用于診斷和監(jiān)測貓科動物的甲狀腺功能亢進的組合物和方法
【專利摘要】本發(fā)明提供診斷貓科動物的甲狀腺功能亢進的存在或風(fēng)險的方法，所述方法包括測量在來自貓科動物的生物樣品中的選自以下的一種或多種生物標(biāo)志物的表達水平：例如IYD、TG、SLC5A5、NIS、TPO、TSHR、DUOX1、DUOX2(ThOX)、TGFB1、CSTD、DCN和SEPP1及其表達產(chǎn)物，其中相對于來自正常貓科動物或貓科動物群體的樣品中的表達對照值或貓科動物的基線值，樣品中一種或多種生物標(biāo)志物表達的升高表明甲狀腺功能亢進的存在或風(fēng)險；治療經(jīng)所述診斷的貓科動物的方法；和用于實施所述方法的組合物、試劑和試劑盒。
【專利說明】用于診斷和監(jiān)測貓科動物的甲狀腺功能亢進的組合物和方
法
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及用于診斷和/或監(jiān)測貓科動物的甲狀腺功能亢進和與甲狀腺功能亢進有關(guān)或由甲狀腺功能亢進引起的貓科動物疾病和病癥的組合物、材料和方法。[0002]發(fā)明背景
甲狀腺功能亢進是貓科動物中最常見的激素異常。它最常見于老年貓科動物，在雌性中略微比雄性中更常見。甲狀腺功能亢進是因甲狀腺激素、特別是甲狀腺素或T-4過量產(chǎn)生引起。T-4的過量產(chǎn)生顯著提高動物的基礎(chǔ)代謝率，導(dǎo)致體重減輕、食欲增加、煩燥、皮毛差、心動過速、飲水和排尿增加、嘔吐、腹瀉、氣促、呼吸困難、發(fā)熱、血壓升高和最終的衰弱、精神萎靡、肌肉震顫、消瘦和死亡。晚期甲狀腺功能亢進常與腎臟問題和心臟問題有關(guān)。有效治療包括使用抑制甲狀腺激素產(chǎn)生的藥物(例如甲巰咪唑或卡比馬唑)、破壞過度活躍的甲狀腺細胞的放射性碘療法和外科甲狀腺切除術(shù)。然而，如果疾病發(fā)現(xiàn)得太晚，損害則可能是不可逆的。因此，早期診斷至關(guān)重要。
[0003]用于診斷甲狀腺功能亢進最常見的試驗是針對T-4的血液檢驗，其中T-4水平顯著升高表明甲狀腺功能亢進；或者T-3抑制試驗，其測量T-4在響應(yīng)給予T-3時的抑制，其中缺乏抑制表明甲狀腺功能亢進狀態(tài)。然而，貓科動物的T-3和T-4水平在每日過程中可波動，使得試驗不可靠，而且還存在可能人為降低T-4水平的各種疾病，因此掩蔽了甲狀腺功能亢進狀態(tài)。使用锝的甲狀腺放射性成像是可行的，并且可用于檢測腫瘤或異常的甲狀腺組織，但它卻是昂貴的。
[0004]因此，需要檢測貓科動物甲狀腺功能亢進的高效且有效的備選方法。
[0005]已開發(fā)出研究差異基因表達的多種方法，例如DNA微陣列、表達標(biāo)簽測序(EST)、基因表達連續(xù)分析(SAGE)、扣除雜交、扣除克隆和mRNA差別顯示(DD)、RNA任意引物PCR(RAP-PCR)、實時PCR (RT-PCR)、代表性差別分析(RDA)、二維凝膠電泳、質(zhì)譜法和針對蛋白質(zhì)的基于蛋白質(zhì)微陣列的抗體結(jié)合。
[0006]由于參與甲狀腺功能亢進的生物學(xué)途徑和內(nèi)在分子相互作用以及胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的復(fù)雜性，十分需要了解遺傳水平上發(fā)生的相互作用。貓科動物中甲狀腺功能亢進早期階段失調(diào)基因的檢測有助于在全基因組基礎(chǔ)上了解貓科動物甲狀腺功能亢進的生物學(xué)，這將有助于設(shè)計用于確定甲狀腺功能亢進的發(fā)展風(fēng)險、確定甲狀腺功能亢進的誘因、診斷甲狀腺功能亢進以及設(shè)計和監(jiān)測甲狀腺功能亢進的治療方案的方法。
[0007]更詳細地了解涉及整個基因表達概況的生物學(xué)途徑可有助于開發(fā)診斷程序、試劑和檢驗試劑盒以及疾病途徑中的有益藥物、營養(yǎng)藥和營養(yǎng)品(膳食)的干預(yù)。這些方法能夠早期檢出并可能預(yù)防或治療潛在的病癥。參與甲狀腺病癥病理學(xué)的失調(diào)基因可用作重要的生物標(biāo)志物，用于診斷和可能預(yù)防或治療所述病癥，并且優(yōu)化合適藥物、營養(yǎng)藥和營養(yǎng)品(膳食)干預(yù)的選擇。
[0008]可利用貓科動物中基因表達的水平和/或所表達的基因產(chǎn)物起作用的水平測定以選擇用于治療或預(yù)防用途的合適藥劑。通過基因表達概況，技術(shù)人員可在選擇作為預(yù)防或治療貓科動物的腎病的藥劑的合適藥物時利用該數(shù)據(jù)。基因表達數(shù)據(jù)和分析還可用于通過利用指示腎功能健康狀態(tài)的生物標(biāo)志物，選擇對促進正常甲狀腺功能表現(xiàn)具有有益作用的營養(yǎng)組合物、膳食補充劑和營養(yǎng)藥。
[0009]迄今在針對與貓科動物疾病診斷有關(guān)的基因表達概況篩選貓科動物基因組方面只進行了極有限的工作。尚未廣泛進行在貓科動物健康群體相對于患有疾病(例如本說明書所述甲狀腺功能亢進)的群體方面的研究。很少可獲得有關(guān)貓科動物基因組表達概況、尤其有關(guān)貓科動物的腎病隨時間推移而發(fā)展的數(shù)據(jù)。
[0010]甲狀腺功能亢進是貓科動物死亡的主要原因。為了有效治療甲狀腺功能亢進，在對心臟和/或腎存在不可逆的損害之前，早期診斷和治療是必要的。因此，需要更好的方法以鑒定患有甲狀腺功能亢進或 甲狀腺功能亢進風(fēng)險升高的動物，使得它們可被適當(dāng)治療。
[0011]發(fā)明概述
本發(fā)明人研究了患甲狀腺功能亢進的貓科動物的甲狀腺組織和全血中的基因表達。在組織研究中，在甲狀腺功能亢進的貓科動物和無甲狀腺功能亢進的貓科動物之間發(fā)現(xiàn)1308個顯著差異表達基因，其FDR (假發(fā)現(xiàn)率)=0.1，表達的倍數(shù)變化>=+/-1.25。在全血研究中，在甲狀腺功能亢進的貓科動物和無甲狀腺功能亢進的貓科動物間發(fā)現(xiàn)了 1094個顯著基因，具有與上文所示的相同的截止值(cutoff)。在組織研究中，發(fā)現(xiàn)已知參與導(dǎo)致甲狀腺激素產(chǎn)生的途徑的所有基因在甲狀腺功能亢進的貓科動物中上調(diào)。這些基因的表達增加顯然促進貓科動物機體中的高T4產(chǎn)生。在全血研究中，發(fā)現(xiàn)60個基因與從實質(zhì)組織材料中發(fā)現(xiàn)的那些基因重疊，其表現(xiàn)在與在組織研究中觀察到的相同的方向上調(diào)節(jié)。如在全血以及在組織中的試驗，通過使用這60個基因，可將甲狀腺功能亢進的貓科動物與正常貓科動物區(qū)別開來。列于下表A和表B的這60個基因，可允許檢測貓科動物甲狀腺功能亢進。
[0012]因此，本發(fā)明提供用于診斷和/或監(jiān)測貓科動物的甲狀腺功能亢進和與甲狀腺功能亢進有關(guān)或由甲狀腺功能亢進引起的貓科動物疾病和病癥的組合物、材料和方法，包括用于以下的組合物和方法:測定貓科動物的甲狀腺功能亢進的發(fā)展風(fēng)險、鑒定貓科動物的甲狀腺功能亢進的誘因、診斷貓科動物的甲狀腺功能亢進、設(shè)計和監(jiān)測貓科動物的甲狀腺功能亢進的治療方案和監(jiān)測貓科動物的甲狀腺功能亢進的狀態(tài)，其中通過利用從獲自所述貓科動物的生物試驗樣品中分離和測量的至少一種相關(guān)生物標(biāo)志物，可檢出甲狀腺功能亢進，其中所述生物標(biāo)志物的表達與所述疾病正相關(guān)或負相關(guān)。用于本發(fā)明的組合物和方法的實踐的相關(guān)生物標(biāo)志物包括存在于所述貓科動物的所述生物試驗樣品中的多核苷酸或蛋白質(zhì)。用于本發(fā)明方法的實踐的生物試驗樣品可包括例如來自所述貓科動物的組織樣品。還可根據(jù)所進行的分泌，選擇生物標(biāo)志物，使得它們可在血清或血漿中或在尿液中檢出。因此生物試驗樣品還可以是獲自所述貓科動物的生物流體的樣品，例如血液或尿液。
[0013]發(fā)現(xiàn)在甲狀腺激素過量產(chǎn)生中特別上調(diào)的基因包括:
IYD (增加4.55倍):該基因編碼催化一碘酪氨酸和二碘酪氨酸(其是甲狀腺激素產(chǎn)生的鹵化副產(chǎn)物)的氧化NADPH依賴性脫碘的酶。該蛋白質(zhì)的N端起膜錨著點的作用。該基因的突變由于激素生成異常4型(其亦稱為脫碘酶缺乏或碘酪氨酸脫鹵素酶缺乏或甲狀腺激素生成4型)所致，引起先天性甲狀腺功能減退。
[0014]TG (增加2.02倍):甲狀腺球蛋白(Tg)是一種主要由甲狀腺產(chǎn)生的糖蛋白同二聚體。它起甲狀腺素和三碘甲腺原氨酸(triiodothyronine)的合成底物以及無活性形式的甲狀腺激素和碘的儲存的作用。甲狀腺球蛋白自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌至其碘化部位，隨后在濾泡腔中進行甲狀腺素生物合成。該基因的突變引起甲狀腺激素生成異常(表現(xiàn)為甲狀腺腫)，并且與中度至重度先天性甲狀腺功能減退有關(guān)。
[0015]SLC5A5, NIS (增加4.6倍):該基因編碼鈉葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白家族的成員。編碼的蛋白質(zhì)負責(zé)組織(例如甲狀腺和分泌乳汁的乳房組織)中碘的攝取。被甲狀腺攝入的碘被摻入代謝調(diào)節(jié)劑三碘甲腺原氨酸(T3)和四碘甲腺原氨酸(T4)中。該基因的突變與甲狀腺激素生成異常I有關(guān)。
[0016]TPO (增加4.06倍):該基因編碼一種膜結(jié)合糖蛋白。編碼的蛋白質(zhì)起酶的作用，并且在甲狀腺功能中起重要作用。該蛋白質(zhì)在甲狀腺球蛋白的酪氨酸殘基的碘化和碘化酪氨酸對之間形成苯氧基酯中起作用以產(chǎn)生甲狀腺激素、甲狀腺素和三碘甲腺原氨酸。該基因的突變與甲狀腺激素生成的幾種病癥有關(guān)，包括先天性甲狀腺功能減退、先天性甲狀腺腫和甲狀腺激素有機化缺陷IIA。
[0017]TSHR (增加2.2倍):由該基因編碼的蛋白質(zhì)是一種膜蛋白，并且是甲狀腺細胞代謝的主要控制器。編碼的蛋白質(zhì)是促甲狀腺素(thyiOthiOpin)和甲狀腺刺激素(thyrostimulin)的受體，并且其活性受腺苷酸環(huán)化酶介導(dǎo)。該基因的缺陷是幾種類型的甲狀腺功能亢進的原因。
·[0018]DU0X2, ThOX (增加1.55倍):由該基因編碼的蛋白質(zhì)是一種糖蛋白和NADPH氧化酶家族的成員。甲狀腺激素的合成被位于甲狀腺濾泡細胞頂端膜上的蛋白質(zhì)復(fù)合物催化。該復(fù)合物含有碘化物轉(zhuǎn)運蛋白、甲狀腺過氧化物酶和包括該編碼的蛋白質(zhì)和DUOXl的過氧化物產(chǎn)生系統(tǒng)。已知該蛋白質(zhì)為雙重氧化酶，因為它具有過氧化物酶同源結(jié)構(gòu)域和gp9 Iphox結(jié)構(gòu)域兩者。
[0019]在甲狀腺功能亢進的貓科動物的血液和甲狀腺組織兩者中上調(diào)的其它基因包括下列基因:
表A
【權(quán)利要求】
1.一種診斷貓科動物中甲狀腺功能亢進的存在或高風(fēng)險的方法，所述方法包括測量在貓科動物的生物樣品中選自以下的一種或多種生物標(biāo)志物的表達水平:表A和表B所列的基因；IYD、TG、SLC5A5、NIS、TPO、TSHR、DUOXl 和 DU0X2 (ThOX)中的任一種；及其表達產(chǎn)物，其中相對于來自正常貓科動物或貓科動物群體的樣品中的表達對照值和/或相對于來自貓科動物之前的各個基線值，樣品中一種或多種生物標(biāo)志物表達的改變表明甲狀腺功能亢進的存在或高風(fēng)險。
2.權(quán)利要求1的方法 a.其中所述一種或多種生物標(biāo)志物包括IYD、TG、SLC5A5、NIS、TP0、TSHR、DU0X1、DU0X2(ThOX)、TGFBl和/或CSTD或其表達產(chǎn)物，且其中相對于來自正常貓科動物或貓科動物群體的樣品中的表達對照值和/或相對于來自貓科動物之前的各個基線值，樣品中IYD、TG、SLC5A5、NIS、TPO、TSHR、DUOXl、DU0X2 (ThOX)、TGFBl 和 / 或 CSTD 或其表達產(chǎn)物的表達增加表明甲狀腺功能亢進的存在或高風(fēng)險，和/或 b.其中所述一種或多種生物標(biāo)志物包括DCN和/或SEPPl，或其表達產(chǎn)物；且其中相對于來自正常貓科動物或貓科動物群體的樣品中的表達對照值和/或相對于來自貓科動物之前的各個基線值，樣品中DCN和/或SEPPl或其表達產(chǎn)物的表達降低表明甲狀腺功能亢進的存在或高風(fēng)險。
3.權(quán)利要求1的方法，其中通過使用(i)包含與對應(yīng)于待測量的一種或多種生物標(biāo)志物的mRNA或cDNA互補的一種或多種寡核苷酸的DNA微陣列，或(ii)用對應(yīng)于待測量的一種或多種生物標(biāo)志物的mRNA或cDNA的寡核苷酸引物的定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，測量一種或多種生物標(biāo)志物的基因表達,來測定一種或多種生物標(biāo)志物的表達水平。
4.權(quán)利要求3的方法，其中測量一種或多種生物標(biāo)志物的基因表達的步驟包括:(i)從組織樣品中分離RNA，(ii)反轉(zhuǎn)錄RNA，獲得相應(yīng)的cDNA，(iii)分離由此獲得的cDNA并使之片段化，(iv)使cDNA片段與DNA微陣列接觸，所述微陣列包含與對應(yīng)于待測量的一種或多種生物標(biāo)志物的cDNA互補的一種或多種寡核苷酸，和(V)檢測cDNA片段和DNA微陣列中的一種或多種寡核苷酸之間的雜交。
5.權(quán)利要求4的方法，其中cDNA片段和DNA微陣列中的一種或多種寡核苷酸之間的雜交在嚴(yán)格條件下進行。
6.權(quán)利要求1的方法，其中通過所表達蛋白質(zhì)的抗體，檢測生物標(biāo)志物的表達水平。
7.權(quán)利要求1的方法，其中通過使用定量質(zhì)譜法測量樣品中蛋白質(zhì)的量，來檢測生物標(biāo)志物的表達水平。
8.權(quán)利要求1的方法，其中相對于正?；蚧€組織中表達的對照值，所述生物樣品中一種或多種生物標(biāo)志物的表達水平為至少30%。
9.權(quán)利要求1的方法，其中將所述生物樣品中一種或多種生物標(biāo)志物的表達水平相對于已知具有相對穩(wěn)定表達的一種或多種基因的表達歸一化。
10.權(quán)利要求1的方法，其中測量來自相同樣品的至少5種生物標(biāo)志物的表達水平。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物樣品是血液或甲狀腺組織的樣品。
12.—種治療、改善或延遲甲狀腺功能亢進進展的方法，所述方法包括通過權(quán)利要求1的方法診斷甲狀腺病癥的存在或高風(fēng)險并通過飲食和/或藥物處理所述病癥。
13.權(quán)利要求13的方法，其中所述飲食是其中碘的水平小于0.35 mg/kg、硒的水平小于0.1 mg/kg和/或花生四烯酸的水平小于或等于0.02%的飲食。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述對有其需要的貓科動物的治療包括給予有效量的抑制T-4產(chǎn)生的藥物、給予放射性碘療法和/或施行外科甲狀腺切除術(shù)。
15.一種用于權(quán)利要求1的方法以診斷貓科動物中甲狀腺功能亢進的存在或風(fēng)險的試劑盒，其包含用于測量來自貓科動物的生物樣品中選自IYD、TG、SLC5A5、NIS、TPO、TSHR、DUOXl、DUOX2 (ThOX)、TGFB1、CSTD、DCN和SEPPl及其表達產(chǎn)物的一種或多種生物標(biāo)志物的基因表達的工具，和 使用所述工具測量來自貓科動物的生物樣品中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達并診斷貓科動物中甲狀腺功能亢進的存在或風(fēng)險的使用說明。
16.權(quán)利要求16的試劑盒，其中所述用于測量一種或多種生物標(biāo)志物的工具包括能夠檢測一種或多種生物標(biāo)志物的基因表達的一種或多種核酸探針。
17.權(quán)利要求17的試劑盒，其包含DNA微陣列，所述DNA微陣列包含能夠檢測一種或多種生物標(biāo)志物的基因表達的一種或多種核酸探針。
18.權(quán)利要求16的試劑盒，其中所述用于測量一種或多種生物標(biāo)志物的工具包括能夠檢測一種或多種生物標(biāo)志物的一種或多種抗體或適配體。
19.權(quán)利要求19的試劑盒，其為ELISA形式，所述試劑盒包含能夠檢測一種或多種生物標(biāo)志物的一種或多種抗體、對應(yīng)于所述生物標(biāo)志物用作標(biāo)準(zhǔn)物的分離蛋白和緩沖液。
20.識別貓科動物蛋白質(zhì)的抗體，所述蛋白質(zhì)選自IYD、TG、SLC5A5、NIS、TPO、TSHR、DUOXl、DU0X2 (ThOX)、TGFBU CSTD, DCN 和 SEPPl 的表達產(chǎn)物。
21.識別 貓科動物蛋白質(zhì)的適配體，所述蛋白質(zhì)選自IYD、TG、SLC5A5、NIS、TPO、TSHR、DUOXl、DU0X2 (ThOX)、TGFBU CSTD, DCN 和 SEPPl 的表達產(chǎn)物。
22.分離和純化的或重組的貓科動物蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)選自IYD、TG、SLC5A5、NIS、TPO、TSHR、DUOXl、DU0X2 (ThOX)、TGFBU CSTD, DCN 和 SEPPl 的表達產(chǎn)物。
23.能夠與貓科動物基因雜交的寡核苷酸探針，所述基因選自IYD、TG、SLC5A5、NIS、TPO、TSHR、DUOXl、DU0X2 (ThOX)、TGFBl、CSTD, DCN 和 SEPPl。
【文檔編號】C12Q1/68GK103597097SQ201280029497
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年6月14日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月15日
【發(fā)明者】S.阿爾-穆拉尼, 高向明 申請人:希爾氏寵物營養(yǎng)品公司