包含csp-b5’-sar因子的動物細胞表達載體及利用該載體的重組蛋白質(zhì)的制備方法【專利摘要】本發(fā)明涉及動物細胞用表達載體及利用該載體制備重組蛋白質(zhì)的方法，上述動物細胞用表達載體包含：（a）細胞毒性絲氨酸蛋白酶-B的5’-核骨架結(jié)合區(qū)；（b）在動物細胞中進行操作的啟動子；以及（c）多聚腺苷酸化序列。本發(fā)明的載體作為包含細胞毒性絲氨酸蛋白酶-B的5’-核骨架結(jié)合區(qū)的載體，具有克服基于向動物細胞導入的外源基因的位置的基因表達抑制現(xiàn)象的效果，且大大提高靶蛋白的表達率。本發(fā)明的載體在動物細胞中有效地表達醫(yī)藥品用重組蛋白質(zhì)或抗體。本發(fā)明的載體及利用該載體的重組蛋白質(zhì)的制備方法能夠非常有用地使用于產(chǎn)業(yè)上的批量生產(chǎn)?！緦＠f明】包含CSP-B5’-SAR因子的動物細胞表達載體及利用該載體的重組蛋白質(zhì)的制備方法【
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】[0001]本發(fā)明涉及一種包含CSP-B(CytotoxicSerineProtease-B,細胞毒性絲氨酸蛋白酶-B)的5’-核骨架結(jié)合區(qū)(SAR，ScaffoldAttachmentRegion)因子的動物細胞表達載體及利用上述載體制備重組蛋白質(zhì)的方法?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]若將對重組蛋白質(zhì)進行加密的外源基因?qū)肴缰袊鴤}鼠卵(CH0，ChineseHamsterOvary)細胞之類的動物細胞，則可以生產(chǎn)用于臨床治療的蛋白質(zhì)醫(yī)藥品。[0003]作為紅細胞生長因子的新型紅細胞生成刺激蛋白(NESP,NovelErythropoiesisStimulatingProtein)也被稱為達依泊汀a(Darbepoetinalfa),它是以在天然型促紅細胞生成素(erythropoietin)中生成兩個N-連接糖鏈部位的方式進行基因操作的蛋白質(zhì)醫(yī)藥品(EgrieandBrowne,Br.J.Cancer,84Suppl.1:3-10(2001))0新型紅細胞生成刺激蛋白刺激造血干細胞，促進向紅細胞類的分化，從而增加紅細胞的生成。新型紅細胞生成刺激蛋白的血清半衰期相比于現(xiàn)有的重組促紅細胞生成素長3倍，因此在慢性腎功能衰竭患者的貧血治療中，少量的給藥也能期待相同的治療效果。[0004]作為抗惡性腫瘤劑的曲妥珠單抗(Trastuzumab)是利用基因重組技術(shù)制備的人源化單克隆抗體(humanizedmonoclonalantibody),其選擇性地對存在于細胞表面的人表皮生長因子受體2(HumanEpidermalgrowthfactorReceptor2,HER2)產(chǎn)生作用。在原發(fā)性乳腺癌的25~30%中確認了人表皮生長因子受體2的超表達，且曲妥珠單抗抑制由人表皮生長因子受體2進行超表達的人類腫瘤細胞的生長。[0005]隨著外源基因向動物細胞染色體的某個位置插入，外源基因?qū)⒕哂胁煌谋磉_率，這是因為，根據(jù)周邊的調(diào)節(jié)因子或染色質(zhì)(chromatin)的結(jié)構(gòu)，外源基因的表達會受到影響(Zahn-Zabaletal.,J.Biotechnol,87,29-42(2001))。[0006]若使用周圍的染色質(zhì)對外源基因的表達不產(chǎn)生影響的染色質(zhì)因子，就能克服基于這種位置的基因表達抑制現(xiàn)象(positioneffect),提高能夠分離對重組蛋白質(zhì)進行高表達的動物細胞克隆的機會，從而能夠縮短制備醫(yī)藥品生產(chǎn)細胞株的時間。正在試圖進行使用能夠克服基于位置的基因表達抑制現(xiàn)象的染色質(zhì)因子，來制備穩(wěn)定的細胞株(stablecellline),而這些因子包含邊界元素(BE,BoundaryElement)、核骨架結(jié)合區(qū)或基質(zhì)結(jié)合區(qū)(SAR/MAR,ScaffoldorMatrixAttachmentRegion)以及基因座控制區(qū)(LCR，LocusControlRegion)等。[0007]SAR是一種也被稱為MAR的長度為300~3000bp的DNA，其被認為使染色體上的染色質(zhì)與核基質(zhì)(nuclearmatrix)的蛋白質(zhì)相結(jié)合，并調(diào)芐基因的表達((Makrides(Ed.),GeneTransferandExpressioninMammalianCells.Elsevier.ChapterlO(2003))，并且能夠在轉(zhuǎn)化的細胞株中提高外源基因的表達(Poljaketal.,NucleicAcidsRes,22,4386—4394(1994)；KalosandFournier,Mol.Cell.Biol,15,198-207(2005))。[0008]茨恩-嘉寶(Zahn-Zabal)等將雞溶菌酶(chickenIysozyme)5’-MAR向突光素酶(luciferase)表達載體導入，并利用該載體對中國倉鼠卵細胞進行轉(zhuǎn)化，來制備了穩(wěn)定細胞(stablecell)(Zahn-Zabaletal.，J.Biotechnol,87，29-42(2001))。當與利用不包含MAR的載體進行轉(zhuǎn)化的穩(wěn)定細胞相比較時，利用包含溶菌酶5’MAR的載體進行轉(zhuǎn)化的穩(wěn)定細胞呈現(xiàn)更高的熒光素酶表達率。并且，相比于包含I副本的溶菌酶5’MAR的載體的情況，在包含2副本的載體的情況下呈現(xiàn)出更高的熒光素酶表達率。這種結(jié)果表明，向動物細胞表達載體導入MAR可以提高靶蛋白的表達率。[0009]韓國專利申請第2000-0043996號在動物細胞表達載體中包含人類β珠蛋白(human-globin)MAR，來克服了向動物細胞導入外源基因時所產(chǎn)生的基因表達抑制現(xiàn)象。該專利除了人類β珠蛋白MAR之外，還使用了登錄于基因銀行Μ83137的人干擾素inhumaninterferon-β)MAR和登錄于基因銀行Μ62716的人類CSP-B3’-SAR，并記述了上述三種SAR/MAR提高作為靶蛋白的β半乳糖苷酶(β-galactosidase)的表達率。并且，上述專利公開有β珠蛋白MAR比干擾素PMAR或CSP-3’SAR具有更優(yōu)秀的效果的研究結(jié)果。[0010]韓國專利申請第2001-0079227號中，向動物細胞表達載體導入人干擾素βMAR，來增加外源基因的表達，并有效地表達了重組蛋白質(zhì)。并且，韓國專利申請第2007-0108451號記述了在動物細胞表達載體中包含2副本的人類β珠蛋白MAR，與β珠蛋白MAR為I副本的情況相比，更優(yōu)秀地提高靶蛋白的表達率。該專利記述了MAR因子I副本和MAR因子2副本的比較研究結(jié)果，但并沒有記載MAR因子2副本和MAR因子3副本的比較研究內(nèi)容。[0011]漢森(Hanson)和雷伊(Ley)從大約70kb的人類染色體14qll.2造血絲氨酸蛋白酶基因族(hematopoieticserineproteasegenecluster)中找出CSP-B5，-SAR和CSP-B3’-SAR，來表明了堿基序列，并在體外試驗(invitro)中確認了上述SAR與來自細胞核中的核骨架(scaffold)相結(jié)合(HansonandLey,Blood,79,610-618(1992))。[0012]CSP-B5’-SAR和CSP_B3’_SAR的堿基序列分別登錄于基因銀行M62717和M62716，且長度分別為2429dp和1233dp，CSP-B5’-SAR相比于CSP-B3’-SAR要長2倍左右?；蜚y行AL136018登錄了人類染色體14基因組(genome)的堿基序列，而在該序列上對CSP-B蛋白質(zhì)進行加密的基因的翻譯開始密碼子(codon)和位于該密碼子的上游(upstream)的5’-SAR之間的長度為1195bp，對CSP-B蛋白質(zhì)進行加密的基因的翻譯終結(jié)密碼子和位于該密碼子的下游(downstream)的3’-SAR之間的長度為4543bp。[0013]本說明書全文中參照了多篇對比文件及專利文獻，并顯示了其引用。所引用的文獻及專利的公開內(nèi)容作為參照全部插入本說明書中，從而更加明確地說明本發(fā)明所屬【
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】的水準及本發(fā)明的內(nèi)容?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0014]要解決的問題[0015]本發(fā)明人為了研發(fā)能夠在動物細胞中有效地生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的載體而努力。其結(jié)果，查明了在載體中包含(incorporated)細胞毒性絲氨酸蛋白酶(CSP-B,CytotoxicSerineProtease—B)的5，-核骨架結(jié)合區(qū)(5，-SAR,ScaffoldorMatrixAttachmentRegion)來使用的情況下，能夠以非常優(yōu)秀的生產(chǎn)效率來生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)，從而完成了本發(fā)明。[0016]因此，本發(fā)明的目的在于，提供動物細胞用表達載體。[0017]本發(fā)明的再一目的在于，提供通過上述的表達載體進行轉(zhuǎn)化的動物細胞。[0018]本發(fā)明的另一目的在于，提供重組蛋白質(zhì)的制備方法。[0019]本發(fā)明的其他目的及優(yōu)點將根據(jù)【
發(fā)明內(nèi)容】、權(quán)利要求書及附圖更加明確。[0020]解決問題的手段[0021]根據(jù)本發(fā)明的一實施方式，本發(fā)明提供動物細胞用表達載體，上述動物細胞用表達載體包含:Ca)細胞毒性絲氨酸蛋白酶-B的5’-核骨架結(jié)合區(qū)；(b)在動物細胞中進行操作的啟動子；以及(C)多聚腺苷酸化序列。[0022]本發(fā)明人為了研發(fā)在動物細胞中能夠有效地生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的載體而努力。其結(jié)果查明，在載體中包含(incorporated)細胞毒性絲氨酸蛋白酶(CSP-B,CytotoxicSerineProtease-B)的5，-核骨架結(jié)合區(qū)(5，-SAR,ScaffoldorMatrixAttachmentRegion)來使用的情況下，能夠以非常優(yōu)秀的生產(chǎn)效率來生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)。[0023]本發(fā)明的動物細胞用表達載體包含CSP-B的5’_SAR、在動物細胞中進行操作的啟動子以及多聚腺苷酸化序列。[0024]本發(fā)明的最大特征在于，利用包含CSP-B的5’-SAR的載體。優(yōu)選地，在本發(fā)明中所利用的CSP-B5’-SAR包含登錄于基因銀行M62717的核苷酸序列，并在序列表第I位中記載有其例示性的核苷酸序列。[0025]CSP-B的5’-SAR在表達載體中大大增加重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)效率。[0026]CSP-B的5’-SAR可位于對所要表達的蛋白質(zhì)進行編碼的核苷酸序列的上游或下游，優(yōu)選地，位于下游。`[0027]如在下述實施例中所證明，相比于現(xiàn)有的CSP-B3’-SAR及β珠蛋白MAR因子，CSP-B5’-SAR在動物細胞中提高靶蛋白的表達率。例如，在中國倉鼠卵(CHO)動物細胞中，分別將每I副本的CSP-B5’-SAR,CSP-B3’-SAR及β珠蛋白MAR因子導入使作為靶蛋白的β半乳糖苷酶發(fā)生表達的載體的情況下，相比于未導入SAR因子的情況，測定出β半乳糖苷酶的活性分別提高了10.0倍、2.2倍及8.7倍(圖7)。即，CSP-B5’-SAR因子相比于其他因子，呈現(xiàn)相對優(yōu)秀的靶蛋白的表達率。[0028]并且，將靶蛋白作為新型紅細胞生成刺激蛋白來確認SAR因子的效果時，導出了類似的結(jié)果。在向載體導入CSP-B5’-SAR和CSP-B3’-SAR因子，并對中國倉鼠卵細胞進行轉(zhuǎn)化的情況下，相比于未導入SAR因子的情況，測定出新型紅細胞生成刺激蛋白的表達率分別提高了11.2倍及3.2倍(表3及圖9)。當向載體導入CSP-B5’-SAR因子時，在其轉(zhuǎn)化的細胞中表達新型紅細胞生成刺激蛋白的陽性克隆(positiveclone)的形成頻率會增加，且隨機選擇的多個克隆的新型紅細胞生成刺激蛋白的表達率也有增加(表4、表5、圖10及圖11)。[0029]將靶蛋白作為抗-HER2抗體來確認了CSP-B5’-SAR因子的效果。在將2副本的CSP-B5’-SAR因子向載體導入，并對CHO細胞進行轉(zhuǎn)化的情況下，相比于未導入SAR因子的情況，測定出相對高的抗-HER2抗體的表達率(表6及圖13)。當向載體導入SAR因子時，隨機選擇的多個克隆顯示出較高的抗-HER2抗體的表達率(圖14及圖15)。[0030]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，5’-SAR在表達載體中以多個副本的方式存在，在此情況下，相比于以I副本的方式存在的情況，增加重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)效率。更優(yōu)選地，5’-SAR在表達載體中以2副本的方式存在。如在下述的實施例中的論證，5’-SAR在表達載體中以2副本的方式存在的情況相比于以3副本的方式存在的情況，重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)效率更優(yōu)秀。[0031]如在下述實施例中的論證，將CSP-B5’-SAR因子向載體導入I副本、2副本及3副本，來確認了基于副本數(shù)的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將SAR因子連續(xù)導入2副本時，所檢測到的β半乳糖酸酶的活性最高(圖8)。即，可視為載體內(nèi)SAR因子的副本數(shù)對靶蛋白的表達率產(chǎn)生影響，且最優(yōu)選為2副本的SAR。[0032]5’_SAR在表達載體中以多個副本的方式存在的情況下，上述多個副本可以連續(xù)或分隔。優(yōu)選地，上述多個副本連續(xù)存在，且更優(yōu)選地，連續(xù)存在于對所要表達的蛋白質(zhì)進行編碼的核苷酸序列的下游。[0033]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，在上述動物細胞中進行操作(operable)的啟動子為巨細胞病毒(CMV,Cytomegalovirus)啟動子(Promoter)、腺病毒(adenovirus)后期啟動子、痘苗病毒(vacciniavirus)7.5K啟動子、猿猴病毒40(SV40,SimianVirus40)啟動子、SV40E1啟動子、單純皰疫病毒(HSV,Herpessimplexvirus)的胸苷激酶(tk,thymidinekinase)啟動子、呼吸道合胞體病毒(RSV,Respiratorysyncytialvirus)啟動子、延伸因子-1a(EF1,elongationfactor-1alpha)啟動子、金屬硫蛋白(metallothionein)啟動子、β-肌動蛋白(β-actin)啟動子、人類白細胞介素-2(IL-2,interluekin_2)基因的啟動子、人類干擾素(IFN，interferon)基因的啟動子、人類白細胞介素_4(IL-4,interluekin-4)基因的啟動子、人類淋巴霉素(humanlymphotoxin)基因的啟動子或人類粒細胞巨曬細胞集落刺激因子(GM-CSF,Granulocytemacrophagecolony-stimulatingfactor)基因的啟動子，更優(yōu)選為巨細胞病毒(CMV)啟動子、猿猴病毒40(SV40)啟動子、SV40E1啟動子、延伸因子-1a(EFlα)啟動子、金屬硫蛋白啟動子或β-肌動蛋白啟動子,最優(yōu)選為巨細胞病毒(CMV)啟動子。`[0034]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，本發(fā)明的載體還包含用于編碼所要表達的蛋白質(zhì)的核苷酸序列，并優(yōu)選為激素、細胞因子、抗體、肽核酸適體、纖連蛋白(AdNectin)、親合體(affibody,美國專利第5831012號)、高親和性多聚體(Avimer,Silverman,J.etal,NatureBiotechnology23(12):1556(2005))或庫尼茲域(Kunitzdomain,ArnouxBetal.,ActaCrystallogr.DBiol.Crystallogr.58(Pt7):12524(2002)及Nixon,AE,Currentopinionindrugdiscovery&development9(2):2618(2006))。更優(yōu)選地，利用本發(fā)明的載體進行表達的蛋白質(zhì)為促紅細胞生成素(ΕΡ0,erythropoietin)、促紅細胞生成素類似物或抗-HER2抗體。最優(yōu)選為促紅細胞生成素、作為促紅細胞生成素類似物的新型紅細胞生成刺激蛋白(NovelErythropoiesisStimulatingProtein,A30N,H32T,P87V,W88N,P90T)或抗-HER2抗體。[0035]上述促紅細胞生成素類似物包含在人類促紅細胞生成素的氨基酸序列中變異的一個或一個以上。促紅細胞生成素類似物能夠以通過氨基酸殘基的增加(addition)、刪除(deletion)或置換(substitution)來發(fā)生變異(mutagenesis)的方式制備，由此能夠增加糖鏈化(glycosylation)位置(site)或置換糖鏈化位置。促紅細胞生成素類似物相比人類促紅細胞生成素具有更多數(shù)量的糖鏈(carbohydratechain),且包含追加一個以上的糖鏈化位置。并且，促紅細胞生成素類似物根據(jù)所追加的糖鏈化位置，相比于自然(naturaloccurring)人類促紅細胞生成素,顯示更高的唾液酸(sialicacid)等級,但不會因此而改變對生物學活性非常重要的蛋白質(zhì)二級或三級結(jié)構(gòu)。促紅細胞生成素類似物可具有一處、二處或三處對N-糖鏈化(N-glycosylation)或O-糖鏈化(O-glycosylation)的追加位置。例如，若第69個亮氨酸(leucine)置換為天冬酰胺(asparagine),則上述亮氨酸會起到N-糖鏈化的第4個位置的作用。[0036]本發(fā)明的載體中所要表達的促紅細胞生成素類似物的例為，選自促紅細胞生成素序列(例如，基因銀行M11319的序列)中第30、51、57、69、88、89、136及138位置中的至少一個位置導入追加的糖鏈化位置。最優(yōu)選地，促紅細胞生成素類似物為包含A30N、H32T、P87V、W88N及P90T變異的新型紅細胞生成刺激蛋白。[0037]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，上述多聚腺苷酸化序列包含牛生長激素終止子、單純皰疫病毒(HSV,Herpessimplexvirus)來源胸苷激酶(TK,Thymidinekinase)或猿猴病毒40(SV40,Simianvirus40)來源多聚腺苷酸化序列。[0038]在本發(fā)明的載體中，優(yōu)選的結(jié)構(gòu)為按5’至3’的順序在動物細胞中進行操作的啟動子-表達蛋白質(zhì)基因-多聚腺苷酸化序列-CSP-B5’-SAR，更優(yōu)選的結(jié)構(gòu)為，在動物細胞中進行操作的啟動子-表達蛋白質(zhì)基因-多聚腺苷酸化序列-CSP-B5’-SAR-CSP-B5’_SAR。[0039]本發(fā)明的載體還能包含選擇標記。上述選擇標記的例子包含針對作用于真核細胞的抗生素的抗性基因，優(yōu)選為針對新霉素、遺傳霉素(G418)及卡那霉素的抗性基因。[0040]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，本發(fā)明的載體用于在動物細胞中表達靶蛋白。上述動物細胞為哺乳類、嚙齒目、鳥類或昆蟲細胞，更優(yōu)選地，包含中國倉鼠卵細胞(CH0，Chinesehamsterovary)、非洲綠猴腎細胞(VERO)、海拉(HeLa)細胞、WI38、幼倉鼠腎細胞(BHK，Babyhamsterkidney)、COS細胞或馬丁達比狗腎上皮細胞(MDCK,Madin-DarbyCanineKidney),更優(yōu)選為中國倉鼠卵細胞、非洲綠猴腎細胞、海拉細胞或馬丁達比狗腎上皮細胞，最優(yōu)選為中國倉鼠卵細胞。[0041]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，本發(fā)明的載體包含二氫葉酸還原酶(dihydrofolatereductase,DHFR)編碼序列。上述序列對載體的擴增有用。[0042]根據(jù)本發(fā)明的再一實施方式,本發(fā)明提供由上述本發(fā)明的表達載體進行轉(zhuǎn)化的動物細胞。[0043]根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式，本發(fā)明提供重組蛋白質(zhì)的制備方法，上述重組蛋白質(zhì)的制備方法包括對上述本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的動物細胞進行培養(yǎng)的步驟。[0044]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，本發(fā)明的重組蛋白質(zhì)的制備方法包括:(i)培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的動物細胞的步驟；以及(ii)獲得在上述培養(yǎng)過程中所生產(chǎn)的重組蛋白質(zhì)的步驟。[0045]在本發(fā)明中所使用的CSP-B5’-SAR因子為未使用于在現(xiàn)有技術(shù)中向動物細胞表達載體導入來試圖提高醫(yī)藥品用重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)率的因子。從下述實施例中可知，若將CSP-B5’-SAR向載體導入，則可在動物細胞中提高靶蛋白的表達率。若為了重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，將當前未曾使用過的新的CSP-B5’-SAR向載體導入，來研發(fā)出能夠更加提高靶蛋白的表達效率的方法，則可以增加蛋白質(zhì)醫(yī)藥品的產(chǎn)業(yè)上的生產(chǎn)率。[0046]在現(xiàn)有技術(shù)中，未曾試圖將CSP-B5’-SAR向動物細胞表達載體導入來提高醫(yī)藥品用重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)率。并且，也未曾研究過當將SAR向載體導入I副本、2副本或3副本來利用該載體對動物細胞進行轉(zhuǎn)化時，使用包含幾副本的SAR的載體是否最能提高重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)率。并且，也未公開對基于SAR因子的位置的靶基因的表達率增加效果的詳細的現(xiàn)有研究結(jié)果。[0047]在將本發(fā)明的表達載體向細胞導入來制備已被轉(zhuǎn)化的動物細胞的情況下，能夠利用多種方法將載體向細胞導入。例如，能夠通過顯微注射法(Capecchi，M.R.，Cell,22:479(1980))、磷酸鈣沉淀法(Graham,F.L.etal.,Virology,52:456(1973))、電穿孔法(Neumann,E.etal.,EMBOJ.,I:841(1982))、脂質(zhì)體-介導轉(zhuǎn)染法(Wong,T.K.etal.,Gene,10:87(1980))、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法(Gopal，Mol.CellBiol.，5:1188-1190(1985))及基因槍法(Yangetal.,Proc.Natl.Acad.Sc1.,87:9568-9572(1990))等向動物細胞內(nèi)注入載體。[0048]被轉(zhuǎn)化的動物細胞的培養(yǎng)能夠利用本發(fā)明所屬領(lǐng)域公知的多種方法的實驗方案進行實施。本發(fā)明中能夠利用的培養(yǎng)基只要是通常利用于動物細胞的培養(yǎng)中的任何培養(yǎng)基即可，例如，能夠利用伊格爾氏最低基礎培養(yǎng)基(Eagles’sMEM,Eagle’sminimumessentialmedium,Eagle,H.Sciencel30:432(1959))>a-MEM(Stanner,CP.etal.,Nat.NewBiol.230:52(1971))、Iscove，sMEM(Iscove,N.etal.,J.Exp.Med.147:923(1978))、199培養(yǎng)基(Morganetal.,Proc.Soc.Exp.Bi0.Med.,73:1(1950))、CMRL1066、RPMI1640(Mooreetal.,J.Amer.Med.Assoc.199:519(1967))、F12(Ham,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA53:288(1965))、FlO(Ham,R.G.Exp.CellRes.29:515(1963))、DMEM(DulbeccoJsmodificationofEagle’smedium,Dulbecco,R.etal.,Virology8:396(1959))、DMEM與F12的混合物(Barnes,D.etal.,Anal.Biochem.102:255(1980))、Way-mouth’sMB752/1(ffaymouth,C.J.Natl.CancerInst.22:1003(1959))、McCoy’s5A(McCoy,T.A.,etal.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.100:115(1959))及MCDB系列(Ham,R.G.etal.,InVitrol4:ll(1978))等。對動物細胞的培養(yǎng)及培養(yǎng)基的說明已在R.1anFreshney,CultureofAnimalCells,AManualofBasicTechnique,AlanRLiss,Inc.,NewYork中進行了詳細記載,且該文獻作為參照插入本說明書中。[0049]發(fā)明的效果`[0050]歸納本發(fā)明的特征及優(yōu)點如下:[0051](a)本發(fā)明的載體為包含CSP-B5’-SAR的載體，具有克服隨著向動物細胞導入的外源基因的不同位置而發(fā)生的基因表達抑制現(xiàn)象的效果，且大大提高靶蛋白的表達率。[0052](b)本發(fā)明的載體在動物細胞中有效地表達醫(yī)藥品用重組蛋白質(zhì)(例如，促紅細胞生成素)或抗體(例如，抗-人表皮生長因子受體2抗體)。[0053](C)本發(fā)明的載體及利用該載體的重組蛋白質(zhì)的制備方法能夠非常有用地使用于醫(yī)藥品的產(chǎn)業(yè)性批量生產(chǎn)?！緦＠綀D】【附圖說明】[0054]圖1為表示β半乳糖苷酶表達載體的結(jié)構(gòu)的簡圖。IacZ為β半乳糖苷酶基因，BGHPA為牛生長激素基因的多聚腺苷酸化序列，以及TKPA為胸苷激酶基因的多聚腺苷酸化序列。[0055]圖2為表示包含I副本的SAR/MAR因子的β半乳糖苷酶表達載體的結(jié)構(gòu)的簡圖。[0056]圖3為表示包含2副本的SAR因子的β半乳糖苷酶表達載體的結(jié)構(gòu)的簡圖。[0057]圖4為表示包含3副本的CSP-B5’_SAR因子的β半乳糖苷酶表達載體的結(jié)構(gòu)的簡圖。[0058]圖5為表不新型紅細胞生成刺激蛋白表達載體的結(jié)構(gòu)的簡圖。[0059]圖6為表示包含SAR/MAR因子的新型紅細胞生成刺激蛋白表達載體的結(jié)構(gòu)的簡圖。[0060]圖7為表示利用導入I副本的SAR/MAR因子的載體進行轉(zhuǎn)化的細胞的相對β半乳糖苷酶活性的圖表。[0061]圖8為表示利用導入I副本、2副本及3副本的SAR因子的載體進行轉(zhuǎn)化的細胞的相對β半乳糖苷酶活性的圖表。[0062]圖9為表示利用導入SAR因子的載體進行轉(zhuǎn)化的細胞的相對新型紅細胞生成刺激蛋白(紅細胞刺激因子)的表達率的圖表。[0063]圖10為表示在利用未導入SAR因子的pCLS07Al載體進行轉(zhuǎn)化的細胞中隨機選擇的24個克隆的新型紅細胞生成刺激蛋白的表達率的圖表。[0064]圖11為表示在利用導入CSP-B5’_SAR因子的pCLSlOAlfl載體進行轉(zhuǎn)化的細胞中隨機選擇的24個克隆的新型紅細胞生成刺激蛋白的表達率的圖表。[0065]圖12為表示抗-HER2抗體表達載體的結(jié)構(gòu)的簡圖。[0066]圖13為表示利用`導入2副本的載體進行轉(zhuǎn)化的細胞的相對抗-HER2抗體的表達率的圖表。[0067]圖14為表示在利用未導入SAR因子的pCLS05H2載體進行轉(zhuǎn)化的細胞中隨機選擇的19個克隆的抗-HER2抗體的表達率的圖表。[0068]圖15為表示在利用導入2副本的CSP-B5’-SAR因子的pCLS05H2f2載體進行轉(zhuǎn)化的細胞中隨機選擇的19個克隆的抗-HER2抗體的表達率的圖表。【具體實施方式】[0069]以下，通過實施例對本發(fā)明進行更加詳細的說明。這些實施例僅僅用于更加具體地說明本發(fā)明，根據(jù)本發(fā)明的要旨，本發(fā)明的范圍不會受限于以下實施例，這對于所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。[0070]實施例[0071]實施例1:SAR/MAR因子的準備[0072]人類CSP-B5’-SAR及3’-SAR因子的準備[0073]為了將登錄于基因銀行M62717及AL136018的人類CSP-B5’-SARDNA通過聚合酶鏈式反應(PCR,PolymeraseChainReaction)進行擴增,準備了人類自然殺傷細胞(naturalkiller細胞、NK細胞及ATCCCRL-2407)的基因組(genomic)DNA。使用DNA分離試劑盒(DneasyBlood&TissueKit,Qiagen,Cat.N0.69504)從NK細胞中準備了基因組DNA,并將這些基因組DNA使用為SARDNA聚合酶鏈式反應的模板。[0074]以NK細胞的基因組DNA作為模板,使用Cs5S300F引物(attcttcagcacctccttaatttttctccc;序列表第5序列)及Cs5S300R引物(ccaggcagccaaagatcagtagttgtgttg;序列表第6序列)執(zhí)行了聚合酶鏈式反應。在98°C溫度下10秒鐘、在60°C溫度下30秒鐘及72°C溫度下2分30秒鐘的條件反復進行35次，從而執(zhí)行了聚合酶鏈式反應。[0075]接著，將該聚合酶鏈式反應的產(chǎn)物克隆于pGEM-T載體(普洛麥格公司，Cat.N0.A3600)，來制備pGEMT-CS5S.3.0k載體。[0076]為了準備登錄于基因銀行M62716及AL136018的人類CSP-B3’-SARDNA，以NK細胞的基因組DNA作為模板,使用2kCspSF引物(tggttccttcattggaaaaggaaaacac;序列表第7序列)及2kCspSR引物(tccgctgaggctgtgcccacagccacc;序列表第8序列)執(zhí)行了聚合酶鏈式反應。然后，以第一次聚合酶鏈式反應產(chǎn)物作為模板，使用CspSF引物(ggatcccattctccttgatgtactaat;序列表第9序列)及CspSR弓丨物(gaattcaaacaactcaatagcaagaaac;序列表第10序列)執(zhí)行了聚合酶鏈式反應。在98°C溫度下10秒鐘、60°C溫度下30秒鐘及72°C溫度下5分鐘的條件反復進行30次，從而執(zhí)行了聚合酶鏈式反應。將第二次聚合酶鏈式反應產(chǎn)物克隆于PGEM-T載體，來制備了pGEMT-CS3S.1.2k載體。[0077]人類β珠蛋白MAR因子的準備[0078]為了利用聚合酶鏈式反應來對登錄于基因銀行L22754和NW-001838021的人類β珠蛋白MARDNA進行擴增，準備了人類G-2細胞的基因組DNA。使用DNA分離試劑盒從G-2細胞中準備基因組DNA，并將這些基因組DNA使用為5’MARDNA聚合酶鏈式反應的模板。以G-2細胞的基因組DNA作為模板,使用Bg5MF-100F_NheI引物(aattgctagcttgtattctgtttcgtgaggcaaggttt;序列表第11序列)及Bg5MR-100R_XhoI引物(aattctcgagttcctctctatgttggctcaaatgtcct;序列表第12序列)執(zhí)行了聚合酶鏈式反應。在98°C溫度下10秒鐘、60°C溫度下30秒鐘及72°C溫度下3分20秒鐘的條件反復進行30次，從而執(zhí)行了聚合酶鏈式反應。然后，將該聚合酶鏈式反應產(chǎn)物克隆于pcDNA3.3-T0P0載體(英杰公司，Cat.N0.K8300-01)，來制備了pcDNA3.3_Bg5M載體。[0079]實施例2:β半乳糖苷酶表達載體的制備`[0080]pC06載體的制備[0081]為了制備依次包含巨細胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)啟動子、多克隆位點(MultipleCloningSites,MCS)及牛生長激素(BovineGrowthHormone,BGH)多聚腺苷酸化序列(polyadenylationsequence,pA)的pC06載體,執(zhí)行了如下實驗。首先，以pcDNA3.1(_)載體(英杰公司，Cat.N0.V795-20)作為模板，使用V6-F引物(aagcttggatccgaattcatcgatggccggccggtaccctcgagctgtgccttctagttgccagc;序列表第13序列)及V6-R引物(gctagctagagccccagctggttctttccg;序列表第14序列)執(zhí)行了聚合酶鏈式反應。在98°C溫度下10秒鐘、60°C溫度下30秒鐘及72°C溫度下I分鐘的條件反復進行30次，從而執(zhí)行了聚合酶鏈式反應。然后，將該聚合酶鏈式反應產(chǎn)物克隆于pcDNA3.3-T0P0載體(英杰公司)，來制備了PC06載體。[0082]pC04’載體的制備[0083]為了制備依次包含猿猴病毒(SV40，SimianVirus40)啟動子、科扎克序列(Kozaksequence,gccatc)、二氫葉酸還原酶(dhfr,dihydrofolatereductase)基因及單純皰疫病毒胸苷激酶(TK,herpessimplexvirusthymidinekinase)pA的pC04’載體,進行了如下實驗。首先，以pcDNA3.3載體作為模板,使用PsvApaDraF引物(aaaattgggccccactacgtgctgtggaatgtgtgtcagttagggt;序列表第15序列)及PsvKzDHR引物(tggtcgaaccatgatggcgcgaaacgatcctcatcctgtctct;序列表第16序列)執(zhí)行了聚合酶鏈式反應，并以pOptiVEC-TOPO載體(英杰公司，Cat.N0.12744-017)作為模板，使用DHKzPsvF引物(ggatcgtttcgcgccatcatggttcgaccattgaactgcatcg;序列表第17序列)及TKNheNdeR弓丨物(tgtgtgcatatggctagcgataacaatttcacacaggaaacag;序列表第18序列)執(zhí)行了聚合酶鏈式反應。在98°C溫度下10秒鐘、60°C溫度下30秒鐘及72°C溫度下I分鐘的條件反復進行30次，從而執(zhí)行了聚合酶鏈式反應。然后，將上述兩種聚合酶鏈式反應產(chǎn)物通過重疊(overlapping)聚合酶鏈式反應相連接,并克隆于pGEM_T載體的Apal及NdeI限制性內(nèi)切酶部位，來制備了pC04’載體。[0084]pC04載體的制備[0085]為了制備在pC04’載體所包含的猿猴病毒啟動子中除去(SV40dEl啟動子)72bp(ggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaacca;序列表第19序列)的一個增強子(enhancer)的pC04載體,進行了如下實驗。首先，利用限制性內(nèi)切酶切斷PC04’載體，然后使大DNA切片進行自身連接(self-ligation)，來制備了PC04載體。[0086]pCLS07載體的制備[0087]為了制備在pC06載體的BGHpA和猿猴病毒啟動子之間插入SV40dEl啟動子、科扎克序列、dhfr基因及TKpA的pCLS07載體，進行了如下實驗。首先，以pC04載體作為模板，使用PsvApaDraF引物及TKNheNdeR引物執(zhí)行了聚合酶鏈式反應。在98°C溫度下10秒鐘、60°C溫度下30秒鐘及72°C溫度下I分20秒鐘的條件反復進行30次，從而執(zhí)行了聚合酶鏈式反應。然后，利用DraIII及NheI限制性內(nèi)切酶分別切斷上述聚合酶鏈式反應產(chǎn)物和pC06載體，并連接由此獲得的兩個大DNA切片，來制備了PCLS07載體。[0088]pCLS08載體的制備[0089]為了向pCLS07載體的NheI限制性內(nèi)切酶部位插入多克隆位點來制備pCLS08載體，進行了如下實驗。首先，以克隆于PGEM-T載體的促紅細胞生成素基因作為模板，使用NhAsElF引物(aattgctagcatatagcgatcgcgcaggacagcttccgacagcagggccagg；序列表第20序列)及BbPsSbNhEIR引物(aattgctagcatatacctgcaggtatatgggcccatatagctgaggttgaatgagaatatcactgtcccagacac;序列表第21序列)執(zhí)行聚合酶鏈式反應，從而制備了多克隆位點。在98°C溫度下10秒鐘、60°C溫度下30秒鐘及72°C溫度下15秒鐘的條件反復進行30次，從而執(zhí)行了聚合酶鏈式反應。然后，將該聚合酶鏈式反應產(chǎn)物克隆于PCLS07載體的NheI限制性內(nèi)切部位，來制備了pCLS08載體。[0090]pCLS08Gl載體的制備[0091]為了向pCLS08載體的HindIII和XhoI限制性內(nèi)切酶部位之間插入IacZ及IacY基因，來制備PCLS08G1載體，進行了如下實驗。首先，以pSV-β-半乳糖苷酶載體(普洛麥格公司，Cat.N0.TB094)作為模板，使用galHinF引物(aattaagcttctcgcgcaacctattttcccctcgaac;序列表第22序列)及galXhoR引物(aattctcgagccgagtttgtcagaaagcagaccaaac;序列表第23序列)執(zhí)行了聚合酶鏈式反應，從而擴增了IacZ及IacY基因。在98°C溫度下10秒鐘、60°C溫度下30秒鐘及72°C溫度下3分30秒鐘的條件反復進行30次，從而執(zhí)行了聚合酶鏈式反應。然后，將該聚合酶鏈式反應產(chǎn)物克隆于PCLS08載體的HindIII及XhoI限制性內(nèi)切酶部位，來制備了pCLS08Gl載體。[0092]pCLS09Gl載體的制備[0093]為了將位于pCLS08Gl載體的兩個NheI限制性內(nèi)切酶部位之間的多克隆位點換成其他多克隆位點來制備PCLS09G1載體，進行了如下實驗。首先，以克隆于pGEM-T載體的促紅細胞生成素基因作為模板，使用NhSbElF引物(aattgctagcatatacctgcaggttgaatgagaatatcactgtcccagaca;序列表第24序列)和NhAsSfPsEIR引物(aattgctagcatatagcgatcgctatatggccatgatggccatatagggcccaggacagcttccgacagcagggccaggc;序列表第25序列)來執(zhí)行聚合酶鏈式反應，來制備了多克隆位點。在98°C溫度下10秒鐘、60°C溫度下30秒鐘及72°C溫度下15秒鐘的條件反復進行30次，從而執(zhí)行了聚合酶鏈式反應。然后，除去位于PCLS08G1載體的兩個NheI限制性內(nèi)切酶部位之間的現(xiàn)有的多克隆位點，并在此克隆利用聚合酶鏈式反應重新制備的多克隆位點，來制備PCLS09G1載體。pCLS09Gl載體的遺傳圖(map)表示在圖1中。[0094]實施例3:包含SAR/MAR的β半乳糖苷酶表達載體的制備[0095]pCLS09Gltl載體的制備[0096]為了在pCLS09Gl載體的SbfI及PspOMI限制性內(nèi)切酶部位之間插入CSP-B3’-SAR因子來制備pCLS09Gltl載體，進行了如下實驗。首先，以pGEMT_CS3S.1.2.k載體作為模板，使用cs3sSbfIF引物(aattcctgcaggggatcccattctccttgatgtactaat;序列表第26序列)及cs3sPsplR引物(aattgggcccgaattcaaacaactcaatagcaagaaac;序列表第27序列)來執(zhí)行聚合酶鏈式反應，從而擴增了CSP-B3’-SAR因子。在98°C溫度下10秒鐘、60°C溫度下30秒鐘及72°C溫度下2分30秒鐘的條件反復進行30次，從而執(zhí)行了聚合酶鏈式反應。然后，將該聚合酶鏈式反應產(chǎn)物克隆于PCLS09G1載體的SbfI及PspOMI限制性內(nèi)切酶部位，來制備了pCLS09Gltl載體。[0097]pCLS09Glfl載體的制備[0098]為了在pCLS09Gl載體的SbfI及PspOMI限制性內(nèi)切酶部位之間插入CSP-B5’-SAR因子來制備pCLS09Glfl載體，進行了如下實驗。首先，以pGEMT_CS5S.3.0k載體作為模板，使用cs5sSbfIF引物(aattcctgcagggaattcctaaacagagcaattaggtaag序列表第28序列)及cs5sPsplR引物(aattgggcccgaattccagtgtaaacgtcttccttgt;序列表第29序列)來執(zhí)行聚合酶鏈式反應，擴增了CSP-B5’-SAR因子。在98°C溫度下10秒鐘、60°C溫度下30秒鐘及72°C溫度下2分30秒鐘的條件反復進行30次，從而執(zhí)行了聚合酶鏈式反應。然后，將該聚合酶鏈式反應產(chǎn)物克隆于PCLS09G1載體的SbfI及PspOMI限制性內(nèi)切酶部位，來制備了pCLS09Glfl載體。[0099]pCLS09Glgl載體的制備[0100]為了在pCLS09Gl載體的SbfI及PspOMI限制性內(nèi)切酶部位之間插入β珠蛋白MAR因子來制備pCLS09Glgl載體，進行了如下實驗。首先，以pcDNA3.3_Bg5M載體作為模板，使用glmSbfIF引物(aattcctgcaggttgtattctgtttcgtgaggcaaggttt;序列表第30序列)及glmPsplR引物(aattgggcccttcctctctatgttggctcaaatgtcct;序列表第31序列)來執(zhí)行聚合酶鏈式反應，擴增了β珠蛋白MAR因子。在98°C溫度下10秒鐘、60°C溫度下30秒鐘及72°C溫度下3分20秒鐘的條件反復進行30次，從而執(zhí)行了聚合酶鏈式反應。然后，將該聚合酶鏈式反應產(chǎn)物克隆于PCLS09G1載體的SbfI及PspOMI限制性內(nèi)切酶部位，來制備了pCLS09Glgl載體。[0101]pCLS09Glt2載體的制備[0102]為了在pCLS09Gltl載體的PspOMI及SfiI限制性內(nèi)切酶部位之間插入CSP-B3，-SAR因子來制備pCLS09Glt2載體，進行了如下實驗。首先，以pGEMT_CS3S.1.2k載體作為模板，使用cs3sPsp2F引物(aattgggcccggatcccattctccttgatgtactaat;序列表第32序列)及cs3sSfi2R引物(aattggccatgatggccgaattcaaacaactcaatagcaagaaac;序列表第33序列)來執(zhí)行聚合酶鏈式反應，擴增了CSP-B3’-SAR因子。在98°C溫度下10秒鐘、60°C溫度下30秒鐘及72°C溫度下2分30秒鐘的條件反復進行30次，從而執(zhí)行了聚合酶鏈式反應。然后，將該聚合酶鏈式反應產(chǎn)物克隆于pCLS09Gltl載體的PspOMI及SfiI限制性內(nèi)切酶部位，來制備了pCLS09Glt2載體。[0103]pCLS09Glf2載體的制備[0104]為了在pCLS09Glfl載體的PspOMI及SfiI限制性內(nèi)切酶部位之間插入CSP-B5’-SAR因子來制備pCLS09Glf2載體，進行了如下實驗。首先，以pGEMT_CS5S.3.0k載體作為模板，使用cs5sPsp2F引物(aattgggcccgaattcctaaacagagcaattaggtaag;序列表第34序列)及cs5sSfi2R引物(aattggccatgatggccgaattccagtgtaaacgtcttccttgt;序列表第35序列)來執(zhí)行聚合酶鏈式反應，擴增了CSP-B5’-SAR因子。在98°C溫度下10秒鐘、60°C溫度下30秒鐘及72°C溫度下2分30秒鐘的條件反復進行30次，從而執(zhí)行了聚合酶鏈式反應。然后，將該聚合酶鏈式反應產(chǎn)物克隆于PCLS09G1H載體的PspOMI及SfiI限制性內(nèi)切酶部位，來制備了pCLS09Glf2載體。[0105]pCLS09Gltf載體的制備[0106]為了在pCLS09Gltl載體的PspOMI及SfiI限制性內(nèi)切酶部位之間插入CSP-B5’-SAR因子來制備pCLS09Gltf載體，進行了如下實驗。首先，以pGEMT_CS5S.3.0k載體作為模板，使用cs5sPsp2F引物(aattgggcccgaattcctaaacagagcaattaggtaag;序列表第34序列)及cs5sSfi2R引物(aattggccatgatggccgaattccagtgtaaacgtcttccttgt;序列表第35序列)來`執(zhí)行聚合酶鏈式反應，擴增了CSP-B5’-SAR因子。在98°C溫度下10秒鐘、60°C溫度下30秒鐘及72°C溫度下2分30秒鐘的條件反復進行30次，從而執(zhí)行了聚合酶鏈式反應。然后，將該聚合酶鏈式反應產(chǎn)物克隆于pCLS09Gltl載體的PspOMI及SfiI限制性內(nèi)切酶部位，來制備了pCLS09Gltf載體。[0107]pCLS09Glf3載體的制備[0108]為了在位于pCLS09Glf2載體的CMV啟動子及bla啟動子之間的BgIII限制性內(nèi)切酶部位插入CSP-B5’-SAR因子來制備pCLS09Glf3載體，進行了如下實驗。首先，以pGEMT_CS5S.3.0k載體作為模板，使用cs5sBgl3F引物(aattagatctgaattcctaaacagagcaattaggtaag;序列表第36序列)及cs5sBgl3R引物(aattagatctgaattccagtgtaaacgtcttccttgt;序列表第37序列)來執(zhí)行聚合酶鏈式反應，擴增了CSP-B5’-SAR因子。在98°C溫度下10秒鐘、60°C溫度下30秒鐘及72°C溫度下2分30秒鐘的條件反復進行30次，從而執(zhí)行了聚合酶鏈式反應。然后，將該聚合酶鏈式反應產(chǎn)物克隆于pCLS09Glf2載體的BgIII限制性內(nèi)切酶部位，來制備了pCLS09Glf3載體。[0109]pCLS09Glf4載體的制備[0110]為了在位于pCLS09Glfl載體的CMV啟動子及bla啟動子之間的BgIII限制性內(nèi)切酶部位插入CSP-B5’-SAR因子，來制備位于以SAR作為靶基因的IacZ及IacY基因的兩側(cè)的pCLS09Glf4載體，進行了如下實驗。首先，以pGEMT-CS5S.3.0k載體作為模板，使用cs5sBgl3F引物(aattagatctgaattcctaaacagagcaattaggtaag;序列表第36序列)及cs5sBgl3R引物(aattagatctgaattccagtgtaaacgtcttccttgt;序列表第37序列)來執(zhí)行聚合酶鏈式反應，擴增了CSP-B5’-SAR因子。在98°C溫度下10秒鐘、60°C溫度下30秒鐘及72°C溫度下2分30秒鐘的條件反復進行30次，從而執(zhí)行了聚合酶鏈式反應。然后，將該聚合酶鏈式反應產(chǎn)物克隆于PCLS09G1H載體的BgIII限制性內(nèi)切酶部位，來制備了pCLS09Glf4載體。[0111]實施例4:使用SAR/MAR導入載體的β半乳糖苷酶的表達[0112]使用pCLS09Gl、pCLS09Glfl、pCLS09Gltl或pCLS09Glgl載體的轉(zhuǎn)化[0113]為了向載體中導入CSP-B5’-SAR、CSP-B3’-SAR及β珠蛋白MAR因子各I副本來了解如下效果，以如下方法對CHODG44細胞(英杰公司，Cat.N0.12609)進行了轉(zhuǎn)化。[0114]將附著培養(yǎng)形態(tài)的DG44細胞在6-孔板中以每孔4XIO5細胞進行分注。在24小時之后，確認了細胞完全附著于板底面。將歐賠-最低基礎培養(yǎng)基(Opt1-MEM)(吉克公司(Gibco)7Cat.N0.31985-070)在已被滅菌的3個管中分別分注500μI之后，混合預先準備的pCLS09Gl、pCLS09Glfl、pCLS09Gltl及pCLS09Glgl載體各2μg，并略微進行了移液管移動。將Opt1-MEM培養(yǎng)基在已被滅菌的3個管中分別分注500μI。在此，分別取10μI的Lipofectamine2000(英杰公司，Cat.N0.11668-027)進行混合，并在略微進行移液管移動之后，在常溫中放置5分鐘?；旌螪NA和試劑溶液，并在常溫中放置20分鐘，且將該混合液放入各個DNA的已準備的6-孔板的孔中均勻地進行了混合。[0115]確認利用pCLS09Gl、pCLS09Glfl、pCLS09Gltl或pCLS09Glgl載體進行轉(zhuǎn)化的細胞池(pool)的β半乳糖苷酶的活性[0116]利用pCLS09Gl、pCLS09Glfl、pCLS09Gltl或pCLS09Glgl載體對DG44細胞進行轉(zhuǎn)化，并在24小時之后交換為包含10%FBS和50μg/ml遺傳霉素(Geneticin)的培養(yǎng)基。每3-4日交換一次培養(yǎng)基，并在37°C、5%CO2條件下培養(yǎng)3周，來制備穩(wěn)定的細胞池。[0117]使用β半乳糖苷酶分析試劑盒(Stratagen,Cat.N0.200383)來確認針對轉(zhuǎn)化的穩(wěn)定細胞的β半乳糖苷酶活性，并求得了以基于載體的β半乳糖苷酶活性和PCLS09G1載體作為基準的相對(relative)β半乳糖苷酶活性。如表1及圖7所示,相比于未導入SAR/MAR因子的PCLS09G1載體，導入SAR/MAR因子的載體均增加了β半乳糖苷酶的活性。并且，相比于導入β珠蛋白MAR因子的pCLS09Glgl載體，導入CSP-B5’_SAR因子的pCLS09GlfI載體的情況顯示出更高的β半乳糖苷酶活性的增加。因此，優(yōu)選地，為了增加靶蛋白的表達率，應向載體導入CSP-B5’-SAR因子。[0118]表1[0119]使用于轉(zhuǎn)化的被導入的β半乳糖苷酶的活性P半乳糖苷酶的載體__SAR/MAR__(units/mg)__相對活性PCLS09G1__^__3A__LO_pCLS09GlflCSP-B5，-SAR__343__10,0pCLS09GltlCSP-B3，-SAR__TA__22_pCLS09Glglβ珠蛋白MAR29.88.7[0120]確認利用pCLS09Glfl,pCLS09Glf2,PCLS09Glf3或pCLS09Glf4載體進行轉(zhuǎn)化的細胞池的β半乳糖苷酶的活性[0121]為了確認CSP-B5’-SAR因子會使靶蛋白的表達率增加，并了解根據(jù)向載體導入的SAR因子的副本數(shù)如何使靶蛋白的表達率的增加產(chǎn)生變化而進行了如下實驗。利用pCLS09Glf1，pCLS09Glf2,PCLS09Glf3或pCLS09Glf4載體對DG44細胞進行轉(zhuǎn)化，并利用遺傳霉素培養(yǎng)基進行選擇，來獲得細胞池。對轉(zhuǎn)化的穩(wěn)定細胞確認β半乳糖苷酶的活性，并求得基于載體的β半乳糖苷酶的活性。如表2和圖8所示，相比于將SAR因子導入I副本或3副本的載體，將SAR因子導入2副本的載體顯示更高的β半乳糖苷酶的活性。即，確認了基于SAR因子的靶蛋白的表達率的增加會根據(jù)SAR因子的副本數(shù)而不同，且將SAR因子向載體導入副本，可使靶蛋白的表達率增加至最大。[0122]表2[0123]【權(quán)利要求】1.一種動物細胞用表達載體，其特征在于，包含:(a)細胞毒性絲氨酸蛋白酶-B的5’-核骨架結(jié)合區(qū)；(b)在動物細胞中進行操作的啟動子；以及(C)多聚腺苷酸化序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動物細胞用表達載體，其特征在于，上述載體還包含核苷酸序列，上述核苷酸序列用于編碼所要表達的蛋白質(zhì)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動物細胞用表達載體，其特征在于，上述5’-核骨架結(jié)合區(qū)以2副本的方式存在。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動物細胞用表達載體，其特征在于，在動物細胞中進行操作的上述啟動子為巨細胞病毒啟動子、腺病毒后期啟動子、痘苗病毒7.5K啟動子、猿猴病毒40啟動子、SV40E1啟動子、單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動子、呼吸道合胞體病毒啟動子、延伸因子-1a啟動子、金屬硫蛋白啟動子、肌動蛋白啟動子、人類白細胞介素-2基因的啟動子、人類干擾素基因的啟動子、人類白細胞介素-4基因的啟動子、人類淋巴霉素基因的啟動子或人類粒細胞巨噬細胞集落刺激因子基因的啟動子。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動物細胞用表達載體，其特征在于，上述多聚腺苷酸化序列為牛生長激素、單純皰疹病毒來源胸苷激酶或猿猴病毒40來源多聚腺苷酸化序列。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動物細胞用表達載體，其特征在于，上述動物細胞為中國倉鼠卵細胞、非洲綠猴腎細胞、海拉細胞、WI38、幼倉鼠腎細胞、COS細胞或馬丁達比狗腎上皮細胞。7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的動物細胞用表達載體，其特征在于，上述蛋白質(zhì)為激素、細胞因子、抗體、肽核酸適體、纖連蛋白、親合體、高親和性多聚體或庫尼茲域。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的動物細胞用表達載體，其特征在于，上述蛋白質(zhì)為促紅細胞生成素、促紅細胞生成素類似物或抗-人表皮生長因子受體2抗體。9.一種動物細胞，其特征在于，根據(jù)權(quán)利要求1至8中的任一項所述的表達載體來進行轉(zhuǎn)化。10.一種重組蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于，包括對上述權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)化的動物細胞進行培養(yǎng)的步驟?！疚臋n編號】C12N5/10GK103797123SQ201280029037【公開日】2014年5月14日申請日期:2012年5月21日優(yōu)先權(quán)日:2011年6月13日【發(fā)明者】高麗旭,李相瑢,金秀娟,文昇基申請人:株式會社鐘根堂