用于檢測(cè)樣品中存在產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及用于檢測(cè)樣品中存在產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌的方法，所述方法包括步驟：a)在測(cè)試樣品上進(jìn)行細(xì)胞裂解以獲得酶懸液；b)使一部分步驟a)中獲得的酶懸液與試劑盒反應(yīng)，所述試劑盒包含-碳青霉烯酶底物，選自碳青霉烯和頭霉素，pH顏色指示劑，當(dāng)反應(yīng)混合物的pH為6.4-8.4時(shí)，所述pH顏色指示劑將改變顏色，其中步驟b)后的顏色變化表示所述測(cè)試樣品中存在產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌。本發(fā)明還涉及試劑盒、涉及微量滴定板以及涉及它們?cè)跈z測(cè)樣品中存在碳青霉烯酶產(chǎn)生者中的用途。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于檢測(cè)樣品中存在產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌的方法
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及用于檢測(cè)樣品中存在產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌的方法。
[0002]發(fā)明背景
[0003]在全世界越來(lái)越多地鑒定產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌分離物(即碳青霉烯酶產(chǎn)生者)(1-3)。它們的早期檢測(cè)成為預(yù)防其傳播并且保存成為用于治療嚴(yán)重感染的最后依靠的抗生素的碳青霉烯的功效的臨床微生物學(xué)范圍的主要問(wèn)題(4)。事實(shí)上，碳青霉烯酶通常與許多產(chǎn)生多藥耐藥性和泛耐藥性的其他非3內(nèi)酰胺耐藥決定因素相關(guān)。此外，由于現(xiàn)有人群的交換和移動(dòng)，碳青霉烯酶產(chǎn)生者的早期識(shí)別成為強(qiáng)制性的，無(wú)論多藥耐藥的醫(yī)院感染采取哪一種抗生素政策或速度。
[0004]大多數(shù)已獲得的碳青霉烯酶屬于P內(nèi)酰胺酶的四種已知種類(lèi)的三種，即安布勒A類(lèi)、安布勒B類(lèi)(金屬P內(nèi)酰胺酶(MBL))和安布勒D類(lèi)(苯唑西林酶(OXA))。這三類(lèi)碳青霉烯酶為碳青霉烯賦予顯著的臨床耐藥性或?yàn)樘记嗝瓜┵x予降低的易感性(1-4)。因此，來(lái)自這三類(lèi)碳青霉烯酶的產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌分離物已經(jīng)同時(shí)涉及醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染。
[0005]三類(lèi)不同的碳青霉烯酶的傳播在全世界顯著不同。例如，KPC產(chǎn)生者(安布勒A類(lèi))大多數(shù)在美國(guó)和南歐鑒定，而頂P、VM、NDM-1(安布勒B類(lèi))在全世界廣泛鑒定，其中NDM-1的主庫(kù)在印度次大陸。至于0XA-48-樣酶(安布勒D類(lèi))，其至少在地中海海岸的南部和東部且最近在歐洲鑒定(5)。
[0006]目前，存在兩種檢測(cè)碳青霉烯酶產(chǎn)生者的方法。第一，可以使用體內(nèi)產(chǎn)生碳青霉烯酶的基于表型的技術(shù)，例如“Etest?”和“Hodge測(cè)試”⑷?！癊test?”是一種測(cè)定許多微生物的抗菌易感性的定量技術(shù)。該系統(tǒng)包含用于測(cè)定抗微生物的不同的抗菌劑的最低抑菌濃度(MIC，U g / mL)的預(yù)定義的抗生素梯度，所述最低抑菌濃度在瓊脂培養(yǎng)基上采用過(guò)夜培養(yǎng)來(lái)測(cè)試。至于“Hodge測(cè)試”,當(dāng)分離物產(chǎn)生酶并允許碳青霉烯易感菌株向著碳青霉烯圓盤(pán)生長(zhǎng)時(shí)，檢測(cè)到碳青霉烯酶產(chǎn)生。“Hodge測(cè)試”的結(jié)果是特有的苜蓿葉樣缺口。然而，令人遺憾地，這些基于表型的技術(shù)既不靈敏也不足以特異性。在很多情況下，已經(jīng)報(bào)告假陽(yáng)性。或者，可以使用用于碳青霉烯酶的分子檢測(cè)技術(shù)。然而，該技術(shù)仍然相當(dāng)昂貴，且需要極度的專(zhuān)業(yè)知識(shí)?；诒硇偷募夹g(shù)和分子檢測(cè)技術(shù)的最終缺點(diǎn)都是它們是耗時(shí)的(12到24h)，因此不滿足實(shí)施避免醫(yī)院疾病爆發(fā)的發(fā)展的預(yù)防分離測(cè)量所需的臨床要求(4)。
[0007]之前的工作采用顯色頭孢菌素例如頭孢硝噻吩和CENTA進(jìn)行P內(nèi)酰胺酶鑒定(6，7)。然而，這些顯色底物分子不能特異性檢測(cè)碳青霉烯酶；它們檢測(cè)任何3內(nèi)酰胺酶，不管其水解特征。至于Cica-P測(cè)試，該測(cè)試采用顯色頭孢菌素HMRZ-86以及特異性抑制劑。盡管該測(cè)試可以檢測(cè)MBL產(chǎn)生者，但是它還需要培養(yǎng)步驟。事實(shí)上，病原體首先必須在適當(dāng)?shù)姆沁x擇性培養(yǎng)基上分離，然后進(jìn)行測(cè)試。然后，僅使用分離的菌落以避免污染和確保生物體是純的。已經(jīng)使用其他測(cè)試， 例如采用芐青霉素作為底物的碘量滴定的測(cè)試和酸量滴定的測(cè)試，但是對(duì)于檢測(cè)碳青霉烯酶也是非特異性的出)。最后，采用包含淀粉瓊脂的亞胺培南的技術(shù)也用于檢測(cè)MBL活性(8)。然而，這最后一種技術(shù)需要蛋白質(zhì)萃取、部分P內(nèi)酰胺酶純化、電泳遷移以及0內(nèi)酰胺酶領(lǐng)域的廣泛知識(shí)。因此，它是耗時(shí)的且通常僅保留用于研究目的。
[0008]為促進(jìn)臨床微生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)碳青霉烯酶產(chǎn)生者的檢測(cè)， 申請(qǐng)人:開(kāi)發(fā)了一種基于簡(jiǎn)單的酸比色技術(shù)的新方法。該方法基于以下概念:通過(guò)水解碳青霉烯酶底物的3內(nèi)酰胺環(huán)，碳青霉烯酶產(chǎn)生羧基，其反過(guò)來(lái)酸化介質(zhì)。然后，由該水解產(chǎn)生的酸性通過(guò)PH顏色指示劑的顏色變化來(lái)鑒定(9)。
[0009]該方法幫助區(qū)分碳青霉烯酶產(chǎn)生者和由非碳青霉烯酶介導(dǎo)的機(jī)制例如聯(lián)合耐藥性機(jī)制(例如外膜滲透性缺陷、頭孢菌素酶的過(guò)度產(chǎn)生、克拉維酸抑制的ESBL...)產(chǎn)生的碳青霉烯耐藥的那些或區(qū)分碳青霉烯酶產(chǎn)生者和表達(dá)廣譜3內(nèi)酰胺酶而不具有碳青霉烯酶活性的菌株(ESBL、質(zhì)粒和染色體編碼的頭孢菌素酶)(10)。
[0010]可解釋的結(jié)果在非常短的時(shí)間內(nèi)獲得，當(dāng)設(shè)計(jì)碳青霉烯酶產(chǎn)生者的容量測(cè)量時(shí)，這是關(guān)鍵的。它消除了采用“Etest?”或“Hodge測(cè)試”技術(shù)的需要，如之前所提及，所述技術(shù)既不特異性也不靈敏，且其在獲得可解釋的結(jié)果之前需要另外的18個(gè)小時(shí)。
[0011]該方法提供了一種檢測(cè)任何類(lèi)型的碳青霉烯酶產(chǎn)生者的快速、可靠和可負(fù)擔(dān)的方法。此外，它是特異性和靈敏的。它也可以經(jīng)歷產(chǎn)業(yè)化過(guò)程，使得其可在全世界任何臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，而實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員無(wú)需大量額外的工作量。
[0012]此外，在流行病學(xué)`領(lǐng)域，當(dāng)需要快速選擇應(yīng)該通過(guò)PCR測(cè)試并測(cè)序從而鑒定碳青霉烯酶基因的菌株時(shí)，使用該方法可能是進(jìn)一步有用的。
[0013]發(fā)明概述
[0014]本發(fā)明涉及用于檢測(cè)樣品中存在產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌的方法，所述方法包括步驟:a)在測(cè)試樣品上進(jìn)行細(xì)胞裂解以獲得酶懸液；b)使一部分步驟a)中獲得的酶懸液與試劑盒反應(yīng)，所述試劑盒包含
[0015]-碳青霉烯酶底物,選自碳青霉烯和頭霉素，
[0016]-pH顏色指示劑，當(dāng)反應(yīng)混合物的pH為6.4-8.4時(shí),所述pH顏色指示劑將改變顏色，
[0017]其中步驟b)后的顏色變化表示所述測(cè)試樣品中存在產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌。
[0018]本發(fā)明也涉及試劑盒，包含選自碳青霉烯和頭霉素的碳青霉烯酶底物和pH顏色指示劑，以及所述試劑盒在檢測(cè)測(cè)試樣品中存在碳青霉烯酶產(chǎn)生者的用途。
[0019]本發(fā)明也涉及微量滴定板，其包含孔或一系列孔，所述孔包含選自碳青霉烯和頭霉素的碳青霉烯酶底物，和所述微量滴定板在檢測(cè)測(cè)試樣品中存在碳青霉烯酶產(chǎn)生者的用途以及所述微量滴定板在最終測(cè)定存在于測(cè)試樣品中的碳青霉烯酶的具體種類(lèi)的用途。
[0020]發(fā)明詳述
[0021]定義:
[0022]如本文所使用，“測(cè)試樣品”是指可包含產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌的待測(cè)試的任何液體或固體材料。通常，細(xì)菌菌落可與這種材料分離。優(yōu)選的“測(cè)試樣品”是生物樣品。
[0023]如本文所使用，“生物樣品”是指從受試者獲得的任何生物樣品。這種“生物樣品”的實(shí)例包括體液、組織、細(xì)胞樣品等。優(yōu)選的“生物樣品”是全血、血清、血漿或尿。
[0024]如本文所使用，“受試者”表示哺乳動(dòng)物，例如嚙齒動(dòng)物、貓科動(dòng)物、犬科動(dòng)物和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物。優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的“受試者”是人。[0025]如本文所使用，“pH顏色指示劑”是鹵色化化合物，其以少量添加至溶液中，使得溶液/介質(zhì)的PH可以肉眼測(cè)定。指示劑引起溶液/介質(zhì)的顏色基于pH而改變。
[0026]如本文所使用，“酶懸液”是指根據(jù)本發(fā)明方法的細(xì)胞裂解步驟(步驟a)促進(jìn)存在于所述測(cè)試樣品的細(xì)胞內(nèi)的酶解放，從而獲得“酶懸液”。
[0027]如本文所使用，“部分”是指采用根據(jù)本發(fā)明方法的步驟a)中獲得的酶懸液的全部或部分以與步驟b)的試劑盒反應(yīng)。通常，根據(jù)本發(fā)明的“部分”是一部分酶懸液。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的“部分”是10 uL到50 uL。
[0028]如本文所使用，“試劑盒”是指包含多種不同的組分作為組合產(chǎn)品用于在本發(fā)明方法中單獨(dú)、同時(shí)或連續(xù)使用的產(chǎn)品。優(yōu)選地，所述組分是選自碳青霉烯和頭霉素的碳青霉烯酶底物、PH顏色指示劑、任選的碳青霉烯酶激活劑和任選的碳青霉烯酶抑制劑。
[0029]檢測(cè)方法:
[0030]如之前所提及，產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌的早期檢測(cè)成為預(yù)防其傳播并且保存成為用于治療嚴(yán)重感染的最后依靠的抗生素的碳青霉烯的功效的臨床微生物學(xué)范圍的主要問(wèn)題。
[0031]作為該問(wèn)題的一種方法， 申請(qǐng)人:開(kāi)發(fā)了一種檢測(cè)任何類(lèi)型的碳青霉烯酶產(chǎn)生者的快速、可靠和可負(fù)擔(dān)的方法。
[0032]因此，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)樣品中存在產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌的方法，所述方法包括步驟:a)在測(cè)試樣品上進(jìn)行細(xì)胞裂解以獲得酶懸液；b)使一部分步驟a)中獲得的酶懸液與試劑盒反應(yīng)，所述試劑盒包含
[0033]-碳青霉烯酶底物，選自碳青霉烯和頭霉素，
[0034]-pH顏色指示劑，當(dāng)反應(yīng)混合物的pH為6.4-8.4時(shí),所述pH顏色指示劑將改變顏色，
[0035]其中步驟b)后的顏色變化表示所述測(cè)試樣品中存在產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌。
[0036]本發(fā)明方法基于以下概念:水解碳青霉烯酶底物的3內(nèi)酰胺環(huán)，碳青霉烯酶產(chǎn)生羧基，其反過(guò)來(lái)酸化介質(zhì)，通常為無(wú)緩沖介質(zhì)。然后，由該水解產(chǎn)生的酸性通過(guò)PH顏色指示劑的顏色變化來(lái)鑒定。顏色變化表明存在碳青霉烯酶。
[0037]通常，培養(yǎng)基用測(cè)試菌株(由測(cè)試樣品獲得)接種，并在旋轉(zhuǎn)振蕩器上培養(yǎng)。然后，將培養(yǎng)物離心并將沉淀重懸于裂解緩沖液中，渦流震蕩并進(jìn)一步培養(yǎng)(類(lèi)似地，可采用在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌菌落應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的直接裂解方案)。充分培養(yǎng)之后，將懸液(即酶懸液)離心，去除上清液并置于冰上。將一小部分該上清液與包含碳青霉烯酶底物和PH顏色指示劑的試劑盒混合。將由試劑盒和測(cè)試的酶懸液組成的混合物進(jìn)一步在某溫度下培養(yǎng)足量時(shí)間，使得觀察到顏色變化。顏色變化表明存在碳青霉烯酶。顏色變化可早在開(kāi)始培養(yǎng)后的5分鐘獲得。在大多數(shù)情況下，30分鐘培養(yǎng)時(shí)間足以獲得碳青霉烯酶產(chǎn)生者的明顯的顏色變化。
[0038]通常，當(dāng)需要快速選擇應(yīng)該通過(guò)PCR測(cè)試并測(cè)序從而鑒定碳青霉烯酶基因的菌株時(shí)，使用該方法可能是進(jìn)一步有用的。因此，一旦通過(guò)本方法確定碳青霉烯酶產(chǎn)生者的存在，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他鑒定技術(shù)可用于進(jìn)一步表征碳青霉烯酶和/或碳青霉烯酶產(chǎn)生者。
[0039]通常，一旦通過(guò)本發(fā)明方法檢測(cè)到碳青霉烯酶活性，該碳青霉烯酶活性可進(jìn)一步用于發(fā)現(xiàn)或評(píng)價(jià)耐碳青霉烯酶活性的新的碳青霉烯酶抑制劑或新分子。在后一種情況下，待評(píng)價(jià)的新分子可以替換試劑盒中所包含的碳青霉烯酶底物分子。
[0040]通常，根據(jù)本發(fā)明的方法可用于檢測(cè)任何選自革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌。優(yōu)選地，產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌選自臨床重要的細(xì)菌，甚至更優(yōu)選選自臨床重要的革蘭氏陰性菌。
[0041]如本文所使用，“臨床重要”的細(xì)菌是指參與醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染的細(xì)菌。通常，產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌選自不動(dòng)細(xì)菌屬(Acinetobacter)、產(chǎn)氣單孢菌屬(Aeromonas)、桿菌屬(Bacillus)、朽1檬細(xì)菌屬(Bacteriodes)、腸桿菌屬(Citrobacter)、腸桿菌屬(Enterobacter)、埃希氏菌屬(Escherichia)、克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella)、摩根氏菌屬(Morganella)、Pandoreae、變形桿菌屬(Proteus)、普羅菲登菌屬(Providencia) >單胞細(xì)菌屬(Pseudomonas)、雷爾氏菌屬(Ralstonia)、蘭奧爾菌屬(Raoultella)、沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)、沙雷菌屬(Serratia)、海洋產(chǎn)電菌屬(Shewanella)、志賀氏桿菌屬(Shigella)和 Strenotrophomonas。
[0042]通常,產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌選自鮑氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas junii)、臘狀芽胞桿菌(Bacillus cereus)、脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)、無(wú)丙二酸朽1 樣酸桿菌(Citrobacter amalonaticus)、弗氏朽1 樣酸桿菌(Citrobacter freundii)、楊氏朽1 樣酸桿菌(Citrobacter youngae)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、阿氏腸桿菌(Enterobacter asburiae)、陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)、大腸桿菌(Escherichia coli)、奧克西托克雷白氏桿菌(Klebsiella oxytoca)、克雷白氏桿菌(Klebsiella pneumoniae)、摩根摩根菌(Morganella morganii)、潘多拉菌(Pandoraea pnomenusa)、奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)、雷特格氏變形桿菌(Proteus rettgeri)、普通變形桿菌(Proteusvulgaris)、斯氏普羅威登斯菌(Providencia stuartii)、銅綠色極毛桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、沙門(mén)氏菌(Salmonella enterica)、靈桿菌(Serratia marcescens)、弗累克斯i內(nèi)氏桿菌(Shigella flex`neri)、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、皮氏羅爾斯頓菌(Ralstonia picketti)和希瓦氏菌藻(Shewanella algae)。
[0043]通常，安布勒A類(lèi)產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌選自以下種:弗氏檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、阿氏腸桿菌、陰溝腸桿菌、大腸桿菌、奧克西托克雷白氏桿菌、克雷白氏桿菌、銅綠色極毛桿菌、沙門(mén)氏菌和靈桿菌，安布勒B類(lèi)產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌選自以下種:鮑氏不動(dòng)桿菌、嗜水氣單胞菌、蠟狀芽胞桿菌、脆弱擬桿菌、無(wú)丙二酸檸檬酸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、楊氏檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、陰溝腸桿菌、大腸桿菌、奧克西托克雷白氏桿菌、克雷白氏桿菌、摩根摩根菌、雷特格氏變形桿菌、普通變形桿菌、斯氏普羅威登斯菌、銅綠色極毛桿菌、靈桿菌、弗累克斯訥氏桿菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，和安布勒D類(lèi)產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌選自以下種:鮑氏不動(dòng)桿菌、大腸桿菌、克雷白氏桿菌、潘多拉菌、銅綠色極毛桿菌、皮氏羅爾斯頓菌和希瓦氏菌藻。
[0044]根據(jù)本發(fā)明，產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌優(yōu)選選自以下屬:不動(dòng)細(xì)菌屬、腸桿菌屬、埃希氏菌屬、克雷伯氏桿菌屬、假單胞細(xì)菌屬和海洋產(chǎn)電菌屬，并且甚至更優(yōu)選地選自鮑氏不動(dòng)桿菌、大腸桿菌、克雷白氏桿菌和銅綠色極毛桿菌。
[0045]如本文所使用，根據(jù)本發(fā)明，碳青霉烯酶底物是選自碳青霉烯和頭霉素的一種底物。
[0046]通常，碳青霉烯選自比阿培南、厄他培南、多利培南、亞胺培南、美羅培南、泰比培南和帕尼培南。
[0047]通常，頭霉素選自拉氧頭孢和頭孢甲氧霉素。在檢測(cè)安布勒B類(lèi)的碳青霉烯酶中頭霉素是特別值得注意的。
[0048]優(yōu)選地，碳青霉烯酶底物是亞胺培南。
[0049]通常，用于試劑盒的碳青霉烯酶底物的濃度為0.1mg / ml-10mg / ml,更優(yōu)選Img / ml-5mg / ml,甚至更優(yōu)選 2mg / ml_3mg / ml。
[0050]根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)反應(yīng)混合物的pH為6.4-8.4，優(yōu)選6.6-7.5時(shí)，pH顏色指示劑將改
變顏色。
[0051 ] 通常，用于試劑盒的pH顏色指示劑的濃度為0.0I % -1 %，更優(yōu)選0.03 % -0.08 %，甚至更優(yōu)選0.05 % -0.06 %。
[0052]通常，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇用于該水解反應(yīng)的合適的pH顏色指示劑?？捎糜诒景l(fā)明的pH指不劑的列表可以在CRC Handbook of Chemistry and Physics:AReady-reference Book of Chemical and Physical Data, 91stRevised ed.(Junelst2010),CRC Press Inc中發(fā)現(xiàn)。例如，用于本發(fā)明的pH指示劑可以選自:6，8-二硝基-2，4-(IH)喹唑二酮(pH:6.4-8.0)、亮黃(pH:6.6-7.8)、酚紅(pH:6.6-8.0)和中性紅(pH:6.8-8.0)。
[0053]優(yōu)選地，用于本發(fā)明的pH顏色指示劑是酚紅，且當(dāng)使用它時(shí)，從紅到黃的顏色變化指不測(cè)試樣品中存在廣生碳青霉稀酶的細(xì)囷。
[0054]通常，步驟b)的反應(yīng)在足以觀察到顏色變化的時(shí)期內(nèi)進(jìn)行。優(yōu)選地，在5分鐘-120分鐘，優(yōu)選在10-60分鐘，更優(yōu)選在20-40分鐘的時(shí)期內(nèi)肉眼觀察到顏色變化?；蛘?，顏色變化的鑒定例如通過(guò)使用光度計(jì)來(lái)自動(dòng)化。
[0055]通常，步驟b)的反應(yīng)在15°C -40°C、優(yōu)選20°C _37°C、更優(yōu)選35°C -37°C的溫度下進(jìn)行。
[0056]基于分子研究，碳青霉烯酶可以進(jìn)一步分為兩種類(lèi)型:在活性部位具有絲氨酸部分的絲氨酸酶(安布勒B、C和D類(lèi))和需要二階陽(yáng)離子通常是鋅作為酶活性的金屬共因子，從而促進(jìn)二環(huán)P內(nèi)酰胺環(huán)的水解的MBL (安布勒B類(lèi))(12)。
[0057]因此，根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式，為了增加方法的靈敏性，所述試劑盒進(jìn)一步包含碳青霉烯酶激活劑，其選自二階陽(yáng)離子或其鹽、及其混合物。
[0058]通常，就安布勒B類(lèi)碳青霉烯酶而言，所述激活劑是選自下組的二階陽(yáng)離子或其鹽:錳、鈷、鎳、鎘、汞、鋅及其混合物(see Biochem J.1974 ；143(1):129_35and theJournal of Biological Chemistry vol.285,N0.7,4570-4577)。優(yōu)選地,碳青霉烯酶激活劑是鋅。
[0059]通常，存在于試劑盒中的碳青霉烯酶激活劑的濃度為0.01mM-1mM,更優(yōu)選0.05mM-0.5mM,甚至更優(yōu)選 0.08mM-0.12mM。
[0060]通常，培養(yǎng)基用測(cè)試菌株(由測(cè)試樣品獲得)接種，并在旋轉(zhuǎn)振蕩器上培養(yǎng)。然后，將培養(yǎng)物離心并將沉淀重懸于裂解緩沖液中，渦流震蕩并進(jìn)一步培養(yǎng)。充分培養(yǎng)之后，將懸液(即酶懸液)離心，去除上清液并置于冰上。將一小部分該上清液與包含碳青霉烯酶底物、PH顏色指示劑和碳青霉烯酶激活劑的試劑盒混合。將由試劑盒和測(cè)試的酶懸液組成的混合物進(jìn)一步在某溫度下培養(yǎng)足量時(shí)間，使得觀察到顏色變化。顏色變化表明存在碳青霉烯酶。顏色變化可早在開(kāi)始培養(yǎng)后的5分鐘獲得。在大多數(shù)情況下，30分鐘培養(yǎng)時(shí)間足以獲得碳青霉烯酶產(chǎn)生者的明顯的顏色變化。
[0061]在優(yōu)選實(shí)施方式中，提供了用于檢測(cè)樣品中存在產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌的方法，所述方法包括步驟:a)在生物樣品上進(jìn)行細(xì)胞裂解以獲得酶懸液；b)使一部分步驟a)中獲得的酶懸液與試劑盒反應(yīng)，所述試劑盒包含 [0062]-亞胺培南作為碳青霉烯酶底物，
[0063]-酚紅作為pH顏色指示劑，和
[0064]-鋅或其鹽作為碳青霉烯酶激活劑，
[0065]其中步驟b)后顏色從紅變成黃表示所述生物樣品中存在產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌。
[0066]根據(jù)一種實(shí)施方式，為了特異性鑒別存在于測(cè)試樣品中的碳青霉烯酶的種類(lèi)，不管安布勒A、B或D類(lèi)碳青霉烯酶，使用碳青霉烯酶抑制劑。
[0067]通常，碳青霉烯酶抑制劑可以是對(duì)于一種碳青霉烯酶而言是單特異性的。例如，對(duì)于安布勒A類(lèi)碳青霉烯酶，碳青霉烯酶抑制劑選自克拉維酸、他唑巴坦、舒巴坦、和氨基苯基硼酸，和對(duì)于安布勒B類(lèi)碳青霉烯酶,選自1-10菲咯啉、吡啶二羧酸、硫醇化合物(例如巰基丙酸和巰基乙酸)和EDTA(12-17)。
[0068]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，安布勒A類(lèi)碳青霉烯酶的單特異性碳青霉烯酶抑制劑是他唑巴坦。
[0069]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，安布勒B類(lèi)碳青霉烯酶的單特異性碳青霉烯酶抑制劑是EDTA,更優(yōu)選與ZnSO4貧化有關(guān)的EDTA。事實(shí)上，EDTA活性通過(guò)二階陽(yáng)離子的貧化而增強(qiáng)。
[0070]通常，對(duì)于一種以上的碳青霉烯酶，碳青霉烯酶抑制劑可以是雙特異性的，例如NXL-104，其對(duì)于安布勒B類(lèi)碳青霉烯酶而言是雙特異性的。
[0071]通常，安布勒A類(lèi)碳青霉烯酶的單特異性碳青霉烯酶抑制劑(例如他唑巴坦)的濃度為 0.1mg / ml-10mg / ml,更優(yōu)選 Img / ml_5mg / ml,甚至更優(yōu)選 2mg / ml_3mg /ml o
[0072]通常，安布勒B類(lèi)碳青霉烯酶的單特異性碳青霉烯酶抑制劑(例如EDTA)的濃度為 0.00IM-0.5M,更優(yōu)選 0.00IM-0.01M,甚至更優(yōu)選為 0.005M。
[0073]通常，安布勒A和D類(lèi)碳青霉烯酶的雙特異性碳青霉烯酶抑制劑(例如NXL-104)的濃度為 0.05mg / ml-10mg / ml,更優(yōu)選 Img / ml_8mg / ml,甚至更優(yōu)選 3mg / L_5mg /ml o
[0074]通常，為了鑒別碳青霉烯酶的類(lèi)型，可以使用96孔微量滴定板并將板分成四個(gè)部分。在第一部分，碳青霉烯酶的存在可根據(jù)之前描述的本發(fā)明方法來(lái)檢測(cè)。在第二部分，安布勒A類(lèi)碳青霉烯酶可通過(guò)添加A類(lèi)碳青霉烯酶的碳青霉烯酶抑制劑來(lái)檢測(cè)。在第三部分，安布勒B類(lèi)碳青霉烯酶可通過(guò)添加B類(lèi)碳青霉烯酶的碳青霉烯酶抑制劑(最后用ZnS04貧化)來(lái)檢測(cè)。最后，在第四部分，安布勒D類(lèi)碳青霉烯酶可通過(guò)添加D類(lèi)碳青霉烯酶的碳青霉烯酶抑制劑來(lái)檢測(cè)。基于所使用的碳青霉烯酶抑制劑，然后本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過(guò)簡(jiǎn)單推導(dǎo)來(lái)建立存在于測(cè)試樣品中的碳青霉烯酶的具體的安布勒類(lèi)型。
[0075]通常，碳青霉烯酶抑制劑可以是試劑盒本身的一部分，因此與碳青霉烯酶底物、pH顏色指示劑和任選的碳青霉烯酶激活劑同時(shí)添加。
[0076]或者，碳青霉烯酶抑制劑可以與試劑盒分開(kāi)，因此同時(shí)或相繼添加至試劑盒和/或測(cè)試樣品(部分酶懸液)。
[0077]曾經(jīng)，根據(jù)本發(fā)明的方法在所有四個(gè)部分中進(jìn)行，也就是說(shuō)，含或不含碳青霉烯酶抑制劑，在進(jìn)行如上所述的方法后獲得的結(jié)果和在進(jìn)行進(jìn)一步添加碳青霉烯酶抑制劑的相同方法后獲得的結(jié)果之間建立比較。
[0078]試劑盒
[0079]根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種試劑盒，其包含選自碳青霉烯和頭霉素的碳青霉烯酶底物和pH顏色指示劑。
[0080]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，所述試劑盒可以進(jìn)一步包含碳青霉烯酶激活劑。因此，所述試劑盒可以包含碳青霉烯酶底物、pH顏色指示劑和碳青霉烯酶激活劑。
[0081]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，所述試劑盒可以進(jìn)一步包含碳青霉烯酶抑制劑。因此，所述試劑盒可以包含碳青霉烯酶底物、pH顏色指示劑、碳青霉烯酶激活劑和碳青霉烯酶抑制劑。
[0082]碳青霉烯酶底物、pH顏色指示劑、碳青霉烯`酶激活劑和碳青霉烯酶抑制劑如本專(zhuān)利申請(qǐng)之前所定義。
[0083]通常，所述試劑盒用于檢測(cè)根據(jù)本發(fā)明方法的樣品中產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌的存在。
[0084]通常，當(dāng)具體的碳青霉烯酶抑制劑存在于試劑盒中時(shí)，可以測(cè)定相應(yīng)的碳青霉烯酶的具體種類(lèi)，不管是安布勒A、B或D類(lèi)。
[0085]微量滴定板:
[0086]根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種微量滴定板，包含孔或一系列孔，所述孔包含選自碳青霉烯和頭霉素的碳青霉烯酶底物。
[0087]通常，所述微量滴定板可以進(jìn)一步包含:
[0088]-孔或一系列孔，其包含選自碳青霉烯和頭霉素的碳青霉烯酶底物和安布勒A類(lèi)碳青霉烯酶抑制劑；
[0089]-孔或一系列孔，其包含選自碳青霉烯和頭霉素的碳青霉烯酶底物和安布勒B類(lèi)碳青霉稀酶抑制劑(最后用ZnS04貧化)；
[0090]-孔或一系列孔，其包含選自碳青霉烯和頭霉素的碳青霉烯酶底物和安布勒D類(lèi)碳青霉烯酶抑制劑。
[0091]微量滴定板還可以包含可以分析并與測(cè)試樣品比較的對(duì)照孔或一系列對(duì)照孔。
[0092]通常,微量滴定板是96孔微量滴定板。
[0093]除了微量滴定板的裝置可用于該目的。例如，可以使用其中已經(jīng)結(jié)合了試劑盒(即碳青霉烯酶底物和PH顏色指示劑)的吸墨水紙。將酶懸液添加至吸墨水紙后，可以觀察該紙是否改變顏色。類(lèi)似地，可以使用塑料槽。事實(shí)上，試劑盒可以容納在這些塑料槽中，然后，將酶懸液添加至這些槽后，可以觀察是否存在顏色變化。
[0094]為了進(jìn)行本發(fā)明方法，將pH顏色指示劑、任選的碳青霉烯酶激活劑和一部分待測(cè)試酶懸液添加至微量滴定板的各孔。隨后，提供使用微量滴定板檢測(cè)根據(jù)本發(fā)明方法的測(cè)試樣品中產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌的存在，向各孔添加至少PH顏色指示劑和一部分待測(cè)試酶懸液。所述微量滴定板尤其非常適合于測(cè)定存在于測(cè)試樣品中的碳青霉烯酶的具體種類(lèi)。
[0095]通常，如果pH顏色指示劑是穩(wěn)定的，在進(jìn)行本發(fā)明方法前，微量滴定板的孔或一系列孔還可以包含pH顏色指示劑和碳青霉烯酶底物或pH顏色指示劑和碳青霉烯酶底物和碳青霉烯酶抑制劑?；蛘撸绻鸓H顏色指示劑是不穩(wěn)定的，其可隨后添加至孔或一系列孔。
[0096]通常，也可以在進(jìn)行本發(fā)明方法前將碳青霉烯酶激活劑和碳青霉烯酶底物或?qū)⑻记嗝瓜┟讣せ顒┖吞记嗝瓜┟傅孜锖吞记嗝瓜┟敢种苿┨砑又廖⒘康味ò宓目谆蛞幌盗锌住；蛘?，碳青霉烯酶可隨后添加至孔或一系列孔。
[0097]碳青霉烯酶底物、pH顏色指示劑、碳青霉烯酶激活劑和碳青霉烯酶抑制劑如本專(zhuān)利申請(qǐng)之前所定義。
[0098]根據(jù)一種實(shí)施方式，一些組分例如碳青霉烯酶底物和碳青霉烯酶抑制劑(當(dāng)存在時(shí))可以直接結(jié)合微量滴定板的固體表面。在這種情況下，將剩余組分(即PH顏色指示劑和任選的碳青霉烯酶激活劑)添加至含有測(cè)試樣品的微量滴定板中的表面結(jié)合的碳青霉烯酶底物和添加至表面結(jié)合的碳青霉烯酶抑制劑(當(dāng)存在時(shí))。
[0099]根據(jù)一種實(shí)施方式，可以將用于進(jìn)行本發(fā)明方法的微量滴定板以及每一種組件放入單個(gè)容器內(nèi)，且將所有多個(gè)容器置于連同用于觀察是否可以在測(cè)試樣品中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌 的說(shuō)明書(shū)的單個(gè)包裝內(nèi)。
[0100]本發(fā)明將進(jìn)一步通過(guò)以下附圖和實(shí)施例來(lái)說(shuō)明。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0101]圖1:檢測(cè)碳青霉烯酶產(chǎn)生者的方法的結(jié)果。
[0102]碳青霉烯酶產(chǎn)生者(加黑數(shù)字)如下:陰溝腸桿菌KPC_2(1)、大腸桿菌COLKPC-2(2)、克雷白氏桿菌H1516-6C0L KPC-2 (3)、克雷白氏桿菌BIC 0XA-48 (4)、克雷白氏桿菌CHA 0XA-48 (5)、陰溝腸桿菌TUR 0XA-48 (6)、大腸桿菌HAN 0XA-48 (7)、克雷白氏桿菌OMA0XA-181(8)、雷特格氏變形桿菌RAP 0XA-181(9)、克雷白氏桿菌UK NDM-1 (10)、克雷白氏桿菌IOMA冊(cè)11-1(11)、大腸桿菌27認(rèn)” NDM-1 (12)、弗氏檸檬酸桿菌STE NDM-1 (13)、大腸桿菌 MAD VIM-1 (14)、克雷白氏桿菌 MAD IMP-13(15) ?
[0103]不產(chǎn)生碳青霉烯酶者(加白數(shù)字)如下:克雷白氏桿菌CTX-M_15(16)、陰溝腸桿菌CTX-M-15 (17)、大腸桿菌CTX-M-14 (18)、克雷白氏桿菌62990XA-163 (19)、大腸桿菌VEB-1 (20)、大腸桿菌 ACC-1 (21)、克雷白氏桿菌 DHA-2 (22)、大腸桿菌 Ecl3SYD CMY-2 (23)、大腸桿菌VMC CMY-10 (24)、陰溝腸桿菌ARF過(guò)表達(dá)AmpC (25)、陰溝腸桿菌CON過(guò)表達(dá)AmpC (26)、克雷白氏桿菌COO孔蛋白缺乏(27)、克雷白氏桿菌BER孔蛋白缺乏(28)、大腸桿菌53野生型(29)、克雷白氏桿菌CIP53153野生型(30)。
【具體實(shí)施方式】
[0104]實(shí)施例1:方法:根據(jù)本發(fā)明的(酸-比色試驗(yàn))
[0105]將 申請(qǐng)人:自己的菌株收集和全世界來(lái)源的多種腸桿菌種類(lèi)的三十六種產(chǎn)生碳青霉烯酶的分離物納入該研究(表1)。預(yù)先表征了這些菌株的分子水平的P內(nèi)酰胺酶含量。
[0106]菌株收集也包含一系列通過(guò)非基于碳青霉烯酶的機(jī)制或通過(guò)產(chǎn)生臨床分離物中通常鑒別的非碳青霉烯酶廣譜的P內(nèi)酰胺酶而對(duì)碳青霉烯的敏感性降低的分離物(表2)。
[0107]在進(jìn)行本發(fā)明方法之前，通過(guò)在37 °C下在Mueller-Hinton瓊脂平板上通過(guò)Etest? (AB bioMerieux ；Solna, Sweden)測(cè)定最低抑菌濃度(MIC)值來(lái)進(jìn)行易感性測(cè)試，易感性測(cè)試的結(jié)果根據(jù)2010年6月修改的臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所(CLSI)指南來(lái)記錄
(18)。亞胺培南的斷點(diǎn)是S < I ii g / ml (易感性)，以及R≤4 ii g / ml (耐藥性)。至于厄他培南的斷點(diǎn)，它們是S≤0.25 ii g / ml和R≤I ii g / ml (參見(jiàn)表1和2)。
[0108]菌株按照以下進(jìn)行本發(fā)明方法。
[0109]用測(cè)試菌株的兩個(gè)菌落接種IOml胰蛋白酶解酪蛋白大豆培養(yǎng)基，并在37°C下在旋轉(zhuǎn)振蕩器上培養(yǎng)3小時(shí)。然后，將培養(yǎng)物以10，OOOg在4°C下離心15分鐘。將沉淀重懸于 Tris-HCL20mM 裂解緩沖液(B-PERII,Bacterial Protein Extraction Reagent, ThermoScientific,Pierce)，渦流震蕩I分鐘，再在室溫下培養(yǎng)30分鐘。為從血培養(yǎng)物獲得高質(zhì)量的蛋白質(zhì)萃取，將細(xì)菌沉淀重懸于裂解緩沖液(B-PERII, Bacterial Protein ExtractionReagent, ThermoScientific Pierce),然后轉(zhuǎn)移至 MicroBead 管(超凈細(xì)菌 DNA 分離試劑盒珠管(MO BIO laboratories)，并在室溫下采用渦流震蕩器進(jìn)行30分鐘通過(guò)劇烈攪拌微珠管獲得細(xì)菌的機(jī)械裂解。
[0110]將細(xì)菌懸液以10，OOOg在4°C下離心5分鐘。將上清液去除并置于冰上。將30iU的該懸液的上清液(即酶懸液)在96孔托盤(pán)的孔中與由3mg亞胺培南一水化物、pH7.5的酚紅溶液和ZnSO4 0.1mM組成的Iml溶液(即試劑盒)的100 U I混合。
[0111] 申請(qǐng)人:所使用的酚紅溶液通過(guò)以下方法制備:取2.2mlpH為8的濃縮酚溶液(由0.5%酹紅在蒸懼水中的混合物制備)，向其中添加16.6ml蒸懼水。然后通過(guò)添加IN NaOH液滴將pH值調(diào)節(jié)至7.5。
[0112]將試劑盒和測(cè)試的酶懸液的混合物在37°C下培養(yǎng)I小時(shí)。還根據(jù)本發(fā)明方法測(cè)試產(chǎn)生或不產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌菌株懸液(陽(yáng)性和陰性對(duì)照)。對(duì)于產(chǎn)生任何種類(lèi)的碳青霉烯酶的所有測(cè)試菌株，孔的顏色從紅轉(zhuǎn)為黃，而對(duì)應(yīng)于不產(chǎn)生碳青霉烯酶的分離物的細(xì)菌提取物的孔仍然是紅色，不管對(duì)于碳青霉烯的敏感性水平(圖1，結(jié)果也參見(jiàn)表1和2)。對(duì)于KPC產(chǎn)生者而言，從紅到黃的顏色變化早在培養(yǎng)開(kāi)始后的5分鐘獲得。在大多數(shù)情況下，30分鐘培養(yǎng)時(shí)間足以獲得碳青霉烯酶產(chǎn)生者的明顯的顏色變化。對(duì)于若干分離物例如若干MP和VIM產(chǎn)生者而言，顏色變化盡管仍是陽(yáng)性的，但較不明顯。該測(cè)試作為盲研究通過(guò)不知道那哪個(gè)孔包含碳青霉烯酶產(chǎn)生者的人來(lái)進(jìn)行。所有測(cè)試以高度可重復(fù)結(jié)果一式三份地進(jìn)行。
[0113]實(shí)施例2:產(chǎn)生碳青霉烯酶的腸桿菌的快速檢測(cè)
[0114]摘要
[0115]開(kāi)發(fā)Carba NP測(cè)試用于快速鑒定腸桿菌中任何碳青霉烯酶產(chǎn)生者。采用分離的細(xì)菌菌落的這種生物化學(xué)測(cè)試基于碳青霉烯亞胺培南的體外水解。與分子基技術(shù)相比，其是100%靈敏和特異性的。這種快速(小于2小時(shí))和廉價(jià)的技術(shù)可在任何實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。其構(gòu)成用于控制全世界碳青霉烯酶產(chǎn)生者的傳播模式的真實(shí)改變。
[0116]研究
[0117]將從來(lái)自我們自己的菌株收集和全球來(lái)源的多種臨床樣品(血培養(yǎng)物、尿、唾液...)分離的多種腸桿菌種類(lèi)的一百六十二個(gè)產(chǎn)生碳青霉烯酶的菌株納入該研究(表3)。該菌株收集也包括對(duì)碳青霉烯充分敏感或由于非碳青霉烯酶基機(jī)制顯示對(duì)碳青霉烯的敏感性降低的四十六個(gè)菌株(表4)。在Mueller-Hinton瓊脂(Biorad,Marnes-la-Coquette,France)上根據(jù)CLSI指南(Clinical and Laboratory Standards Institute.PerformanceStandards for Antimicrobial Susceptibility Testing ；Twenty-Second InformationalSupplement.M100-S22.Wayne (PA), USA:CLSI ；2012)對(duì)所有菌株進(jìn)行抗菌譜研究。按照如下進(jìn)行Carba NP(Carbapenemase Nordmann-Poirel)測(cè)試。將直接從抗菌譜回收的測(cè)試菌株的一劑校準(zhǔn)的劑量(IOiU)重懸于Tris-HC120mM裂解緩沖液(B-PERII，BacterialProtein Extraction Reagent, Thermo Scientific, Pierce),潤(rùn)流震蕩 I 分鐘，再在室溫下培養(yǎng)30分鐘。將該細(xì)菌懸液以10，OOOxg在室溫下離心5分鐘。30iU上清液，相當(dāng)于酶的細(xì)菌懸液，在96孔托盤(pán)的孔中與由3mg亞胺培南一水化物(Sigma, Saint-QuentinFallavier, France)、pH7.8 的酌 紅溶液和 0.1mM ZnSO4(Merck Millipore, Guyancourt,France)組成的Iml溶液的IOOii I混合。所使用的酹紅溶液通過(guò)以下方法制備:取2ml0.5% w / V的酌?紅(Merck Millipore)溶液，向其中添加16.6ml蒸懼水。然后通過(guò)添加INNaOH液滴將pH值調(diào)節(jié)至7.8。待測(cè)試的酚紅溶液和酶懸液的混合物在37°C下最多2小時(shí)。測(cè)試結(jié)果通過(guò)不了解樣品性質(zhì)的技術(shù)人員來(lái)解釋。
[0118]預(yù)先表征了所有菌株的分子水平的P內(nèi)酰胺酶含量。采用Etest? (ABbioMerieux ；Solna, Sweden)測(cè)定碳青霉烯的最低抑菌濃度,并根據(jù)如2011年更新的US指南(CLSI)記錄結(jié)果。
[0119]采用Carba NP測(cè)試，對(duì)于產(chǎn)生碳青霉烯酶的所有測(cè)試菌株(表3)，孔的顏色從紅轉(zhuǎn)為橙或黃(圖2)，而對(duì)應(yīng)于不產(chǎn)生碳青霉烯酶的分離物的細(xì)菌提取物的孔仍然是紅色，不管對(duì)于碳青霉烯的敏感性水平(表4)。對(duì)于KPC產(chǎn)生者而言，從紅到黃的顏色變化早在培養(yǎng)開(kāi)始后的5-10分鐘獲得。在大多數(shù)情況下，30分鐘培養(yǎng)時(shí)間足以獲得碳青霉烯酶產(chǎn)生者的明顯的顏色變化。與碳青霉烯酶基因作為金本位的分子基鑒定相比，測(cè)試的特異性和靈敏性都為100%。所有測(cè)試一式三份地進(jìn)行，獲得相同和可重復(fù)的結(jié)果。
[0120]Carba NP測(cè)試完美`地將碳青霉烯酶產(chǎn)生者(表3)與由于非碳青霉烯酶介導(dǎo)的機(jī)制例如聯(lián)合耐藥機(jī)制(與頭孢菌素酶和/或ESBL的過(guò)度產(chǎn)生相關(guān)的外膜滲透性缺陷)而耐碳青霉烯的菌株區(qū)分開(kāi)，或?qū)⑻记嗝瓜┟府a(chǎn)生者(表3)與對(duì)碳青霉烯敏感但表達(dá)廣譜3內(nèi)酰胺酶而不具有碳青霉烯酶活性的菌株(ESBL、質(zhì)粒和染色體編碼的頭孢菌素酶)(表4)區(qū)分開(kāi)。在小于2小時(shí)的總時(shí)間內(nèi)獲得可解釋的陽(yáng)性結(jié)果，其是獨(dú)特的，使得可以實(shí)施快速容量測(cè)量以限制碳青霉烯酶產(chǎn)生者的傳播。
[0121]結(jié)論
[0122]Carba NP測(cè)試具有多種益處。它是廉價(jià)、快速和高度靈敏和特異性的，去除了其他耗時(shí)且不那么靈敏或特異性的鑒定碳青霉烯酶產(chǎn)生者的技術(shù)的需要。采用該精確的測(cè)試將顯著改進(jìn)感染有或移植有碳青霉烯酶產(chǎn)生者的患者的檢測(cè)。Carba NP測(cè)試已經(jīng)在我們的部門(mén)中常規(guī)實(shí)施并獲得優(yōu)異的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，它顯著降低了實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員的工作量并簡(jiǎn)化了潛在的碳青霉烯酶產(chǎn)生者的臨床管理。
[0123]該測(cè)試?yán)缈捎糜谥苯訙y(cè)試⑴從血培養(yǎng)物的抗菌譜獲得的細(xì)菌，和/或(ii)在抗菌素易感性測(cè)試之前在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌菌落。對(duì)于從那些臨床樣品中直接分離的細(xì)菌的抗生素管理者而言，預(yù)期檢測(cè)碳青霉烯酶產(chǎn)生者的時(shí)間增益將為至少24小時(shí)。它也可用于快速鑒定耐碳青霉烯和/或耐從糞便回收的多藥耐藥細(xì)菌的篩選獲得的廣譜頭孢菌素的分離物。這對(duì)于預(yù)防疾病爆發(fā)而言將是非常重要的。使用Carba NP測(cè)試可以通過(guò)促進(jìn)在關(guān)鍵的臨床試驗(yàn)中的患者募集而支持新抗生素的開(kāi)發(fā)。用作本地設(shè)計(jì)測(cè)試的該測(cè)試可以促進(jìn)全球監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)。
[0124]來(lái)自Carba NP測(cè)試的結(jié)果可以有效選擇待進(jìn)一步通過(guò)PCR測(cè)試和/或進(jìn)行測(cè)序以詳細(xì)鑒定碳青霉烯酶基因的菌株。最后，使用該測(cè)試的另一區(qū)域可以是已知是碳青霉烯酶產(chǎn)生者的大貯庫(kù)的低收入鄉(xiāng)村。它首次提供了用于檢測(cè)腸桿菌科中的多藥耐藥性的主要成分的友好方案。使用Carba NP測(cè)試將通過(guò)改變控制全世界碳青霉烯酶產(chǎn)生者的模式而促進(jìn)碳青霉烯的良好管理。
[0125]實(shí)施例3:快速檢測(cè)產(chǎn)生碳青霉烯酶的假單胞細(xì)菌屬
[0126]摘要
[0127]假單胞細(xì)菌屬中碳青霉烯耐藥性主要與外膜滲透性降低有關(guān)，或與碳青霉烯酶的表達(dá)有關(guān)。目前，碳青霉烯酶檢測(cè)取決于不夠靈敏或特異性或昂貴的表型基或分子基技術(shù)。此外，那些技術(shù)是耗時(shí)的，因此限制了臨床重要性。本文已經(jīng)評(píng)價(jià)了基于碳青霉烯的體外水解的新技術(shù)，Carba NP測(cè)試來(lái)檢測(cè)假單胞細(xì)菌屬中的碳青霉烯酶的產(chǎn)生。用36種碳青霉烯酶和72種非碳青霉烯酶產(chǎn)生者來(lái)測(cè)試。Carba NP測(cè)試是特異性和靈敏的(分別為100%和94.4% )，以及快速的(小于2小時(shí))。該成本效益的技術(shù)可以在全世界任何臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中實(shí)施。它為鑒定產(chǎn)生碳青霉烯酶的假單胞細(xì)菌屬提供安全的技術(shù)，因此對(duì)于預(yù)防其在醫(yī)院的傳播而言是非常有用的工具。
[0128]方法
[0129]菌株收集
[0130]將從來(lái)自我們的菌 株收集和全球來(lái)源的多種臨床樣品(血培養(yǎng)物、尿、唾液等)分離的屬于若干假單胞細(xì)菌屬種類(lèi)的三十六個(gè)產(chǎn)生碳青霉烯酶的分離物納入該研究(表5)。預(yù)先表征了菌株的分子水平的3內(nèi)酰胺酶含量。該收集也包含代表在假單胞細(xì)菌屬中鑒別的主要P內(nèi)酰胺耐藥性表型和P內(nèi)酰胺酶多樣性的特征的72個(gè)菌株。(包括PER-、VEB-, BEL-、SHV-, TEM-和OXA-類(lèi)型的ESBL)(表6)。此外，大多數(shù)這些菌株耐碳青霉烯。
[0131]易感性測(cè)試
[0132]在37°C下在 Mueller-Hinton 瓊脂平板(Becton Dickinson, Le Pont de Chaix,France)上米用Etest? (bioMerieux ；La Balmes-les-Grottes,France)進(jìn)行易感性測(cè)試，并根據(jù)2012年更新的US指南(CLSI)記錄結(jié)果。亞胺培南、美羅培南和多利培南的斷點(diǎn)如下:易感性(S) ( 2，和耐藥性(R)/ ml.[0133]Carba NP 測(cè)試
[0134]如之前所詳細(xì)描述,在37°C下在Mueller-Hinton瓊脂平板(Becton Dickinson)上生長(zhǎng)的菌株上進(jìn)行Carba NP測(cè)試(7)。該測(cè)試基于檢測(cè)碳青霉烯亞胺培南的P內(nèi)酰胺環(huán)的水解，然后PH指示劑的顏色變化。簡(jiǎn)言之，將直接從抗菌譜回收的測(cè)試菌株的一劑校準(zhǔn)的劑量(IOu I)重懸于 Tris-HC120mM 裂解緩沖液(B-PERII，Bacterial ProteinExtraction Reagent, Thermo Scientific, Pierce),潤(rùn)流震蕩 I 分鐘，再在室溫下培養(yǎng) 30分鐘。將該細(xì)菌懸液以10，OOOxg在室溫下離心5分鐘。30 u I上清液，相當(dāng)于酶的細(xì)菌懸液，在96孔托盤(pán)的孔中與由3mg亞胺培南一水化物(Sigma, Saint-Quentin Fallavier,France)、pH7.8 的酚紅溶液和 0.1mM ZnSO4(Merck Millipore, Guyancourt, France)組成的Iml溶液的100 μ I混合。所使用的酹紅溶液通過(guò)以下方法制備:取2ml0.5% w / V的酹紅(Merck Millipore)溶液，向其中添加16.6ml蒸懼水。然后通過(guò)添加IN NaOH液滴將pH值調(diào)節(jié)至7.8。待測(cè)試的酚紅溶液和酶懸液的混合物在37°C下最多2小時(shí)。測(cè)試結(jié)果通過(guò)不了解樣品性質(zhì)的技術(shù)人員來(lái)解釋。
[0135]結(jié)果
[0136]采用Carba NP測(cè)試，對(duì)于產(chǎn)生碳青霉烯酶的所有分離物(除未檢測(cè)出的若干GES型產(chǎn)生者之外)，孔的顏色從紅轉(zhuǎn)為橙或黃(表5)。對(duì)應(yīng)于不產(chǎn)生碳青霉烯酶的分離物的細(xì)菌提取物的孔仍然是紅色(陰性)，不管對(duì)于碳青霉烯的耐藥性水平(表6)。在大多數(shù)情況下，30分鐘培養(yǎng)時(shí)間足以獲得碳青霉烯酶產(chǎn)生者的明顯的顏色變化。發(fā)現(xiàn)該測(cè)試的特異性和靈敏性分別為100%和94.4%。所有測(cè)試一式三份地進(jìn)行，獲得相同和可重復(fù)的結(jié)果。有意思的是，在根據(jù)CLSI指南基本上對(duì)碳青霉烯敏感的兩種碳青霉烯酶產(chǎn)生者(產(chǎn)生IMP-1的P.stutzeri PB207和P.putida NTU92 / 99)中檢測(cè)到碳青霉烯酶活性。
[0137]Carba NP測(cè)試將碳青霉烯酶產(chǎn)生者(表5)與由于非碳青霉烯酶介導(dǎo)的機(jī)制例如聯(lián)合耐藥機(jī)制(與頭孢菌素酶和/或ESBL的過(guò)度產(chǎn)生相關(guān)的外膜滲透性缺陷+ / -)而耐碳青霉烯的那些分離物(表6)區(qū)分開(kāi)。
[0138]討論
[0139]如之前在腸桿菌科中所報(bào)告(參見(jiàn)實(shí)施例2)，Carba NP測(cè)試對(duì)于在非發(fā)酵罐中例如在假單胞細(xì)菌屬中檢測(cè)碳青霉烯酶活性具有多種益處。Carba NP去除了都需要進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)24-72小時(shí)的碳青霉烯酶活性的體外檢測(cè)(Hodge測(cè)試)和基于β內(nèi)酰胺酶抑制劑的表型技術(shù)(對(duì)于KPC為硼酸，對(duì)于MBL為EDTA)的需要。此外，由于銅綠色極毛桿菌的低的外膜滲透性，在銅綠色極毛桿菌中證實(shí)β內(nèi)酰胺酶活性的抑制比在腸桿菌中更難。使用這種抑制基技術(shù)可能不能檢測(cè)甚至是真實(shí)的碳青霉烯酶產(chǎn)生者中的碳青霉烯酶活性(Picao等.Clin.Microbiol.46:2028-2037)。Carba NP測(cè)試明確地將碳青霉烯酶與耐碳青霉烯的銅綠色極毛桿菌中的碳青霉烯酶產(chǎn)生者區(qū)分開(kāi)。它也可以檢測(cè)仍然對(duì)碳青霉烯敏感的碳青霉烯酶產(chǎn)生者中的碳青霉烯酶活性。Carba NP測(cè)試是第一種可用于鑒別碳青霉烯酶產(chǎn)生者的具有這樣高度特異性、敏感性和快速(小于2小時(shí))的技術(shù)。然而，不得不考慮到?jīng)]有檢測(cè)GES型碳青霉烯酶，特別是在具有高流行的地理區(qū)域(即巴西、南非)。沒(méi)有檢測(cè)那些特異性GES衍生物可能是由于它們的弱的固有碳青霉烯酶活性。事實(shí)上，GES型碳青霉烯酶的GES型ESBL的點(diǎn)突變體類(lèi)似物。它們(例如在野生型大腸桿菌背景中)不賦予對(duì)碳青霉烯的明顯耐藥性(keat/Km為0.02-0.26 μ M's-1)，與例如MBL相反，其賦予高得多的碳青霉烯酶耐藥性水平(通常kMt / Km > I μ M's—1)。此外，作為體外耐碳青霉烯的來(lái)源的GES型變種的碳青霉烯酶活性的真實(shí)的臨床顯著性(治療失敗)仍然待評(píng)價(jià)。
[0140]我們目前在我們的部門(mén)常規(guī)實(shí)施Carba NP測(cè)試。它已經(jīng)用于調(diào)查在非發(fā)酵罐中對(duì)碳青霉烯酶的敏感性有任何略微降低的分離物中的碳青霉烯酶活性。它提供優(yōu)異的和可重復(fù)的結(jié)果。該Carba NP測(cè)試的結(jié)果用于選擇進(jìn)一步通過(guò)PCR測(cè)試且當(dāng)需要精確鑒定碳青霉烯酶基因時(shí)進(jìn)行測(cè)序的菌株。
【權(quán)利要求】
1.用于檢測(cè)樣品中存在產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌的方法，所述方法包括步驟: a)在測(cè)試樣品上進(jìn)行細(xì)胞裂解以獲得酶懸液； b)使一部分步驟a)中獲得的酶懸液與試劑盒反應(yīng)，所述試劑盒包含 -碳青霉烯酶底物，選自碳青霉烯和頭霉素， -pH顏色指示劑，當(dāng)反應(yīng)混合物的pH為6.4-8.4時(shí),所述pH顏色指示劑將改變顏色， 其中步驟b)后的顏色變化表示所述測(cè)試樣品中存在產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述測(cè)試樣品是選自血樣和尿樣的生物樣品。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌選自不動(dòng)細(xì)菌屬、產(chǎn)氣單孢菌屬、桿菌屬、朽1檬細(xì)菌屬、腸桿菌屬、腸桿菌屬、埃希氏菌屬、克雷伯氏桿菌屬、摩根氏菌屬、Pandoreae、變形桿菌屬、普羅菲登菌屬、假單胞細(xì)菌屬、雷爾氏菌屬、蘭奧爾菌屬、沙門(mén)氏菌屬、沙雷菌屬、海洋產(chǎn)電菌屬、志賀氏桿菌屬和Strenotrophomonas。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中所述試劑盒還包含碳青霉烯酶激活劑，其選自二階陽(yáng)離子或其鹽，及其混合物。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中所述其中步驟b)的反應(yīng)在15°C-40°C、優(yōu)選20 0C -37°C、更優(yōu)選35°C -37 °C的溫度下進(jìn)行。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中所述步驟b)的反應(yīng)在足以觀察到顏色變化的時(shí)期內(nèi)進(jìn)行，優(yōu)選地，在5分鐘-120分鐘，優(yōu)選在10-60分鐘，更優(yōu)選在20-40分鐘的時(shí)期內(nèi)肉眼觀察到顏色變化。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其`中所述方法包括步驟: a)在生物樣品上進(jìn)行細(xì)胞裂解以獲得酶懸液； b)使一部分步驟a)中獲得的酶懸液與試劑盒反應(yīng)，所述試劑盒包含 -亞胺培南作為碳青霉烯酶底物， -酚紅作為pH顏色指示劑,和 -鋅或其鹽作為碳青霉烯酶激活劑， 其中步驟b)后顏色從紅變成黃表示所述生物樣品中存在產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌。
8.—種試劑盒,包含選自碳青霉烯和頭霉素的碳青霉烯酶底物和pH顏色指示劑。
9.權(quán)利要求8的試劑盒，還包含碳青霉烯酶激活劑，其選自二階陽(yáng)離子或其鹽，及其混合物。
10.權(quán)利要求8或9的試劑盒,還包含碳青霉烯酶抑制劑。
11.權(quán)利要求8-10任一項(xiàng)所定義的試劑盒在檢測(cè)根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所定義的方法的樣品中存在產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌中的用途。
12.微量滴定板，包含孔或一系列孔，所述孔包含選自碳青霉烯和頭霉素的碳青霉烯酶底物。
13.權(quán)利要求12的微量滴定板，還包含: -孔或一系列孔，其包含選自碳青霉烯和頭霉素的碳青霉烯酶底物和安布勒A類(lèi)碳青霉烯酶抑制劑； -孔或一系列孔，其包含選自碳青霉烯和頭霉素的碳青霉烯酶底物和安布勒B類(lèi)碳青霉烯酶抑制劑； -孔或一系列孔，其包含選自碳青霉烯和頭霉素的碳青霉烯酶底物和安布勒D類(lèi)碳青霉烯酶抑制劑。
14.權(quán)利要求13所定義的微量滴定板在檢測(cè)根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所定義的方法的樣品中存在產(chǎn)生碳青霉烯酶的細(xì)菌和/或在測(cè)定存在于樣品中的碳青霉烯酶的具體種類(lèi)中的用途，其中向各孔添加至少PH顏色指示劑和一部分待測(cè)試的酶懸液。
15.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法、權(quán)利要求8-11任一項(xiàng)的試劑盒及其用途和權(quán)利要求12-14任一項(xiàng)的微量滴定板及其用途，其中所述碳青霉烯選自比阿培南、厄他培南、多利培南、亞胺培南、美羅培南、泰比培南和帕尼培南,優(yōu)選亞胺培南，以及頭霉素選自拉氧頭孢和頭孢甲氧霉 素。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK103764838SQ201280030398
【公開(kāi)日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2012年6月21日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月22日
【發(fā)明者】L·多爾泰, P·諾德曼, L·普瓦雷爾 申請(qǐng)人:國(guó)家醫(yī)療保健研究所, 巴黎公共救濟(jì)院, 巴黎第十一大學(xué)