用于大腸桿菌中異源蛋白質(zhì)生產(chǎn)的新的表達(dá)和分泌載體系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及大腸桿菌中重組DNA表達(dá)/分泌系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)將重組蛋白向大腸桿菌周質(zhì)間隙的基于信號(hào)肽易位的潛能與大腸桿菌的膜缺陷型突變體相結(jié)合以進(jìn)一步輔助分泌至細(xì)胞間隙中。本發(fā)明還涉及表達(dá)系統(tǒng)，該表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)一步包含輔助質(zhì)粒以驅(qū)動(dòng)表達(dá)轉(zhuǎn)位子來促進(jìn)過表達(dá)重組蛋白的增加的周質(zhì)分泌。此外，該系統(tǒng)還促進(jìn)大腸桿菌中目標(biāo)特定蛋白的有效生產(chǎn)。
【專利說明】用于大腸桿菌中異源蛋白質(zhì)生產(chǎn)的新的表達(dá)和分泌載體系統(tǒng)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及革蘭氏陰性原核生物中的重組DNA表達(dá)/分泌系統(tǒng)，該革蘭氏陰性原核生物如大腸桿菌(Escherichia coli),其包括但不限于大腸桿菌BL21DE3 (E.coliBL21DE3)和大腸桿菌K12 (E.coli K12)。更詳細(xì)地，本發(fā)明涉及將重組蛋白向大腸桿菌(E.coli)的周質(zhì)間隙的基于信號(hào)肽易位的潛能與大腸桿菌的膜缺陷型突變體相結(jié)合以進(jìn)一步輔助分泌至細(xì)胞外間隙(extracellular space)的系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002]原核生物已經(jīng)被廣泛地用于生產(chǎn)重組蛋白。受控表達(dá)所需多肽或蛋白伴隨著通過重組DNA技術(shù)將編碼蛋白的基因結(jié)合在啟動(dòng)子之后，可以通過外部因素調(diào)控其活性。在載體上，最通常在質(zhì)粒上攜帶該表達(dá)構(gòu)建體。將攜帶該表達(dá)構(gòu)建體的質(zhì)粒引入宿主細(xì)菌中并在存在激活啟動(dòng)子的化合物的情況下培養(yǎng)該生物體獲得高水平表達(dá)的所需蛋白。以這種方式，可以生產(chǎn)大量的所需蛋白。
[0003]大腸桿菌是用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的最常用的原核生物。已經(jīng)開發(fā)了許多不同種類的質(zhì)粒載體用于在大腸桿菌中使用以構(gòu)建表達(dá)系統(tǒng)。不同的變異體采用了幾種不同類型的啟動(dòng)子、可選擇性標(biāo)志物和復(fù)制起點(diǎn)，其中每種不同的配置賦予表達(dá)載體獨(dú)特的性質(zhì)。在最常見的布置中，所表達(dá)的蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中積累。盡管該方法對(duì)一些蛋白質(zhì)是有用的，但是并非所有蛋白質(zhì)均可以在細(xì)胞質(zhì)中以活性狀態(tài)積累。通常，當(dāng)所需蛋白以相對(duì)于宿主蛋白高水平產(chǎn)生時(shí)，蛋白質(zhì)以不溶性顆粒(也稱為包含體)積累。以包涵體積累的蛋白質(zhì)難以恢復(fù)成活性形式。
[0004]解決該問題的兩種方·式是亦或?qū)⒛繕?biāo)蛋白輸出到內(nèi)膜和外膜之間的周質(zhì)中亦或促進(jìn)向細(xì)胞外間隙分泌。使克隆的基因產(chǎn)物分泌到周質(zhì)間隙/胞外培養(yǎng)基中存在幾種可能的優(yōu)勢，包括:1)蛋白質(zhì)產(chǎn)物可以避開胞質(zhì)蛋白酶；2)如果被分泌，通常分泌的蛋白質(zhì)如激素、木質(zhì)素降解酶和葡聚糖酶可能僅能夠在大腸桿菌內(nèi)折疊成它們的活性構(gòu)象；3)可以促進(jìn)二硫鍵的正確形成，因?yàn)橹苜|(zhì)間隙提供比細(xì)胞質(zhì)更具氧化性的環(huán)境；4)由于潛在的對(duì)宿主產(chǎn)生毒性作用，毒性酶如核酸酶或蛋白酶不能在細(xì)胞質(zhì)中生產(chǎn)；和5)易于純化。
[0005]為了將蛋白質(zhì)靶向周質(zhì)，將它們作為與遵循不同分泌途徑(例如，Sec、Tat和SRP)的信號(hào)肽序列(例如，PelB、OmpA、DsbA、TorA和MalE)的融合體表達(dá)。其他策略包括:a.修飾信號(hào)肽以提高易位；b.在大腸桿菌中使用異源信號(hào)序列；c.共表達(dá)周質(zhì)侶伴蛋白(例如，Dsb家族蛋白)；d.蛋白酶-陰性突變體株以減少蛋白水解作用。
[0006]在多數(shù)情況下，對(duì)于細(xì)胞質(zhì)生產(chǎn)來說將重組蛋白輸出至大腸桿菌周質(zhì)是優(yōu)選的。然而，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被過表達(dá)時(shí)，輸出效率顯著降低并且失去該系統(tǒng)的一些優(yōu)勢。為了避免過表達(dá)信號(hào)肽-重組蛋白融合體之后宿主的易位機(jī)制過載，已經(jīng)嘗試使用來自分泌途徑的相應(yīng)的轉(zhuǎn)位子(translocons)來補(bǔ)充天然分泌機(jī)制。
[0007]與分泌至周質(zhì)相比，胞外生產(chǎn)重組蛋白具有幾種優(yōu)勢。胞外生產(chǎn)不需要外膜破壞來回收目標(biāo)蛋白，并且因此它避免了通過周質(zhì)蛋白酶的胞內(nèi)蛋白水解作用并使得能夠連續(xù)
生產(chǎn)重組蛋白。
[0008]已經(jīng)應(yīng)用了多種方法來促進(jìn)由大腸桿菌胞外分泌重組蛋白。這些方法包括使用生化藥劑、物理方法(滲透壓沖擊、凍融)、溶菌酶處理和氯仿沖擊。然而，僅可以在收獲細(xì)胞后應(yīng)用這些方法。除了一小類蛋白質(zhì)如毒素和溶血素外，大腸桿菌通常不會(huì)胞外分泌蛋白質(zhì)。一般地，從周質(zhì)向培養(yǎng)基移動(dòng)重組蛋白是損害外膜的完整性的結(jié)果。
[0009]可以通過多種方法實(shí)現(xiàn)損害細(xì)菌外膜的完整性。一種方法涉及將產(chǎn)物融合到通常分泌到培養(yǎng)基中的載體蛋白(例如，溶血素)上，或融合到在外膜上表達(dá)的蛋白(例如，OmpF)上。
[0010]還可以通過共表達(dá)kiI或編碼跨膜蛋白TolA第三拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)域(TolAIII)的基因或來自菊歐文氏菌(E.chrysanthemi) EC16的外基因(out genes)將分泌到大腸桿菌周質(zhì)的蛋白質(zhì)釋放到培養(yǎng)基中。還可以在大腸桿菌中胞外生產(chǎn)重組蛋白中使用細(xì)菌素釋放蛋白(BRP)0
[0011]胞外生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的另一種方法使用L-型細(xì)胞，即細(xì)胞壁較少或細(xì)胞壁缺陷細(xì)胞。已構(gòu)建了外膜蛋白(0mp、t0l、lpp、enV)的敲除體并且已將相應(yīng)的滲漏株用于促進(jìn)分泌性重組蛋白表達(dá)。
[0012]大腸桿菌K12是GRAS生物體，這使它成為用于大規(guī)模生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)的安全系統(tǒng)。然而，通常認(rèn)為K12不是分泌性重組蛋白表達(dá)株。生產(chǎn)如在本發(fā)明中所描述的有效分泌型大腸桿菌K12菌株的方法是將信號(hào)肽-蛋白質(zhì)融合體和過表達(dá)轉(zhuǎn)位子組件的可能與膜缺陷型突變體相結(jié)合。
[0013]本發(fā)明利用了新信號(hào)肽的能力，選擇該信號(hào)肽的核苷酸序列從而使它們可以將目標(biāo)蛋白質(zhì)(protein of interest)引導(dǎo)至大腸桿菌細(xì)胞的不同細(xì)胞區(qū)室。因此,本發(fā)明提供七種不同信號(hào)肽的平臺(tái)，其可以被測試以確定可能用于分泌性表達(dá)所關(guān)注蛋白的最佳組合。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明涉及革蘭氏陰性原核生物中的重組DNA表達(dá)/分泌系統(tǒng)，所述革蘭氏陰性原核生物如大腸桿菌，包括但不限于大腸桿菌K12或大腸桿菌BL21DE3。所述系統(tǒng)將重組蛋白向大腸桿菌周質(zhì)間隙的基于信號(hào)肽易位的潛能與膜缺陷型突變體相結(jié)合以進(jìn)一步輔助分泌至細(xì)胞外間隙。
[0015]本發(fā)明的另一個(gè)方面是可選地包含輔助質(zhì)粒的表達(dá)載體，所述輔助質(zhì)粒促進(jìn)轉(zhuǎn)位子的表達(dá)以促進(jìn)過表達(dá)重組蛋白的增加的周質(zhì)分泌。所述系統(tǒng)可以進(jìn)一步用于生產(chǎn)由大腸桿菌宿主分泌的特定蛋白，其中通常不由宿主分泌這些蛋白。另外，該系統(tǒng)還促進(jìn)有效生產(chǎn)大腸桿菌中目標(biāo)特定蛋白。表達(dá)載體包含分泌性信號(hào)序列、可誘導(dǎo)啟動(dòng)子和目標(biāo)基因(geneof interest)。
[0016]本發(fā)明的又一個(gè)方面是獲得重組細(xì)胞的方法，所述方法包括以下操作:(a)獲得重組載體，(b)用所述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞和(C)可選地用輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化所述宿主細(xì)胞以獲得重組細(xì)胞；
[0017]本發(fā)明的再一個(gè)方面是獲得重組肽的方法，所述方法包括以下操作:(a)獲得包含分泌性信號(hào)序列、可誘導(dǎo)啟動(dòng)子和目標(biāo)基因的重組載體；(b)用重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞和可選地用輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；(C)表達(dá)重組載體并使重組肽分泌到胞外培養(yǎng)基中；以及(d)可選地純化以獲得重組肽。
[0018]本發(fā)明的另一個(gè)方面是用于獲得重組肽的試劑盒，所述試劑盒包含表達(dá)載體、重組細(xì)胞或它們的組合；以及組裝用于獲得重組肽的試劑盒的方法，所述方法包括以下操作:將表達(dá)載體、重組細(xì)胞或它們的組合合并。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]為了使本發(fā)明容易理解并付諸實(shí)踐，如參考附圖所示，現(xiàn)將對(duì)示例性實(shí)施方式進(jìn)行說明。將附圖連同下文中的詳細(xì)說明一起引入本說明書并成為本說明書的一部分，并將它們用于進(jìn)一步說明實(shí)施方式和解釋根據(jù)本發(fā)明的多種原理和優(yōu)勢。
[0020]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，圖1示出用于表達(dá)載體的質(zhì)粒圖譜的示意圖，pAEVOl攜帶受可誘導(dǎo)T5啟動(dòng)子控制的信號(hào)肽-目標(biāo)蛋白融合體。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，圖2是T7啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophiIus)麥芽糖淀粉酶轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的示意圖。
[0022]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，圖3A示出0.1mM IPTG誘導(dǎo)后來自表達(dá)融合至麥芽糖淀粉酶的MalE、TorA和pelB信號(hào)肽的菌株的裂解產(chǎn)物的SDS-PAGE分析。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，圖3B示出0.1mM IPTG誘導(dǎo)研究后來自表達(dá)融合至麥芽糖淀粉酶的DsbA、YcdO, FhuD, MdoD和pelB信號(hào)肽的菌株的裂解產(chǎn)物的SDS-PAGE分析。
[0024]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，圖4示出ImM IPTG誘導(dǎo)研究后來自表達(dá)融合至麥芽糖淀粉酶的MalE、YcdO, TorA, FhuD和pelB信號(hào)肽的菌株的裂解產(chǎn)物的SDS-PAGE分析。
`[0025]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，圖5A示出與相應(yīng)未誘導(dǎo)的培養(yǎng)相比，用融合至pelB、MalE、FhuD, DsbA和MdoD的0.1mM麥芽糖淀粉酶活性的誘導(dǎo)倍數(shù)。
[0026]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，圖5B示出與相應(yīng)未誘導(dǎo)的培養(yǎng)相比，用融合至MalE、FhuD, TorA, YcdO和pelB的ImM麥芽糖淀粉酶活性的誘導(dǎo)倍數(shù)。
[0027]附表說明
[0028]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，表1列出信號(hào)序列的氨基酸殘基和各自的輸出途徑。
[0029]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，表2列出信號(hào)序列。
[0030]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，表3列出信號(hào)序列質(zhì)粒信息。
【具體實(shí)施方式】
[0031]為了更清楚和簡潔地描述并指出要求保護(hù)的發(fā)明的主題，為在以下說明書中使用的特定術(shù)語提供了以下定義。
[0032]根據(jù)上下文需要，術(shù)語“表達(dá)”表示轉(zhuǎn)錄或翻譯，或兩者。
[0033]術(shù)語“表達(dá)載體”表示在特定宿主細(xì)胞中的包含表達(dá)可操作性連接的核苷酸序列所必需的適合的控制核苷酸序列(例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、抑制子、操縱子序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn))的重組DNA分子。表達(dá)載體可以是自復(fù)制的，如質(zhì)粒，并且因此可以攜帶復(fù)制位點(diǎn)，或者它可以是亦或隨機(jī)地亦或在目標(biāo)位點(diǎn)處整合到宿主染色體中的載體。表達(dá)載體可以包含作為可選擇性標(biāo)志物的選擇基因用于在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中提供表型選擇。表達(dá)載體也可以包含用于控制翻譯的序列。
[0034]術(shù)語“可操作性連接的”或“以可操作性組合”表示將核苷酸序列相對(duì)于控制核苷酸序列布置以起始、調(diào)控或指導(dǎo)所需蛋白質(zhì)分子的直接轉(zhuǎn)錄和/或合成。
[0035]術(shù)語“核苷酸”表示核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。“核酸”是指核苷酸聚合物并且可以是單鏈或雙鏈的?！岸嗑酆塑账帷笔侵搁L度為12個(gè)以上核苷酸的核酸。
[0036]術(shù)語“目標(biāo)核苷酸序列(Nucleotide sequence of interest)”是指編碼“目標(biāo)蛋白質(zhì)、多肽或肽”的核苷酸序列，它們的生產(chǎn)可以被本領(lǐng)域的技術(shù)人員視為是出于任何原因所期望的。這些核苷酸序列包括但不限于結(jié)構(gòu)基因、調(diào)控基因、抗體基因、酶基因等或其部分的編碼序列。目標(biāo)核苷酸序列可以包含來自多種不同生物之一的基因的編碼序列。
[0037]如果核苷酸序列可以被翻譯成蛋白質(zhì)的氨基酸序列，則核苷酸序列“編碼”或“用于編碼”蛋白質(zhì)。所述核苷酸序列可以或可以不包含明確的翻譯起始密碼子或終止密碼子。
[0038]“目標(biāo)蛋白質(zhì)、多肽或肽序列”是由“目標(biāo)核苷酸序列”所編碼的。蛋白質(zhì)、多肽或肽可以是來自任何生物的蛋白質(zhì)，所述生物包括但不限于哺乳動(dòng)物、昆蟲、微生物(如細(xì)菌和病毒)。它可以是任何類型的蛋白質(zhì)，其包括但不限于結(jié)構(gòu)蛋白、調(diào)控蛋白、抗體、酶、抑制劑、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、激素、親水性或疏水性蛋白、單體或二聚體、治療相關(guān)蛋白、工業(yè)相關(guān)蛋白或它們的部分。
[0039]“肽”是4至20個(gè)氨基酸的聚合物，“多肽”是21至50個(gè)氨基酸的聚合物，而“蛋白質(zhì)”是多于50個(gè)氨基酸的聚合物。
[0040]當(dāng)用于表示蛋白質(zhì)時(shí)，術(shù)語“部分”是指該蛋白質(zhì)的片段。片段的尺寸可以在4個(gè)氨基酸殘基至蛋白質(zhì)的全部氨基酸序列減去I個(gè)氨基酸的范圍內(nèi)。
·[0041]術(shù)語“純化的”或“純化”是指從樣品除去不希望的組分。例如，從生長培養(yǎng)基中純化分泌的蛋白質(zhì)，可以表示除去培養(yǎng)基的其他組分(即，蛋白質(zhì)和其他有機(jī)分子)，從而提高分泌的蛋白質(zhì)的百分比。
[0042]術(shù)語“修飾”、“突變”或“變異”在本文中可互換使用，并且表示:(a)其中已經(jīng)添加或刪除了一個(gè)或多個(gè)核苷酸的、或用不同的核苷酸或修飾堿基替代了一個(gè)或多個(gè)核苷酸的核苷酸序列；或(10其中已經(jīng)添加或刪除了一個(gè)或多個(gè)氨基酸的、或用不同的氨基酸替代了一個(gè)或多個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)、肽或多肽。變異可以是天然存在的或可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員之一實(shí)驗(yàn)生產(chǎn)的。變異可以是與親本序列有一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸不同的蛋白質(zhì)、肽、多肽或多核苷酸(即，添加、刪除或替代)。
[0043]術(shù)語“周質(zhì)”是指細(xì)胞質(zhì)膜的外表面和革蘭氏陰性細(xì)菌的脂多糖層的內(nèi)表面之間的凝膠狀區(qū)域。
[0044]術(shù)語“分泌”是在指細(xì)菌中表達(dá)的重組蛋白分泌至周質(zhì)或胞外生長培養(yǎng)基。
[0045]根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明涉及包含分泌性信號(hào)序列、可誘導(dǎo)啟動(dòng)子和目標(biāo)基因的表達(dá)載體。本發(fā)明還涉及包含所述載體、可選地連同輔助質(zhì)粒的重組細(xì)胞，其中，所述重組細(xì)胞是膜缺陷型細(xì)胞。
[0046]本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式涉及獲得重組細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟:a.獲得重組載體；b.用重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；和c.可選地用輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以獲得重組細(xì)胞。
[0047]另一個(gè)實(shí)施方式涉及獲得重組肽的方法，所述方法包括以下步驟:a.獲得包含分泌性信號(hào)序列、可誘導(dǎo)啟動(dòng)子和目標(biāo)基因的重組載體；b.用重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以及可選地，用輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；C.表達(dá)重組載體并將重組肽分泌到胞外培養(yǎng)基中；以及d.可選地純化以獲得重組肽。
[0048]在本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述分泌性信號(hào)序列是密碼子優(yōu)化的序列，其選自包含SEQ ID NOl至SEQ ID N07的組；并且可誘導(dǎo)啟動(dòng)子是T5啟動(dòng)子。
[0049]在本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述目標(biāo)基因選自包含原核基因和真核基因的組。
[0050]在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是原核細(xì)胞，優(yōu)選地，大腸桿菌K12 ;并且輔助質(zhì)粒是攜帶來自原核分泌系統(tǒng)的分子伴侶或轉(zhuǎn)位子的質(zhì)粒。
[0051]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式涉及用于獲得重組肽的試劑盒，所述試劑盒包含表達(dá)載體、重組細(xì)胞或它們的組合。
[0052]本發(fā)明進(jìn)一步包括組裝用于獲得重組肽的試劑盒的方法，所述方法包括以下操作:將表達(dá)載體、重組細(xì)胞或它們的組合合并。
[0053]在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式中，輔助質(zhì)粒選自包含攜帶來自細(xì)菌分泌機(jī)制(例證性地，SEC和TAT)的侶伴蛋白或轉(zhuǎn)位子的任何組分的質(zhì)粒的組。
[0054]本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過將重組蛋白、多肽或肽分泌至胞外生長培養(yǎng)基來生產(chǎn)目標(biāo)重組蛋白、多肽或肽的方法。
[0055]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，該方法利用攜帶天然大腸桿菌分泌性信號(hào)序列的特定密碼子優(yōu)化變異體的表達(dá)載體來指導(dǎo)重組蛋白、多肽或肽通過單獨(dú)的或組合的SEC、TAT或SRP輸出途徑分泌至周質(zhì)(表1)。
[0056]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中`，表達(dá)載體在可誘導(dǎo)T5啟動(dòng)子的下游攜帶信號(hào)序列，所述信號(hào)序列選自 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5、SEQ ID NO:6 或 SEQ ID NO:7 (表 2)。
[0057]在一個(gè)實(shí)施方式中，表達(dá)載體選自由質(zhì)粒pAEVOl、pAEV02、pAEV03、pAEV04、pAEV05、pAEV06、pAEV07 組成的組(表 3)。
[0058]在一個(gè)實(shí)施方式中，表達(dá)載體用于在原核宿主細(xì)胞中使用，例如，大腸桿菌(Escherichia coli)或其菌株。
[0059]在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式中，提供了由任何表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的分離的宿主細(xì)胞，以致細(xì)胞表達(dá)并分泌由該核酸編碼的目標(biāo)蛋白質(zhì)、多肽或肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞是原核宿主細(xì)胞，例如，大腸桿菌或其菌株。
[0060]在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方式中，描述了在單個(gè)核苷酸序列中使用對(duì)應(yīng)于序列ID.N0.2、ID.N0.3和ID.N0.5的利用了兩種周質(zhì)分泌信號(hào)特征的信號(hào)肽。因此，使用相應(yīng)的表達(dá)載體可以避免堵塞特定的分泌途徑并提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量。本發(fā)明中所描述的表達(dá)載體將攜帶受可誘導(dǎo)T5啟動(dòng)子控制的信號(hào)-肽目標(biāo)蛋白融合體，從而使它們服從于在大腸桿菌K12宿主中用于誘導(dǎo)異源蛋白表達(dá)。
[0061]在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方式中，描述了使用輔助質(zhì)粒來共表達(dá)屬于SEC和TAT分泌途徑的轉(zhuǎn)位子。具體地，這些輔助質(zhì)粒中的一種將編碼作為單個(gè)操縱子的基因secYdecE和secG。另一種輔助質(zhì)粒將編碼作為單個(gè)操縱子的tatA、tatB和tatC。這兩種轉(zhuǎn)位子編碼的操縱子將受可誘導(dǎo)T5啟動(dòng)子的控制從而使它們服從于在大腸桿菌K12宿主中用于誘導(dǎo)異源蛋白表達(dá)。[0062]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，使用信號(hào)肽-重組蛋白融合載體和轉(zhuǎn)位子編碼質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化具有缺陷型外膜的大腸桿菌菌株。該大腸桿菌菌株不僅將重組蛋白靶向周質(zhì)間隙，而且還將促進(jìn)其滲漏蛋白被動(dòng)擴(kuò)散穿過外膜進(jìn)入胞外培養(yǎng)基。
[0063]實(shí)施例
[0064]為了更全面地理解本發(fā)明，說明了以下制備和測試實(shí)施例。這些實(shí)施例僅是出于說明的目的，并且不應(yīng)視為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0065]實(shí)施例1
[0066]克隆麥芽糖淀粉酶
[0067]以下實(shí)施例說明將麥芽糖淀粉酶編碼基因克隆至pET20b+并用在本發(fā)明中所描述的七種其他信號(hào)肽SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO: 7替換pET20b+麥芽糖淀粉酶中的pelB信號(hào)肽。
[0068]使用攜帶NcoI和BamHI位點(diǎn)的引物擴(kuò)增來自嗜熱脂肪芽孢桿菌的麥芽糖淀粉酶基因。引物序列為:MANcoI 正向引物:5’ -gatcgtaccatgggaATGAGCAGTTCCGCAAGCGT-3’ 和MABglII 反向引物:5’ -gatcgtacagatctTCTAGACTAGTTTTGCCACG-3，。
[0069]接著，用NcoI和BglII酶消化該P(yáng)CR產(chǎn)物并將其克隆到NcoI和BamHI消化的pET-20b(+)載體中。將所得的連接混合物轉(zhuǎn)化到DH5ci大腸桿菌細(xì)胞中。序列驗(yàn)證質(zhì)粒以確定正確的麥芽糖淀粉酶編碼基因，然后用NdeI和NcoI消化以通過凝膠洗脫除去pelB信號(hào)肽。合成具有NdeI和NcoI突出末端的七種信號(hào)肽(SEQ.1D.N0.1、SEQ.1D.N0.2、SEQ.1D.N0.3、SEQ.1D.N0.4、SEQ.1D.N0.5、SEQ.1D.N0.6 和 SEQ.1D.N0.7)，并將它們克隆到該載體中。所獲得的載體保留了由來自pET-20b(+)的ATG起始密碼子限定的閱讀框(圖2)。將這七種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5 α大腸·桿菌細(xì)胞中。從DH5 α大腸桿菌細(xì)胞分離質(zhì)粒，驗(yàn)證，然后用于轉(zhuǎn)化BL21 DE3 (生產(chǎn)株，其中可以使用IPTG誘導(dǎo)異源基因表達(dá))。
[0070]實(shí)施例2
[0071]本實(shí)施例說明了使用SDS-PAGE和麥芽糖淀粉酶活性測試對(duì)不同麥芽糖淀粉酶信號(hào)肽融合體的誘導(dǎo)研究。
[0072]在以作為碳源的葡萄糖和100ug/ml氨芐西林補(bǔ)充的基本培養(yǎng)基中使所有八種BL21 (DE3)菌株生長，并在溫育振蕩器中以37°C、200rpm保持過夜。用50ml含有氨芐西林的酵母浸膏培養(yǎng)基將該培養(yǎng)物1:100稀釋至新鮮的250ml三角瓶中，并在振蕩培育箱中在37°C下以200rpm生長。當(dāng)600nm下的OD達(dá)到0.6時(shí)，將0.1mM IPTG加入到培養(yǎng)物中。然后，將培養(yǎng)物在26°C下以200rpm溫育16h。將誘導(dǎo)的和未誘導(dǎo)的培養(yǎng)物(除了未添加IPTG之外，以與誘導(dǎo)培養(yǎng)相同的方式生長)以3500rpm沉淀15分鐘。在含有IOmM NaCl (pH5)的樣品緩沖液中重懸浮沉淀物。超聲處理沉淀物以釋放可溶性蛋白，沉淀細(xì)胞碎片并在SDS-PAGE上分析上清液。類似地，通過將ImM IPTG加入培養(yǎng)物進(jìn)行誘導(dǎo)并將誘導(dǎo)溫度保持在 30。。。
[0073]在用0.1mM IPTG 誘導(dǎo)并在 26 °C 生長 16h 后，攜帶 pAEVOl、pAEV05、pAEV06 和pET-20b (+)構(gòu)建體的菌株在70kDa處呈現(xiàn)出明顯的蛋白條帶，這是麥芽糖淀粉酶在12%SDS-PAGE上預(yù)期的尺寸。pAEV06和pAEVOl中誘導(dǎo)的麥芽糖淀粉酶蛋白水平與親本載體是相當(dāng)?shù)模鳳AEV05的誘導(dǎo)水平高于親本的(圖3A和圖3B)。在攜帶pAE04和pAEV07的菌株中未生產(chǎn)麥芽糖淀粉酶。[0074]攜帶pAEV03質(zhì)粒的菌株顯示出誘導(dǎo)截短的蛋白，而pAEV02菌株顯示出明顯的麥芽糖淀粉酶的滲漏表達(dá)，即在誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)所生產(chǎn)的麥芽糖淀粉酶的量方面無差異(圖3A和 3B)。
[0075]將進(jìn)行確定麥芽糖淀粉酶蛋白的位置的實(shí)驗(yàn)。這將弄清楚信號(hào)肽融合體的分泌性質(zhì)。我們的數(shù)據(jù)提示融合至不同的信號(hào)肽將不同程度地有助于不同的目標(biāo)蛋白的表達(dá)分泌。
[0076]在用ImM IPTG 誘導(dǎo)并在 30°C生長 6h 后，攜帶 pAEVOl、pAEV02、pAEV04、pAEV05和pET-20b (+)構(gòu)建體的菌株在70kDa處呈現(xiàn)出明顯的蛋白條帶，這是麥芽糖淀粉酶在12%SDS-PAGE上預(yù)期的尺寸(圖4)。該數(shù)據(jù)表明不同的IPTG濃度和誘導(dǎo)后溫度在異源蛋白表達(dá)中起重要作用。
[0077]還使超聲處理的上清液經(jīng)受葡萄糖氧化酶法以確定麥芽糖淀粉酶活性。在麥芽糖淀粉酶活性方面，當(dāng)用0.1mM IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)物時(shí)，與親本相比，在pAEVOl構(gòu)建體中觀察到了更高的誘導(dǎo)倍數(shù)(圖5A)。
[0078]在麥芽糖淀粉酶活性方面，當(dāng)用ImM IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)物時(shí)，與親本相比，pAEV05和pAEVOl構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的菌株均顯示出更高的誘導(dǎo)倍數(shù)(圖5B)。攜帶在SDS-PAGE上顯示出麥芽糖淀粉酶表達(dá)的其他構(gòu)建體的菌株表現(xiàn)出與親本相似的功能性麥芽糖淀粉酶活性(圖5A和 5B)。
[0079]結(jié)果表明在pAEVOl和pAEV05的情況下，與親本質(zhì)粒相比，明顯更大量的功能性的麥芽糖淀粉酶被導(dǎo)向周質(zhì)間隙。與PelB相比，對(duì)于將麥芽糖淀粉酶定位至大腸桿菌周質(zhì)間隙，MalE和FhuD似乎表現(xiàn)出改善的信號(hào)肽。
[0080]表1
[0081]`
信號(hào)序列途徑每個(gè)信號(hào)序列的氨基酸序列所得質(zhì)粒
MalE SEC'MKIKTG ARIL ALS ALTTMM FSASALApAEVOl
YcdO TAT-SEC MTINFRRNALQLSVAALFSSAFMANApAEV02
MdoD TAT-SEC MDRRRFIICGSMAMAAVCGTSGIASLFSQAAFA pAEV03

MNNNDLFQASRRRFLAQLGGLTVAGMLGPSLL
TorA TATpAEV04

TPRRATAAQAA
FhuD TAT-SEC MSGLPLISRRRLLTAMALSPLLWQMNTAHApAEV05
DsbA SRPMKK1WLALAGLVLAFSASAAQpAEY06
OmpA SECM K KTAIAI AVAL AG FAT VAQ ApAEV07
[0082]表2
[0083]
【權(quán)利要求】
1.一種重組宿主細(xì)胞，包含表達(dá)載體和可選的輔助質(zhì)粒，其中，所述重組細(xì)胞是膜缺陷型細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體能夠引導(dǎo)在適合的宿主細(xì)胞中蛋白質(zhì)、多肽或肽的表達(dá)和分泌，其中，所述表達(dá)載體還包含分泌性信號(hào)序列、可誘導(dǎo)啟動(dòng)子和目標(biāo)基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的輔助質(zhì)粒，所述輔助質(zhì)粒共表達(dá)屬于SEC、TAT、SRP輸出途徑或它們的組合的轉(zhuǎn)位子。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其中，目標(biāo)基因包括原核基因和真核基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其中，所述分泌性信號(hào)序列選自SEQID NO: 1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8 或 SEQ ID NO:9。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體在宿主細(xì)胞中使用，其中所述宿主細(xì)胞是原核生物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離的宿主細(xì)胞，其中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌或其菌株。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含至少一種質(zhì)粒，所述質(zhì)粒選自pAEVOl、pAEV02、pAEV03、pAEV04、pAEV05、pAEV06 或 pAEV07。
9.一種獲得重組細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟: a)獲得重組載體； b)用所述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；和` c)可選地用輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化所述宿主細(xì)胞以獲得所述重組細(xì)胞。
10.一種獲得重組肽的方法，所述方法包括以下步驟: a)獲得包含分泌性信號(hào)序列、可誘導(dǎo)啟動(dòng)子和目標(biāo)基因的重組載體； b)用所述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并且可選地用輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化所述宿主細(xì)胞； c)表達(dá)所述重組載體并使所述重組肽分泌到胞外培養(yǎng)基中；和 d)可選地純化所述重組肽。
11.根據(jù)權(quán)利要求9和10中所述的輔助質(zhì)粒，所述輔助質(zhì)粒共表達(dá)屬于SEC、TAT、SRP輸出途徑或它們的組合的轉(zhuǎn)位子。
12.根據(jù)權(quán)利要求9和10所述的方法，其中，表達(dá)載體包含至少一種質(zhì)粒，所述質(zhì)粒選自 pAEVOl、pAEV02、pAEV03、pAEV04、pAEV05、pAEV06 或 pAEV07。
13.根據(jù)權(quán)利要求9和10所述的方法，其中，所述表達(dá)載體包含密碼子優(yōu)化的分泌性信號(hào)序列，所述分泌性信號(hào)序列選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8 或 SEQ ID NO:9。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述可誘導(dǎo)啟動(dòng)子是T5啟動(dòng)子。
15.根據(jù)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞具有缺陷外膜，進(jìn)一步用信號(hào)肽-重組蛋白融合載體和轉(zhuǎn)位子編碼質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化所述宿主細(xì)胞。
16.一種用于獲得重組肽的試劑盒，所述試劑盒包含表達(dá)載體、重組細(xì)胞或其組合。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103797122SQ201280026991
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年4月8日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月8日
【發(fā)明者】埃亞潘·奈爾, 蘇尼爾·庫馬爾·蘇庫馬蘭, 沙拉卡·薩曼特, 古尼亞·古普塔, 蘇塔卡恩·披猜姆圖, 加內(nèi)什·薩姆巴西瓦姆 申請人:安瑟生物科技私人有限公司