用于酶介導(dǎo)的信號放大的新方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于對靶標(biāo)相關(guān)信號的酶介導(dǎo)放大以使樣本中的生物學(xué)靶標(biāo)或化學(xué)靶標(biāo)可視化的方法和化合物，其中靶標(biāo)被固定化，具體地，本發(fā)明涉及用于使包括細(xì)胞的樣本中的靶標(biāo)可視化的氧化還原酶介導(dǎo)的信號放大。本發(fā)明的方法對于與醫(yī)療診斷和療法相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)記物的定性和定量評估特別有用。
【專利說明】用于酶介導(dǎo)的信號放大的新方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于靶標(biāo)相關(guān)信號的酶介導(dǎo)放大以使樣本中生物靶標(biāo)或化學(xué)標(biāo)靶可視化的方法和化合物，其中靶標(biāo)是固定化的。本發(fā)明的方法可用于對組織學(xué)樣本中生物標(biāo)記物的定性和定量評測，特別是可用于診斷應(yīng)用中。
【背景技術(shù)】
[0002]免疫化學(xué)(IHC)是醫(yī)療診斷中的常見工具，并且還通常用于對治療性生物標(biāo)記物的評估。特別地，生物標(biāo)記物通常需要對其存在的程度進(jìn)行定量評估。當(dāng)這些試劑應(yīng)用至固定于固體支撐物(support)上或在溶液中的純化蛋白時，抗體對細(xì)胞和組織的應(yīng)用呈現(xiàn)出在所遇到的情況之外的特異性難題。存在很多能夠影響免疫檢測的因素，其中有組織的固定和制備、抗原修復(fù)的持續(xù)時間和類型以及抗體特異性。另一個困難是對以低水平存在的靶標(biāo)的檢測能力。與可溶性測定(assay)相同，增加信號而不提高非特異性背景水平成為問題。最常研究的方法是信號放大，這通過連續(xù)幾輪的酶促反應(yīng)來達(dá)到。
[0003]3，3 ’ - 二氨基聯(lián)苯胺(DAB )是辣根過氧化物酶(HRP )的發(fā)色底物，其被廣泛地用于使組織學(xué)樣本中標(biāo)記有過氧化物酶活性的靶標(biāo)蛋白可視化。該方法利用與靶向樣本中蛋白的抗體相連的HRP，將DAB從溶液沉積到靶向蛋白的位點上，由此對蛋白進(jìn)行標(biāo)記。該方法不是特別靈敏，因此適合于檢測相對大量的靶標(biāo)蛋白。與DAB沉積相關(guān)的信號不能進(jìn)一步放大。所要提及的其他缺點是，該方法需要相當(dāng)大量的靶標(biāo)特異性抗體來充滿所有靶標(biāo)位點，而且相當(dāng)耗費時間。此外，該方法提供均勻的染色形態(tài)，對顯微鏡工作者顯示出均一顏色，且具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)例如膜、胞質(zhì)和核的胞內(nèi)分辨度，這使得不可能準(zhǔn)確地使染色定量。
[0004]近來，已經(jīng)記載了一種全新的基于HRP-DAB的IHC可視化系統(tǒng)。該系統(tǒng)將DAB不僅用作標(biāo)記靶標(biāo)的HRP的發(fā)色底物，還用作在HRP的輔助下交聯(lián)水溶液中其它可檢測的HRP底物并將它們沉積在固定化HRP的周圍的制劑(參見W02009036760、W02010094283和W02010094284)。在組織學(xué)樣本中，該方法`會生成與傳統(tǒng)HRP-DAB染色相似的染色形態(tài)，但是，與傳統(tǒng)染色相比，該染色更加靶標(biāo)特異化和靈敏，并且過程更快且穩(wěn)健。
[0005]新方法并不使得靶標(biāo)的量直接接近于樣本中染色的量，因為這兩個量之間的關(guān)聯(lián)不是線性的。因此，通過所有這些方法可視化的組織學(xué)樣本中的靶標(biāo)的量僅可以相對地進(jìn)行評測，而不是精確地評測。然而，在某些情況下，這種新描述的HRP-DAB靶標(biāo)標(biāo)記系統(tǒng)能夠很強(qiáng)地放大與單個靶標(biāo)相關(guān)的信號，從而使單個靶標(biāo)例如單個蛋白或核酸分子可以單獨地在樣本中可視化為有顏色或熒光的較大點并且通過使用普通低倍的明場或熒光光學(xué)顯微鏡來進(jìn)行檢測(參見W02011047680)?？梢栽谥笕菀椎貙颖局兄睆礁哌_(dá)4微米的視覺上分開(distinct)的單個點進(jìn)行手動或自動定量,并且祀標(biāo)的量可以很精確地確定(參見PCT/DK2011/000131)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明涉及可應(yīng)用于靶標(biāo)固定在例如固體支撐物上或固體支撐物內(nèi)的樣本的強(qiáng)大的新型信號放大系統(tǒng)，使得可以將大量樣本中的非常寬動態(tài)濃度范圍內(nèi)的單獨單個靶標(biāo)實體例如單個生物學(xué)分子或化學(xué)分子、單個分子結(jié)構(gòu)、單個分子復(fù)合物、單個顆粒等可視化為視直徑約I微米至約3微米的視覺上分開的點。該系統(tǒng)也可應(yīng)用于對均質(zhì)化(homogeneous)染色(即，分辨率沒有達(dá)到明顯的單個點)的固定化靶標(biāo)進(jìn)行可視化。
[0007]根據(jù)本發(fā)明的放大系統(tǒng)包括至少一個在水溶液中孵育假定含有靶標(biāo)的樣本的步驟，該水溶液包含:
[0008](i)具有氧化還原酶活性的酶的第一底物；
[0009](ii)該酶的第二底物，以及任選地
[0010](iii)過氧化物化合物，
[0011]其中，第一底物是α -氰基-4-羥基肉桂酸(ACHCA)或其衍生物，且第二底物是含有一種或多種能夠作為有氧化還原酶活性的酶的底物的化合物以及可檢測標(biāo)記物的結(jié)合物(conjugate)分子。
[0012]根據(jù)本發(fā)明，在上述水溶液中孵育假定包含靶標(biāo)的樣本，使得樣本中包含靶標(biāo)的位點通過結(jié)合物分子的沉積而被標(biāo)記，然而，這僅僅是在靶標(biāo)包含氧化還原酶活性且靶標(biāo)固定在樣本內(nèi)或固定在固體支撐物上或固體支撐物內(nèi)的情況下。固定化靶標(biāo)可以固有地包含氧化還原酶活性或者其可以通過另一物質(zhì)與該酶相關(guān)聯(lián)，另一物質(zhì)為例如包含辣根過氧化物酶(HRP)或大豆過氧化物酶(SP)的靶標(biāo)特異性結(jié)合劑。樣本中的靶標(biāo)通過檢測所沉積第二底物的可檢測標(biāo)記物的方式來檢測。
[0013]因此，在一些實施方式中，本發(fā)明的方法可以包括以下步驟:
[0014]a)在水溶液中孵育假定含有固定化靶標(biāo)的樣本，該固定化的靶標(biāo)包含具有氧化還原酶活性的酶，水溶液包含:
[0015](i)該酶的第一底物；
[0016](ii)該酶的第二底物，以及任選地
[0017](iii)過氧化物化合物，
[0018]其中，第一底物是α -氰基-4-羥基肉桂酸(ACHCA)或其衍生物，且第二底物是含有一種或多種能夠作為有氧化還原酶活性的酶的底物的化合物以及可檢測標(biāo)記物的結(jié)合物分子；
[0019]b)檢測樣本中第二底物的沉積分子的標(biāo)記物。
[0020]在其他實施方式中，本發(fā)明的方法可以包括以下步驟:
[0021]a)將假定包含靶標(biāo)的樣本與一種或多種結(jié)合劑孵育，其中樣本或靶標(biāo)被固定化，其中至少一種結(jié)合劑是靶標(biāo)特異性結(jié)合劑且至少一種結(jié)合劑包括具有氧化還原酶活性的酶；
[0022]b )在水溶液中孵育樣本(a )，水溶液包含:
[0023](i)該酶的第一底物；
[0024](ii)該酶的第二底物，以及任選地
[0025](iii)過氧化物化合物，
[0026]其中，第一底物是α -氰基-4-羥基肉桂酸(ACHCA)或其衍生物，且第二底物是含有一種或多種能夠作為有氧化還原酶活性的酶的底物的化合物以及可檢測標(biāo)記物的結(jié)合物分子；[0027]c)檢測樣本中第二底物的沉積分子的標(biāo)記物。
[0028]術(shù)語“任選地”是指過氧化物化合物不是本發(fā)明所有實施方式的水溶液中的必要成分:當(dāng)具有氧化還原酶活性的酶是過氧化物酶時，其是溶液的成分，而當(dāng)酶是酚氧化酶時，其可以從溶液中去掉。
[0029]在其他實施方式中，本發(fā)明的方法可以包含一個或多個其他檢測步驟，包括使用本發(fā)明的放大系統(tǒng)或使用其他放大系統(tǒng)例如W02011047680、W02009036760、W02010094283或W02010094284的放大系統(tǒng)進(jìn)行的附加信號放大步驟。
[0030]使用本發(fā)明放大系統(tǒng)的靶標(biāo)可視化方法適合于(i )將靶標(biāo)被固定化的樣本中的單個靶標(biāo)實體可視化為分開的染色(或熒光或放射性)點，其中單個點具有約I~約3微米的視直徑并對應(yīng)于單個靶標(biāo)單元，以及(ii )將靶標(biāo)可視化為均質(zhì)化染色(即，不是由多個分開的染色點例如直徑I~3微米的點構(gòu)成)。
[0031]本發(fā)明的可視化系統(tǒng)使得可以使用靶標(biāo)特異性結(jié)合劑的多種組合、多種不同可檢測標(biāo)記物、不同信號放大系統(tǒng)的組合、多種酶底物等來在一個樣本中檢測多種多樣的靶標(biāo)。
[0032]本發(fā)明的一個方面涉及對根據(jù)本發(fā)明可視化的靶標(biāo)進(jìn)行定量。樣本中的單個靶標(biāo)實體和靶標(biāo)總量均能夠非常精確地進(jìn)行定量。
[0033]本發(fā)明的另一方面涉及放大系統(tǒng)在醫(yī)學(xué)診斷中作為診斷測定(assay)的一部分的用途。通過本發(fā)明方法進(jìn)行診斷靶標(biāo)檢測及定量的靈敏性和精確度對于分子診斷和搭配診斷以及個性化療法是非常有價值的。
[0034]本發(fā)明可視化系統(tǒng)的其 他優(yōu)點是其使用(i)無毒、(ii)無色、(iii)明確的(welldefined)、(iv)穩(wěn)定的和(V)容易得到的化合物。
[0035]再一優(yōu)點是本發(fā)明的所有方法均可以手動和自動執(zhí)行。
【具體實施方式】
[0036]本發(fā)明涉及可用于使用多種測定形式(format)對多種樣本中固定在例如支撐物上的靶標(biāo)進(jìn)行可視化和檢測的強(qiáng)大的信號放大系統(tǒng)，其中靶標(biāo)包含氧化還原酶酶促活性。具體而言，本發(fā)明的放大系統(tǒng)有利于檢測復(fù)雜組織學(xué)樣本中的靶標(biāo)生物學(xué)分子。
[0037]根據(jù)本發(fā)明的靶標(biāo)可視化系統(tǒng)包括至少一個在水溶液中孵育假定含有氧化還原酶活性的靶標(biāo)的步驟，其中靶標(biāo)固定在支撐物上，且水溶液含有:
[0038]i)與靶標(biāo)相關(guān)聯(lián)的具有氧化還原酶活性的酶的第一底物；
[0039]ii)該酶的第二底物，以及任選地
[0040]iii)過氧化物化合物，
[0041]其中，第一底物是α -氰基-4-羥基肉桂酸(ACHCA)或其衍生物，且
[0042]第二底物是含有一種或多種能夠作為有氧化還原酶活性的酶的底物的化合物以及可檢測標(biāo)記物的結(jié)合物分子。
[0043]在一個實施方式中，本發(fā)明涉及用于對樣本中假定包含氧化還原酶活性的靶標(biāo)進(jìn)行檢測的方法，其中靶標(biāo)和/或樣本被固定化，該方法包括以下步驟:
[0044]a)在水溶液中孵育假定含有靶標(biāo)的樣本，水溶液包含:
[0045](i)具有氧化還原酶活性的酶的第一底物，
[0046](ii)該酶的第二底物，以及任選地[0047](iii)過氧化物化合物，
[0048] 其中，第一底物是α -氰基-4-羥基肉桂酸(ACHCA)或其衍生物，且第二底物是含有一種或多種能夠作為有氧化還原酶活性的酶的底物的化合物以及可檢測標(biāo)記物的結(jié)合物分子；
[0049]b)檢測樣本中第二底物的沉積分子的標(biāo)記物。
[0050]在另一實施方式中，用于檢測樣本中靶標(biāo)的方法包括以下步驟，其中靶標(biāo)和/或樣本被固定:
[0051]a)將假定含有靶標(biāo)的樣本與一種或多種結(jié)合劑孵育，其中至少一種結(jié)合劑是靶標(biāo)特異性結(jié)合劑且至少一種結(jié)合劑包括具有氧化還原酶活性的酶；
[0052]b)在水溶液中孵育樣本(a)，該水溶液包含:
[0053](i)該酶的第一底物；
[0054](ii)該酶的第二底物，以及任選地
[0055](iii)過氧化物化合物，
[0056]其中，第一底物是α -氰基-4-羥基肉桂酸(ACHCA)或其衍生物，且第二底物是含有一種或多種能夠作為有氧化還原酶活性的酶的底物的化合物以及可檢測標(biāo)記物的結(jié)合物分子；
[0057]c)檢測樣本中第二底物的沉積分子的標(biāo)記物。
[0058]在不同實施方式中，本發(fā)明的方法可以包括一個或多個額外步驟，例如洗滌步驟、進(jìn)一步的靶標(biāo)檢測步驟、其他信號放大步驟例如根據(jù)本發(fā)明或其他放大系統(tǒng)(例如在W02011047680中記載的放大系統(tǒng))的信號放大步驟或滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)系統(tǒng)的步驟、使用本領(lǐng)域記載的方法之一例如H&E染色、基于堿性磷酸酶(AP)的染色等對其他靶標(biāo)進(jìn)行可視化的步驟。本文描述的放大系統(tǒng)可以與領(lǐng)域內(nèi)開發(fā)的可應(yīng)用的用于將固定化分子靶標(biāo)可視化的幾乎任何的信號放大系統(tǒng)進(jìn)行組合。
[0059]本發(fā)明的信號放大系統(tǒng)以及靶標(biāo)可視化和檢測方法的不同方面和非限制性實施方式描述如下。
[0060]樣本
[0061]術(shù)語“樣本”是指來自更大整體或群體的代表性部分或單一項，一定量或一部分的假定含有待檢測靶標(biāo)的物質(zhì)或?qū)ο?，例如一部分或一定量的包含待分析的靶?biāo)分子、顆粒、結(jié)構(gòu)的生物材料、化學(xué)材料、環(huán)境材料，例如活檢樣本、食品樣本、土壤樣本等。典型的樣本顯示出物質(zhì)或?qū)ο蟮氖Ｓ嗖糠质鞘裁椿驊?yīng)該是什么。在一個實施方式中，本發(fā)明的樣本可以是環(huán)境樣本，例如土壤樣本或溢出物樣本。在另一個實施方式中，樣本可以是食品樣本。在另一個實施方式中，樣本可以是有機(jī)分子庫的一部分。在另一實施方式中，樣本可以是戰(zhàn)劑(warfare)樣本。
[0062]在一個實施方式中，本發(fā)明的樣本是生物學(xué)樣本。
[0063]生物學(xué)樣本可以示例為:
[0064]1.含有懸浮細(xì)胞和/或細(xì)胞殘骸的樣本，例如血液樣本、克隆細(xì)胞的懸浮液、身體組織勻漿等；
[0065]2.含有動物體、身體組織、涂片或體液或腫瘤樣本(例如活檢樣本)的完整或破損細(xì)胞的樣本；其可以是新鮮的組織樣本或保存的組織樣本，例如福爾馬林固定石蠟包埋的組織樣本；
[0066]3.含有活的有機(jī)體的樣本,例如含有動物、植物、細(xì)菌、真菌等的介質(zhì)的樣本；
[0067]4.含有病毒顆粒、其殘骸或病毒產(chǎn)物的樣本，例如含有病毒核酸、蛋白、肽等的身體涂片；
[0068]5.含有細(xì)胞的細(xì)胞器的樣本； [0069]6.含有天然或重組的生物學(xué)分子的樣本，例如血漿樣本、條件細(xì)胞培養(yǎng)基等。
[0070]7.含有植物細(xì)胞或其殘骸的樣本。
[0071]生物學(xué)樣本的上述實例以示例說明的目的給出，但是不限制本發(fā)明的實施方式。
[0072]化學(xué)樣本的實例可以通過化學(xué)化合物庫例如肽庫的樣本進(jìn)行示例說明，但是并不限制于此。環(huán)境樣本的實例可以通過土壤、水或空氣樣本和食品樣本進(jìn)行示例說明，但是不限制于此。
[0073]在一些實施方式中，本發(fā)明涉及含有固定化靶標(biāo)的樣本(例如，任何以上實例)，即在本發(fā)明的可視化和檢測過程中靶標(biāo)不能自由移動的樣本，例如靶標(biāo)移動通過機(jī)械或化學(xué)方式而大大降低或消除的樣本，例如在樣本或靶標(biāo)附著至某個支撐物或介質(zhì)上或者附著在某個支撐物或介質(zhì)內(nèi)的情況，例如組織學(xué)樣本等。因此，含有目標(biāo)靶標(biāo)的單個單元和/或聚集(aggregated)的單獨單元的樣本可以在檢測步驟之前固定到固體支撐物上。本發(fā)明的含有固定靶標(biāo)的樣本的實例包括但不限于，新鮮的或保存的(例如，福爾馬林固定和石蠟包埋的)固定至玻璃玻片或塑料玻片的表面的生物學(xué)組織樣本，含有固定至膜、ELISA板的生物學(xué)分子或化學(xué)分子的樣本等。在這些實施方式中，樣本的靶標(biāo)可以是固定在樣本內(nèi)，例如固定在組織樣本內(nèi)的蛋白，或者是固定在某些材料的表面或某些材料內(nèi)，其中某些材料為例如固體材料或凝膠例如硝化纖維膜、膠原蛋白/瓊脂糖/石蠟塊等的一部分。
[0074]在一個實施方式中，本發(fā)明涉及不包含靶標(biāo)的樣本，例如對照樣本。在另一實施方式中，本發(fā)明涉及假定包含靶標(biāo)的樣本，例如具有未知內(nèi)容物的樣本。
[0075]上述的術(shù)語“固體支撐物”是指，一件在本發(fā)明的過程條件下為固體的且化學(xué)惰性的任何材料。“化學(xué)惰性”在本文中是指所選的支撐物對本發(fā)明方法的靶標(biāo)可視化和檢測結(jié)果具有最小化影響或完全沒有影響。
[0076]適合用作固定本發(fā)明中樣本/靶標(biāo)的支撐物的材料實例包括但不限于:合成的聚合物支撐物，例如聚苯乙烯、聚丙烯、取代的聚苯乙烯例如胺化的或羧化的聚苯乙烯?’聚丙烯酰胺；聚酰胺；聚氯乙烯；玻璃；瓊脂糖；硝化纖維；尼龍；聚偏二氟乙烯；表面修飾的尼龍等?？梢赃x擇任何適用于固定樣本或靶標(biāo)以及適用于所選的測定形式例如用于IHC、ELISA、印跡(blotting)等的此類惰性支撐物。
[0077]麵
[0078]術(shù)語“靶標(biāo)”在本文中是指假定存在于樣本中并且可以以特定物理和/或功能特征為特征的目標(biāo)對象。如果沒有明確在文中指明，本發(fā)明的術(shù)語“靶標(biāo)”是指樣本中目標(biāo)對象的基本相同實體的整個池(pool)，而不是該對象的一個單個實體。本文中的術(shù)語“基本相同”是指，樣本中全部靶標(biāo)池的所有或幾乎所有單個實體具備使得它們能被認(rèn)作靶標(biāo)的一個或多個特征，例如靶標(biāo)可以是特定蛋白(包括樣本中該特定蛋白的所有分子)、特定分子復(fù)合物或結(jié)構(gòu)(包括樣本中該特定分子復(fù)合物或分子結(jié)構(gòu)的幾乎所有單元)，其可以是病毒或細(xì)菌，其中樣本中病毒顆?；蚣?xì)菌體的總?cè)后w是靶標(biāo)。[0079]與對于特定細(xì)胞類型、組織、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生理條件等為特征性的特征相關(guān)的生物學(xué)對象，例如分子、分子復(fù)合物、結(jié)構(gòu)、顆?；蛴袡C(jī)體，通常在領(lǐng)域中被稱為這些特定細(xì)胞類型、組織、細(xì)胞結(jié)構(gòu)或生理條件的“生物學(xué)標(biāo)記物”。這些可以在不同的實施方式中作為本發(fā)明靶標(biāo)的生物學(xué)標(biāo)記物的非限制性實例包括但不限于，核苷酸序列、蛋白或其他生物學(xué)分子，例如碳水化合物或脂質(zhì)、染色體結(jié)構(gòu)或膜結(jié)構(gòu)、病毒、細(xì)菌、微生物等。因此，在本發(fā)明的一些實施方式中，術(shù)語“靶標(biāo)”與術(shù)語“生物學(xué)標(biāo)記物”可互換地使用，其是指對于特定細(xì)胞類型、組織、生理條件等為特征性的分子、分子復(fù)合物、結(jié)構(gòu)或顆粒，其中，試樣中任何后述生物學(xué)標(biāo)記物的總?cè)后w被認(rèn)為是靶標(biāo)。
[0080]在一個實施方式中，靶標(biāo)可以是蛋白，例如細(xì)胞膜受體或胞質(zhì)蛋白，在另一實施方式中，靶標(biāo)可以是核酸，例如胞質(zhì)核酸。在本發(fā)明的一些實施方式中，任何后述靶標(biāo)的衍生物，包括片段、前體、突變體等也可以是是靶標(biāo)。
[0081]因此，在本發(fā)明的不同實施方式中，靶標(biāo)可以是生物學(xué)或化學(xué)靶標(biāo)分子、或顆粒、或分子復(fù)合物或細(xì)胞復(fù)合物、或分子結(jié)構(gòu)或細(xì)胞結(jié)構(gòu)、或病毒、或微生物，或該靶標(biāo)分子、顆粒、復(fù)合物、結(jié)構(gòu)、病毒或微生物的片段。在包含于化學(xué)樣本或環(huán)境樣本中的靶標(biāo)之中，可以有不同的污染物、毒素、戰(zhàn)劑物質(zhì)、分子庫成員、工業(yè)非毒性廢料化合物等。
[0082]在一個實施方式中，本發(fā)明涉及如下的靶標(biāo)，其中靶標(biāo)是多個單獨的基本相同的單元。術(shù)語“單元”是指在計算中被視為一體的單一量的靶標(biāo)，其可以通過定義靶標(biāo)的物理特征和/或功能特征而鑒定。術(shù)語“單獨單元”是指單元可從相同種類的其他單元或環(huán)境的其他成分中(通過功能的物理特征)分離出來并且可以分開地考慮和計數(shù)。術(shù)語“單個單元”在本文中是指一個靶標(biāo)單元，即與許多相反或相對的一個。術(shù)語“單獨單元”在本文中與術(shù)語“單個單元”可互換地使用。例如，靶標(biāo)蛋白的單個/單獨單元在本文中是指靶標(biāo)蛋白的單個單獨分子，即相同種類的多個分子中的一個分子。術(shù)語“基本相同的單元”是指，靶標(biāo)的多個單一單元具有一個或多個使得這些單元被考慮為靶標(biāo)的特征。術(shù)語“獨立的”是指靶標(biāo)的單個單元作為分開的實體存在，且并不依賴于樣本中相同種類的其他分開實體的存在。
·[0083]在一個實施方式中，本發(fā)明涉及靶標(biāo)的單個單元，例如單個靶標(biāo)分子、單個顆粒
坐寸ο
[0084]本發(fā)明在一些實施方式中涉及作為一部分生物學(xué)分子的單個靶標(biāo)單元，其具有允許脫離于相同分子的其他部分考慮該部分分子的特定物理或功能特征，例如靶標(biāo)蛋白的蛋白水解片段、融合蛋白的一部分、靶標(biāo)蛋白的特定結(jié)構(gòu)域、核酸的特定結(jié)構(gòu)、表位等。
[0085]在不同的實施方式中，多個的單個靶標(biāo)單元可以由單個單獨的生物或化學(xué)分子、單個單獨的單個顆粒、單個單獨的分子復(fù)合物或細(xì)胞復(fù)合物、單個單獨的分子結(jié)構(gòu)或細(xì)胞結(jié)構(gòu)、或單個單獨病毒或單個單獨微生物，或該分子、顆粒、復(fù)合物、結(jié)構(gòu)、病毒或微生物的單個單獨片段來表示。
[0086]在一個優(yōu)選實施方式中，靶標(biāo)是與癌癥相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)記物，例如激素和生長因子及其受體的核酸和多肽、細(xì)胞粘附分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)分子等，例如包括生長因子roGF、VEGF、TGF、HGF或EGF、它們的受體和通路相關(guān)分子的群組的基因、RNA和蛋白，與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路例如JAK/STAT通路或Aktl/PKB細(xì)胞存活通路、或5-FU通路相關(guān)的基因及其產(chǎn)物，雌激素受體ER及其基因(ERSl)等。本發(fā)明的方法使得可以簡單快速地對生物學(xué)標(biāo)記物進(jìn)行可視化和定量。
[0087]本發(fā)明的方法使得可以對以較寬動態(tài)范圍存在于樣本中的靶標(biāo)進(jìn)行可視化和定量。可以在一個樣本以及相同樣本中對非常高含量以及非常低含量的靶標(biāo)進(jìn)行可視化和定量，或者可以在單獨的樣本中對其進(jìn)行評估?？梢栽谝粋€樣本或相同樣本中對兩種或更多種不同的靶標(biāo)進(jìn)行可視化，例如，蛋白靶標(biāo)和核酸靶標(biāo)，或者兩種或更多種不同的蛋白靶標(biāo)，或者兩種或更多種不同的核酸靶標(biāo)等。
[0088]在一個實施方式中，單個靶標(biāo)單元可以基本均勻地分布在整個樣本中，在其他實施方式中，單個靶標(biāo)單元可以在樣本的一部分更大量地出現(xiàn)且在其他部分更少量地出現(xiàn)。在所有的后述實施方式中，可以使用本發(fā)明的方法在一個樣本或相同樣本中對單個靶標(biāo)單元進(jìn)行可視化和定量。在一些實施方式中，其中一個目標(biāo)靶標(biāo)與另一目標(biāo)靶標(biāo)相關(guān)聯(lián)，例如第一靶標(biāo)和第二靶標(biāo)以特定分子結(jié)合或結(jié)構(gòu)例如受體二聚體存在于樣本中，另一目標(biāo)靶標(biāo)可以通過對樣本中第一靶標(biāo)進(jìn)行可視化和定量來可視化和定量，或者兩種靶標(biāo)可以獨立進(jìn)行可視化和定量。
[0089]在一些實施方式中，本發(fā)明可以涉及單個靶標(biāo)單元的部分子群，例如存在于樣本中的靶標(biāo)的單個單獨單元總數(shù)的大部分或小部分。術(shù)語“部分子群”在本文中是指等于或小于99%的單個靶標(biāo)單元的總?cè)后w的一部分，例如等于或小于樣本中單個靶標(biāo)單元總量的90%，例如小于85%，例如75~80%的樣本中靶標(biāo)單元的總量，例如小于75%，例如樣本中單個革G標(biāo)單元總量的1%~50%,例如樣本中祀標(biāo)單元總量的1%~25%等。由50%~99%的總?cè)后w表示的部分子群單個靶標(biāo)單元根據(jù)本發(fā)明定義為存在于樣本中的單個靶標(biāo)單元的大部分。由小于50%的樣本中單個靶標(biāo)單元的總?cè)后w表示的部分子群根據(jù)本發(fā)明被定義為存在于樣本中的單個靶標(biāo)單元的小部分。
[0090]在一個實施方式中，大部分的單獨單個靶標(biāo)單元可涉及本發(fā)明的離散單個靶標(biāo)位點的形成；在另一實施方式中，小部分的單獨單個靶標(biāo)單元可涉及本發(fā)明的離散單個靶標(biāo)位點的形成。在一個實施方式 中，當(dāng)靶標(biāo)或單個靶標(biāo)單元以非常低的量存在于樣本中時，可以優(yōu)選基本所有的單獨單個單元均涉及本發(fā)明的單個結(jié)合位點的形成。本發(fā)明的單個結(jié)合位點是含有固定化靶標(biāo)的樣本或支撐物的位點，其中靶標(biāo)固有地包含有氧化還原酶酶促活性或者與包含該酶促活性的物質(zhì)(agent)相關(guān)聯(lián)。
[0091]在一個實施方式中，靶標(biāo)可以是具有固有的氧化還原酶酶促活性的分子、結(jié)構(gòu)、顆粒、微生物(等)，例如過氧化物酶例如HRP等。在另一實施方式中，靶標(biāo)可以是不具有該酶促活性的化合物、分子、結(jié)構(gòu)、顆粒、微生物(等)。在后述實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的靶標(biāo)可以被該酶促活性標(biāo)記，例如借助包含氧化還原酶活性的結(jié)合劑。
[0092]結(jié)合劑
[0093]在一些實施方式中，本發(fā)明的靶標(biāo)可視化方法可以包括將假定含有靶標(biāo)的樣本與一種或多種結(jié)合劑孵育的步驟，其中(i )至少一種結(jié)合劑能夠識別并特異性地結(jié)合至靶標(biāo)，
(ii)至少一種結(jié)合劑包含氧化還原酶活性。
[0094]術(shù)語“結(jié)合劑”在本文中是指能夠直接且特異性地結(jié)合至樣本中其結(jié)合配偶體(例如結(jié)合至靶標(biāo)分子、另一結(jié)合劑、半抗原等)的分子或另一種物質(zhì)例如顆粒。術(shù)語“特異性地”是指結(jié)合劑對其結(jié)合配偶體具有特異親和性。術(shù)語“直接地”是指結(jié)合劑在相互作用時與其特定的結(jié)合配偶體相互作用并形成直接的鍵合。相反地，術(shù)語“間接地”在本文中涉及相互間不具有特異親和性的兩種物質(zhì)之間的特定相互作用，且它們的相互作用由其他試劑介導(dǎo)，其中至少兩種該試劑是特異結(jié)合對的成員。示出本發(fā)明的間接結(jié)合的一個實例可以是含有靶標(biāo)蛋白分子、與靶標(biāo)蛋白結(jié)合的一抗以及與一抗結(jié)合的二抗的復(fù)合物。在該復(fù)合物中，根據(jù)本發(fā)明，二抗間接地與靶標(biāo)蛋白作用。
[0095]能夠直接并特異性地結(jié)合樣本中靶標(biāo)的結(jié)合劑在本文中被稱為“第一結(jié)合劑”;能夠直接并特異性結(jié)合至第一結(jié)合劑或結(jié)合至直接與靶標(biāo)相關(guān)聯(lián)的物質(zhì)的結(jié)合劑在本文中稱為“第二結(jié)合劑”。根據(jù)本發(fā)明的靶標(biāo)可視化系統(tǒng)可以包含多個可以間接結(jié)合至靶標(biāo)的結(jié)合劑，例如第三、第四和其他結(jié)合劑。在一些實施方式中，第一結(jié)合劑或其他實施方式中的第二或第三結(jié)合劑可以用來接觸樣本識別靶標(biāo)，結(jié)合至靶標(biāo)并與其形成復(fù)合物。在一些實施方式中，第一或第二結(jié)合劑可包含本發(fā)明的酶促活性并且可以通過該酶促活性標(biāo)記靶標(biāo)。第三和其他結(jié)合劑也可以包含酶促活性并且可用在本發(fā)明方法的其他步驟中，例如檢測靶標(biāo)位點處的可檢測結(jié)合物分子的沉積等。在一些實施方式中，第二、第三和其他結(jié)合劑用來放大、改變或降低與靶標(biāo)相關(guān)的信號。[0096]在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明結(jié)合劑是不同的特異性結(jié)合對的成員。
[0097]本領(lǐng)域中已知眾多不同的特異性結(jié)合對，它們是能夠特異性相互結(jié)合的成對的兩種不同分子。適用于實踐本發(fā)明的特異性結(jié)合對的成員可以是免疫型或非免疫型的。
[0098]非免疫特異性結(jié)合對包括其中兩種組分相互共有天然親合力但不是抗體的體系。示例的非免疫結(jié)合對是生物素-抗生物素蛋白或生物素-鏈酶親和素、葉酸-葉酸結(jié)合蛋白、互補核酸、受體-配體等。本發(fā)明也包括相互形成共價鍵的非免疫結(jié)合對。示例的共價結(jié)合對包括巰基反應(yīng)基團(tuán)(如馬來酰亞胺)和鹵乙?；苌锖桶贩磻?yīng)基團(tuán)如異硫氰酸酯、琥珀酰亞胺酯、磺酰鹵，以及如3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)和3-( 二甲基-氨基)苯甲酸(DMAB)的偶合染料等。
[0099]免疫特異性結(jié)合對可以示例為抗體-抗體體系或半抗原-抗半抗原體系。在一個實施方式中，本發(fā)明的免疫特異性結(jié)合對可以是含有兩種或更多種相互有親和性的抗體分子的抗體-抗體結(jié)合對，例如一抗和二抗對，其中一抗代表第一結(jié)合劑且二抗代表第二結(jié)合劑；含有3種或4種或更多種抗體成員的抗體體系可以用在另一實施方式中。在本發(fā)明的其它實施方式中，免疫結(jié)合對可以由半抗原-抗半抗原體系代表。在這些實施方式中，第一結(jié)合劑可以由含有對靶和半抗原具有親合力的分子的結(jié)合物(例如與半抗原連接的一抗或核酸序列)代表，并且第二結(jié)合劑可以由抗半抗原抗體代表。
[0100]術(shù)語“半抗原”意指一種小分子，其中可以將所述小分子視作對其可產(chǎn)生抗體的孤立表位，盡管如果注入動物中，半抗原單獨不會引起免疫反應(yīng)，它必須與載體(通常是蛋白質(zhì))結(jié)合。由于半抗原是小分子，故多個拷貝的半抗原可以連接至大分子，例如聚合物分子，如蛋白質(zhì)、核苷酸序列、葡聚糖等。在信號放大是必需或有利的情況下，半抗原可以充當(dāng)測定模式的便利標(biāo)記物分子。因此，結(jié)合的多拷貝半抗原提供了增強(qiáng)的靈敏度，例如增加的信號強(qiáng)度。合適半抗原的非限定實例包括熒光素(FITC)、2，4- 二硝基酚(DNP)、myc地高辛(DIG)、酪氨酸、硝基酪氨酸生物素和染料，例如四甲基羅丹明、德克薩斯紅(Texas Red)，丹橫酸(dansyl)、Alexa Fluor488> BODIPY FL、螢光黃和 Alexa Fluor405/Cascade Blue 突光團(tuán)，記載在US20080305497中的半抗原也可以用于本發(fā)明的目的。
[0101]如本文中所用的術(shù)語“抗體”意指免疫球蛋白或其部分，并且包括含有抗原結(jié)合位點的任何多肽，無論其來源、產(chǎn)生方法和其它特征是什么。該術(shù)語包括，例如多克隆抗體、單克隆抗體、單特異性抗體、多特異性抗體、人源化抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、合成抗體、重組抗體、雜合抗體、突變抗體和CDR-移植抗體?？贵w部分可以包括仍能結(jié)合抗原的任何片段，例如Fab、F(ab’)2、Fv、SCFv?？贵w的起源由基因組序列限定，無論產(chǎn)生方法是什么。
[0102]在本發(fā)明的上下文中，一抗是指與靶標(biāo)特異性結(jié)合，更具體地是與樣品的單個靶標(biāo)單元特異性結(jié)合，例如與單個靶標(biāo)分子特異性結(jié)合的抗體結(jié)合劑，例如整個抗體分子、所述分子的片段或衍生物，例如含有抗體的結(jié)合物或聚合抗體。在一些實施方式中，一抗可以是能夠與不同靶標(biāo)的兩個(或更多)單個單獨單元結(jié)合的二價抗體，例如能夠與受體二聚物例如Her2/Her3 二聚物結(jié)合的抗體。在這個實施方式中，本發(fā)明的單個靶標(biāo)單元可以是單個Her2/Her3 二聚物，并且該靶標(biāo)可以是樣品中的Her2/her3 二聚物群，其包括該樣品中的全部所述二聚物。一抗可以源自任何溫血物種，例如哺乳動物、鳥類。
[0103]在本發(fā)明的上下文中，二抗是指具有下述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體結(jié)合劑，例如整個抗體分子、所述分子的片段或衍生物，例如含有抗體的結(jié)合物或聚合抗體，其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與一抗、或在靶標(biāo)部位處沉積的半抗原、或與一抗或另一結(jié)合劑直接或間接連接的半抗原特異性結(jié)合。
[0104]在本發(fā)明的上下文中，三抗是指包括下述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體結(jié)合劑，例如整個抗體分子、所述分子的片段或衍生物，例如含有抗體的結(jié)合物或聚合抗體，其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與二抗或連接至二抗的半抗原或連接至聚合物(其與二抗結(jié)合)的半抗原或在靶標(biāo)部位處沉積的結(jié)合物分子的半抗原特異性結(jié)合。
[0105]有時，抗體可以同時充當(dāng)二抗和三抗。
[0106]在本發(fā)明中使用的抗體，包括一抗、二抗和三抗，可以得自于任何哺乳類物種，例如大鼠、小鼠、山羊、豚鼠、驢、兔、馬、美洲駝、駱駝或任何鳥類物種例如雞、鴨。如本文中所用的，源自任何哺乳物種或鳥類物種，意指編碼特定抗體的核酸序列的至少一部分源自特定哺乳動物(例如大鼠、小鼠、山羊或兔)或特定鳥(例如雞、鴨)的基因組序列。抗體可以是任意同種型(isotype),例如 IgG、IgM`、IgA、IgD、IgE 或任何亞類,例如 IgGl> IgG2、IgG3、IgG4。
[0107]在某些實施方式中，一抗包含能夠特異性結(jié)合由生物學(xué)樣本的細(xì)胞表達(dá)的生物學(xué)標(biāo)記物特別是該生物學(xué)標(biāo)記物的單個單獨單元的抗原結(jié)合區(qū)域。標(biāo)記物可以表達(dá)在細(xì)胞表面上或表達(dá)在細(xì)胞膜內(nèi)，即在細(xì)胞的內(nèi)部，例如在胞質(zhì)內(nèi)、在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)等。在一些實施方式中，生物學(xué)標(biāo)記物可以從細(xì)胞提取，因此其存在于無細(xì)胞的介質(zhì)中，例如在水溶液中，或者其是存在于細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)、血漿、腦脊液等中的可溶分子。對應(yīng)樣本的實例如上所述。
[0108]在某些實施方式中，二抗包含特異性結(jié)合一抗例如結(jié)合至一抗的恒定區(qū)域的抗原結(jié)合區(qū)域。在某些實施方式中，二抗可以與聚合物結(jié)合。在一些實施方式中，2~20個二抗，例如5~15個二抗可以與聚合物結(jié)合。在其他實施方式中，聚合物可以與I~10個二抗結(jié)合，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個二抗。
[0109]在某些實施方式中，三抗可以包含特異性結(jié)合二抗例如結(jié)合至二抗的恒定區(qū)、或結(jié)合至與二抗連接的半抗原、或結(jié)合至與二抗結(jié)合的聚合物的抗原結(jié)合區(qū)域。在某些實施方式中，三抗結(jié)合至聚合物。在一些實施方式中，I~20個三抗可以結(jié)合至聚合物。在其他實施方式中，I~5個三抗，例如1、2、3、4或5個三抗可以與聚合物結(jié)合。[0110]在一些實施方式中，可以優(yōu)選包含結(jié)合劑的單個結(jié)合單元的聚合物，例如與一個分子的一抗、二抗或三抗結(jié)合的聚合物。
[0111]可用于本發(fā)明目的的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體，工程抗體包括嵌合抗體、⑶R接枝抗體和使用噬菌體展示或可選技術(shù)制造的人工選擇抗體。
[0112]可以通過本領(lǐng)域熟知的多種方法中的任何一種來制造本發(fā)明的抗體結(jié)合齊Li，例如根據(jù) Harlow and Lane, Antibodies: a Laboratory Manual, (1998) (ColdSpring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY)。用于制備重組抗體分子的技術(shù)在上述文獻(xiàn)和多個其它文獻(xiàn)例如EP0623679、EP0368684和EP0436597中有過描述?？梢詮腸DNA庫中分離編碼抗體的核酸?？梢詮氖删w庫中分離編碼抗體的核酸(參見例如 McCafferty 等人 1990，Nature348:552，Kang 等人 1991，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:4363;EP0589877B1 )?？梢酝ㄟ^已知序列的基因改組而獲得編碼抗體的核酸(Mark等人1992，Bio/Technol.10:779)?？梢酝ㄟ^體內(nèi)重組而分離編碼抗體的核酸(Waterhouse等人1993，Nucl.Acid Res.21:2265)。用于本發(fā)明方法中的抗體包括人化的免疫球蛋白(參見U.S.5，585，089，Jones等人1986，Nature332:323)?？梢砸匀魏慰赡艿姆绞礁淖儽景l(fā)明的抗體，假定它們保持它們的結(jié)合親和性，例如它們可以與效應(yīng)蛋白、毒素、標(biāo)記物等融合?？贵w與不同試劑結(jié)合的方法也在領(lǐng)域內(nèi)熟知并在本發(fā)明以下的示例性實施方式中描述。
[0113]在本發(fā)明的一個實施方式中，抗體結(jié)合劑由Fab區(qū)域表示。
[0114]在一個實施方式中，抗體結(jié)合劑可以是包括兩種或更多種不同抗體結(jié)合劑的組合物，例如包括第一抗體 結(jié)合劑和第二抗體結(jié)合劑的組合物，其中該兩種或更多種不同抗體劑具有不同的免疫結(jié)合對。在一個實施方式中，在組合物中，兩種或更多種不同抗體結(jié)合劑中的至少一種是能夠與靶標(biāo)特異結(jié)合的抗體，且至少一種其它結(jié)合劑是包括酶的抗體。
[0115]在另一實施方式中，本發(fā)明涉及作為非免疫特異結(jié)合對的成員的結(jié)合劑，例如互補的核苷酸序列或核酸類似分子。
[0116]含有核酸或核酸類似分子例如DNA分子、RNA分子、PNA分子的結(jié)合劑可以用于對核酸靶標(biāo)的單個單獨單元進(jìn)行可視化和定量。
[0117]用作本發(fā)明目的的結(jié)合劑的核酸序列可以化學(xué)合成或在重組細(xì)胞中產(chǎn)生。兩種產(chǎn)生模式在領(lǐng)域內(nèi)均公知(參見，例如Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Manual, 2nd ed.Cold Spring Harbor Press)。在一些實施方式中，核酸結(jié)合劑可以包括肽核酸(PNA)。肽核酸是如下的核酸分子，其中通常存在于DNA和RNA中的脫氧核酸或核糖骨架(backbone)被肽骨架替換。制作PNA的方法在領(lǐng)域內(nèi)已知(參見，例如Nielson, 2001, Current Opinion in Biotechnologyl2:16)(并入本文以供參考)。在其它實施方式中，結(jié)合劑可以包括鎖核酸(LNA)(Sorenson等人2003，Chem.Commun.7 (17):2130)。
[0118]在一些實施方式中，核酸結(jié)合劑可以包括至少一個寡核苷酸序列或至少一個聚核苷酸序列，其在特定的嚴(yán)格條件下與生物樣品中靶標(biāo)序列的單個單元(例如，單個mRNA序列)特異雜交。本文中使用術(shù)語“在嚴(yán)格條件下的雜交”來描述雜交的條件，在該條件下，顯著地相互互補例如至少70%、至少80%、至少85~90%互補的核苷酸序列保持相互結(jié)合。如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402 (并入本文以供參考)中所述的確定互補百分比。
[0119]指定的嚴(yán)格條件在領(lǐng)域內(nèi)已知，并可以在Current Protocols in MolecularBiology, John ffiley&Sons, Inc.(Ausubel 等人 1995eds.)，第 2、4 和 6 節(jié)(并入本文以供參考)中找到。此外，在 Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nded.Cold Spring Harbor Press,第7、9和11章(并入本文以供參考)中描述了指定的嚴(yán)格條件。在一些實施方式中，雜交條件為高度嚴(yán)格的條件。高度嚴(yán)格的雜交條件的實例是在65~70°C下在4X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中的雜交或是在42~50°C下在4X SSC加50%甲酰胺中的雜交，之后在65~70°C下在IXSSC中洗滌一次或多次。應(yīng)理解的是，其它的試劑可以添加到雜交和/或洗滌緩沖液中，例如，封閉劑(BSA或鮭魚精子DNA)、洗滌劑(SDS )、螯合劑(EDTA )、聚蔗糖、PVP等。
[0120]在一些實施方式中，結(jié)合劑可以在中等嚴(yán)格的條件下與樣品中的靶標(biāo)序列雜交。本文中使用的中等嚴(yán)格包括能夠由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員基于例如DNA的長度而容易確定的條件。例不的條件在 Sambrook 等人 Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2ded.Vol.1, pp.1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)(并入本文以供參考)中記載，包括使用5XSSC、0.5%SDS、1.0mM EDTA (ρΗ8.0)的預(yù)洗液，42°C下50%甲酰胺、6 X SSC的雜交條件(或其它類似的雜交液，例如Stark溶液，在50%甲酰胺中，42°C)，以及 60。。、0.5XSSC、0.1%SDS 的洗滌條件。
[0121]在一些實施方式中，結(jié)合劑在低等嚴(yán)格的條件下與樣品中的靶標(biāo)序列雜交。本文中使用的低等嚴(yán)格條件可以包括能夠由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員基于例如DNA的長度而容易確定的條件。例如，低等嚴(yán)格可以包括在含有35%甲酰胺、5XSSC、50mM Tris_HCl(pH7.5)、5mM EDTA、0.1%PVP、0.1%聚蔗糖、1%BSA和500 μ g/ml變性的鮭魚精子DNA的溶液中于40°C對DNA預(yù)處理6小時。在具有以下改變的相同溶液中進(jìn)行雜交:使用0.02%PVP、0.02%聚蔗糖、0.2%BSAU00 μ g/ml鮭魚精子DNA、10% (wt/vol)硫酸葡聚糖和5~20 X IQ6CPM結(jié)合劑。于40°C在雜交混合物中孵育樣品18~20小時，之后在含有2XSSC、25mM Tris-HCl(pH7.4)、5mM EDTA和0.1%SDS的溶液中于55°C洗滌樣品1.5h。使用新鮮溶液替換洗滌液并將其于60°C再孵育1.5h。
[0122]在其它實施方式中，本發(fā)明可以涉及結(jié)合劑，其為源自非抗體蛋白的肽序列或包括該肽序列，例如源自不同蛋白的核酸結(jié)合域、不同細(xì)胞和核受體的配體及其衍生物的肽序列。這些結(jié)合劑的一些非限制性實例可以是能夠與抗體恒定區(qū)結(jié)合的補體級聯(lián)的經(jīng)典通路的clq蛋白，MHC分子例如I類MHC和II類MHC和非常規(guī)MHC，具有特異結(jié)合配偶體的分子例如涉及細(xì)胞信號通路的分子例如具有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的分子，例如fos/jun、myc、GCN4，具有SHl或SH2結(jié)構(gòu)域的分子，例如Src或Grb_2 ;免疫球蛋白受體，例如Fe受體；嵌合蛋白，即工程制備為將兩種或更多種特異結(jié)合配偶體的特征結(jié)合的蛋白，例如亮氨酸拉鏈可以被工程化為抗體的Fe區(qū)，SH2結(jié)構(gòu)域可以被工程化為在抗體的Fe區(qū)中表達(dá)。在其它實施方式中，融合蛋白可以被工程化為包括具有取代的可變結(jié)構(gòu)域的抗體Fe部分。
[0123]結(jié)合劑也可以是能夠與生物大分子的某些結(jié)構(gòu)單元特異結(jié)合的小分子。
[0124]在一些實施方式中，結(jié)合劑可以包括可檢測的標(biāo)記物，例如，熒光物質(zhì)、半抗原、酶等。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及標(biāo)記的結(jié)合劑，即標(biāo)記的第三結(jié)合劑或其他結(jié)合劑，其能夠特異性地結(jié)合所沉積的可檢測分子并用于本發(fā)明的靶標(biāo)位點的可視化。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及含有酶標(biāo)記物的結(jié)合劑。合適的酶標(biāo)記物的非限制性實例可以是辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(ΑΡ)、β-半乳糖苷酶(GAL)、葡萄糖_6_磷酸脫氫酶、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、轉(zhuǎn)化酶、黃嘌呤氧化酶、螢火蟲熒光素酶、葡糖氧化酶(GO)。在一個實施方式中，結(jié)合劑可以包含HRP作為標(biāo)記物。在另一實施方式中，結(jié)合劑可以包含AP作為標(biāo)記物。
[0125]在一些其他實施方式中，可以優(yōu)選與本發(fā)明的酶結(jié)合的相對小分子的結(jié)合劑，例如，與酶例如HRP的一個或兩個或更多個部分結(jié)合的抗體的分離Fab片段。這些結(jié)合劑是較緊湊的分子，且其可以有利于檢測被周圍的其它分子“隱藏”或掩蓋在靶標(biāo)或樣本中的單獨靶標(biāo)單元；可能隱藏在靶標(biāo)分子內(nèi)的單個目標(biāo)靶標(biāo)結(jié)構(gòu)；可能在復(fù)雜的生物學(xué)樣本包括細(xì)胞中難以接觸到的單個病毒顆粒。使用這些結(jié)合劑以降低結(jié)合劑對樣本中靶標(biāo)不相關(guān)對象的非特異性結(jié)合也是有利的。在一個實施方式中，使用小的結(jié)合劑構(gòu)建體作為第一結(jié)合劑(其中Fab片段得自多克隆抗體)或第二結(jié)合劑(Fab片段得自多克隆二抗)，具體例如(Fab) r (HRP) i，對于檢測以非常低的含量(即，通過采用酶介導(dǎo)的染料沉積的任何其他領(lǐng)域內(nèi)已知的可視化方法檢測不出的含量)存在于樣本中的靶標(biāo)可能是有利的。使用這些Fab結(jié)合劑使得可以將結(jié)合劑多重特異性地結(jié)合至樣本中它們的結(jié)合配偶體，同時，可以用多個酶標(biāo)記物大量標(biāo)記它們的結(jié)合配偶體。這樣可以顯著增強(qiáng)在含有多個酶標(biāo)記物的樣本部位處的報告物沉積。
[0126]在其他實施方式中，使用較大的結(jié)合劑構(gòu)建體可能是有利的，例如含有與多個特異性結(jié)合劑(例如，抗體)化學(xué)連接以及任選地與一種或多種標(biāo)記物化學(xué)連接的核聚合物的結(jié)合物分子。兩種構(gòu)建體均可以提高特異性靶標(biāo)染色的水平并降低非特異性染色。此外，含有結(jié)合劑以及數(shù)十至數(shù)百個酶部分的較大結(jié)合物，在例如關(guān)注于非常快速的靶標(biāo)檢測或需要獲得每單獨靶標(biāo)位點的較大沉積的情況下可能是有利的。當(dāng)靶標(biāo)以非常低的量存在于樣本中時，也可推薦使用這些構(gòu)建體。
[0127]形成本發(fā)明靶標(biāo)位點所必需的結(jié)合劑的量可以根據(jù)不同因素而變化，例如樣本種類、靶標(biāo)種類、結(jié)合劑種類、結(jié)合劑的結(jié)合親和性等。使用常規(guī)普遍的知識，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇合適的結(jié)合劑并確定·各個特定實施方式所需的量。在一些實施方式中，可優(yōu)選調(diào)節(jié)形成靶標(biāo)位點的結(jié)合劑的量，從而使并非所有存在于樣本中的單個靶標(biāo)單元而是其部分子群參與形成本發(fā)明的靶標(biāo)位點，例如在樣本包含大量靶標(biāo)或以寬泛的動態(tài)濃度范圍存在的靶標(biāo)的實施方式中。在其他實施方式中，可以優(yōu)選所有或基本所有的單個靶標(biāo)單元參與形成本發(fā)明的靶標(biāo)位點，例如在樣本具有非常低的靶標(biāo)表達(dá)或單個靶標(biāo)單元的表達(dá)的情況下。在后述的實施方式中，可以優(yōu)選所使用的結(jié)合劑的量將保證由樣本的基本大部分單獨單個單元形成結(jié)合位點，即基本大部分所存在的單個靶標(biāo)單元將參與靶標(biāo)位點的形成。
[0128]塵
[0129]根據(jù)本發(fā)明，樣本中的靶標(biāo)通過在含有固定化靶標(biāo)的樣本位點上沉積具備氧化還原酶活性的酶的可檢測底物而進(jìn)行可視化，其中該位點含有該酶。
[0130]根據(jù)本發(fā)明的酶是具有氧化還原酶活性的酶(在本文中可互換地稱為“氧化還原酶”或“本發(fā)明的酶”)。
[0131]術(shù)語“具有氧化還原酶活性的酶”是指在酶的EC編號分類中被分類為ECl的酶，其催化電子從一個分子(還原劑，也稱為氫或電子供體)轉(zhuǎn)移至另一分子(氧化劑，也稱為氧或電子受體)。在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明涉及被分類為El.10.(酚氧化酶)和El.11.(過氧化物酶)的氧化還原酶。[0132]在一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明涉及酚氧化酶，特別是含銅氧化酶家族，漆酶(E1.10.3.2)。漆酶作用于酚和類似分子，進(jìn)行單電子氧化。漆酶通過促進(jìn)木質(zhì)醇(天然出現(xiàn)的酚的家族)的氧化耦合而在木質(zhì)素形成中發(fā)揮作用。適用于本發(fā)明目的的漆酶可以是例如由Phillips LE和Leonard TJ (Benzidine as aSubstrate for Measuring Phenoloxidase Activity in Crude Cell-Free Extractsof SchizophylIum commune.Mycologial976, 68:277-285)> 或 Kunamneni A,PlouFJ, Ballesteros A,Alcalde M.(Laccases and their applications:a patent review.Recent Pat Biotechnol.2008，2 (I):10-24)、或 Rodriguez Couto S, Toca Herrera JL(Industrial and biotechnological applications of laccases:a review.BiotechnolAdv.2006，24(5):500-13)描述的酶。
[0133]在本文中使用術(shù)語“漆酶”來指代一種本發(fā)明的具有酚氧化酶活性的酶，然而應(yīng)該理解的是，漆酶是適用于本發(fā)明目的的酚氧化酶的很多實施方式中的一個。
[0134]漆酶屬于氧化酶家族,其需要氧作為酶作用的第二底物。當(dāng)酶是漆酶時,在一個實施方式中，用于本發(fā)明沉積反應(yīng)的氧源可以是存在沉積介質(zhì)中的過氧化物化合物，在另一個實施方式中，其可以是存在空氣中的氧。
[0135]在另一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明涉及催化以下形式的反應(yīng)的過氧化物酶酶促活性:
[0136]ROORj + 電子供體(2e_) +2H+ — R0H+R’ OH。
[0137]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，具有過氧化物酶活性的酶是辣根過氧化物酶(HRP)0在本發(fā)明的另一個實施方式中，具有過氧化物酶活性的酶是大豆過氧化物酶(SP)。
[0138]在氧化還原酶是過 氧化物酶的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的沉積介質(zhì)包含過氧化物化合物。
[0139]對于一些過氧化物酶，最佳底物是過氧化氫，一些其他的過氧化物酶對有機(jī)的氫過氧化物例如有機(jī)過氧化物更有活性。電子供體的特性在很大程度上依賴于酶的結(jié)構(gòu)，例如辣根過氧化物酶(HRP)可以利用多種有機(jī)化合物，同時作為電子供體和電子受體。HRP具有可接近的活性位點，很多化合物可以觸及反應(yīng)位點。
[0140]酶促活性，即氧化還原酶活性，例如酚氧化酶或過氧化物酶活性可以由與結(jié)合劑分子直接或間接連接的全長酶分子、或混有酶促活性的酶片段(例如51%~99.9%的全長酶分子，或少于51%，例如40%、30%以下)表示。
[0141]根據(jù)本發(fā)明，結(jié)合劑可以與一個或更多個酶部分直接或間接結(jié)合(本文中的術(shù)語“部分(moiety)”意指能具有氧化還原酶活性的部分酶分子，它包括整個或基本上整個的酶分子以及任意大小的所述分子的仍可具有氧化還原酶酶促活性的部分)。全部結(jié)合劑或者第一結(jié)合劑和/或第二結(jié)合劑、第三結(jié)合劑等的分子可以與氧化還原酶的一個或數(shù)個功能活性部分結(jié)合。在一個實施方式中，第一結(jié)合劑的至少一個分子可以與可具有氧化還原酶活性的一個或多個酶促部分結(jié)合；在另一實施方式中，第二結(jié)合劑的至少一個分子可以與一個或多個這些部分結(jié)合。術(shù)語“直接結(jié)合”是指酶部分通過化學(xué)鍵連接至結(jié)合劑分子。術(shù)語“間接結(jié)合”是指酶的部分通過連接分子與結(jié)合劑分子相關(guān)聯(lián)，連接分子與結(jié)合劑具有化學(xué)鍵且與酶具有化學(xué)鍵。結(jié)合生物學(xué)分子和連接分子的方法為領(lǐng)域內(nèi)熟知并在以下示例。
[0142]在一個實施方式中，氧化還原酶的部分是HRP的部分，例如能具有HRP酶促活性的HRP全分子或其片段，其也可以是含有HRP的具備酶促活性的部分的重組蛋白等。在另一個實施方式中，氧化還原酶的部分可以是大豆氧化還原酶(SP)的部分。在另一個實施方式中，氧化還原酶的部分可以是漆酶的部分。
[0143]包括具備氧化還原酶活性的酶的結(jié)合劑的非限制性實例可以是抗體分子或其衍生物，例如與一個或多個HRP部分結(jié)合的Fab片段，以及與HRP結(jié)合的核酸結(jié)合劑等。這些結(jié)合劑可以直接或間接地結(jié)合至單個靶標(biāo)單元，例如單個靶標(biāo)分子，并由此形成復(fù)合物，其中單個復(fù)合物包含靶標(biāo)的單個單獨單元以及一種或多種結(jié)合劑，其中一種或多種結(jié)合劑包括具有氧化還原酶活性的酶。
[0144]在一個實施方式中，結(jié)合劑可以是含有過氧化物酶或本發(fā)明的另一種酶的一個、或兩個或更多個部分的結(jié)合物，其中該部分與結(jié)合劑(例如與HRP的一個或更多個部分結(jié)合的抗體分子)連接。在另一個實施方式中，結(jié)合劑可以是含有間接地與結(jié)合劑連接的兩個或更多個具有過氧化物酶活性的酶(例如HRP的兩個或更多個部分)的結(jié)合物，例如一個或更多個抗體分子和一個或更多個HRP部分獨立地與骨架聚合物連接的結(jié)合物。
[0145]每分子結(jié)合劑的HRP數(shù)量可以為每結(jié)合劑I個酶部分至每結(jié)合劑20~50個酶部分或更多。在一些實施方式中，可以優(yōu)選使用這樣的結(jié)合劑，其中每結(jié)合劑的HRP部分?jǐn)?shù)目是至少2個，優(yōu)選每結(jié)合劑2個至25個酶部分，例如在3個和20個之間，如4、5、6、7、8、9、10個等。可以優(yōu)選使用每結(jié)合劑的酶部分?jǐn)?shù)量是2或更多的結(jié)合劑，其中期望將樣本中的靶標(biāo)可視化為分開的點(例如具有顏色、熒光或放射性的點)。在一些實施方式中，可以優(yōu)選使用含有每結(jié)合劑多于4個(優(yōu)選為5~20，例如5~15)酶部分的結(jié)合劑。具有多于4個酶部分的結(jié)合劑有利于形成可以可視化為基本上相同大小的視覺上分開的點的靶標(biāo)位點。在一些實施方式中，可優(yōu)選基本上所有與酶相關(guān)聯(lián)的結(jié)合劑分子相對于每分子包含大約相同數(shù)量的酶部分，例如每結(jié)合劑分子4~6、5~7、6~8、7~9、8~10等，例如每抗體分子4~6或6~8個HRP部分。根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合劑也可以包含不同氧化還原酶的部分的組合。
[0146]固有地含有氧化還原酶活性的單個靶標(biāo)單元、或(直接或間接)結(jié)合至含有具備氧化還原酶活性(例如過氧化物酶活性)的酶的結(jié)合劑的單個靶標(biāo)單元，構(gòu)成本發(fā)明的單個靶標(biāo)位點。在一個實施方式中，本發(fā)明的單個靶標(biāo)位點可以包括單個靶標(biāo)單元、至少一種第一結(jié)合劑和至少一種第二結(jié)合劑，其中該至少一種第二結(jié)合劑與具有過氧化物酶活性的一個或更多個酶例如HRP結(jié)合。在另一個實施方式中，單個靶標(biāo)位點可以包括單個靶標(biāo)單元、至少一種與半抗原結(jié)合的第一結(jié)合劑和半抗原抗體，其中半抗原抗體與具有過氧化物酶活性的一個、兩個或更多個酶例如HRP結(jié)合。在另一個實施方式中，靶標(biāo)位點可以包含單個靶標(biāo)單元和含有氧化還原酶活性的第一結(jié)合劑例如HRP的一個或更多個部分。本發(fā)明的靶標(biāo)位點可以包括(任意上述的)單個靶標(biāo)單元與任何上述結(jié)合劑的任何組合，其中該組合包含氧化還原酶活性，例如過氧化物酶活性，例如HRP。
[0147]在一個實施方式中，本發(fā)明的單個靶標(biāo)位點可以是包含具備本發(fā)明酶促活性的單個靶標(biāo)單元的固體支撐物的單個位點(任意上述)。如上所討論的，在一些實施方式中，氧化還原酶可以自身是靶標(biāo)，因此，固定在固體支撐物上或固體支撐物內(nèi)的氧化還原酶例如HRP、SP、漆酶等可以是本發(fā)明的靶標(biāo)位點。
[0148]酶底物[0149]為了使固有地含有氧化還原酶活性或與氧化還原酶活性相關(guān)聯(lián)的靶標(biāo)可視化，在含有與本發(fā)明靶標(biāo)位點相關(guān)聯(lián)的酶的第一底物、以及酶的第二底物的水溶液中孵育含有這些靶標(biāo)的樣本。
[0150]根據(jù)本發(fā)明的與靶標(biāo)位點相關(guān)的酶的第一底物是α-氰基-4-羥基肉桂酸
[0151]
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測樣本中的固定化靶標(biāo)的方法，其中所述靶標(biāo)固有地包括氧化還原酶酶促活性或與氧化還原酶酶促活性相連，所述方法包括在水溶液中孵育假定包括所述靶標(biāo)的樣本，所述水溶液包括 (i)所述酶促活性的第一底物，以及 (ii)所述酶促活性的第二底物，
2.其中所述第一底物是α-氰基-4-羥基肉桂酸(ACHCA)或其衍生物，所述第二底物是包括一種或多種能夠作為所述酶促活性的底物的化合物以及可檢測標(biāo)記物的結(jié)合物分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述氧化還原酶酶促活性與選自酚氧化酶或過氧化物酶的酶相關(guān)聯(lián)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述酶是過氧化物酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項所述的方法，其中所述水溶液包括過氧化物化合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1~5中任一項所述的方法，其中所述第二底物是式(i)的結(jié)合物分子:
(Y) n-L-(Z)m, 其中 Y是能夠作為具有氧化還原酶活性的酶的底物的化合物； Z是可檢測標(biāo)記物； L是連接物化合物或化學(xué)鍵， 其中 η是I~150的整數(shù)，且 m是I~150的整數(shù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中Y是式(II)的化合物:
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述結(jié)合物包括至少兩個式(II)的化合物Y。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、6、7或8所述的方法，其中所述結(jié)合物包括一個或多個阿魏酸殘基，或其衍生物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求6~9中任一項所述的方法，其中所述結(jié)合物包括可檢測標(biāo)記物，所述可檢測標(biāo)記物為熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、發(fā)色物質(zhì)或放射性物質(zhì)。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中α-氰基-4-羥基肉桂酸(ACHCA)或其衍生物的量在約0.15mM至約50mM的范圍內(nèi)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中ACHCA的量在約0.75mM至約5.75mM的范圍內(nèi)。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中ACHCA的量在約5.85mM至約50mM的范圍內(nèi)。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述靶標(biāo)并不固有地包括氧化還原酶活性，且所述活性經(jīng)由試劑與所述靶標(biāo)相連。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所 述的方法，其中所述試劑是靶標(biāo)特異性結(jié)合劑或能夠特異性結(jié)合至與所述靶標(biāo)相連或相關(guān)聯(lián)的物質(zhì)的試劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，包括 a)將假定包括所述靶標(biāo)的樣本與一種或多種結(jié)合劑孵育，其中至少一種結(jié)合劑是靶標(biāo)特異性結(jié)合劑且至少一種結(jié)合劑包括具有氧化還原酶活性的酶； b)在權(quán)利要求1~13中任一項所述的水溶液中孵育樣本(a)； c)在樣本(b)中檢測包括一種或多種能夠作為所述酶促活性的底物的化合物以及可檢測標(biāo)記物的結(jié)合物分子的沉積。
17.根據(jù)權(quán)利要求1、14、15或16所述的方法，其中所述靶標(biāo)是生物學(xué)分子。
18.根據(jù)權(quán)利要求1、14、15、16或17所述的方法，其中至少一種所述結(jié)合劑是抗體。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中第一結(jié)合劑是包括過氧化物酶或酚氧化酶的一個部分的多克隆一抗的(Fab)1片段。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中第二結(jié)合劑是包括過氧化物酶或酚氧化酶的一個部分的多克隆二抗的(Fab)1片段。
21.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述樣本是包括細(xì)胞的生物學(xué)樣本。
22.—種包括α-氰基-4-羥基肉桂酸(ACHCA)和結(jié)合物分子的水溶液，所述結(jié)合物分子包括一種或多種能夠作為氧化還原酶酶促活性的底物的化合物以及可檢測標(biāo)記物。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的水溶液，其中所述結(jié)合物分子選自在權(quán)利要求6~10中任一項中定義的分子。
24.一種組件試劑盒，用于可視化樣本中固有地包括氧化還原酶酶促活性或與氧化還原酶酶促活性相連的靶標(biāo)，所述組件試劑盒包括權(quán)利要求22或23所述的溶液。
25.—種測定,包括權(quán)利要求1~21中任一項所述的方法。
26.—種診斷方法，包括權(quán)利要求25所述的測定。
【文檔編號】C12Q1/00GK103597089SQ201280029392
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年4月19日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月19日
【發(fā)明者】J·洛澤, G·斯克拉蒂奇克瓦 申請人:丹麥達(dá)科有限公司