用于治療與masp-2依賴性補(bǔ)體活化相關(guān)的狀況的方法
【專利摘要】在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了在有生命受試者中抑制MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的影響的方法。本發(fā)明包括將有效抑制MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的量的MASP-2抑制劑施用于需要其的受試者的步驟。在一些實(shí)施方案中，MASP-2抑制劑抑制與MASP-2介導(dǎo)的替代補(bǔ)體途徑活化相關(guān)的細(xì)胞損傷，而使免疫系統(tǒng)的經(jīng)典(C1q依賴性)途徑組分保持完整。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于抑制凝集素依賴性補(bǔ)體活化的影響的組合物，所述組合物包含治療有效量的MASP-2抑制劑和藥學(xué)可接受的載體。
【專利說(shuō)明】用于治療與MASP-2依賴性補(bǔ)體活化相關(guān)的狀況的方法
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[0003]發(fā)明背景
補(bǔ)體系統(tǒng)為在人和其他脊椎動(dòng)物中啟動(dòng)、增強(qiáng)和協(xié)調(diào)對(duì)微生物感染和其他急性損傷的免疫應(yīng)答提供了早期的作用機(jī)制(M.K.Liszewski和J.P.Atkinson, 1993，inFundamental Immunology,第三版，W.E.Paul 編輯，Raven Press, Ltd., New York)。盡管補(bǔ)體活化提供了重要的針對(duì)潛在病原體的第一線防御，但是促進(jìn)保護(hù)性免疫應(yīng)答的補(bǔ)體活性也可以表現(xiàn)出對(duì)宿主的潛在威脅(K.R.Kalli,等人，Springer Semin.1mmunopathol./5":417_431， 1994; B.P.Morgan, Eur.J.Clinical Invest!g.匆:219-228, 1994)。例如，C3和C5蛋白水解產(chǎn)物募集并活化嗜中性粒細(xì)胞。盡管對(duì)宿主防御不可缺少，但是活化的中性粒細(xì)胞不加選擇地釋放破壞性酶，可能造成器官損傷。此外，補(bǔ)體活化可能導(dǎo)致溶胞的補(bǔ)體組分沉積在附近的宿主細(xì)胞以及微生物靶上，導(dǎo)致宿主細(xì)胞裂解。
[0004]補(bǔ)體系統(tǒng)也已經(jīng)被牽連進(jìn)許多急性和慢性疾病狀況的發(fā)病機(jī)制，所述疾病包括:心肌梗死、中風(fēng)、ARDS、再灌注損傷、敗血癥性休克、熱燒傷之后的毛細(xì)血管滲漏、心肺分流術(shù)后炎癥、移植排斥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、重癥肌無(wú)力和阿爾茨海默氏病。在幾乎所有的這些疾病中，補(bǔ)體都不是病因，而是發(fā)病機(jī)制所涉及的若干因素之一。盡管如此，補(bǔ)體活化可能是重要的病理機(jī)制，并在許多這類疾病狀況的臨床控制中表現(xiàn)出有效之處。對(duì)各種疾病狀況中補(bǔ)體介導(dǎo)的組織損傷的重要性的增加的認(rèn)識(shí)增強(qiáng)了對(duì)有效補(bǔ)體抑制藥物的需求。迄今為止，依庫(kù)麗單抗(Solaris?),針對(duì)C5的抗體,是已被批準(zhǔn)用于人使用的唯一補(bǔ)體-靶向藥物。然而，C5是位于補(bǔ)體系統(tǒng)“下游”的幾個(gè)效應(yīng)分子之一，并且C5的阻斷不抑制補(bǔ)體系統(tǒng)的活化。因此，補(bǔ)體激活的起始步驟的抑制劑相對(duì)于“下游”補(bǔ)體抑制劑具有顯著優(yōu)勢(shì) 。
[0005]目前，普遍認(rèn)為補(bǔ)體系統(tǒng)可通過(guò)三種不同的途徑被活化:經(jīng)典途徑、凝集素途徑和替代途徑。經(jīng)典途徑通常是由宿主抗體與外源顆粒(即抗原)相結(jié)合構(gòu)成的復(fù)合物觸發(fā)的，因此需要預(yù)先暴露于該抗原來(lái)產(chǎn)生特異性抗體應(yīng)答。因?yàn)榻?jīng)典途徑的活化取決于宿主的先前的適應(yīng)性免疫應(yīng)答，所以經(jīng)典途徑是獲得性免疫系統(tǒng)的一部分。相反，凝集素途徑和替代途徑兩者不依賴于適應(yīng)性免疫(adaptive immunity),是先天性免疫系統(tǒng)的一部分。
[0006]補(bǔ)體系統(tǒng)的活化導(dǎo)致了絲氨酸蛋白酶酶原的序貫活化。經(jīng)典途徑活化的第一步是特異性識(shí)別分子Clq與結(jié)合了抗原的IgG和IgM分子結(jié)合。Clq與Clr和Cls絲氨酸蛋白酶酶原結(jié)合成稱為Cl的復(fù)合物。當(dāng)Clq與免疫復(fù)合物結(jié)合之后，Clr的Arg-1le位點(diǎn)進(jìn)行自我蛋白水解裂解，接著是Clr介導(dǎo)的裂解和Cls的活化，從而獲得裂解C4和C2的能力。C4裂解成兩個(gè)片段，稱為C4a和C4b，且類似地，C2裂解成C2a和C2b。C4b片段能夠與鄰近的羥基或氨基形成共價(jià)鍵，且通過(guò)與活化C2的C2a片段進(jìn)行非共價(jià)相互作用而產(chǎn)生C3轉(zhuǎn)化酶(C4b2a)。C3轉(zhuǎn)化酶(C4b2a)通過(guò)蛋白水解裂解成C3a和C3b亞組分而活化C3，導(dǎo)致生成C5轉(zhuǎn)化酶(C4b2a3b)，所述C5轉(zhuǎn)化酶(C4b2a3b)通過(guò)裂解C5而導(dǎo)致形成膜攻擊復(fù)合物(C5b與C6、C7、C8和C-9組合，也稱為“MAC”)，所述膜攻擊復(fù)合物可以破壞細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞裂解。C3和C4的活化形式(C3b和C4b)共價(jià)沉積在外源靶表面上，其被多種吞噬細(xì)胞上的補(bǔ)體受體所識(shí)別。
[0007]獨(dú)立地，補(bǔ)體系統(tǒng)通過(guò)凝集素途徑活化的第一步也是特異性識(shí)別分子的結(jié)合，接著是所結(jié)合的絲氨酸蛋白酶酶原的活化。然而，凝集素途徑中的識(shí)別分子包含一組碳水化合物結(jié)合蛋白(甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)、H-纖維膠凝蛋白(H-ficolin)、M-纖維膠凝蛋白、L-纖維膠凝蛋白和C型凝集素CL-1 I)(統(tǒng)稱為凝集素)，而不是通過(guò)Clq來(lái)結(jié)合免疫復(fù)合物。參見 J.等}Biochim.Biophys.Acta 757J?:387-400，(2002) ; Holmskov等人，Annu.Rev.1mmunol.21:547-578 (2003) ; Teh 等人，Immunology 101:225-232(2000))。還參見 J.Luet等人，Biochim Biophys Acta 1572:387-400 (2002) ; Holmskov等人，Annu Rev Immunol 21:547-578 (2003) ; Teh 等人，Immunology 101:225-232(2000); Hansen 等人，J.1mmunol 185(10):6096-6104 (2010)。
[0008]Ikeda等人首先證明，與Clq類似，MBL在與酵母甘露聚糖包被的紅細(xì)胞結(jié)合之后能夠以C4依賴的方式使補(bǔ)體系統(tǒng)活化(Ikeda等人，J.Biol.Chem.^:7451-7454,(1987))。MBL是膠原凝集素蛋白家族的成員，是鈣依賴性凝集素，與具有定位于吡喃糖環(huán)赤道面上的3-羥基和4-羥基的碳水化合物結(jié)合。因此MBL的重要配體是D-甘露糖和N-乙酰-D-葡糖胺，而不符合這種空間要求的碳水化合物則對(duì)MBL沒有可檢出的親和力(Weis等人，Nature 360:127-134, (1992))。MBL和單價(jià)糖之間的相互作用是極弱的，解離常數(shù)通常在單位數(shù)毫摩爾(single-digit millimolar)的范圍內(nèi)。MBL通過(guò)親合力(即通過(guò)同時(shí)與彼此緊密鄰近定位的多個(gè)單糖殘基相互作用)實(shí)現(xiàn)了與聚糖配體的緊密特異性結(jié)合(Lee 等人，Archiv.Biochem.Biophys.299:129-136，(1992))。MBL 識(shí)別通常修飾微生物諸如細(xì)菌、酵母、寄生蟲和某些病毒的碳水化合物模式。相反，MBL不識(shí)別D-半乳糖和唾液酸，即倒數(shù)第二位的糖和倒數(shù)第一位的糖，它們一般修飾哺乳動(dòng)物血漿和細(xì)胞表面糖蛋白上存在的“成熟”復(fù)雜糖綴合物。認(rèn)為這種結(jié)合特異性促進(jìn)“外源”表面的識(shí)別且有助于保護(hù)免于“自身活化”。然而，MBL確實(shí)以高親和力結(jié)合高甘露糖“前體”聚糖簇，這些簇位于被隔離在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體內(nèi)的N-連接的糖蛋白和糖脂上(Maynard等人，7； Biol.Chem.257:3788-3794，1982)。因此，受損細(xì)胞是通過(guò)MBL結(jié)合的凝集素途徑活化的潛在目標(biāo)。
[0009]纖維膠凝蛋白(ficolin)具有類型不同于MBL的凝集素結(jié)構(gòu)域，稱為血纖蛋白原樣結(jié)構(gòu)域。纖維膠凝蛋白以不依賴Ca++的方式來(lái)結(jié)合糖殘基。在人體中，已經(jīng)鑒定出纖維膠凝蛋白的三種類型(L-纖維膠凝蛋白、M-纖維膠凝蛋白和H-纖維膠凝蛋白)。L-纖維膠凝蛋白和H-纖維膠凝蛋白這兩種血清纖維膠凝蛋白共同對(duì)N-乙酰-D-葡糖胺具有特異性；然而，H-纖維膠凝蛋白還結(jié)合N-乙酰-D-半乳糖胺。L-纖維膠凝蛋白、H-纖維膠凝蛋白、CL-1l和MBL的糖特異性的差異意味著不同的凝集素可能是互補(bǔ)的，盡管有重疊，但是可能靶向不同的糖綴合物。這個(gè)觀點(diǎn)得到了最新報(bào)道的支持，即在凝集素途徑的已知凝集素中，只有L-纖維膠凝蛋白與脂磷壁酸特異性結(jié)合，脂磷壁酸是一種存在于所有革蘭氏陽(yáng)性菌上的細(xì)胞壁糖綴合物(Lynch等人，J Immunol.77J?: 1198-1202, (2004))。膠原凝集素(即MBL)和纖維膠凝蛋白在氨基酸序列上沒有顯著的相似性。然而，兩組蛋白質(zhì)具有類似的結(jié)構(gòu)域組構(gòu)，與Clq類似，裝配成寡聚結(jié)構(gòu)，這樣就使得多位點(diǎn)結(jié)合的可能性最大化。
[0010]MBL的血清濃度在健康人群中是高度可變的，這在遺傳上是由MBL基因的啟動(dòng)子和編碼區(qū)二者的多態(tài)性/突變所控制的。作為急性期蛋白，MBL的表達(dá)在炎癥期間進(jìn)一步上調(diào)。L-纖維膠凝蛋白在血清中存在的濃度與MBL的濃度類似。因此，凝集素途徑的L-纖維膠凝蛋白分支在力量上可能與MBL臂相當(dāng)。MBL和纖維膠凝蛋白也可能作為調(diào)理素起作用，這允許吞曬細(xì)胞祀向至MBL和纖維膠凝蛋白裝飾的表面(參見Jack等人，J LeukocBiol., 77 (3):328-36 (2004), Matsushita和Fujita, Immunobiology, 205 (4-5):490-7(2002), Aoyagi 等人，J Immunol，174 (I): 418-25 (2005)。這種調(diào)理素作用需要這些蛋白質(zhì)與吞卩遼細(xì)胞受體相互作用(Kuhlman等人，J.Exp.Med.169\ 1733, (1989);Matsushita 等人，J.Biol.Chem.271:2448-54, (1996))，其身份還未得到確定。
[0011]人MBL通過(guò)其膠原樣結(jié)構(gòu)域與獨(dú)特的Clr/Cls樣絲氨酸蛋白酶(稱為MBL相關(guān)的絲氨酸蛋白酶(MBL-associated serine proteases, MASP))形成特異性、高親和力的相互作用。迄今為止已經(jīng)描述了三種MASP。首先，鑒定出單一的酶“MASP”，其特征是負(fù)責(zé)啟動(dòng)補(bǔ)體級(jí)聯(lián)(即裂解 C2 和 C4)的酶(Matsushita 等人，J Exp Med 176(6): 1497-1502(1992) ; Ji 等人，J.1mmunol.7^:571-578, (1993))。隨后確定 MASP 活性，實(shí)際上是兩種蛋白酶 MASP-1 和 MASP-2 的混合物(Thiel 等人，Nature J浙:506-510, (1997))。然而，有研究表明僅MBL-MASP-2復(fù)合物就足以使補(bǔ)體活化(Vorup-Jensen等人，7；Immunol.165\ 2093-2100, (2000))。此外，只有 MASP-2 快速裂解 C2 和 C4 (Ambrus 等人，J.1mmunol.7沿:1374-1382，(2003))。因此，MASP-2 是負(fù)責(zé)激活 C4 和 C2 以產(chǎn)生 C3 轉(zhuǎn)化酶C4b2a的蛋白酶。這是不同于經(jīng)典途徑的Cl復(fù)合物的顯著差異，Cl復(fù)合物中兩種特異性絲氨酸蛋白酶(Clr和Cls)協(xié)同作用導(dǎo)致了補(bǔ)體系統(tǒng)的活化。此外，已經(jīng)分離出第三種新的蛋白酶 MASP-3 (Dahl, Μ.R.，等人，Immunity 152001)。MASP-1 和 MASP-3是同一基因的可變剪接產(chǎn)物。
[0012]MASP與Cl復(fù)合物的酶成分Clr和Cls的那些共享相同的結(jié)構(gòu)域組構(gòu)(Sim等人，Biochem.Soc.Trans.28:545，2000)。這些結(jié)構(gòu)域包括 N 末端 Clr/Cls/ 海膽 VEGF/ 骨形成蛋白(CUB)結(jié)構(gòu)域、表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域、第二 CUB結(jié)構(gòu)域、補(bǔ)體調(diào)控蛋白結(jié)構(gòu)域的串聯(lián)和絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域。與在Cl蛋白酶中一樣，MASP-2的活化通過(guò)絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域附近的Arg-1le鍵裂解而產(chǎn)生，這將酶分成二硫鍵連接的A鏈和B鏈，后者由絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。
[0013]MBL還可以與MASP-2的可變切片形式(被稱作19 kDa的MBL相關(guān)蛋白(MApl9)或小MBL相關(guān)蛋白(sMAP),其缺乏MASP2的催化活性)結(jié)合。(Stover, J.1mmunol.7似:3481-90, (1999) ; Takahashi 等人，Int.1mmunol.77:859-863，(1999))。MApl9包括MASP-2的前兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，其后接著是4個(gè)獨(dú)特氨基酸的額外序列。Mapl9的功能不明確(Degn 等人，J Immunol.Methods, 2011)。MASP-1 和 MASP-2 基因分別位于人 3 號(hào)染色體和 I 號(hào)染色體上(Schwaeble 等人，Immunobiology 455-466, (2002))。
[0014]若干證據(jù)表明存在不同的MBL-MASP復(fù)合物，且血清中MASP的大部分不與MBL復(fù)合(Thiel,等人，J Immunol.165:878-887, (2000))。H-纖維膠凝蛋白和L-纖維膠凝蛋白都與所有的MASP結(jié)合,并且激活凝集素補(bǔ)體途徑，同MBL —樣(Dahl等人，Immunity75-: 127-35, (2001) ; Matsushita 等人，7； Immunol.7你:3502-3506，(2002))。凝集素途徑和經(jīng)典途徑都形成共同的C3轉(zhuǎn)化酶(C4b2a)，這兩條途徑在這一步會(huì)合。
[0015]普遍認(rèn)為在天然宿主中，凝集素途徑在宿主抵抗感染的防御中具有重要作用。MBL參與宿主防御的強(qiáng)有力證據(jù)來(lái)自于對(duì)功能性MBL血清水平降低的患者的分析(Kilpatrick, Biochim.Biophys.Actal572\AQ\-Al?>, (2002))。這些患者表現(xiàn)出復(fù)發(fā)性細(xì)菌和真菌感染的易感性。這些癥狀通常在生命早期在易損表觀窗期間是明顯的，因?yàn)閺哪阁w獲得的抗體效價(jià)降低，但處于全部抗體應(yīng)答發(fā)展之前。這種癥狀經(jīng)常是由于MBL膠原部分的數(shù)個(gè)位點(diǎn)突變引起的，其干擾了 MBL寡聚體的正確形成。然而，由于MBL可以作為不依賴于補(bǔ)體的調(diào)理素起作用，所以還不知道對(duì)感染的易感性增加在多大程度上是由于受損的補(bǔ)體活化所致。
[0016]與經(jīng)典途徑和凝集素途徑相反，沒有發(fā)現(xiàn)替代途徑中完成識(shí)別功能的起始因子(initiator)，而在其他兩種途徑中是Clq和凝集素來(lái)完成識(shí)別功能的。目前普遍接受的是，替代途徑自發(fā)經(jīng)歷低水平轉(zhuǎn)換活化(turnover activation),其可以在缺乏使自發(fā)補(bǔ)體活化保持受檢查的正確分子元件的外來(lái)表面或其他異常表面(細(xì)菌、酵母、病毒感染細(xì)胞或者受損組織)上容易地?cái)U(kuò)增。有四種血漿蛋白直接參與了替代途徑的活化:C3、因子B和因子D以及備解素。
[0017]盡管大量證據(jù)表明 在非感染性人類疾病的發(fā)病機(jī)制中，經(jīng)典補(bǔ)體途徑和替代補(bǔ)體途徑兩者都存在，但是對(duì)凝集素途徑作用的評(píng)價(jià)才剛剛開始。最新研究提供的證據(jù)表明，凝集素途徑的活化可能是造成缺血/再灌注損傷中補(bǔ)體活化和相關(guān)炎癥的原因。Collard等人(2000)報(bào)告受到氧化應(yīng)激的培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合MBL，且在暴露于人血清之后顯示出C3沉積(Collard 等人，Am.J.Pathol.7紐:1549-1556，(2000))。此外，用阻斷性抗 MBL單克隆抗體處理人血清抑制了 MBL結(jié)合和補(bǔ)體活化。將這些發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展到心肌缺血-再灌注大鼠模型上，其中比起用對(duì)照抗體處理的大鼠，用針對(duì)大鼠MBL的阻斷性抗體處理的大鼠在冠狀動(dòng)脈閉塞之后顯示心肌損傷顯著較輕(Jordan等人，Circulation 104\ 1413-1418,
(2001))。尚不清楚氧化應(yīng)激后MBL與血管內(nèi)皮結(jié)合的分子機(jī)制；最近的研究表明，氧化應(yīng)激后凝集素途徑的活化可能是由MBL與血管內(nèi)皮細(xì)胞角蛋白結(jié)合而介導(dǎo)的，而不是與糖綴合物結(jié)合結(jié)合而介導(dǎo)的(Collard等人，Am.J.Pathol.7砂:1045-1054，(2001))。其他研究已顯示出缺血/再灌注損傷發(fā)病機(jī)制中的經(jīng)典途徑和替代途徑以及凝集素途徑在這種疾病中的作用仍然存在爭(zhēng)議(Riedermann, N.C.，等人，Am.J.Pathol.162\363-367,
2003)。
[0018]一項(xiàng)新近的研究已經(jīng)顯示，MASP-1 (可能還有MASP-3)對(duì)于將替代途徑活化酶因子D從其酶原形式轉(zhuǎn)換為其酶促活性形式是需要的(參見Takahashi M.等人，J Exp Med207(1):29-37 (2010))。該過(guò)程的生理重要性通過(guò)在MASP-1/3-缺陷小鼠的血漿中不存在替代途徑功能活性而得到強(qiáng)調(diào)。對(duì)于替代途徑發(fā)揮作用，需要由天然C3蛋白水解形成C3b。由于替代途徑C3轉(zhuǎn)化酶(C3bBb)含有C3b作為必需亞基，關(guān)于通過(guò)替代途徑的第一個(gè)C3b來(lái)源的問(wèn)題代表了令人困擾的問(wèn)題，且促使了相當(dāng)多的研究工作。
[0019]C3屬于含有極少的被稱為硫酯鍵的翻譯后修飾的蛋白質(zhì)家族(還有C4和α -2巨球蛋白)。硫酯基團(tuán)由形成共價(jià)硫脂連接的谷氨酰胺的末端羰基與三個(gè)氨基酸距離的半胱氨酸的巰基所形成。該鍵是不穩(wěn)定的，并且親電谷氨?；?硫酯可以與親核部分諸如羥基或氨基反應(yīng)，從而與其他分子形成共價(jià)鍵。當(dāng)被隔離在完整C3的疏水口袋內(nèi)部時(shí)，硫酯鍵是相當(dāng)穩(wěn)定的。然而，C3被蛋白水解裂解成C3a和C3b，導(dǎo)致C3b上高反應(yīng)性的硫酯鍵暴露出來(lái)，并且，在包含羥基或氨基的鄰近部分的親核攻擊后，C3b變得與目標(biāo)共價(jià)連接。除了有大量文件證明C3b與補(bǔ)體靶共價(jià)結(jié)合的作用外，還有研究認(rèn)為C3硫酯具有觸發(fā)替代途徑的關(guān)鍵作用。根據(jù)普遍接受的“慢轉(zhuǎn)理論(tick-over theory)”，替代途徑是由液相轉(zhuǎn)化酶iC3Bb的形成所啟動(dòng)的，iC3Bb是由C3與水解硫酯(iC3; C3 (H2O))和因子B形成的(Lachmann, P.J.,等人，Springer Semin.1mmunopa thol.7:143-162, (1984))。C3b樣C3由天然C3經(jīng)蛋白質(zhì)中內(nèi)部硫酯的緩慢自發(fā)水解而產(chǎn)生(Pangburn, M.K.,等人，J.Exp.Med.7^:856-867, 1981)。通過(guò)C3 (H2O) Bb轉(zhuǎn)化酶的活性，C3b分子沉積在靶表面，從而啟動(dòng)替代途徑。
[0020]對(duì)替代途徑活化的起始因子的了解甚少。認(rèn)為激活因子包括酵母細(xì)胞壁(酵母聚糖)、許多純的多糖、兔紅細(xì)胞、某些免疫球蛋白、病毒、真菌、細(xì)菌、動(dòng)物腫瘤細(xì)胞、寄生蟲和受損細(xì)胞。這些激活因子所共有的唯一特征是碳水化合物的存在，但是碳水化合物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和多樣性使得難以確定共享的分子決定子，這是公認(rèn)的。已被廣泛接受的是，替代途徑活化通過(guò)該途徑的抑制調(diào)節(jié)組分諸如因子H、因子1、DAF和CRl和備解素(這是替代途徑唯一陽(yáng)性調(diào)節(jié)物)之間精細(xì)平衡而得到控制(參見Schwaeble ff.J.和Reid K.B.,Immunol Today 20(1):17-21 (1999))。
[0021]除了上述明顯失調(diào)的活化機(jī)制之外，對(duì)于凝集素/經(jīng)典途徑C3轉(zhuǎn)化酶(C4b2a)，替代途徑也可以提供強(qiáng)大的放大環(huán)路(amplification loop)，因?yàn)樗a(chǎn)生的任何C3b都能與因子B —起參與形成額外的替代途徑C3轉(zhuǎn)化酶(C3bBb)。替代途徑C3轉(zhuǎn)化酶通過(guò)備解素的結(jié)合而穩(wěn)定。備解素延長(zhǎng)了替代途徑C3轉(zhuǎn)化酶的半衰期6-10倍。向替代途徑C3轉(zhuǎn)化酶中添加C3b導(dǎo)致替代途徑C5轉(zhuǎn)化酶的形成。
[0022]認(rèn)為所有三種途徑(即經(jīng)典、凝集素和替代途徑)會(huì)合于C5，它被裂解形成具有多種促炎作用的產(chǎn)物。會(huì)合后的途徑被稱為末端補(bǔ)體途徑。C5a是最有效的過(guò)敏毒素，引起平滑肌和血管緊張度以及血管通透性的改變。它也是嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞兩者的強(qiáng)有力的趨化因子和激活因子。C5a介導(dǎo)的細(xì)胞活化能夠通過(guò)誘導(dǎo)釋放多種另外的炎癥介質(zhì)來(lái)顯著放大炎癥反應(yīng)，另外的炎癥介質(zhì)包括細(xì)胞因子、水解酶、花生四烯酸代謝物和活性氧類另O。C5裂解導(dǎo)致了 C5b-9的形成，它也被稱為膜攻擊復(fù)合物(MAC)。目前強(qiáng)有力的證據(jù)表明，亞裂解的MAC沉積除了起裂解成孔復(fù)合物的作用外，還可能還在炎癥中發(fā)揮重要作用。
[0023]除了在免疫防御 中的基本作用外，補(bǔ)體系統(tǒng)是造成許多臨床疾病的組織損傷的原因。因此，迫切需要開發(fā)治療上有效的補(bǔ)體抑制劑以抑制這些副作用。
[0024]發(fā)明概述
提供本概述，從而以簡(jiǎn)化形式引入概念的選擇，其在以下發(fā)明詳述中進(jìn)一步描述。本概述既不欲鑒定請(qǐng)求保護(hù)的主題的關(guān)鍵特征，也不欲用于協(xié)助確定請(qǐng)求保護(hù)的主題的范圍。[0025]在一個(gè)方面，本發(fā)明提供抑制有生命的受試者中MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的副作用的方法。該方法包括將有效抑制MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的量的MASP-2抑制劑施用于需要其的受試者的步驟。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，MASP-2抑制劑抑制通過(guò)凝集素依賴性MASP-2系統(tǒng)的補(bǔ)體活化，但基本上不抑制通過(guò)經(jīng)典或Clq依賴性系統(tǒng)的補(bǔ)體活化，從而Clq依賴性系統(tǒng)仍然具有功能。
[0026]在本發(fā)明這些方面的一些實(shí)施方案中，MASP-2抑制劑是抗MASP-2抗體或其片段。在其他實(shí)施方案中，抗MASP-2抗體具有降低的效應(yīng)子功能。在一些實(shí)施方案中，MASP-2抑制劑是MASP-2抑制肽或非肽MASP-2抑制劑。
[0027]另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于抑制MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的副作用的組合物，該組合物包含治療有效量的MASP-2抑制劑和藥學(xué)可接受的載體。本發(fā)明還提供制備用于抑制需要其的有生命的受試者中MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的副作用的藥物的方法，其包括藥物載體中的治療有效量的MASP-2抑制劑。本發(fā)明還提供制備用于抑制MASP-2依賴性補(bǔ)體活化以治療下文所述病癥、疾病和障礙中每一種的藥物的方法。
[0028]本發(fā)明的方法、組合物和藥物用于在患有如本文將進(jìn)一步描述的急性或慢性病理病癥或損傷的哺乳動(dòng)物受試者、包括人中體內(nèi)抑制MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的副作用。
[0029]在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供用于抑制患有陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria)的受試者中MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的方法,其包括將包含有效抑制MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的量的MASP-2抑制劑的組合物施用于所述受試者。
[0030]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于抑制患有非因子H依賴性非典型溶血性尿毒綜合征(non-Factor H-dependen t atypical hemolytic uremic syndrome (aHUS))或處于發(fā)生非因子H依賴性非典型溶血性尿毒綜合征的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者中MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的方法，其包括將包含有效抑制MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的量的MASP-2抑制劑的組合物施用于所述受試者。
[0031]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于降低處于發(fā)生非典型溶血性尿毒綜合征(aHUS)的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者將患有與aHUS相關(guān)的臨床癥狀的可能性的方法，其包括:(a)確定受試者中已知與aHUS相關(guān)的基因標(biāo)志物的存在；(b)定期監(jiān)測(cè)受試者，以確定選自貧血、血小板減少、腎功能不全和肌酸酐上升的至少一種癥狀的存在或不存在；和(C)在確定貧血、血小板減少、腎功能不全或肌酸酐上升的至少一種的存在之后，將有效抑制MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的量的MASP-2抑制劑的組合物施用于所述受試者，其中施用所述組合物的量有效且時(shí)間期間足以改善所述一種或多種癥狀。
[0032]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供抑制患有繼發(fā)于感染的非典型溶血性尿毒綜合征(aHUS)或處于發(fā)生繼發(fā)于感染的非典型溶血性尿毒綜合征(aHUS)的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者中MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的方法，其包括將包含有效抑制MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的量的MASP-2抑制劑的組合物施用于所述受試者。
[0033]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供治療患有非典型溶血性尿毒綜合征(aHUS)的受試者的方法，其包括將包含有效抑制MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的量的MASP-2抑制劑的組合物施用于所述受試者，其中所述MASP-2抑制劑的施用通過(guò)靜脈內(nèi)導(dǎo)管或其他導(dǎo)管遞送方法而施用。[0034]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于降低處于發(fā)生溶血性尿毒綜合征(HUS)的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者中發(fā)生腎功能受損的可能性的方法，其包括將包含有效抑制MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的量的MASP-2抑制劑的組合物施用于所述受試者。
[0035]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供治療患有溶血性尿毒綜合征(HUS)的受試者的方法，其包括將包含有效抑制MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的量的MASP-2抑制劑的組合物施用于所述受試者，其中所述MASP-2抑制劑的施用通過(guò)靜脈內(nèi)導(dǎo)管或其他導(dǎo)管遞送方法而施用于所述受試者。
[0036]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供治療患有血栓性血小板減少性紫癜(TTP)或表現(xiàn)出與TTP的診斷一致的癥狀的受試者的方法，其包括將包含有效抑制MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的量的MASP-2抑制劑的組合物施用于所述受試者，其中所述MASP-2抑制劑的施用通過(guò)靜脈內(nèi)導(dǎo)管或其他導(dǎo)管遞送方法而施用于所述受試者。
[0037]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供治療患有難治性血栓性血小板減少性紫癜(TTP)的受試者的方法，其包括將包含有效抑制MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的量的MASP-2抑制劑的組合物施用于所述受試者。
[0038]在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供用于抑制患有冷球蛋白血癥的受試者中MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的方法，其包括將包含有效抑制MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的量的MASP-2抑制劑的組合物施用于所述受試者。
[0039]在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供用于抑制患有冷凝集素病的受試者中MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的方法，其包括將包含有效抑制MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的量的MASP-2抑制劑的組合物施用于所述受試者。
[0040]在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供用于抑制患有青光眼的受試者中MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的方法，其包括將包含有效抑制MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的量的MASP-2抑制劑的組合物施用于所述受試者。
[0041]在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供用于抑制處于發(fā)生急性放射綜合征的風(fēng)險(xiǎn)中或患有急性放射綜合征的受試者中MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的方法，其包括將包含有效抑制MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的量的MASP-2抑制劑的組合物施用于所述受試者。在一些實(shí)施方案中，抗MASP-2抑制劑是抗-MASP-2抗體。在一些實(shí)施方案中，在輻射暴露(諸如用輻射治療之前或預(yù)期暴露于輻射之前)將MASP-2抑制劑預(yù)防性施用于受試者。在一些實(shí)施方案中，在暴露于輻射之后24至48小時(shí)內(nèi)施用MASP-2抑制劑。在一些實(shí)施方案中，在暴露于輻射之前和/或之后以足以減輕與急性放射綜合征相關(guān)的一種或多種癥狀的量施用MASP-2抑制劑。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0042]通過(guò)參考下面的詳細(xì)描述連同附圖，本發(fā)明前述的方面以及許多附帶的優(yōu)點(diǎn)將更容易領(lǐng)會(huì)，同樣也更好理解，其中: 圖1是說(shuō)明人MASP-2基因組結(jié)構(gòu)的圖；
圖2A是說(shuō)明人MASP-2蛋白的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的示意圖；
圖2B是說(shuō)明人MApl9蛋白的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的示意圖；
圖3是說(shuō)明鼠MASP-2敲除策略的圖；圖4是說(shuō)明人MASP-2微基因構(gòu)建體的圖；
圖5A提供了證明MASP-2缺陷導(dǎo)致凝集素途徑介導(dǎo)的C4活化喪失的結(jié)果，如通過(guò)甘露聚糖上C4b沉積缺陷所測(cè)定的，如實(shí)施例2所述；
圖5B提供了證明MASP-2缺陷導(dǎo)致凝集素途徑介導(dǎo)的C4活化喪失的結(jié)果，如通過(guò)酵母聚糖上C4b沉積缺陷所測(cè)定的，如實(shí)施例2所述；
圖5C提供了證明獲自MASP-2 +/-、MASP-2 _/_和野生型品系的血清樣品的相對(duì)C4活化水平的結(jié)果，如通過(guò)甘露聚糖和酵母聚糖上的C4b沉積所測(cè)定的，如實(shí)施例2所述；
圖6提供了證明加入鼠重組MASP-2到MASP-2 _/_血清樣品中以蛋白濃度依賴的方式恢復(fù)了凝集素途徑介導(dǎo)的C4活化的結(jié)果，如通過(guò)甘露聚糖上的C4b沉積所測(cè)定的，如實(shí)施例2所述；
圖7提供了證明MASP-2 -/-品系中經(jīng)典途徑有功能的結(jié)果，如實(shí)施例8所述；
圖8A提供了證明抗MASP-2 Fab2抗體#11抑制C3轉(zhuǎn)化酶形成的結(jié)果，如實(shí)施例10所
述；
圖8B提供了證明抗MASP-2 Fab2抗體#11與天然大鼠MASP-2結(jié)合的結(jié)果，如實(shí)施例10所述；
圖8C提供了證明抗MASP-2 Fab2抗體#41抑制C4裂解的結(jié)果，如實(shí)施例10所述；
圖9提供了證明經(jīng)測(cè)試抑制C3轉(zhuǎn)化酶形成的所有抗MASP-2 Fab2抗體還被發(fā)現(xiàn)抑制C4裂解的結(jié)果，如實(shí)施例10所述；
圖10是說(shuō)明從用于抗MASP-2阻斷性Fab2抗體表位作圖的大鼠MASP-2衍生的重組多肽的示意圖，如實(shí)施例11所述；
圖11提供了證明抗MASP-2 Fab2 #40和#60與大鼠MASP-2多肽結(jié)合的結(jié)果，如實(shí)施例11所述；
圖12提供了證明腎缺血/再灌注損傷模型中再灌注后24小時(shí)和48小時(shí)野生型(+/+)和MASP-2 (-/-)小鼠的血尿素氮清除率的結(jié)果，如實(shí)施例12所述；
圖13A提供了顯示從野生型(+/+)和MASP-2 (-/-)小鼠中分離的RPE-脈絡(luò)膜復(fù)合體中的基線VEGF蛋白水平的結(jié)果，如實(shí)施例13所述；
圖13B提供了顯示黃斑變性模型中激光誘發(fā)的損傷之后第三天野生型(+/+)和MASP-2(-/-)小鼠的RPE-脈絡(luò)膜復(fù)合體中VEGF蛋白水平的結(jié)果，如實(shí)施例13所述；
圖14提供了顯示野生型(+/+)和MASP-2 (-/-)小鼠中激光誘發(fā)損傷后第七天平均脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)體積的結(jié)果，如實(shí)施例13所述；
圖15A和圖15B提供了在正常大鼠血清中施用MASP-2 Fab2抗體之后C4b沉積的抑制(圖15A)和凝血酶活化的抑制(圖15B)的劑量響應(yīng)曲線，如實(shí)施例14中所述；
圖16A和圖16B提供了在彌散性血管內(nèi)凝血的局部Schwartzman反應(yīng)模型中，與未處理的野生型小鼠和其中補(bǔ)體途徑被放血?jiǎng)┭坨R蛇毒因子(cobra venom factor, CVF)和末端途徑抑制劑(C5aR拮抗劑)抑制的野生型小鼠中的血小板凝集(圖16A)相比，MASP-2 (-/-)小鼠中測(cè)定的血小板凝集(表示為凝集面積)(圖16B)，如實(shí)施例15中所述；圖17圖示說(shuō)明在WT(+/+)供體腎的WT(+/+) (B6)或MASP-2(-/_)移植受體小鼠中測(cè)定的血尿素氮(BUN)水平，如實(shí)施例16中所述；
圖18將WT(+/+)和MASP-2(-/_)小鼠的百分比存活圖示為盲腸結(jié)扎和穿刺(CLP)模型中微生物感染后的天數(shù)的函數(shù),如實(shí)施例17中所述；
圖19圖示說(shuō)明盲腸結(jié)扎和穿刺(CLP)模型中微生物感染后在WT(+/+)和MASP-2 (-/-)中測(cè)定的細(xì)菌數(shù)，如實(shí)施例17中所述；
圖20為說(shuō)明在用綠膿假單胞菌的鼻內(nèi)施用攻擊后6天WT(+/+)、MASP-2(-/_)和C3 (-/-)小鼠的百分比存活的Kaplan-Mayer圖，如實(shí)施例18中所述；
圖21圖示說(shuō)明在WT小鼠內(nèi)小鼠抗MASP-2單克隆抗體的0.3 mg/kg或1.0 mg/kg皮下給藥之后，在不同時(shí)間點(diǎn)取樣的樣品中C4b沉積的水平，測(cè)定為對(duì)照的％，如實(shí)施例19中所述；
圖22圖示說(shuō)明在WT小鼠內(nèi)小鼠抗MASP-2單克隆抗體的0.6 mg/kg腹膜內(nèi)給藥之后，在不同時(shí)間點(diǎn)取樣的樣品中C4b沉積的水平，測(cè)定為對(duì)照的％，如實(shí)施例19中所述；
圖23圖示說(shuō)明在用0.3 mg/kg或1.0 mg/kg小鼠抗MASP-2單克隆抗體的單次腹膜內(nèi)注射預(yù)處理的WT(+/+)小鼠中激光誘發(fā)損傷后第7天的平均脈絡(luò)膜新生血管形成(CNV)體積，如實(shí)施例20中所述；
圖24A圖示說(shuō)明在用5X 108/100 μ I cfu腦膜炎奈瑟氏菌0? meningitidis)感后MASP-2(-/_)和WT(+/+)小鼠的百分比存活，如實(shí)施例21中所述；
圖24B圖示采自用5X108 cfu/100 μ I腦膜炎奈瑟氏菌感染的MASP-2 ΚΟ(-/_)和WT(+/+)小鼠的血樣中在不同時(shí)間點(diǎn)回收的腦膜炎奈瑟氏菌的log cfu/ml，如實(shí)施例21中所述；
圖25A圖示在用2X108 cfu/100 μ I腦膜炎奈瑟氏菌感染后MASP-2 Κ0(-/_)和WT(+/+)小鼠的百分比存活，如實(shí)施例21中所述；
圖25B圖示說(shuō)明采自用2X108 cfu/100 μ I腦膜炎奈瑟氏菌感染的WT(+/+)小鼠的血樣中在不同時(shí)間點(diǎn)回收的腦膜炎奈瑟氏菌的log cfu/ml,如實(shí)施例21中所述；
圖25C圖示說(shuō)明采自用2X108 cfu/100 μ I腦膜炎奈瑟氏菌感染的MASP-2 (-/-)小鼠的血樣中在不同時(shí)間點(diǎn)回收的腦膜炎奈瑟氏菌的log cfu / ml，如實(shí)施例21中所述。
圖26A圖示說(shuō)明證明MASP-2 (-/-)小鼠保留功能性經(jīng)典途徑的C3b沉積測(cè)定的結(jié)果，如實(shí)施例22中所述；
圖26B圖示說(shuō)明證明MASP-2 (-/-)小鼠保留功能性經(jīng)典途徑的在酵母多糖包被的板上的C3b沉積測(cè)定的結(jié)果，如實(shí)施例22中所述；
圖27A圖示說(shuō)明在C4 (-/-)小鼠(n=6)和匹配的WT同窩小鼠對(duì)照(n=7)中冠狀動(dòng)脈的左前降支(LAD)結(jié)扎和再灌注之后的心肌缺血/再灌注損傷(MIRI)誘導(dǎo)的組織損失，其顯示處于風(fēng)險(xiǎn)中的區(qū)域(AAR)和梗死面積(INF)，如實(shí)施例22中所述；
圖27B圖示說(shuō)明在如圖42A中所述處理的C4 (-/-)和WT小鼠中作為風(fēng)險(xiǎn)中的區(qū)域(AAR)的函數(shù)的梗死面積(INF)，其證明，C4 (-/-)小鼠和WT對(duì)照(虛線)一樣易受MIRI的影響，如實(shí)施例22中所述；
圖28A圖示說(shuō)明使用來(lái)自WT小鼠的血清、來(lái)自C4 (-/-)小鼠的血清和與甘露聚糖與預(yù)孵育的來(lái)自C4 (-/-)小鼠的血清的C3b沉積測(cè)定的結(jié)果，如實(shí)施例22中所述；
圖28B圖示說(shuō)明對(duì)于來(lái)自WT的血清和與各種濃度的抗鼠MASP-2 mAb (mAbMll)混合的MASP-2 (-/-)小鼠的血清的C3b沉積測(cè)定的結(jié)果，如實(shí)施例22中所述；
圖28C圖示說(shuō)明對(duì)來(lái)自WT(C4充足)的人血清和C4缺陷血清和與甘露聚糖與預(yù)孵育的來(lái)自C4缺陷受試者的血清的C3b沉積測(cè)定的結(jié)果，如實(shí)施例22中所述；
圖28D圖示說(shuō)明對(duì)來(lái)自WT(C4充足)的人血清和與抗人MASP-2 mAb (mAbH3)混合的來(lái)自C4缺陷受試者的人血清的C3b沉積測(cè)定的結(jié)果，如實(shí)施例22中所述；
圖29A圖示說(shuō)明在凝集素活化途徑特異性測(cè)定條件下或在經(jīng)典活化途徑特異性測(cè)定條件下測(cè)試的來(lái)自各種補(bǔ)體缺陷小鼠品系的血漿中C3轉(zhuǎn)化酶活性的比較分析，如實(shí)施例22中所述；
圖29B圖示說(shuō)明在凝集素活化途徑特異性條件測(cè)試的來(lái)自各種補(bǔ)體缺陷小鼠品系的血漿中C3轉(zhuǎn)化酶活性的時(shí)間分辨的動(dòng)力學(xué)，如實(shí)施例22中所述；
圖30說(shuō)明如a’鏈的存在顯示的凝血酶底物FXIa和FXa對(duì)人C3的活化的Western印跡分析的結(jié)果，如實(shí)施例23中所述；
圖 31 顯示在從 WT、MASP-2 (-/-)、F1 1 (-/-)、F11 (_/_)/C4 (-/-)和 C4 (_/_)獲得的血清樣品上的C3沉積測(cè)定的結(jié)果，如實(shí)施例23中所述；
圖32A是顯示在對(duì)照小鼠和在用抗鼠MASP-2抗體(mAbMl I)或抗人MASP-2抗體(mAbH6)處理的小鼠中在暴露于7.0 Gy輻射之后隨時(shí)間的百分比存活的Kaplain-Meier存活圖，如實(shí)施例29中所述；
圖32B是顯示在對(duì)照小鼠和在用抗鼠MASP-2抗體(mAbMl I)或抗人MASP-2抗體(mAbH6)處理的小鼠中在暴露于6.5 Gy輻射之后隨時(shí)間的百分比存活的Kaplain-Meier存活圖，如實(shí)施例29中所述；
圖33是圖示說(shuō)明在施用2.6 X IO7 cfu的腦膜炎奈瑟氏菌血清群A Z2491的感染劑量之后MASP-2 KO和WT小鼠的百分比存活的Kaplan-Meyer圖，其證明，MASP-2缺陷小鼠被保護(hù)免于腦膜炎奈瑟氏菌誘導(dǎo)的死亡，如實(shí)施例30中所述；
圖34是圖示說(shuō)明在施用6 X IO6 cfu的腦膜炎奈瑟氏菌血清群B菌株MC58的感染劑量之后MASP-2 KO和WT小鼠的百分比存活的Kaplan-Meyer圖，其證明，MASP-2缺陷小鼠被保護(hù)免于腦膜炎奈瑟氏菌血清群B菌株MC58誘導(dǎo)的死亡，如實(shí)施例30中所述；
圖35圖示說(shuō)明在用6xl06 cfu的腦膜炎奈瑟氏菌血清組B菌株MC58 1.p.感染后取自MASP-2 KO和WT小鼠的血液樣品中在不同時(shí)間點(diǎn)回收的腦膜炎奈瑟氏菌血清群B菌株MC58的log cfu/ml (在兩組小鼠中不同時(shí)間點(diǎn)n=3，結(jié)果表示為平均值土SEM)，其證明，盡管MASP-2 KO小鼠被與WT小鼠相同劑量的腦膜炎奈瑟氏菌血清群B菌株MC58所感染，但是MASP-2 KO小鼠與WT相比具有增強(qiáng)的菌血癥的清除，如實(shí)施例30中所述；
圖36圖示說(shuō)明在6xl06 cfu/100 μ l的腦膜炎奈瑟氏菌血清群B菌株MC58的感染后3、6、12和24小時(shí)MASP-2和WT小鼠的平均疾病評(píng)分，其證明，MASP-2缺陷小鼠顯示出對(duì)感染的高抗性，在感染后6小時(shí)具有低得多的疾病評(píng)分，如實(shí)施例30中所述；
圖37是圖示說(shuō)明在施用4 X 106/100 μl cfu腦膜炎奈瑟氏菌血清群B菌株MC58的感染劑量和隨后在感染后3小時(shí)施用抑制性抗MASP-2抗體(I mg/kg)或?qū)φ胀涂贵w之后小鼠的百分比存活的Kaplan-Meyer圖，其證明，抗MASP-2抗體對(duì)于治療和改善被腦膜炎奈瑟氏菌感染的受試者的存活是有效的，如實(shí)施例31中所述；
圖38圖示說(shuō)明在與㈧正常人血清(NHS)加人抗MASP-2抗體；⑶正常人血清(NHS)加同種型對(duì)照抗體；(C) MBL-/-人血清；(D)正常人血清(NHS)和(E)熱失活的正常人血清(NHS)存在的情況下孵育后0、30、60和90分鐘在用6.5xl06 cfu/100 μ I腦膜炎奈瑟氏菌血清群B菌株MC58 1.p.感染后在20%人血清濃度中在不同時(shí)間點(diǎn)回收的腦膜炎奈瑟氏菌血清群B-MC58的活計(jì)數(shù)的log cfu/ml,其顯示,人血清中腦膜炎奈瑟氏菌的補(bǔ)體依賴性殺傷被添加人抗MASP-2抑制性抗體所顯著增強(qiáng)，如實(shí)施例32中所述；
圖39圖示說(shuō)明在小鼠血清樣品中在不同時(shí)間點(diǎn)回收的腦膜炎奈瑟氏菌血清群B-MC58的活計(jì)數(shù)的log cfu/ml，其證明，與WT小鼠血清相比，MASP-2 _/_小鼠血清對(duì)腦膜炎奈瑟氏菌具有更高水平的殺菌活性，如實(shí)施例32中所述；
圖40圖示說(shuō)明了一定范圍的血清濃度的人血清對(duì)甘露聚糖包被的鼠紅細(xì)胞的溶血(如通過(guò)光度法測(cè)量的裂解的小鼠紅細(xì)胞(Cryy/C3-/-)至上清液的血紅蛋白釋放所測(cè)量的)。測(cè)試的血清包括熱失活(HI) NHS、MBL-/-、NHS +抗-MASP-2抗體和NHS對(duì)照，如實(shí)施例33中所述；
圖41圖示說(shuō)明了一定范圍的血清濃度的人血清對(duì)未包被的鼠紅細(xì)胞的溶血(如通過(guò)光度法測(cè)量的裂解的WT小鼠紅細(xì)胞至上清液的血紅蛋白釋放所測(cè)量的)。測(cè)試的血清包括熱失活(HI) NHS、MBL-/-、NHS +抗-MASP-2抗體和NHS對(duì)照，其證明，抑制MASP-2抑制未敏化的WT小鼠紅細(xì)胞的補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解，如實(shí)施例33中所述；
圖42圖示說(shuō)明了一定范圍的血清濃度的人血清對(duì)未包被的鼠紅細(xì)胞的溶血(如通過(guò)光度法測(cè)量的裂解的小鼠紅細(xì)胞(CD55/59 -/-)至上清液的血紅蛋白釋放所測(cè)量的)。測(cè)試的血清包括熱失活(HI) NHS、MBL-/-> NHS +抗-MASP-2抗體和NHS對(duì)照，如實(shí)施例33中所述；
圖43圖示說(shuō)明在對(duì)照小鼠和在用抗人MASP-2抗體(mAbH6)處理的小鼠中在暴露于8.0 Gy輻射之后隨時(shí)間的百 分比存活，如實(shí)施例34中所述；
圖44圖示說(shuō)明在MASP-2-/-和WT小鼠中LPS注射后至發(fā)生微血管閉塞的時(shí)間，顯示經(jīng)60分鐘測(cè)量的具有血栓形成的小鼠的百分比，這證明，在WT小鼠中在15分鐘后檢測(cè)到血栓形成，其中多達(dá)80%的WT小鼠在60分鐘時(shí)表現(xiàn)出血栓形成；相比之下，MASP-2 -/-中無(wú)一在60分鐘期間過(guò)程中顯示任何血栓形成(對(duì)數(shù)秩:p=0.0005)，如實(shí)施例35中所述；和圖45圖示說(shuō)明了在STX/LPS誘導(dǎo)的HUS模型中鹽水處理的對(duì)照小鼠(n=5)和抗MASP-2抗體處理的小鼠(n=5)隨時(shí)間(小時(shí))的百分比存活，其證明所有對(duì)照小鼠到42小時(shí)死亡，然而，與之相比，100 %的抗MASP-2抗體處理的小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)的時(shí)間進(jìn)程過(guò)程中存活，如實(shí)施例36中所述。
[0043]序列表描述
SEQ ID NO:1 人 MAp 19 cDNA
SEQ ID NO: 2人MAp 19蛋白(具有前導(dǎo)序列)
SEQ ID NO: 3 人 MApl9 蛋白(成熟)
SEQ ID NO:4 人 MASP-2 cDNA
SEQ ID NO: 5人MASP-2蛋白(具有前導(dǎo)序列)
SEQ ID NO:6 人 MASP-2 蛋白(成熟)
SEQ ID NO: 7 人 MASP-2 gDNA (外顯子 1-6)
抗原:(關(guān)于MASP-2成熟蛋白)
SEQ ID NO:8 CUBI 序列(氨基酸 1-121)
SEQ ID NO:9 CUBEGF 序列(氨基酸 1-166)SEQ ID NO: 10 C臓GFCUBII (氨基酸 1_293)
SEQ ID NO: 11 EGF 區(qū)(氨基酸 122-166)
SEQ ID NO: 12絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(氨基酸429 - 671)
SEQ ID NO: 13失活的絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(氨基酸610-625，具有Ser618至Ala的突
變)
SEQ ID NO:14
TW.GPIiWPHPV’FGR1.fp1.W 肽)
SEQ ID NO:15


ILChYDFVIC1.SSCjAKVI^ATI i:CjQ (CtiBi IlA:i
SEQ ID NO: 16 I HiSDVSN?,Vfik核心 I
SEQ ID NO: 17 1:YSI1JSSLD!1'FR.SDY.SN 1-；KPF1 fMB1.結(jié)合k '!
SEQ ID NO:18 I!—職 I
SEQ ID NO: 19 ΛΝMLCAO1.1::SCKjK1；)SCRGfJSCK；/\1.\?(絲氨酸蛋白酶結(jié)合核心)
詳述
肽抑制劑:
SEQ ID NO: 20 MBL 全長(zhǎng) cDNA
SEQ ID NO:21 MBL 全長(zhǎng)蛋白
SEQ ID NO:22 OGK-X-GP (共有結(jié)合序列)
【權(quán)利要求】
1.抑制患有陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)的受試者中MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的方法，其包括將包含有效抑制MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的量的MASP-2抑制劑的組合物施用于所述受試者。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述MASP-2抑制劑是抗MASP-2抗體或其片段。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述MASP-2抑制劑是特異性結(jié)合SEQID N0:6的部分的抗MASP-2單克隆抗體或其片段。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物增加紅細(xì)胞在所述受試者中的存活。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述受試者表現(xiàn)出選自以下的一種或多種癥狀:(i)低于正常水平的血紅蛋白，(ii)低于正常水平的血小板；(iii)高于正常水平的網(wǎng)織紅細(xì)胞，和(iv)高于正常水平的膽紅素。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述受試者先前已經(jīng)經(jīng)歷或正在經(jīng)歷用抑制補(bǔ)體蛋白C5的裂解的末端補(bǔ)體抑制劑的治療。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括將抑制補(bǔ)體蛋白C5的裂解的末端補(bǔ)體抑制劑施用于所述受試者。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述末端補(bǔ)體抑制劑是人源化抗C5抗體或其抗原結(jié)合片段。
9.權(quán)利要求8的方法 ，其中所述末端補(bǔ)體抑制劑是依庫(kù)麗單抗。
10.權(quán)利要求2的方法，其中所述抗體或其片段選自:重組抗體、具有降低的效應(yīng)子功能的抗體、嵌合抗體、人源化抗體和人抗體。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物通過(guò)皮下、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)或作為吸入劑施用。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述組合物通過(guò)皮下施用。
13.抑制患有非因子H依賴性非典型溶血性尿毒綜合征(aHUS)或處于發(fā)生非因子H依賴性非典型溶血性尿毒綜合征(aHUS)的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者中MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的方法，其包括將包含有效抑制MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的量的MASP-2抑制劑的組合物施用于所述受試者。
14.權(quán)利要求13的方法，其中在施用所述組合物之前，確定所述受試者表現(xiàn)選自以下的一種或多種癥狀:⑴貧血、(ii)血小板減少(iii)腎功能不全和(iv)肌酸酐上升，并且將所述組合物以有效量施用足夠長(zhǎng)的時(shí)間期間，以改善所述一種或多種癥狀。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述受試者患有與因子1、因子B或膜輔因子CD46相關(guān)的 aHUS。
16.權(quán)利要求13的方法，其中所述MASP-2抑制劑是抗MASP-2抗體或其片段。
17.權(quán)利要求13的方法，其中所述MASP-2抑制劑是特異性結(jié)合SEQID NO:6的部分的抗MASP-2單克隆抗體或其片段。
18.用于降低處于發(fā)生非典型溶血性尿毒綜合征(aHUS)的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者將患有與aHUS相關(guān)的臨床癥狀的可能性的方法，其包括: (a)確定所述受試者中已知與aHUS相關(guān)的基因標(biāo)志物的存在； (b)定期監(jiān)測(cè)所述受試者，以確定選自貧血、血小板減少、腎功能不全和肌酸酐上升的至少一種癥狀的存在或不存在；和(C)在確定貧血、血小板減少、腎功能不全或肌酸酐上升的至少一種的存在之后，將有效抑制MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的量的MASP-2抑制劑的組合物施用于所述受試者，其中將所述組合物以有效量施用足夠長(zhǎng)的時(shí)間期間，以改善所述一種或多種癥狀。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述MASP-2抑制劑是抗MASP-2抗體或其片段。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述MASP-2抑制劑是特異性結(jié)合SEQID NO:6的部分的抗MASP-2單克隆抗體或其片段。
21.權(quán)利要求18的方法，其中步驟(a)包括對(duì)從所述受試者獲得的樣品上進(jìn)行基因篩選測(cè)試并且在選自以下的基因中鑒定與aHUS相關(guān)的至少一種基因標(biāo)志物的存在:補(bǔ)體因子H(CFH)、因子I (CFI)、因子B (CFB)、膜輔因子CD46、C3、補(bǔ)體因子H-相關(guān)蛋白(CFHRl)、抗凝蛋白血栓調(diào)節(jié)蛋白(THBD)、補(bǔ)體因子H-相關(guān)蛋白3(CFHR3)和補(bǔ)體因子H-相關(guān)蛋白4(CFHR4)。
22.權(quán)利要求18的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括監(jiān)測(cè)所述受試者的已知與觸發(fā)aHUS臨床癥狀相關(guān)的事件的發(fā)生，并且在所述觸發(fā)事件之前、期間或之后將所述包含MASP-2抑制劑的組合物施用于所述受試者。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述與觸發(fā)aHUS臨床癥狀相關(guān)的事件選自藥物暴露、感染、惡性腫瘤、損傷、器官或組織移植和懷孕。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述感染是細(xì)菌感染。
25.權(quán)利要求18的方法，其中所述組合物通過(guò)皮下施用。
26.抑制患有繼發(fā)于感染的非典型溶血性尿毒綜合征(aHUS)或處于發(fā)生繼發(fā)于感染的非典型溶血性尿毒綜合征(aHUS)的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者中MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的方法，其包括將包含有效抑制MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的量的MASP-2抑制劑的組合物施用于所述受試者。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述受試者患有肺炎鏈球菌感染相關(guān)的非腸道aHUS或處于發(fā)生與肺炎鏈球菌感染相關(guān)的非腸道aHUS的風(fēng)險(xiǎn)中。
28.權(quán)利要求26的方法，其中所述MASP-2抑制劑是抗MASP-2抗體或其片段。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述MASP-2抑制劑是特異性結(jié)合SEQID NO:6的部分的抗MASP-2單克隆抗體或其片段。
30.治療患有非典型溶血性尿毒綜合征(aHUS)的受試者的方法，其包括將包含有效抑制MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的量的MASP-2抑制劑的組合物施用于所述受試者，其中所述MASP-2抑制劑的施用通過(guò)靜脈內(nèi)導(dǎo)管或其他導(dǎo)管遞送方法而施用。
31.權(quán)利要求30的方法，其進(jìn)一步包括用血漿置換治療所述患者。
32.權(quán)利要求30的方法，其中所述包含MASP-2抑制劑的組合物在血漿置換不存在的情況下進(jìn)行施用。
33.權(quán)利要求32的方法，其中通過(guò)導(dǎo)管施用所述包含MASP-2抑制劑的組合物持續(xù)第一時(shí)間期間，進(jìn)一步包括施用所述包含MASP-2抑制劑的組合物持續(xù)第二時(shí)間期間，其中所述組合物在所述第二時(shí)間期間過(guò)程中通過(guò)皮下施用。
34.權(quán)利要求33的方法，進(jìn)一步包括定期確定至少一種補(bǔ)體因子的水平，其中確定與標(biāo)準(zhǔn)值或健康受試者相比所述至少一種補(bǔ)體因子的水平降低表明需要繼續(xù)用所述組合物治療。
35.權(quán)利要求30的方法，其中所述MASP-2抑制劑是抗MASP-2抗體或其片段。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述MASP-2抑制劑是特異性結(jié)合SEQID NO:6的部分的抗MASP-2單克隆抗體或其片段。
37.用于降低處于發(fā)生溶血性尿毒綜合征(HUS)的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者中發(fā)生腎功能受損的可能性的方法，其包括將包含有效抑制MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的量的MASP-2抑制劑的組合物施用于所述受試者。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述處于發(fā)生HUS的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者表現(xiàn)出選自以下的至少一種或多種癥狀:腹瀉、具有血管內(nèi)紅細(xì)胞破壞的涂片證據(jù)的小于30%的血細(xì)胞比容水平、血小板減少和上升的肌酸酐水平。
39.權(quán)利要求37的方法，其中所述受試者被禁忌使用抗生素的腸源性大腸桿菌所感染。
40.權(quán)利要求37的方法，其中所述受試者被志賀氏菌或沙門氏菌所感染。
41.權(quán)利要求39的方法，其中在抗生素不存在的情況下在第一時(shí)間期間過(guò)程中將所述包含MASP-2抑制劑的組合物施用于所述受試者。
42.權(quán)利要求40的方法，其中在抗生素存在的情況下在第一時(shí)間期間過(guò)程中將所述包含MASP-2抑制劑的組合物施用于所述受試者。
43.權(quán)利要求 37、41或43中任一項(xiàng)的方法，其中在所述第一時(shí)間期間過(guò)程中通過(guò)靜脈內(nèi)導(dǎo)管或其他導(dǎo)管遞送方法將所述MASP-2抑制劑施用于所述受試者。
44.權(quán)利要求41、權(quán)利要求42或權(quán)利要求43的方法，進(jìn)一步包括施用所述包含MASP-2抑制劑的組合物持續(xù)第二時(shí)間期間，其中在所述第二時(shí)間期間過(guò)程中通過(guò)皮下施用所述組合物。
45.權(quán)利要求44的方法，進(jìn)一步包括定期確定至少一種補(bǔ)體因子的水平，其中確定與標(biāo)準(zhǔn)值或健康受試者相比所述至少一種補(bǔ)體因子的水平降低表明需要繼續(xù)用所述組合物治療。
46.權(quán)利要求37的方法，其中所述MASP-2抑制劑是抗MASP-2抗體或其片段。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述MASP-2抑制劑是特異性結(jié)合SEQID NO:6的部分的抗MASP-2單克隆抗體或其片段。
48.治療患有溶血性尿毒綜合征(HUS)的受試者的方法，其包括將包含有效抑制MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的量的MASP-2抑制劑的組合物施用于所述受試者，其中所述MASP-2抑制劑的施用通過(guò)靜脈內(nèi)導(dǎo)管或其他導(dǎo)管遞送方法而施用于所述受試者。
49.權(quán)利要求48的方法，其進(jìn)一步包括用血漿置換治療所述受試者。
50.權(quán)利要求48的方法，其中所述包含MASP-2抑制劑的組合物在血漿置換不存在的情況下進(jìn)行施用。
51.權(quán)利要求48的方法，其中通過(guò)導(dǎo)管施用所述包含MASP-2抑制劑的組合物持續(xù)第一時(shí)間期間，進(jìn)一步包括施用所述包含MASP-2抑制劑的組合物持續(xù)第二時(shí)間期間，其中所述組合物在所述第二時(shí)間期間過(guò)程中通過(guò)皮下施用。
52.權(quán)利要求51的方法，進(jìn)一步包括定期確定至少一種補(bǔ)體因子的水平，其中確定與標(biāo)準(zhǔn)值或健康受試者相比所述至少一種補(bǔ)體因子的水平降低表明需要繼續(xù)用所述組合物治療。
53.權(quán)利要求48的方法，其中所述MASP-2抑制劑是抗MASP-2抗體或其片段。
54.權(quán)利要求53的方法，其中所述MASP-2抑制劑是特異性結(jié)合SEQID N0:6的部分的抗MASP-2單克隆抗體或其片段。
55.治療患有血栓性血小板減少性紫癜(TTP)或表現(xiàn)出與TTP的診斷一致的癥狀的受試者的方法，其包括將包含有效抑制MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的量的MASP-2抑制劑的組合物施用于所述受試者，其中所述MASP-2抑制劑的施用通過(guò)靜脈內(nèi)導(dǎo)管或其他導(dǎo)管遞送方法而施用于所述受試者。
56.權(quán)利要求55的方法,其中所述受試者表現(xiàn)出選自以下的一種或多種癥狀:中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害、血小板減少、嚴(yán)重心臟損害、嚴(yán)重肺損害、胃腸梗死和壞疽。
57.權(quán)利要求55的方法，其中所述受試者對(duì)于ADAMTS13抑制劑的存在測(cè)試呈陽(yáng)性，并且所述方法進(jìn)一步包括將免疫抑制劑施用于所述受試者。
58.權(quán)利要求55的方法，其中在血漿置換不存在的情況下施用所述包含MASP-2抑制劑的組合物持續(xù)第一時(shí)間期間。
59.權(quán)利要求55的方法，其中所述受試者對(duì)于ADAMTS-13抑制劑的存在測(cè)試呈陽(yáng)性，并且所述方法進(jìn)一步包括施用ADAMTS-13。
60.權(quán)利要求55的方法，其進(jìn)一步包括用血漿置換治療所述受試者。
61.權(quán)利要求55的方法，其中所述包含MASP-2抑制劑的組合物在血漿置換存在的情況下進(jìn)行施用。
62.權(quán)利要求55的方法，`其中通過(guò)導(dǎo)管施用所述包含MASP-2抑制劑的組合物持續(xù)第一時(shí)間期間，進(jìn)一步包括施用所述包含MASP-2抑制劑的組合物持續(xù)第二時(shí)間期間，其中所述組合物在所述第二時(shí)間期間過(guò)程中通過(guò)皮下施用。
63.權(quán)利要求62的方法，進(jìn)一步包括定期確定至少一種補(bǔ)體因子的水平，其中確定與標(biāo)準(zhǔn)值或健康受試者相比所述至少一種補(bǔ)體因子的水平降低表明需要繼續(xù)用所述組合物治療。
64.權(quán)利要求55的方法，其中所述MASP-2抑制劑是抗MASP-2抗體或其片段。
65.權(quán)利要求54的方法，其中所述MASP-2抑制劑是特異性結(jié)合SEQID NO:6的部分的抗MASP-2單克隆抗體或其片段。
66.治療患有難治性血栓性血小板減少性紫癜(TTP)的受試者的方法，其包括將包含有效抑制MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的量的MASP-2抑制劑的組合物施用于所述受試者。
67.權(quán)利要求66的方法，其中所述組合物通過(guò)皮下施用。
68.權(quán)利要求66的方法，進(jìn)一步包括定期確定至少一種補(bǔ)體因子的水平，其中確定與標(biāo)準(zhǔn)值或健康受試者相比所述至少一種補(bǔ)體因子的水平降低表明需要繼續(xù)用所述組合物治療。
69.權(quán)利要求66的方法，其中所述MASP-2抑制劑是抗MASP-2抗體或其片段。
70.權(quán)利要求69的方法，其中所述MASP-2抑制劑是特異性結(jié)合SEQID NO:6的部分的抗MASP-2單克隆抗體或其片段。
71.抑制患有冷球蛋白血癥的受試者中MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的方法，其包括將包含有效抑制MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的量的MASP-2抑制劑的組合物施用于所述受試者。
72.權(quán)利要求71的方法，其中所述MASP-2抑制劑是抗MASP-2抗體或其片段。
73.權(quán)利要求72的方法，其中所述MASP-2抑制劑是抗MASP-2單克隆抗體或其片段。
74.抑制患有冷凝集素病的受試者中MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的方法，其包括將包含有效抑制MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的量的MASP-2抑制劑的組合物施用于所述受試者。
75.權(quán)利要求74的方法，其中所述MASP-2抑制劑是抗MASP-2抗體或其片段。
76.權(quán)利要求75的方法，其中所述MASP-2抑制劑是抗MASP-2單克隆抗體或其片段。
77.抑制患有青光眼的受試者中MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的方法，其包括將包含有效抑制MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的量的MASP-2抑制劑的組合物施用于所述受試者。
78.權(quán)利要求77的方法，其中所述MASP-2抑制劑是抗MASP-2抗體或其片段。
79.權(quán)利要求78的方法，其中所述MASP-2抑制劑是抗MASP-2單克隆抗體或其片段。
80.抑制處于發(fā)生急性放射綜合征的風(fēng)險(xiǎn)中或正患有急性放射綜合征的受試者中MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的方法，其包括將包含有效抑制MASP-2依賴性補(bǔ)體活化的量的MASP-2抑制劑的組合物施用于所述受試者。
81.權(quán)利要求80的方法，其中所述MASP-2抑制劑是抗MASP-2抗體或其片段。
82.權(quán)利要求81的方法，其中所述MASP-2抑制劑是抗MASP-2單克隆抗體或其片段。
83.權(quán)利要求81的方法，其中在輻射暴露之前將所述MASP-2抑制劑預(yù)防性施用于所述受試者。
84.權(quán)利要求81的方法，其中在輻射暴露之后24小時(shí)至48小時(shí)內(nèi)將所述MASP-2抑制劑施用于所述受試者。`
85.權(quán)利要求81的方法，其中在輻射暴露之后將所述MASP-2抑制劑施用于所述受試者。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103781492SQ201280028263
【公開日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2012年4月6日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月8日
【發(fā)明者】G.A.德莫普羅斯, T.達(dá)德勒, H-W.施維布爾 申請(qǐng)人:萊斯特大學(xué), 奧默羅斯公司