶的氨基酸及核苷酸序列已經分別公布于W02010125174和W02010125175(芬蘭AB Enzymes Oy)。并且，來源于如麥軸梗霉屬和耳霉屬等真菌種的堿性蛋白酶已經被報道過(摘要見Anwar和Saleemuddinl988)。
[0005]在液態(tài)去垢劑中使用蛋白酶的主要問題是它們的不穩(wěn)定性。在液態(tài)去垢劑中，酶與水以及如陰離子表面活性劑和絡合劑的離散劑直接接觸，這會導致不可逆變性。蛋白酶降解包括去垢劑配方中的其他酶和其自身的蛋白質。自身蛋白質水解通過表面活性劑和高溫得到加強。因此，包含蛋白酶的液態(tài)去垢劑的穩(wěn)定性代表著產品研發(fā)中一個主要的挑戰(zhàn)(Maurer,2010)。
[0006]為了改進工業(yè)用絲氨酸蛋白酶的穩(wěn)定性，已經使用了多種方法。W092/03529(丹麥Novo Nordisk A/S)、US2009/096916 (美國 Genencor 國際公司)和 TO2007/145963 (美國Procter&Gamble公司)公開了一種可逆的肽或蛋白型的蛋白酶抑制劑的使用。包含蛋白酶的液態(tài)去垢劑組分通常包括蛋白酶抑制劑，如含有或不含多元醇的硼酸，以抑制蛋白酶的活性。此類抑制劑的一個例子是公開于US2010/0120649(丹麥Novozymes A/S)的4-甲酰苯基硼酸(4-FPBA)。蛋白酶的穩(wěn)定性還通過聯(lián)合使用鹵鹽與多元醇得到改進(W002/08398，美國Genencor國際公司)。EP0352244A2 (丹麥NovoNordiskA/S)建議通過使用兩性化合物、例如表面活性劑來改進源自于芽孢桿菌的酶的穩(wěn)定性。
[0007]基于由晶體結構和同源蛋白之間的序列相似性比較所得到的信息，可以設計出具有改良的穩(wěn)定性和/或改良的性能的蛋白質變體。通過定點和/或隨機突變，已經研發(fā)出具有改良的催化效率和/或針對溫度、氧化劑和不同洗滌條件具有更好的穩(wěn)定性以及具有改進的液態(tài)去垢劑儲藏穩(wěn)定性的天然絲氨酸蛋白酶的變體。
[0008]作為細胞外堿性內肽酶被分離出來的嗜熱霉菌素EC3.4.21.65是由嗜熱真菌馬拉分支霉產生的。嗜熱霉菌素被描述為一段含325個氨基酸殘基的單鏈蛋白質。它有活性位點序列為-亮氨酸-絲氨酸_(甘氨酸)_蘇氨酸-絲氨酸甲硫氨酸_，其是典型的枯草桿菌蛋白酶家族成員的序列。嗜熱霉菌素擁有一個特殊的二硫鍵。嗜熱霉菌素并不像嗜熱細菌的細胞外絲氨酸蛋白酶一樣熱穩(wěn)定，但是它比大多數(shù)真菌的蛋白酶更加穩(wěn)定(Gaucher和Stevenson，2004)。根據(jù)Ong和Gaucher (1975)，嗜熱霉菌素的熱失活發(fā)生在73°C且存在于IOmM Ca2+的條件下。嗜熱霉菌素在廣泛的pH值范圍中水解酪蛋白。水解酪蛋白的最佳pH值大約是8.5。
[0009]Abu-Shady等人(2001)公開了來自于馬拉分支霉的蛋白酶的性狀，它是從取自埃及屠宰場的土壤樣本中就地分離，加以培養(yǎng)以取得蛋白酶。這篇公開文獻描述了馬拉分支霉蛋白酶在特定去垢劑的存在下在低濃度(0.7%)、30-90°C下使用15-60分鐘預孵育時間(即在類似于洗滌的條件下)的相對活性。然而，它并沒有給出任何關于此蛋白酶在去垢劑本身中的去污性能或者儲藏穩(wěn)定性的說明，而這些對于蛋白酶在去垢劑配方中的使用的適宜性來說是關鍵的性質。該公開文獻還描述了部分純化過的蛋白酶的溫度和PH曲線。蛋白酶的最適溫度是50°C，最適pH值是9.0。
[0010]盡管已經發(fā)表了大量的專利公開文本、綜述和文章，它們公開了源自多種微生物的真菌絲氨酸蛋白酶，例如源自于放射菌類(Nocardiopsis dassonvillei)和真菌(Paecilomycesmarquandii)微生物的低溫堿性蛋白酶，例如見EP0290567和EP0290569(丹麥Novo Nordisk A/S)，然而仍然非常需要新型的蛋白酶，其適于尤其是在低溫或中等溫度的范圍內有效地修飾、降解和去除不同污垢的蛋白質材料，并且在具有高度變化性質的去垢劑存在時是穩(wěn)定的。由于絲氨酸蛋白酶的自催化性質，儲藏過程中的穩(wěn)定性也十分重要。
[0011]同樣希望的是，通過從發(fā)酵液和菌絲體中簡單分離而能夠大量地生產絲氨酸蛋白酶，并能夠經濟上合算地向下游加工。

【發(fā)明內容】

[0012]本發(fā)明的目的是提供源自酵母的、在廣泛的pH值范圍內具有活性、在低溫和中溫下作用得尤其好的絲氨酸蛋白酶。應用于去垢劑的絲氨酸蛋白酶還必須在去垢劑存在時穩(wěn)定，并能和去垢劑兼容。尤其是，本發(fā)明的目的是提供能夠在比商業(yè)用酶制劑更低的溫度下去除包括洗衣服和洗盤子的污垢在內的蛋白質材料的絲氨酸蛋白酶，由此例如能清洗更敏感的材料，并能節(jié)省能源。本發(fā)明的另一目的是提供編碼所述酶的核酸分子、重組載體、生產所述酶的宿主細胞、包含所述酶的組合物、用于制備該組合物的方法，以及所述酶和包含所述酶的組合物的使用。
[0013]根據(jù)本發(fā)明的真菌的絲氨酸蛋白酶可以在高產的真菌宿主中生產，并且其下游加工、例如分離發(fā)酵液和菌絲體易于執(zhí)行。
[0014]本發(fā)明涉及一種絲氨酸蛋白酶，它具有絲氨酸蛋白酶活性，并包含與如SEQ IDNo: 18所定義的氨基酸序列具有至少66%的一致性的氨基酸序列。一種優(yōu)選的絲氨酸蛋白酶源自于棒續(xù)枝霉(Libert) Oorschot de Hoog。
[0015]在本文中，“源自于”不僅意欲用于表示已被或者能被所討論的一株生物體來生產,還表示通過從這樣的菌株中分離得來的DNA序列編碼并在轉化了所述DNA序列的宿主生物體中生產的絲氨酸蛋白酶。最后，這個術語意欲用于表示被合成的和/或來源于cDNA的DNA序列所編碼的并且具有所討論的絲氨酸蛋白酶的識別特征的絲氨酸蛋白酶。
[0016]本發(fā)明優(yōu)選地涉及真菌絲氨酸蛋白酶，其具有絲氨酸蛋白酶活性，并包括與如SEQIDNo: 18定義的成熟畸枝霉屬ALK04122蛋白酶具有至少66%的一致性的氨基酸序列，或者包括如SEQ ID NO: 18定義的成熟畸枝霉屬ALK04122蛋白酶的氨基酸序列。
[0017]本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶可由畸枝霉屬得到，優(yōu)選是由樟絨枝霉(Libert)Oorschot de Hoog (馬拉分支霉(Miehe)的同義詞，Cooney & R.Emers.)得到。根據(jù)該特別優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶可以從保存于登記號CBS128533的畸枝霉屬ALK04122菌株或者從保存于登記號CBS128564的畸枝霉屬ALK04178菌株得到?；γ箤貯LK04178的蛋白酶本質上與畸枝霉屬ALK04122菌株的蛋白酶相同。
[0018]真菌絲氨酸蛋白酶的分子質量介于20到35kDa之間。在pH8.5的條件下，酶的最適溫度在30°C到80°C的范圍內，最好是70°C左右。在50°C的條件下，酶的最適pH值在從至少pH6到pHIO的范圍內，最 好是pHIO。溫度和pH特性通過以酪蛋白為底物、30分鐘的反應時間確立。
[0019]本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶能夠在去垢劑存在時在0°C到90°C的溫度下、優(yōu)選在5°C到60°C的溫度下、尤其優(yōu)選在10°C到40°C的溫度下降解和去除蛋白質污垢。
[0020]本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶由一段分離的多核苷酸序列編碼，該序列在嚴格條件下與包含于擁有核苷酸序列SEQ ID No: 11的質粒pALK3092(保存于登記號為DSM24426的大腸桿菌RF8758中)的多核苷酸序列，或者成為編碼成熟ALK04122蛋白酶SEQ ID No: 17的序列雜交。或者，本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶由一段分離的多核苷酸序列編碼，該序列在嚴格條件下能與包含于擁有核苷酸序列SEQ ID如:12的質粒？4認3093(保存于登記號為DSM24427的大腸桿菌RF8759中)的多核苷酸序列雜交。
[0021]所述酶由一段分離的多核苷酸序列編碼，該序列編碼含有如SEQ ID No: 18所定義的成熟畸枝霉屬ALK04122蛋白酶的氨基酸序列或與如SEQ ID No: 18所定義的成熟畸枝霉屬ALK04122蛋白酶的氨基酸序列具有至少66%的一致性的氨基酸序列的多肽。所述酶優(yōu)選地由含有核苷酸序列SEQ ID No: 17的分尚的核酸分子編碼。
[0022]本發(fā)明的全長真菌絲氨酸蛋白酶由含有保存于登記號為DSM24410的大腸桿菌RF8791的質粒pALK3094的多核苷酸序列編碼。
[0023]真菌絲氨酸蛋白酶由 重組表達載體生產，該載體含有編碼本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶的核酸分子，可操作于連接到能夠在適宜宿主中指導絲氨酸蛋白酶表達的常規(guī)序列上。適且彳百王包括異源彳百王，優(yōu)選是木霉囷屬、曲霉屬、鍵抱囷屬、腐質霉屬、金抱子囷屬、鏈孢霉屬、根霉屬菌、青霉菌屬、毀絲霉屬和被抱霉屬的微生物宿主。
[0024]所述酶優(yōu)選由木霉菌屬或曲霉屬真菌生產，最好是在里氏木霉中生產。
[0025]本發(fā)明還涉及包含編碼絲氨酸蛋白酶的多核苷酸序列的分離的核酸分子，其選自:
[0026](a)—種編碼多肽的核酸分子，該多肽具有絲氨酸蛋白酶活性，并含有如SEQ IDNo: 18所述的氨基酸序列；
[0027](b)—種編碼多肽的核酸分子，該多肽具有絲氨酸蛋白酶活性，并與SEQ ID No: 18的氨基酸序列具有至少66%的一致性。
[0028](c) 一種核酸分子，其具有如SEQ ID No: 17所述的核苷酸序列的編碼序列。
[0029]Cd) 一種核酸分子,其具有包含于DSM24410中的多核苷酸序列的編碼序列。
[0030](e) —種核酸分子，其編碼序列由于遺傳密碼的簡并性而與從(C)到(d)的任一核酸分子的編碼序列不同；并且
[0031](f)一種核酸分子，其在嚴格條件下與包含于DSM24426或者SEQ ID No:17的核酸分子雜交，后者編碼具有絲氨酸蛋白酶活性并且與如SEQ ID No: 18所示的氨基酸序列有至少66%的一致性的氨基酸序列的多肽。
[0032]本發(fā)明進一步涉及一種重組表達載體，其含有可操作地連接到能夠在適宜宿主中指導所述絲氨酸蛋白酶基因的表達的常規(guī)序列上的本發(fā)明的核苷酸序列。適宜宿主包括異源宿主，優(yōu)選是木霉菌屬、曲霉屬、鐮孢菌屬、腐質霉屬、金孢子菌屬、鏈孢霉屬、根霉屬菌、青霉菌屬、毀絲霉屬和被抱霉屬的微生物宿主。所述酶優(yōu)選由木霉菌屬或曲霉屬真菌生產，最好是在里氏木霉中生產。
[0033]本發(fā)明還涉及包含如上所述的重組表達載體的宿主細胞。宿主細胞優(yōu)選是微生物宿主,例如絲狀真菌。優(yōu)選的宿主有木霉菌屬、曲霉屬、鐮孢菌屬、腐質霉屬、金孢子菌屬、鏈孢霉屬、根霉屬菌、青霉菌屬、毀絲霉屬和被抱霉屬的微生物。更加優(yōu)選的宿主是木霉菌屬或曲霉屬真菌微生物，最優(yōu)選的是絲狀真菌里氏木霉。
[0034]本發(fā)明涉及生產具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽的方法，所述方法包括培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞的步驟和回收多肽的步驟。本發(fā)明還包括一種多肽，其具有由本發(fā)明的核酸序列編碼的絲氨酸蛋白酶活性，并能從上述方法獲得。
[0035]本發(fā)明涉及一種用于獲取酶制劑的方法，其包括步驟:培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞，要么從細胞中回收多肽要么從培養(yǎng)基中分離細胞并獲取上清液。本發(fā)明還包括一種能由上述方法獲得的酶制劑。
[0036]本發(fā)明涉及一種包含本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶的酶制劑。
[0037]本發(fā)明進一步涉及一種包含本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶的組合物。
[0038]包含本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶的酶制劑或組合物(如去垢劑配方)進一步含有選自于由含有或不含介體的蛋白酶(除本發(fā)明外的其他蛋白酶)、淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶 、角質酶、果膠酶和氧化酶所組成的組中的其他酶，以及選自于由穩(wěn)定劑、緩沖液、表面活性劑、漂白劑、介體、防蝕劑、增潔劑、抗再沉積劑、光亮劑、染料、色素、香料、腐蝕劑、研磨劑和防腐劑等所組成的組中的適宜添加劑。
[0039]生產宿主的用過的培養(yǎng)基同樣可以使用，或者可以除去宿主細胞，和/或可使其集中、過濾或分離。還可以對其進行干燥。包含本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶的酶制劑和組合物可以是液體、粉末、顆?；蛘咚幤男问?。酶可以在制劑或組合物中呈固定化的形態(tài)。
[0040]本發(fā)明還包括本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶或酶制劑在去垢劑、處理纖維、處理蛋白質材料(如毛、發(fā)、皮革、絲)、處理食物或飼料，或者任何涉及蛋白質材料的修飾、降解或移除方面的應用。酶或酶制劑尤其可作為去垢劑添加劑在去垢液、去垢粉和去垢片中使用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0041]圖1 (1A和1B)顯示了畸枝霉屬ALK04122的蛋白酶基因的核苷酸序列，其編碼的蛋白酶的部分啟動子(從ATG上游50個核苷酸)和終止子序列(從終止密碼子下游60個核苷酸)以及推導的氨基酸序列。經SignalP V3.0程序分析而推斷的信號肽用小寫字母表示，并加有下劃線。前端序列及由前端序列推導的氨基酸用小寫字母表示。成熟的核苷酸和肽序列用大寫字母表示。三個推斷的內含子序列用小寫斜體字母表示，并在核苷酸序列下用虛線標記。終止密碼子用序列下方的星號表示。用于畸枝霉屬ALK04178蛋白酶基因PCR (聚合酶鏈式反應)克隆的引物DET27 (5’-上游引物，s)和DET28 (3’-下游引物，as)的位置用雙下劃線標注。
[0042]圖1A顯不了崎枝霉屬ALK04122蛋白酶基因及其部分啟動子的核昔酸序列。蛋白酶基因序列包括從51到960的核苷酸，即編碼從Metl到Val279的氨基酸序列的序列區(qū)域，以及蛋白酶的Ala280的第一個密碼子。
[0043]圖1B顯示了畸枝霉屬ALK04122蛋白酶基因及其部分啟動子的核苷酸序列。蛋白酶基因序列包括從961到1486(包括TAA終止密碼子)的核苷酸，即編碼蛋白酶的從Ala280(最后兩個密碼子)到Arg401的氨基酸序列的序列區(qū)域。
[0044]圖2示意性地顯示了用作構建pALK3097表達框的骨架的質粒pALK2777的質粒圖。畸枝霉屬蛋白酶基因連接到cbhl(cel7A)啟動子(通過SacII位點精確融合)和終止子序列(通過連接序列中的BamHI位點)之間，使之成為SacI1-BamHI剪切過的pALK2777。更多細節(jié)請參見例2。質粒pALK2777包含用于轉化子篩選的一段合成的amdS標記基因。pcbhl表示cbhl啟動子；tcbhl表示c bhl終止子；s_amdS表示合成的amdS標記基因(cDNA)；Linker表示包括如BamHI位點的連接序列。
[0045]圖3示意性地顯示了 pALK3097表達框，其從載體骨架上通過NotI酶解得到，用于在里氏木霉中表達畸枝霉屬ALK04122的蛋白酶基因。pcbhl表示cbhl啟動子；tcbhl表示cbhl終止子；s_amdS表示合成的amdS標記基因(cDNA) ； I inker表示連接序列。
[0046]圖4顯示了在12%SDS_PAGE (十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)膠上分析的部分純化的重組蛋白。條帶1:部分純化的畸枝霉屬蛋白酶的樣品；條帶2:MW(分子量)標記(聚丙烯酰胺凝膠電泳標尺未染色的蛋白質梯(Page Ruler Unstained Protein Ladder),Fermentas)o
[0047]圖5 (5A和5B)顯示了在不同溫度和pH值條件下酶的相對活性。
[0048]圖5A描述了重組畸枝霉屬蛋白酶和Savinase? 16L的溫度曲線，其是在pH8.5的條件下用30分鐘的反應時間以酪蛋白為底物而測定的。數(shù)據(jù)點是三次獨立測量結果的平均值。
[0049]圖5B描述了 pH值對重組畸枝霉屬蛋白酶和Savinase? 16L的活性的影響。所用的緩沖液是40mMBritton-Robinson緩沖液,使用了酪蛋白作為底物，反應時間是30分鐘，反應溫度是50°C。數(shù)據(jù)點是三次獨立測量結果的平均值。
[0050]圖6 (6A，6B，6C和6D)描述了在10_50°C，pH8左右，在濃度為5g/l的市售液態(tài)去垢劑存在下60分鐘時，重組畸枝霉屬ALK04122蛋白酶對于血液/奶/墨水污垢的去污性能(Art.117，C0+PES，系列序號11_08，新批次，EMPA)。市售的蛋白酶制劑Savinase? 16L和SavinaseS Ultra 16L 被用于比較。
[0051]圖6A描述了在10°C條件下的去污性能。
[0052]圖6B描述了在20°C條件下的去污性能。
[0053]圖6C描述了在30°C條件下的去污性能。
[0054]圖6D描述了在50°C條件下的去污性能。
[0055]圖7 (7A，7B，7C和7D)描述了在10-50°C，pH8左右，在濃度為5g/l的市售液態(tài)去垢劑存在下60分鐘時，重組畸枝霉屬ALK04122蛋白酶對于血液/奶/墨水污垢的去污性能(Art.117，C0+PES，系列序號 11-07，舊批次，EMPA)。 Savinase:: Ultra 16L 被用于比較。
[0056]圖7A描述了在10°C條件下的去污性能。
[0057]圖7B描述了在20°C條件下的去污性能。
[0058]圖7C描述了在30°C條件下的去污性能。
[0059]圖7D描述了在50°C條件下的去污性能。
[0060]圖8 (8A，8B，8C和8D)描述了在10_50°C，pH8左右，在濃度為5g/l的市售液態(tài)去垢劑存在下60分鐘時，重組畸枝霉屬ALK04122蛋白酶對于血液/奶/墨水污垢的去污性能(Art.117, C0+PES,系列序號 11-08,新批次，EMPA)。Savinase? 16L和 Savinase? Ultra16L被用于比較。
[0061]圖8A描述了在10°C條件下的去污性能(酶用量計為蛋白質)。
[0062]圖8B描述了在20°C條件下的去污性能(酶用量計為蛋白質)。
[0063]圖8C描述了在30°C條件下的去污性能(酶用量計為蛋白質)。
[0064]圖8D描述了在50°C條件下的去污性能(酶用量計為蛋白質)。
[0065]圖9 (9A，9B，9C，9D，9E，9F，9G和9H)顯示了在3(rC和6(rC，pH8左右，在濃度為5g/l的市售液態(tài)去垢劑存在下60分鐘時，重組畸枝霉屬ALK04122蛋白酶在清洗檢驗法測試(Launder Ometer test)下對不同污垢的性能。Savinase? Ultra 16L被用于比較。
[0066]圖9A顯示了在30°C條件下對草、棉花的性能，Art.164 (系列序號23_03)，EMPA。
[0067]圖9B顯示了在60°C條件下對草、棉花的性能，Art.164 (系列序號23_03)，EMPA。
[0068]圖9C顯示了在30°C條件下對血液/奶/墨水、棉花的性能，Art.116 (系列序號18-16)，EMPA。
[0069]圖9D顯示了在60°C條件下對血液/奶/墨水、棉花的性能，Art.116 (系列序號18-16)，EMPA。
[0070]圖9E顯示了在30°C條件下對血液/奶/墨水、C0+PES的性能，Art.117 (系列序號11_08，新批次)410^。
[0071]圖9F顯示了在60°C條件下對血液/奶/墨水、C0+PES的性能，Art.117 (系列序號11_08，新批次)410^。
[0072]圖9G顯示了在30°C條件下對血液/奶/墨水、C0+PES的性能，Art.117 (系列序號 10-07，舊批次)，EMPA0
[0073]圖9H顯示了在60°C條件下對血液/奶/墨水、C0+PES的性能，Art.117 (系列序號 10-07，舊批次)，EMPA0
[0074]圖10 (10A和10B)顯示了去垢劑粉存在下蛋白酶的性能。
[0075]圖1OA描述了在50°C、60分鐘、pH值約為10.5、5g/l市售傳統(tǒng)去垢粉(如例8所述)存在的條件下，重組畸枝霉屬ALK04122蛋白酶對血液/奶/墨水、C0+PES、Art.117 (系列序號11-08)、EMPA的性能。Savinase? Ultra 16L被用于比較。
[0076]圖1OB描述了在50°C、60分鐘、pH值約為10、5g/l去垢粉Art.601，EMPA存在的條件下，重組畸枝霉屬ALK04122蛋白酶對血液/奶/墨水、CO+PES、Art.117 (系列序號11-08)、EMPA 的性能。Savinase? Ultra 16L 被用于比較。
[0077]圖11 (11A和11B)顯示了蛋白酶儲藏于37°C時的穩(wěn)定性。
[0078]圖1lA顯示了當用Proxel LV或丙二醇(PG)保藏/穩(wěn)定時，重組畸枝霉屬ALK04122蛋白酶儲藏于37°C時的穩(wěn)定性。
[0079]圖1lB顯示了當用Proxel LV或丙二醇(PG)保藏/穩(wěn)定時，重組蛋白酶Fe_RF6318(見W02010125174A1)儲藏于37°C時的穩(wěn)定性。
[0080]圖12 (12A和12B)顯示了蛋白酶在去垢劑中的穩(wěn)定性。
[0081]圖12A顯示了在37°C、pH值約為7的條件下重組畸枝霉屬ALK04122蛋白酶在生態(tài)標簽標準洗漆劑(ecolabel referencedetergent)中的穩(wěn)定性。市售制劑SaviiusL'i'Ultra 16L和重組蛋白酶Fe_RF6318 (見W02010125174A1)被用于比較。去垢劑中使用的酶制劑用量為4% (w/w)0
[0082]圖12B顯示了在37°C、pH值約為8的條件下，畸枝霉屬ALK04122蛋白酶在市售液態(tài)去垢劑中的穩(wěn)定性。市售制劑SiivimiscK Ultra 16L和重組蛋白酶Fe_RF6318 (見W02010125174A1)被用于比較。去垢劑中使用的酶制劑用量為4% (w/w)0
[0083]序列表
[0084]SEQ ID NO:1用于畸枝霉屬蛋白酶探針合成的PCR的DETl上游引物的序列
[0085]SEQ ID NO:2用于畸枝霉屬蛋白酶探針合成的PCR的DET2上游引物的序列
[0086]SEQ ID NO:3用于畸枝霉屬蛋白酶探針合成的PCR的DET3下游引物的序列
[0087]SEQ ID N0:4用于畸枝霉屬蛋白酶探針合成的PCR的DET4下游引物的序列
[0088]SEQ ID NO:5用于畸枝霉屬蛋白酶探針合成的PCR的DET5上游引物的序列
[0089]SEQ ID N0:6用于設計DETl的PCR上游引物的共有肽序列的核苷酸序列
[0090]SEQ ID NO: 7用于設計DET2的PCR上游引物的共有肽序列的核苷酸序列
[0091]SEQ ID N0:8用于設計DET3的PCR下游引物的共有肽序列的核苷酸序列
[0092]SEQ ID N0:9用于設計DET4的PCR下游引物的共有肽序列的核苷酸序列
[0093]SEQ ID NO: 10用于設計DET5的PCR上游引物的肽序列的核苷酸序列
[0094]SEQ ID NO: 11使用DET5和DET4以畸枝霉屬ALK04122的基因組DNA為模板在PCR反應中得到的PCR片段的序列。此 片段包含部分畸枝霉屬蛋白酶基因，并是質粒PALK3092的插入片段。
[0095]SEQ ID NO: 12用DET5和DET4以畸枝霉屬ALK04178的基因組DNA為模板的PCR反應得到的PCR片段的序列。此片段包含部分畸枝霉屬蛋白酶基因，并是質粒PALK3093的插入片段。
[0096]SEQ ID NO: 13編碼畸枝霉屬ALK04122蛋白酶的全長氨基酸序列的核苷酸序列。質粒PALK3094包括全長基因。通過PCR由畸枝霉屬ALK04178克隆的蛋白酶基因序列與此序列相同。
[0097]SEQ ID NO: 14畸枝霉屬ALK04122蛋白酶的全長氨基酸序列包括全長蛋白酶的從Metl到Arg401的氨基酸。
[0098]SEQ ID NO: 15編碼畸枝霉屬ALK04122蛋白酶原酶形式的氨基酸序列的核苷酸序列。[0099]SEQ ID NO: 16包括全長蛋白酶的從Gly21到Arg401的氨基酸的畸枝霉屬ALK04122蛋白酶原酶形式的氨基酸序列
[0100]SEQ ID NO: 17編碼畸枝霉屬ALK04122蛋白酶的成熟形式的氨基酸序列的核苷酸序列
[0101]SEQ ID NO: 18包括全長蛋白酶從Ala 121到Arg 401的氨基酸的畸枝霉屬ALK04122蛋白酶的成熟形式的氨基酸序列
[0102]SEQ ID N0:19用于克隆畸枝霉屬ALK04178 蛋白酶基因的PCR上游引物DET27的序列
[0103]SEQ ID NO: 20用于克隆畸枝霉屬ALK04178蛋白酶基因的PCR下游引物DET28的序列
[0104]SEQ ID NO: 21用于構建pALK3097中表達框的PCR上游引物DET17的序列
[0105]SEQ ID NO: 22用于構建pALK3097中表達框的PCR下游引物DET18的序列
[0106]菌種保藏
[0107]畸枝霉屬ALK04122于2010年12月20日保存于位于荷蘭Uppsalalaan8, 3508AD, Utrecht的荷蘭微生物菌種保藏中心(CBS)，登記號為CBS128533。
[0108]畸枝霉屬ALK04178于2011年I月5日保存于位于荷蘭Uppsalalaan8, 3508AD, Utrecht的荷蘭微生物菌種保藏中心(CBS)，登記號為CBS128564。
[0109]包括質粒pALK3094的大腸桿菌菌株RF8791于2010年12月20日保存于位于德國Inhoffenstrasse 7B, D-38124Braunschweig的德國微生物菌種保藏中心(DSMZ),登記號為 DSM24410。
[0110]包括質粒PALK3092的大腸桿菌菌株RF8758于2011年I月3日保存于位于德國Inhoffenstrasse7B, D_38124Braunschweig的德國微生物菌種保藏中心(DSMZ),登記號為DSM24426。
[0111]包括質粒PALK3093的大腸桿菌菌株RF8759于2011年I月3日保存于位于德國Inhoffenstrasse7B, D_38124Braunschweig的德國微生物菌種保藏中心(DSMZ),登記號為DSM24427。
【具體實施方式】[0112]本發(fā)明提供了一種源自真菌的絲氨酸蛋白酶。此蛋白酶在廣泛的pH值范圍內具有活性，并且在洗滌中有廣泛的最佳溫度范圍，在低溫范圍內以及中溫和高溫時性能尤佳。本酶對于去垢劑應用十分理想，能忍受典型的去垢劑組分，并在去垢劑溶液中低酶水平時有效。本蛋白酶尤其在使用溫度為0°c到90°C時具有活力，優(yōu)選溫度范圍是5°C到60°C，更佳的溫度范圍是從10°C到40°C。本發(fā)明的蛋白酶在液態(tài)去垢劑組分中同樣高度穩(wěn)定。因此，本發(fā)明提供了一種新型絲氨酸蛋白酶，其可應用于去垢劑和其他應用中，尤其是在液態(tài)配方中。本真菌絲氨酸蛋白酶可以在高產量的真菌宿主中生產，并且其下游處理、例如從發(fā)酵液和菌絲體中的分離簡單易行。
[0113]特別是，本發(fā)明提供了一種絲氨酸蛋白酶，其具有絲氨酸蛋白酶活性，并含有與如SEQ ID No: 18中所的氨基酸序列具有至少66%的一致性的氨基酸序列。本發(fā)明優(yōu)選地提供了一種真菌絲氨酸蛋白酶，其具有絲氨酸蛋白酶活性，并含有如SEQ ID No:18中所限定的氨基酸序列。一種優(yōu)選的絲氨酸蛋白酶從樟絨枝霉(Lib.)Oorschot de Hoog衍生得到。
[0114]在本發(fā)明中，“絲氨酸蛋白酶”或“絲氨酸內肽酶”或“絲氨酸內蛋白酶”均指經國際生物化學與分子生物學聯(lián)盟(IUBMB)命名法分類為EC3.4.21的酶。蛋白酶可用類屬特異性抑制劑來分類。絲氨酸蛋白酶抑制劑的不同種類包括合成型化學抑制劑和天然蛋白質抑制劑。因此，絲氨酸蛋白酶活性可通過在適宜條件下基于特異性底物分解的試驗或使用含有或不含絲氨酸蛋白酶特異性抑制劑的含底物的任何蛋白的試驗加以確定。
[0115]如本發(fā)明中使用的術語“絲氨酸蛋白酶活性”是指對含蛋白質的底物如酪蛋白、血紅蛋白、牛血清蛋白(BSA)的水解活性。分析蛋白水解活性的方法在文獻中廣為人知，可參考文獻如Gupta等人(2002)的文章。
[0116]絲氨酸蛋白酶以前酶原的形式作為無活性的酶原前體或酶原而合成，后者通過去除信號序列(分泌信號肽或前肽)和前序列(前肽)活化，以得到有活性的成熟形式的酶(Chen和Inouye, 2008)。此活化過程涉及蛋白酶的作用，可能由絲氨酸蛋白酶的少量自消化或自催化處理造成，例如在生產的翻譯后階段或者在用過的培養(yǎng)基中或者在培養(yǎng)基或酶制劑的儲藏過程中。原酶活化還可以通過在宿主生物培養(yǎng)時或培養(yǎng)后往培養(yǎng)基中添加能使無活性的原酶轉化成有活性的成熟酶的蛋白水解酶來實現(xiàn)。酶的縮短還可以通過如在將基因轉化入生產宿主前截短編碼多肽的基因來實現(xiàn)。本發(fā)明中的絲氨酸蛋白酶的“前酶原形式”是指包含前肽和原肽的酶?！霸感问健笔侵负性牡狈η半?信號序列)的酶。
[0117]術語“成熟”是指絲氨酸蛋白酶的在其去除信號序列(前肽)和原肽后含有對于酶活性或催化活性必須的氨基酸的形式。在絲狀真菌中，這是分泌入培養(yǎng)基的自然形式。成熟序列的第一個氨基酸可以通過分泌蛋白酶的N端測序來確定。在生化數(shù)據(jù)缺失的情況下，N端的位置可以通過將氨基酸序列和同源蛋白的成熟氨基酸序列進行比對來估測?？墒褂萌?Clustalff2 alignment (http://www.eb1.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)來比對序列。
[0118]最大類型的市售的絲氨酸蛋白酶是“堿性絲氨酸蛋白酶”，其是指在pH值為9到11或pH值甚至為10到12.5的條件下具有活性且穩(wěn)定(Shimogaki等人，1991)且等電點約為PH9的酶?？梢栽谶m宜緩沖液中、不同pH值條件下通過跟蹤蛋白酶底物的活性來確定催化活性的最佳PH值。典型情況下，去垢劑蛋白酶在其工作所在的去垢劑溶液的pH值大約與酶的Pl值大致相同時表現(xiàn) 最佳?？梢酝ㄟ^在由丙烯酰胺、淀粉或瓊脂糖組成的固定化PH梯度膠上等點聚焦，或者通過從氨基酸序列預測pl，如通過使用ExPASy服務器上的pl/MW 工具(http://expasy.0rg/tools/pi_tool.html ；Gasteiger 等人，2003)來確定 pi。
[0119]成熟堿性絲氨酸蛋白酶的分子量在15到35kDa的范圍內，通常是從約25到30kDa的范圍內(Rao等人，1998)。絲氨酸蛋白酶的分子量可以通過質譜分析或者SDS-PAGE(Laemmli, 1970)確定。還可以從酶的氨基酸序列來預測分子量。
[0120]大部分天然絲氨酸蛋白酶的最適溫度在60°C左右(Rao等人，1998)?？梢酝ㄟ^在適宜緩沖液、不同溫度條件下，以如例3所述的酪蛋白為底物或者通過文獻中描述的其他底物和緩沖液體系(Gupta等人，2002)來測定絲氨酸蛋白酶的最佳溫度。
[0121]根據(jù)本發(fā)明，成熟的重組畸枝霉屬絲氨酸蛋白酶的分子量約為29kDa，pH8.5、以酪蛋白為底物、反應時間為30分鐘時的最佳溫度約為70°C，并在50°C時且以酪蛋白為底物、反應時間為30分鐘的條件下在堿性pH值范圍內、例如pHIO的條件下具有活性。重組畸枝霉屬絲氨酸蛋白酶在去垢劑存在下具有優(yōu)良性能，在廣泛的如從低溫到中溫甚至高溫范圍內有高度可變的性質?；谙礈鞐l件、輔助成分和去垢劑中的添加劑，重組畸枝霉屬絲氨酸蛋白酶在60°C或以下時尤其有用。
[0122]為了提高在如去垢劑等多種工業(yè)應用中畸枝霉屬絲氨酸蛋白酶的性能，希望改進天然酶的性質。這些性質包含如儲藏穩(wěn)定性、去垢劑存在或不存在下的穩(wěn)定性、PH穩(wěn)定性、氧化穩(wěn)定性、對漂白劑的抵抗力和底物特異性。此酶的蛋白質自水解活性對儲藏穩(wěn)定性有影響，其應該盡量降低。不言而喻，例如在洗衣和洗碗組分中，與母酶或蛋白酶前體相比，改進過的酶的洗滌性能不應被減弱。換句話說，與母絲氨酸蛋白酶相比，希望酶變體有相似甚至更好的洗滌性能和去污性質。
[0123]所生產的蛋白酶、尤其是絲氨酸蛋白酶可通過使用常規(guī)的酶化學方法純化，例如鹽制備法、超過濾法、離子交換層析法、親和層析法、膠過濾法和疏水作用色譜法。可通過蛋白質鑒定、酶活性試驗和SDS-PAGE來檢測純化。可以測定在不同溫度和pH值條件下純化酶的酶活性和穩(wěn)定性，以及分子量和等電點。
[0124]本發(fā)明的重組絲氨酸蛋白酶純化顯示于例4。離心、過濾過的培養(yǎng)基上清液通過經20mM MES ρΗ5.3平衡過的HiPr印26/10脫鹽柱(來自于GE Healthcare)。膠過濾后的樣品通過經20mM MES ρΗ5.3平衡過的ImL S Sepharose HP柱(來自于GE Healthcare)。蛋白質用NaCl遞增梯度(0.5M)洗提。含有蛋白酶的部分匯合，并用Amicon Ultra-410，000C0離心過濾裝置MILLIPORE濃縮。樣品用經20mM MES, 150mM NaCl ρΗ5.3平衡過的Superdex75膠過濾柱進一步純化。匯合含有蛋白酶的部分。在SDS-PAGE膠上(圖4)分析最終樣品。自然也可以改為用其他已知的純化方法來替代這里所描述的方法或作為其附加來分離本發(fā)明的酶。重組絲氨酸蛋白酶被純化(如例4所述)，并用于鑒定pH和溫度曲線(如例5所述)。
[0125]蛋白酶活性大體上基于可溶性底物的降解。在去垢劑應用中，蛋白酶必須作用于至少部分不可溶的底物。因此，對于去垢劑蛋白酶的一個重要參數(shù)是吸附和水解這些不可溶碎片的能力。
[0126]本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶可源自于下列任何生物:細菌、古生菌、真菌、酵母，甚至高等真核生物，如植物。所述酶優(yōu)先來源于真菌，包括絲狀真菌和酵母，如源自于選自包含畸枝霉屬的類屬。由于能夠容易地進行下游處理以得到無微生物的酶或酶組合物，真菌堿性蛋白酶比細菌蛋 白酶有利。通過純化蛋白之前的過濾手段，可以輕松除去菌絲體。[0127]本發(fā)明的真菌發(fā)酵產物的微臭相對于源自于芽孢桿菌的產品是有利的，后者通常散發(fā)難聞的臭味。因此，對于最終組合物需要更少的香料來掩蓋臭味，這使得該產品也適合于不宜使用香料的應用。
[0128]本發(fā)明涉及一種真菌絲氨酸蛋白酶，其在去垢劑存在下具有優(yōu)良性能，在廣泛的例如從0°c到90°C的低溫到中溫具有高度可變的性質，優(yōu)選在溫度范圍介于5°C到60°C之間，尤其優(yōu)選在溫度范圍介于10°C到40°C之間。
[0129]在本發(fā)明中，“在去垢劑存在下的優(yōu)良性能”是指酶(在這里指本發(fā)明的重組絲氨酸蛋白酶)能在比許多市售枯草桿菌蛋白酶更低的溫度下起作用。換言之，優(yōu)良性能是指酶能夠在低溫到中溫范圍能降解或去除蛋白質污垢或材料，但尤其能在比現(xiàn)在市售的枯草桿菌蛋白酶產品更低的溫度范圍下，例如市售枯草桿菌蛋白酶產品Savinase?或Savinase?Ultra 16L (丹麥 NovozymesA/S)。
[0130]根據(jù)洗滌條件、輔助成分和去垢劑中的添加劑，本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶可在特別是不高于60°C的溫度下使用。酶還可以在不高于50°C、不高于40°C、不高于30°C、不高于20°C以及不高于10°C條件下起作用。出乎意料的是，一種最佳溫度約為70°C的嗜熱酶在低于40°C、甚至低于30°C溫度下有效且有用。
[0131]在去垢劑存在下，本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶在如上定義的溫度下起作用，所述絲氨酸蛋白酶尤其在去垢劑存在、不高于40°C的條件下具有優(yōu)良性能。在不同的測試條件下對于不同的污垢，經deltaL*測試，源自于畸枝霉屬的真菌絲氨酸蛋白酶的去污能力遠遠優(yōu)于市售產品Savinase?或Savinase攀Ultra 16L (丹麥Novozymes Α/S)。結果在例6到例8和圖6到圖10中顯示。
[0132]根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式，重組真菌絲氨酸蛋白酶是一種多肽，其具有絲氨酸蛋白酶活性，并含有如SEQ ID如:18定義的成熟畸枝霉屬么1^04122蛋白酶的氨基酸序列，或者與如SEQ ID No: 18定義的成熟畸枝霉屬ALK04122蛋白酶的氨基酸序列具有至少66%的一致性的氨基酸序列。優(yōu)選的酶顯示有至少66%、優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少75%、還更優(yōu)選至少80%的一致性。甚至還更優(yōu)選的氨基酸序列與SEQ ID No: 18的氨基酸序列顯示有至少85%或者至少90%或95%、更加優(yōu)選為至少98%、最優(yōu)為99%的一致性。酶的一致性可用對應的成熟序列區(qū)域來合適地進行比較。
[0133]本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶可來源于畸枝霉屬，最好來源于樟絨枝霉(Libert)Oorschot de Hoog (馬拉分支霉(Miehe)的同義詞，Cooney & R.Emers.),它是 EC3.4.21 的成員。根據(jù)該特別優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶源自于以登記號CBS128533保藏的畸枝霉屬ALK04122菌株，或者源自于以登記號CBS128564保藏的畸枝霉屬ALK04178菌株?；γ箤貯LK04178的蛋白酶與畸枝霉屬ALK04122菌株的蛋白酶本質上相同。
[0134]術語“一致性”在這里是指兩種氨基酸序列間在具有大概一樣數(shù)量的氨基酸的對應序列區(qū)間之間互相比較的一致性。例如，可以比較兩段氨基酸序列的全長或成熟序列的一致性。兩種要比較的分子的氨基酸序列可以在一個或多個部位有所不同，但這并不改變分子的生物學功能或結構。這種變異可自然形成，因為不同的宿主生物，或者氨基酸序列的突變，或者它們可以通過特異性突變實現(xiàn)。變異可由氨基酸序列中的一個或多個位點的缺失、替換、插入、增加或組合而產生。可通過ClustalW2 alignment(http://www.eb1.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)以默認設置(蛋白質權重矩陣為:連接，開口:10 ;間隙延伸:0.20 ；間隙距離:5)來估量一致性。
[0135]本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式是一種成熟真菌絲氨酸蛋白酶，其具有絲氨酸蛋白酶活性以及如SEQ ID如:18定義的畸枝霉屬41^04122蛋白酶的氨基酸序列。成熟酶沒有信號序列或前肽以及原序列或原肽。本發(fā)明的成熟絲氨酸蛋白酶包括在SEQ ID No: 14中所示的全長蛋白酶的從Alal21到Arg401的氨基酸。因此，包括信號序列(前肽)和原肽的具有SEQ ID No: 14的全長畸枝霉屬ALK04122蛋白酶以及缺乏信號序列(前肽)而具有SEQ IDNo: 16的原酶也在本發(fā)明的范圍內。
[0136]本發(fā)明涉及一種真菌絲氨酸蛋白酶，其成熟形式的分子質量或分子量(麗)在20到35kDa之間，優(yōu)選25到33kDa之間，更加優(yōu)選在28到30kDa之間。最優(yōu)二是通過使用ExPASy服務器上的工具Compute pi/MW tool (Gasteiger等人,2003)而得到的成熟多肽的預測分子量29kDa。
[0137]本發(fā)明的酶在廣泛的溫度范圍內對降解蛋白質材料有效。當如例5所述在pH8.5、30分鐘反應時間、以酪蛋白為底物時，真菌絲氨酸蛋白酶的最適溫度在從30°C到80°C的范圍內(至少具有最大活性的10%)，優(yōu)選從40°C到80°C的范圍內(至少具有最大活性的20%)，更加優(yōu)選從50°C到80°C的范圍內(至少具有最大活性的40%)，最好選擇從60°C到80°C的范圍內(至少具有最大活性的65%)，最大活性在70°C。
[0138]當如例5所述在50°C、使用30分鐘反應時間、以酪蛋白為底物時，本酶的最適pH值在從PH6到至少pHIO的范圍內。最適pH值尤其在pH6到pHIO之間(至少具有60%的最大活性)，更加優(yōu)選PH9到pHIO之間(具有至少70%的最大活性)，最好是在pHIO左右。
[0139]絲氨酸蛋白酶、合適地說本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶“在去垢劑存在下具有優(yōu)良性能”，也就是說能夠在去垢劑存在下在低溫范圍內降解或去除蛋白質污垢或材料，尤其是比現(xiàn)在市售的枯草桿菌蛋白酶產品、例如市售酶產品Savinase?或Savinase? Ultra 16L(丹麥Novozymes A/S)更低 的溫度范圍下。在去垢劑存在下，本發(fā)明的酶在5°C到60°C的范圍內，優(yōu)選不高于50°C時作用良好。本酶在溫度不高于40°C或不高于30°C時也能起作用。
[0140]根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式，真菌絲氨酸蛋白酶由分離的多核苷酸序列編碼，該序列在嚴格條件下與包含于擁有大腸桿菌RF8758中核苷酸序列SEQ ID No: 11的質粒pALK3092的多核苷酸序列或探針序列雜交，該大腸桿菌RF8758保存于德國微生物菌種保藏中心(DSMZ)，登記號為DSM24426。
[0141]通過類似方式，本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶(由畸枝霉屬ALK04178得到)通過一段分離的多核苷酸序列編碼，其在嚴格條件下與包含于大腸桿菌RF8759中的擁有核苷酸序列SEQ ID No: 12的質粒pALK3093的多核苷酸序列雜交，該大腸桿菌RF8759保存于德國微生物菌種保藏中心(DSMZ )，登記號為DSM24427。
[0142]此外，本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶通過一段分離的多核苷酸序列編碼，其在嚴格條件下與包含于大腸桿菌RF8791中的擁有核苷酸序列SEQ ID No: 17的質粒pALK3094的多核苷酸序列雜交，該大腸桿菌RF8791保存于德國微生物菌種保藏中心(DSMZ)，登記號為DSM24410。
[0143]本發(fā)明中，畸枝霉屬蛋白酶基因通過用如例4所述的嚴格雜交PCR制備的探針分離得到?？捎脴藴史肿由飳W方法來分離宿主生物的cDNA或基因組DNA，例如在分子生物學手冊(如Sambrook和Russell, 2001)中描述的方法。
[0144]通常在“高度嚴格”的條件下實施與DNA探針(如包含多于100-200個核苷酸的SEQID No: 11、SEQ ID No: 12或SEQ ID No: 17)的雜交，即在比完美雜交物的計算出的解鏈溫度(Tm)低20-25°C的溫度下的雜交，其中Tm根據(jù)Bolton和McCarthy (1962)算出。通常，預雜交和雜交在至少 65°C下、在 6X SSC (或 6X SSPE)、5XDenhardt 氏試劑、0.5% (w/v)SDS、100 μ g/ml變性、片段化的鮭魚精子DNA中實施。加入50%甲酰胺會使預雜交和雜交溫度降低到42°C。洗滌在低鹽濃度中進行，如室溫條件下(RT)，在2XSSC-0.5%SDS (w/v)中15分鐘，然后室溫條件下在2XSSC-0.1%SDS (w/v)中，最后在至少65°C下，0.1 X SSC-0.1%SDS(w/v)中，或者在例Id中描述的條件下。
[0145]根據(jù)一個優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的優(yōu)選真菌絲氨酸蛋白酶由一種分離的核酸分子編碼，其編碼包含在SEQ ID No: 18中表征的氨基酸序列的多肽，或與SEQ ID No: 18的氨基酸序列具有至少66%的一致性的多肽。優(yōu)選酶顯示有至少66%、優(yōu)選至少70%、更加優(yōu)選至少75%、甚至更優(yōu)選至少80%的一致性。更加優(yōu)選的氨基酸序列顯示與SEQ ID No: 18的氨基酸序列有至少85%或者至少90%或95%、更加優(yōu)選至少98%、最好99%的一致性。通過使用相對應的成熟序列區(qū)域來比較酶的一致性。[0146]因此，在本發(fā)明的范圍內包括一種多肽序列，其由編碼本發(fā)明的除酶的成熟形式外包括前肽(信號序列)和原肽的全長絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列的核酸分子編碼，其氨基酸序列在SEQ ID No: 14中表征。
[0147]在本發(fā)明的范圍內還包括一種多肽序列，其由編碼本發(fā)明的除酶的成熟形式外包括原肽的絲氨酸蛋白酶的原肽形式的核酸分子編碼，其氨基酸序列在SEQ ID No:16中表征。
[0148]本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式是通過分離的核酸分子編碼的真菌絲氨酸蛋白酶，其包含編碼成熟形式的含有SEQ ID No:18的畸枝霉屬ALK04122絲氨酸蛋白酶的核苷酸序列。
[0149]根據(jù)一個優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶由分離的核酸分子編碼，其包含編碼成熟形式畸枝霉屬ALK04122酶(SEQ ID No: 18)的核苷酸序列SEQ ID No: 17。
[0150]因此，由含有包含本酶“編碼序列”的核苷酸序列SEQ ID No: 13的核酸分子編碼的多肽在本發(fā)明的范圍內。表達“編碼序列”是指從翻譯起始密碼子(ATG)開始、在翻譯終止密碼子(TAA、TAG或TGA)終止的核苷酸序列。翻譯的全長多肽通常以甲硫氨酸開始，可能含有內含子區(qū)域。
[0151]一種真菌絲氨酸蛋白酶也在本發(fā)明的范圍內，其由包含編碼畸枝霉屬ALK04122原酶形式的SEQ ID No: 15核苷酸序列的核酸分子編碼。
[0152]根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方式，真菌絲氨酸蛋白酶由多核苷酸序列編碼，其含在包含大腸桿菌RF8791 (以登記號DSM24410保藏)中的核苷酸序列SEQ ID No: 13的質粒 pALK3094 中。
[0153]本發(fā)明的一個實施方式是由重組表達載體生產的絲氨酸蛋白酶，其包含編碼如上描述的、可操作于連接到能夠在適宜宿主中指導所述絲氨酸蛋白酶表達的常規(guī)序列上的真菌絲氨酸蛋白酶的核酸分子。所述重組表達載體的構建和所述載體的應用在例2中有更多細節(jié)的描述。[0154]用于生產真菌絲氨酸蛋白酶的適宜宿主是同源性宿主或異源性宿主，例如包括細菌、酵母和真菌的微生物宿主。如木霉菌屬、曲霉屬、鐮孢菌屬、腐質霉屬、金孢子菌屬、鏈孢霉屬、根霉屬菌、青霉菌屬、毀絲霉屬和被抱霉屬的絲狀真菌由于下游處理和酶產物回收的簡便性是優(yōu)選的生產宿主。適宜宿主包括如里氏木霉、黑曲霉、米曲霉、醬油曲霉、泡盛曲霉或日本曲霉典型菌株、鐮孢霉或尖孢鐮刀菌、特異腐質霉或柔毛腐質霉、粗糙脈孢菌和粗糙脈孢菌孢子的物種，其中一些在如AMFEP2009市售酶列表(http://www.amfep.0rg/list.html)中被列為酶生產宿主生物。本酶更加優(yōu)選地是從木霉菌屬或曲霉屬的絲狀真菌宿主生產，例如里氏木霉、黑曲霉、米曲霉或泡盛曲霉。根據(jù)本發(fā)明的最優(yōu)選實施方式，真菌絲氨酸蛋白酶從里氏木霉中生產。
[0155]本發(fā)明還涉及包含編碼絲氨酸蛋白酶的多核苷酸序列的分離的核酸分子，其選自:
[0156](g) 一種核酸分子，其編碼具有絲氨酸蛋白酶活性且含有如SEQ ID No: 18所述的氨基酸序列的多肽。
[0157](h) 一種核酸分子，其編碼具有絲氨酸蛋白酶活性且與SEQ ID No: 18的氨基酸序列有至少66%的一致性的多肽。
[0158](i) 一種核酸分子，其含有如SEQ ID No: 17所述的核苷酸序列的編碼序列。
[0159](j)—種核酸分子，其含有含在DSM24410中的多核苷酸序列的編碼序列。
[0160](k) 一種核酸分子，其編碼序列由于遺傳密碼的簡并性而與從(C)到(d)的任一核酸分子的編碼序列不同；并且
[0161](I) 一種核酸分子，其在嚴格條件下與包含于編碼具有絲氨酸蛋白酶活性且與如SEQ ID No: 18所述的氨基酸序列具有至少66%的一致性的氨基酸序列的多肽的DSM24426或SEQ ID No: 17中的核酸分子雜交。
[0162]本發(fā)明的核酸分子可以是RNA或DNA，其中DNA可由基因組DNA或cDNA構成。
[0163]可以在編碼本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶的多核苷酸序列的分離和酶處理方面使用標準分子生物學方法，包括基因組DNA和質粒DNA的分離、用來生產DNA片段的DNA消化、測序、大腸桿菌轉化等。基本方法在標準分子生物學手冊(如Sambrook和Russell, 2001)描述。
[0164]編碼畸枝霉屬ALK04122多肽的畸枝霉屬蛋白酶基因的分離在例I中描述。簡單地說，在PCR反應中使用簡并寡核苷酸引物(SEQ ID No:5和SEQ ID No:4)得到的PCR片段被用來分離源自畸枝霉屬ALK04122的蛋白酶基因。包括蛋白酶基因的基因組片段與pBluescript II KS+載體連接。保藏于德國微生物菌種保藏中心(DSMZ)中登記號為DSM24410的大腸桿菌中的質粒PALK3094包括全長畸枝霉屬蛋白酶基因。絲氨酸蛋白酶的推論的氨基酸序列由DNA序列分析得來。
[0165]畸枝霉屬ALK04122蛋白酶(SEQ ID No: 13)的核苷酸序列、其部分啟動子和終止子序列以及推論的氨基酸序列(SEQ ID No:14)在圖1A-B中呈現(xiàn)?；蜷L度為1436bp (包括終止密碼子)。找到三個長度為72bp、87bp和71bp的推定的內含子。推論的蛋白質序列由包括20個氨基酸組成的預測的信號序列(SignalP V3.0 ;Nielsen等人，1997和Nielsen和Krogh, 1998)和從Gly21到Aspl20的預測的前肽在內的401個氨基酸組成。成熟多肽的預測的分子量是28.5kDa，預測的pi是6.15。通過使用ExPASy服務器上的工具Compute pl/MW tool (Gasteiger等人,2003)做了這些預測。推論的氨基酸序列包含三個可能的N-糖基化位點(Asnl34、Asnl72和Asn277)，但根據(jù)CBS服務器NetNGlyc V1.0只有兩個位點，Asnl34與Asn277是類似的。通過使用美國國立生物技術信息中心(NCBI)的版本為2.2.25的BLASTP程序搜索了與已發(fā)表的編碼序列的同源性(Altschul等人，1990)。成熟畸枝霉屬蛋白酶序列與大多數(shù)同原序列的對應區(qū)域的一致性值通過使用ClustalW2 alignment (可在如 http://www.eb1.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/ 上得到；矩陣為:連接，開口:10;間隙延伸:0.20 ;間隙距離:5)得到。結果顯示于表2中。
[0166]下面是對本發(fā)明成熟畸枝霉屬ALK04122蛋白酶(SEQ ID No: 18)從BLASTP搜索得到的最高一致性值:對于Coccidioides posadasii(—種二態(tài)真菌)的推定的類枯草桿菌蛋白酶(EER24932.1)和粗球孢子菌的假定的蛋白質CMG_09197 (XP_001239485.1)是66%，對于Uncinocarpus reesii (一種腐生型真菌)的假定的蛋白質UREG_05170 (EEP80328.1)是65%，對于粗球孢子菌的假定的蛋白質CMB_01394 (ΧΡ_001247623.1)、Coccidioidesposadasii的推定的類枯草桿菌蛋白酶(EER23662.1)、Uncinocarpus reesii的假定的蛋白質(EEP81307.1)和太田節(jié)皮菌的堿性蛋白酶(EEQ28657.1)是64%。對于專利文獻中的序列的最高一致性是對美國US5962765 (AAE30270.1 ;來自于金龜子綠僵菌的蛋白酶)中的SEQIDNo:2和TO8807581 (AAA54276.1 ;來自于白色念球菌的蛋白酶)中的SEQ ID No: 15的55%。成熟畸枝霉屬ALK04122蛋白酶序列(SEQ ID No: 18)與上述用ClustalW2 alignment比對得到的同原序列的成熟序列進行比對。用ClustalW2 alignment (http://www.eb1.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)比對得到的一致性值(得分％)是從63%到65%。
[0167]因此，在本發(fā)明的范圍內包括一種分離的多核苷酸序列或分離的核酸分子，其編碼包含如SEQ ID No: 18和15表征(即SEQ ID No: 14的全長絲氨酸蛋白酶從Alal21到Arg401的氨基酸)的畸枝霉屬ALK04122酶的成熟形式的氨基酸序列的真菌絲氨酸蛋白酶或多肽。
[0168]核酸分子優(yōu)選是包含如SEQ ID No: 17描述的編碼序列的分子，其編碼本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶的成熟形式 。
[0169]本發(fā)明的分離的核酸分子可以是一種包括包含于DSM24410、DSM24426或DSM24427中的多核苷酸序列的編碼序列的分子。DSM24426具有用于克隆全長畸枝霉屬ALK04122蛋白酶基因的PCR片段(SEQ ID No: 11)的核苷酸序列。DSM24427具有來自于畸枝霉屬ALK04178的PCR片段(SEQ ID No: 12)的核苷酸序列。DSM24410具有全長畸枝霉屬ALK04122蛋白酶基因(SEQ ID No: 13)的核苷酸序列。
[0170]本發(fā)明的核酸分子也可是如上描述的核苷酸序列的類似物?！昂啿⑿浴笔侵负塑账嵝蛄械念愃莆铮湓谝粋€或多個核苷酸或密碼子上不同，但編碼本發(fā)明的重組蛋白酶。
[0171 ] 核酸分子也可是一種能在嚴格條件下與包含于質粒PALK3092或pALK3093的PCR探針的核酸分子雜交，質粒分別保存于登記號為DSM24426和DSM24427的大腸桿菌中，或者是一種能在嚴格條件下與編碼具有絲氨酸蛋白酶活性和氨基酸序列的成熟多肽的DNA序列SEQ ID No:17的核酸分子雜交。雜交DNA可源自于屬于畸枝霉屬種類的真菌，或者它能源自于其他真菌種類。
[0172] 因此，包含如SEQ ID No: 17所述的核苷酸序列及其類似物的分離的核酸分子屬于本發(fā)明的范圍內。[0173]本發(fā)明還涉及一種重組表達載體或重組表達載體構建物，其可用于在適宜原核宿主或真核宿主中擴增或表達編碼所選絲氨酸蛋白酶的核酸序列。重組表達載體包含DNA或核酸序列，其促進或指導在適宜宿主中絲氨酸蛋白酶編碼序列的表達和分泌，例如啟動子、增強子、終止子(包括轉化和翻譯終止信號)和可操作于連接到編碼所述絲氨酸蛋白酶的多核苷酸序列的信號序列。表達載體可進一步包含用于選擇轉化子菌株的標記基因，或者選擇標記可以在另一個載體構建物中通過共轉化引入宿主。所述調控序列可與生產生物同源或者異源，或者它們可以源自于分離編碼絲氨酸蛋白酶的基因的生物。
[0174]在絲狀真菌中用來表達本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶的啟動子的例子是米曲霉TAKA淀粉酶、堿性蛋白酶ALP以及丙糖磷酸異構酶、黑根毛霉脂肪酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、尖孢鐮刀菌類胰蛋白酶、孢子菌纖維二糖水解酶I啟動子、里氏木霉纖維二糖水解酶I (Cel7A)等的啟動子。
[0175]在酵母中，如釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1 )、半乳糖激酶(GAL1 )、乙醇脫氫酶(ADH2)和3-磷酸甘油酸酯激酶的啟動子可用來提供表達。[0176]在細菌宿主中用以指導本發(fā)明絲氨酸蛋白酶的轉錄的啟動子序列的例子是大腸桿菌的Iac操縱子、天藍色鏈霉菌瓊脂糖酶dagA啟動子、地衣芽孢桿菌α -淀粉酶基因(amyL)的啟動子、嗜熱脂肪芽胞桿菌麥芽糖淀粉酶基因(amyM)的啟動子、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因的啟動子等的啟動子
[0177]適宜的終止子包括上述提到的基因或其他任何鑒定過的終止子序列的終止子。
[0178]適宜的轉化或選擇標記包括補足宿主中的缺陷的標記，例如枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌或曲霉菌amdS和niaD的dal基因。選擇還可基于給予抗生素抗性的標記，如氨節(jié)青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、腐草霉素或勻霉素抗性。
[0179]優(yōu)選本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶的細胞外表達。因此，重組載體包括在所選宿主中促進分泌的序列。本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶的信號序列或前序列或前肽可包括在重組表達載體中，或者可用另一個能在所選宿主中促進表達的信號序列來替代天然信號序列。因此，所選信號序列可以與表達宿主同源或者異源。天然原肽還可用另一原肽替代。原肽可以與表達宿主同源或者異源。
[0180]適宜的信號序列的例子是真菌或酵母生物的信號序列，例如源自于表達良好的基因的信號序列。這些信號序列從文獻中已被詳知。
[0181]重組載體可進一步包括能促進載體整合入宿主染色體DNA中以得到穩(wěn)定的表達和/或促進瞄準宿主基因組中的某些位點的序列。
[0182]本發(fā)明的畸枝霉屬ALK04122蛋白酶及其自身的信號序列從里氏木霉cbhl(cel7A)啟動子表達，如例2所述。用于轉化里氏木霉宿主的表達載體的構建還包括cbhl終止子和用于從未轉化細胞里選擇轉化子的合成的amdS標記。
[0183]本發(fā)明還涉及含有如上所述的重組表達載體的宿主細胞。用于生產真菌絲氨酸蛋白酶的適宜宿主是同源或異源宿主，例如包括細菌、酵母、真菌在內的微生物宿主。也可以使用植物細胞或哺乳動物細胞的生產體系。
[0184]如木霉囷屬、曲霉屬、鍵抱囷屬、腐質霉屬、金抱子囷屬、鏈抱霉屬、根霉屬囷、青霉菌屬、毀絲霉屬和被抱霉屬的絲狀真菌由于下游處理和酶產物回收的簡便性是優(yōu)選的宿主。適宜的表達和生產宿主體系是如從絲狀真菌宿主里氏木霉(EP244234)中研發(fā)出的生產體系，或者如米曲霉或黑曲霉(W09708325，US5843745，US5770418)、泡盛曲霉、醬油曲霉和日本曲霉類型的菌株的曲霉菌生產體系，或者為如尖孢鐮刀菌(Malardier等人，1989)或鍵抱霉的鍵刀囷以及為粗糖脈抱囷、黑根毛霉、聞山被抱霉、棉毛嗜熱絲抱霉或腐質霉或為真菌孢子(US6573086)而研發(fā)的生產體系。為酵母研發(fā)的適宜生產體系是為釀酒酵母、粟酒裂酵母或畢赤酵母研發(fā)的體系。為細菌研發(fā)的適宜生產系統(tǒng)是為芽胞桿菌屬(如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌)，為大腸桿菌，或者為放射菌類鏈霉菌屬研發(fā)的生產系統(tǒng)。優(yōu)選地，本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶是從木霉菌屬或曲霉屬的絲狀真菌宿主生產的，例如里氏木霉或黑曲霉、米曲霉、醬油曲霉、泡盛曲霉或日本曲霉典型菌株。根據(jù)本發(fā)明的最優(yōu)選實施方式，真菌絲氨酸蛋白酶在里氏木霉中生產。
[0185]本發(fā)明還涉及一種生產具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽的方法，所述方法包括培養(yǎng)天然或重組宿主細胞的步驟，該細胞在適宜條件下具有本發(fā)明絲氨酸蛋白酶的重組表達載體，并可選擇性地分離所述酶。生產培養(yǎng)基可以是適合培養(yǎng)宿主生物且含有有效表達的誘導物的培養(yǎng)基。適宜培養(yǎng)基從文獻中已被詳知。
[0186]本發(fā)明涉及一種具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽，所述多肽由本發(fā)明的核酸分子編碼，并且可以由如上所述的方法得到。
[0187]本發(fā)明進一步涉及一種獲取包含具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽的酶制劑的方法，所述方法包含如下步驟:培養(yǎng)具有本發(fā)明表達載體的宿主細胞，以及要么從細胞中回收多肽，要么從培養(yǎng)基中分離細胞并取得具有絲氨酸蛋白酶活性的上清液。
[0188]本發(fā)明還涉及一種具有如上所述的絲氨酸蛋白酶的酶制劑。該酶制劑或酶組合物具有絲氨酸蛋白酶活性，并且可以通過依據(jù)本發(fā)明的方法獲得。
[0189]包含本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶的酶制劑以及酶組合物在本發(fā)明的范圍內。
[0190]包含本發(fā)明絲氨酸蛋白酶的酶制劑或酶組合物(如去垢劑配方)可進一步包含選自于蛋白酶(除本發(fā)明外的其他蛋白酶)、淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶、角質酶、果膠酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶和氧化酶的其他酶，例如含有或不含介體的漆酶或過氧化物酶。這些酶被預計能夠增強本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶的性能，例如通過去除在要被處理的材料中存在的碳水化合物和油或脂。所述酶可以是通過宿主品種生產的天然或重組酶，或者可以在培養(yǎng)過程后加入到培養(yǎng)基上清液中。
[0191]所述酶制劑或酶組合物可進一步包含選自于表面活性劑或表面活化劑、緩沖液、防蝕劑、穩(wěn)定劑、漂白劑、介體、增潔劑、腐蝕劑、研磨劑和防腐劑、光亮劑、抗再沉積劑、染料、色素、香料等的一種或多種適宜添加劑。
[0192]表面活性劑在乳化油脂和濕化表面時有用。表面活性劑可以是包括半極性的和/或陰離子和/或陽離子和/或兩性離子的非離子表面活性劑。
[0193]可在酶制劑或酶組合物中加入緩沖液以調節(jié)pH值，或影響其他成分的性能或穩(wěn)定性。
[0194]適宜的穩(wěn)定劑包括如丙二醇或甘油的多元醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物、妝等。
[0195]漂白劑被用來氧化和降解有機化合物。適宜的化學漂白劑系統(tǒng)的例子有H2O2來源，例如含有或不含有形成過酸的漂白激活劑(如四乙酰乙二胺)的過硼酸鹽或過碳酸鉀，或者如酰胺、酰亞胺或砜類的過氧酸?；瘜W氧化劑可通過使用氧化酶、例如漆酶或過氧化物酶來部分或完全取代。許多漆酶在介體缺失的情況下不能有效運作。
[0196]增潔劑或絡合劑包括如沸石、二磷酸、三磷酸、碳酸鹽、檸檬酸等的物質。酶制劑可進一步包含一種或多種聚合體，例如羥甲基化纖維素、聚(乙烯乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)等。也可加入柔順劑、腐蝕劑、用于防止其它成分腐壞的防腐劑、研磨劑和以及修飾起泡和粘性性質的物質。
[0197]根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式，包含所述酶的所述酶制劑或酶組合物以液體、粉末、顆?；蛘咂瑒┑男问酱嬖?。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式，所述組合物是液體、粉末、顆粒或者片劑形式的去垢劑制劑。另外，制劑或組合物中的酶可以固定酶的形式存在。
[0198]本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶可以和其他蛋白酶、尤其是堿性蛋白酶類似地用于去垢劑、蛋白質、釀酒、肉、照相業(yè)、皮革業(yè)、乳業(yè)和制藥工業(yè)(Kalisz，1988 ;Rao等人，1988)。舉例來說，它可被用作將纖維蛋白廢物(如角、皮革、指甲和毛發(fā))轉化為有用的生物質、蛋白質精料或氨基酸的化學藥品的替代物(Anwar和Saleemuddin, 1988)。本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶的使用可以與其他酶類似地在改進皮革質量、減少環(huán)境污染和節(jié)省能源方面被證明是成功的，它也可與堿性絲氨酸蛋白酶一樣在肽的合成與D，L-氨基酸混合物的解析上使用?？莶輻U菌蛋白酶與廣譜抗生素結合治療燒傷和創(chuàng)傷是絲氨酸蛋白酶在醫(yī)藥工業(yè)中應用的一個例子，因此本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶還可有這類應用，并可與堿性蛋白酶類似地應用于去除外科手術器械上的血潰和清潔隱形眼鏡或假牙。與源自于冠狀耳霉的堿性蛋白酶類似，本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶可用于在動物細胞培養(yǎng)基中替代胰蛋白酶。本發(fā)明的蛋白酶還可用于膜的清潔和生物膜的破壞。在烘焙中，本蛋白酶可用于水解食物蛋白質(如牛奶中的蛋白質)的如谷膠網絡的破壞及其他食物應用。它們還可用于如處理酵母、精煉(從動物骨頭中分離更多蛋白質)、創(chuàng)造新味、減少苦味、改變乳化性質、產生具有生物活性的肽和減少蛋白質的變應原性。底物包括動物、植物和微生物蛋白質。
[0199]去垢劑工業(yè)、尤其是衣服去垢劑工業(yè)是在高pH值范圍內具有活性的蛋白酶的單一的主要消費者(Anwar和Saleemuddin, 1998)。理想的去垢劑蛋白酶應具有廣泛的底物特異性，以促進由食物、草、血液和其他身體分泌物產生的多種污垢的去除。它還應在去垢劑溶液的PH值和離子強度下、洗滌溫度和pH值條件下具有活性，能忍受機械處理及加入去垢劑的螯合劑和氧化劑。出于保護能源的意識，現(xiàn)在希望的是在較低溫度下使用蛋白酶。
[0200]本發(fā)明還涉及絲氨酸蛋白酶或酶制劑在去垢劑、處理紡織品纖維、處理蛋白質材料(如毛、發(fā)、絲、皮革)、處理飼料或食物、或任何涉及蛋白質材料的修飾、降解或去除的應用方面的使用。
[0201]因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式是如上描述的絲氨酸蛋白酶作為在洗衣去垢劑和包括自動洗碗組合物的洗碗組合物中有用的去垢劑添加劑的應用。
[0202]用語“去垢劑”用以表示用來協(xié)助清潔或具有清潔性質的物質或材料。術語“去垢力”表示清潔性質的存在或程度。清潔性質的程度可以測試于不同的蛋白質或含蛋白質的底物材料或污垢或污垢混合物，其粘在如紡織品纖維或玻璃上的固態(tài)的、不溶于水的載體上。典型的蛋白質材料包括血液、奶、墨水、蛋、草和醬汁。以測試為目的的多種蛋白質污垢已能在市場上買到。去垢劑酶的功能是降解和去除含蛋白質的污垢。測試結果依用于洗滌測試的污垢的種類、去垢劑的成分和紡織品的本性和狀態(tài)而定(Maurer，2004)。
[0203]在本發(fā)明中，術語“低溫”是指從10°C到30°C的溫度范圍，根據(jù)實驗其對許多現(xiàn)有的酶制劑，尤其是去垢劑酶制劑的性能并不是最佳的。術語“中溫”是指從30°C到60°C的溫度范圍。
[0204]術語“可用于低溫或中溫范圍內”包括希望酶能在低溫或中溫范圍(10°C到60°C)內有效運作的工業(yè)應用。這類應用包括其在食物、飼料和皮革工業(yè)、制藥、診斷、廢物管理和銀回收中的應用。如在此所指，這些應用不包括本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶作為生物防控劑對植物致病性真菌和線蟲起生物防控作用的應用。
[0205]在本發(fā)明中，術語“去垢劑穩(wěn)定性”是指酶或酶變體在去垢劑溶液、在儲藏和/或洗滌過程中充分保留其活性。因此，在如輕型生態(tài)標簽標準去垢劑(Ecolabel ReferenceDetergent, wfk Testgewebe GmbH)或如例6表3中描述的市售液態(tài)去垢劑的去垢劑存在下它能有效地降解或去除蛋白質污垢或材料?？赏ㄟ^測定如在去垢劑中37°C下孵育幾天之后的殘余活性來分析穩(wěn)定性。殘留蛋白酶活性可以用如例3所描述的方法或其他任何文獻中公開的方法(Gupta等人，2002)來測定。
[0206]術語絲氨酸蛋白酶的“有效用量”是指在特定去垢劑成分中為實現(xiàn)酶活性的必要的蛋白酶的量。本發(fā)明的去垢劑組合物優(yōu)選包含按重量計從約0.0001%到約10%的本發(fā)明蛋白酶變體的去垢劑組合物，更優(yōu)選從0.001%到約1%，還更加優(yōu)選從0.001%到約0.5%。
[0207]典型地，蛋白酶的洗滌性能以“去垢效率”或“去垢效果”或“清潔性質的程度”來測量，其是指例如在人為弄臟的樣品或測試布的沾污材料中的亮度或顏色變化的可見且可測量的增加。亮度或變色值可以測量，例如通過用如從例6到例8中描述的L*a*b*顏色空間坐標系的分光光度計以反射系數(shù)值來測量顏色。顯示蛋白酶性能(去污效率)的蛋白質污垢的退色或去除例如以△!>來計算，其是指酶處理過的織物的亮度值L*減去用無酶洗液(酶空白或對照)處理過的織物的亮度值L*。去垢劑的存在可提高酶在去污中的性能。本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶可在具不同成分的去垢劑存在時在堿性條件下降解多種蛋白質污垢(例6到例8)。
[0208]如例6所示，本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶在市售液體去垢劑中在10_50°C、尤其是在不高于30°C時對于去除血液/奶/墨水污垢來說明顯優(yōu)于市售蛋白酶制劑Savinase? 16L和Savinnse? Ultra 16L (圖6和圖7)。酶制劑以酶活力單位給量。當使用加入的蛋白質用量來計量給藥時也觀察到了同樣的效果(圖8)。出乎意料的是，畸枝霉屬ALK04122蛋白酶在十分廣泛的溫度范圍內、尤其在如10_30°C的低溫下顯示有極佳的去污性能，盡管它在分析條件下、以酪蛋白為底物(大約70°C，圖5A)時具有高溫最適宜性。在分析條件下具有類似溫度曲線的Savinase? (圖5A)清晰地顯示了在冷洗溫度下較低的性能。這些測試結果表明，根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶在廣泛的溫度范圍內、甚至在非常低的冷洗溫度下也具有與液態(tài)去垢劑一起使用的優(yōu)異的性能。
[0209]當在液態(tài)去垢劑中在30°C和60°C條件下測試時，除了不同的血液/奶/墨水污垢之外，畸枝霉屬ALK04122蛋白酶也能有效地去除如草和可可的污垢。處理在ATLAS LP-2清洗檢驗儀中進行，酶以酶活力單位給量。結果(圖9A-H)顯示，畸枝霉屬蛋白酶對幾種污垢既在30°C又在60°C中有效，與Savinase? Ultra 16L相比顯示了更好的去垢性能?；γ箤貯LK04122還對花生油/奶和蛋黃污 垢有效。
[0210]畸枝霉屬ALK04122蛋白酶的性能還通過含有漂白劑和光亮劑的市售傳統(tǒng)去垢劑粉末以及通過不含光亮劑和漂白劑的ECE參考去垢劑77在如例8所述的50°C、pH分別為10.5或10的條件下測試。測試了酶對于去除聚酯纖維-棉材料上的血液/奶/墨水污垢的能力。如圖1OA和B所示，本發(fā)明的蛋白酶還在極堿條件下適合于粉末狀去垢劑，當每種酶制劑劑量以酶活力單位計量時，其效果與Savinase? Ultra 16L相類似。
[0211]除了洗滌以外，本發(fā)明的酶還可在儲藏過程中充分地保持其活性，即使當儲藏在液態(tài)去垢劑中的時候，如例9和10所示?；γ箤貯LK04122蛋白酶在37°C下與如鐮孢菌屬蛋白酶Fe_RF6318(W02010125174Al)相比具有極佳的儲藏穩(wěn)定性(圖1lA和B)。圖12A和12B顯示了畸枝霉屬蛋白酶與鐮孢菌屬蛋白酶相比在輕型生態(tài)標簽標準洗滌劑(wfkTestgewebe GmbH)和市售液態(tài)去垢劑(表3)中具有尤其優(yōu)良的穩(wěn)定性，并在生態(tài)標簽中具有與市售細菌蛋白酶Savinase? 16L相比類似的穩(wěn)定性。根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶在高溫下的良好穩(wěn)定性使其尤其適合在氣候暖和的國家作為液態(tài)去垢劑配方。
[0212]根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶可在去垢劑液和去垢劑粉末中使用，如從例6到例10所示。本發(fā)明酶制劑的酶可配制用于手洗或機洗衣物，或可配制用于家庭頑固表面清潔或優(yōu)選手洗或機洗碗盤的操作。
[0213]總之可以看到，提供了一種新型的熱穩(wěn)定的真菌絲氨酸蛋白酶，其源自于嗜熱微生物，在低溫下表現(xiàn)尤其優(yōu)良，且在液態(tài)去垢劑組分中兼容和穩(wěn)定，由此只需要更少的穩(wěn)定劑和其他添加劑。
[0214]本發(fā)明以下列涉及本發(fā)明的部分實施方式的實施例加以說明，但并不意味著本發(fā)明僅限于這些實施例。
[0215]實施例
[0216]實施例1.為克隆來源于畸枝霉屬的蛋白酶基因和克隆來源于畸枝霉屬ALK04122和ALK04178菌株的蛋白酶基因的探針的合成
[0217](a) DNA的分離和所用的分子生物學方法
[0218]使用標準分子生物學方法來進行DNA的分離和酶處理(如質粒DNA的分離，用以產生DNA片段的DNA酶切消化)、大腸桿菌轉化、測序等。所用的基本方法如酶、試劑或試劑盒的生產廠家所描述，或者如標準分子生物學手冊(如SambiOOk和RUSSell，2001)中所描述。以被Raeder和Broda (1985)具體描述的方法從絲狀真菌中分離基因組DNA。
[0219](b)用于制備探針的引物
[0220]用于克隆編碼畸枝霉屬蛋白酶的基因的探針通過PCR來合成?；谡婢鞍酌?如分別在 AB Enzymes Oy 的 W02010125174、W02010125175 和 W02011003968 中的水賊鐮刀菌RF6318、銳頂鐮刀菌RF7182和里氏木霉Prbl)的氨基酸序列共有序列設計簡并的上游和下游寡核苷酸。根據(jù)選自于發(fā)表的樟絨枝霉嗜熱霉菌素(總共34個氨基酸；Swiss-Prot登記號為P13858.1)的N-端序列的區(qū)域合成了一種額外的5’端引物(DET5)。采用上述序列的氨基酸20-28來設計DET5。用于其設計的引物序列和肽序列在下面表1中表示(分別是SEQ ID NOs:1-5及SEQ ID NOs:6_10)。在該表中包括了寡聚核苷酸的名稱、SEQ ID NO、長度、簡并性和核苷酸序列，以及用于引物及其SEQ ID NOs:6-10的準備的肽序列。
[0221]表1.在探針擴增中用作PCR引物的寡核苷酸(SEQ ID NOs:1_5) [0222]
【權利要求】
1.一種絲氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶具有絲氨酸蛋白酶活性，并包括與SEQ IDNO: 18的氨基酸序列具有至少66%的一致性的氨基酸序列。
2.根據(jù)權利要求1所述的絲氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶包括與SEQID NO: 18的氨基酸序列具有至少85%的一致性的氨基酸序列。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的絲氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶具有如SEQID NO: 18所示的氨基酸序列。
4.根據(jù)權利要求1到3中任一項所述的絲氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶由如SEQIDNO: 18所示的氨基酸序列構成。
5.根據(jù)權利要求1到4中任一項所述的絲氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶由畸枝霉屬ALK04122的保藏菌株CBS128533或由畸枝霉屬ALK04178的保藏菌株CBS 128564得到。
6.根據(jù)權利要求1到5中任一項所述的絲氨酸蛋白酶，其特征在于，所述酶的成熟形式具有在20到35kDa之間的分子量，優(yōu)選在25到33kDa之間的分子量，尤其優(yōu)選在28到30kDa之間的分子量。
7.根據(jù)權利要求1到6中任一項所述的絲氨酸蛋白酶,其特征在于,在pH8.5下使用30分鐘反應時間并以酪蛋白為底物，所述酶的最適溫度是從30°C到80°C，優(yōu)選從40°C到70 V，更加優(yōu)選在50 V到80 V之間，最優(yōu)選70 V。
8.根據(jù)權利要求1到7中任一項所述的絲氨酸蛋白酶，其特征在于，在50°C的溫度下使用30分鐘反應時間并以酪蛋白為底物，所述酶的最適pH值是從至少pH6到pHIO，優(yōu)選在pH9到pHIO之間，最優(yōu)選pHIO。
9.根據(jù)權利要求1到8中任一項所述的絲氨酸蛋白酶，其特征在于，在去垢劑存在下且溫度在O到90°C之間、優(yōu)選在5到60°C、特別優(yōu)選在10到40°C時，所述酶能夠降解和去除蛋白質污垢。
10.一種具有編碼絲氨酸蛋白酶的多核苷酸序列的分離的核酸分子，其選自由如下構成的組中: (a)—種核酸分子，其編碼具有絲氨酸蛋白酶活性且包括如SEQID NO: 18所述的氨基酸序列的多肽； (b)—種核酸分子，其編碼具有絲氨酸蛋白酶活性且與SEQID NO: 18的氨基酸序列具有至少66%的一致性的多肽； (c)一種核酸分子，其包括如SEQ ID NO: 17所述的核苷酸序列的編碼序列； Cd) 一種核酸分子，其包括在DSM24410中的多核苷酸序列的編碼序列； (e)—種核酸分子，其編碼序列由于遺傳密碼的簡并性而與從(c)到(d)的任一核酸分子的編碼序列不同；和 (g)—種核酸分子，其包括多核苷酸序列，后者在嚴格條件下與包含于編碼具有絲氨酸蛋白酶活性且與如SEQ ID NO: 18所述的氨基酸序列具有至少66%的一致性的氨基酸序列的多肽的DSM24426或者SEQ ID NO: 17中的核酸分子雜交。
11.根據(jù)權利要求10所述的分離的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括多核苷酸序列，其在嚴格條件下與包括在以登記號DSM24426保藏的大腸桿菌RF8758中的包括核苷酸序列SEQ ID NO: 11的質粒pALK3092中的多核苷酸序列雜交，或者在嚴格條件下與包括在以登記號DSM24427保藏的大腸桿菌RF8759中的包括核苷酸序列SEQ ID NO: 12的質粒PALK3093中的多核苷酸序列雜交。
12.—種重組表達載體，其包括根據(jù)權利要求10或11所述的可操作于連接到能在適宜宿主中指導所述絲氨酸蛋白酶的表達的調控序列上的核酸序列。
13.—種宿主細胞，其包括根據(jù)權利要求12所述的重組表達載體。
14.根據(jù)權利要求13所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主是微生物宿主。
15.根據(jù)權利要求13或14所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主是絲狀真菌。
16.根據(jù)權利要求13到15中任一項所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主是木霉菌屬、曲霉屬、鍵抱囷屬、腐質霉屬、金抱子囷屬、鏈抱霉屬、根霉屬囷、青霉囷屬、毀絲霉屬和被抱霉屬類屬的。
17.根據(jù)權利要求16所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主是木霉菌屬或曲霉屬的。
18.根據(jù)權利要求17所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主是里氏木霉。
19.一種生產具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽的方法，所述方法包括步驟:培養(yǎng)根據(jù)權利要求13到18中任一項所述的宿主細胞；以及回收多肽。
20.一種具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽，其由根據(jù)權利要求10所述的核酸分子編碼，并可通過根據(jù)權利要求19所述的方法獲得。
21.一種獲得酶制劑的方法，其包括步驟:培養(yǎng)根據(jù)權利要求13到18中任一項所述的宿主細胞；以及 從細胞中回收多肽或者從培養(yǎng)基中分離細胞并獲得上清液。
22.—種酶制劑，其可由根據(jù)權利要求21所述的方法獲得。
23.一種酶制劑，其包括根據(jù)權利要求1到9中任一項所述的絲氨酸蛋白酶。
24.根據(jù)權利要求22或23所述的酶制劑，其特征在于，所述制劑包括選自于含有或不含介體的蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角質酶、果膠酶和氧化酶的其他酶。
25.根據(jù)權利要求22到24中任一項所述的酶制劑，其特征在于，所述制劑包括選自于穩(wěn)定劑、緩沖液、表面活性劑、增潔劑、漂白劑、介體、防蝕劑、抗再沉積劑、腐蝕劑、研磨劑、光亮劑、染料、色素、香料和防腐劑的一種或多種添加劑。
26.根據(jù)權利要求22到25中任一項所述的酶制劑，其特征在于所述酶制劑以液體、粉末、顆?；蚱瑒┑男问酱嬖?。
27.根據(jù)權利要求1到9中任一項所述的絲氨酸蛋白酶或根據(jù)權利要求22到26中任一項所述的酶制劑在去垢劑方面，在處理纖維方面，在處理優(yōu)選選自于毛、發(fā)、皮革和絲的蛋白質材料方面，在處理食物或飼料方面，或者在涉及修飾、降解或去除蛋白質材料方面的應用。
28.根據(jù)權利要求1到9中任一項所述的絲氨酸蛋白酶或根據(jù)權利要求22到26中任一項所述的酶制劑作為去垢劑添加劑、優(yōu)選在液態(tài)去垢劑、去垢劑粉末和去垢劑片中的應用。
29.一種去垢劑組分，其特征在于，所述組分包括據(jù)權利要求1到9中任一項所述的絲氨酸蛋白酶或根據(jù)權利要求22到26中任一項所述的酶制劑，以及選自于穩(wěn)定劑、緩沖液、表面活性劑、增潔劑、漂白劑、介體、防蝕劑、抗再沉積劑、腐蝕劑、研磨劑、光亮劑、染料、色素、香料和防腐劑的添加劑。
30.根據(jù)權利要求29所述的去垢劑組分，其特征在于，所述組分中包括選自于含有或不含介體的蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角質酶、果膠酶和氧化酶的其他酶 。
【文檔編號】C12N9/58GK103890172SQ201280026496
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年3月30日 優(yōu)先權日:2011年3月31日
【發(fā)明者】萊納·瓦爾塔卡里, 卡里·云圖寧, 瑪麗亞·帕洛黑莫, 彭蒂·奧亞帕洛 申請人:芬蘭Ab酶制劑公司