通過pcr檢測微生物dna的方法、系統(tǒng)及組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了通過廣譜PCR來檢測樣品中的低豐度微生物DNA的方法、系統(tǒng)以及組合物。本發(fā)明的方法是基于一種新穎的策略，該策略用一種非細(xì)菌性標(biāo)記序列來對靶DNA模板的5'端進(jìn)行標(biāo)記，從而使這些模板不同于PCR試劑中存在的內(nèi)源性污染物。還提供了用于對這些模板和引物集進(jìn)行標(biāo)記以擴(kuò)增這些經(jīng)過標(biāo)記的模板的融合探針。還提供了用于使本發(fā)明的方法便利并且自動(dòng)化的系統(tǒng)和試劑盒。
【專利說明】通過PCR檢測微生物DNA的方法、系統(tǒng)及組合物
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年5月19日提交的美國臨時(shí)申請61/487，709的權(quán)益，將該案的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合于此。
[0003]序列表
[0004]本申請包含序列表。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005] 本發(fā)明涉及分子測定領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及用于檢測微量微生物DNA的一種基于PCR的方法以及用于執(zhí)行該方法的組合物。
【背景技術(shù)】
[0006]理論上，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)潛在地是用于快速檢測一種分析物(例如，食品樣品或臨床試樣)中的微生物的所有現(xiàn)有方法中最靈敏的。在需要檢測廣泛范圍的病原體并且有一些難以在體外培養(yǎng)或需要一段較長的培養(yǎng)期的情況下，PCR的價(jià)值尤其值得關(guān)注。舉例來說，通過靶向一種保守的基因，如細(xì)菌的16S rRNA基因或真核病原體(如真菌)的18S，可以僅使用一次PCR反應(yīng)就實(shí)現(xiàn)隨機(jī)篩選或檢測。然而，在實(shí)踐中，使用廣譜PCR來檢測微量的微生物仍充斥著許多挑戰(zhàn)。限制PCR在微生物檢測中的實(shí)際應(yīng)用的一些因素包括PCR對抑制劑、污染及實(shí)驗(yàn)條件的固有的敏感性。最難并且長期存在的一個(gè)問題是PCR試劑的內(nèi)源性污染。
[0007]用于執(zhí)行PCR的試劑，甚至是可商購的那些，都是從細(xì)菌來源獲得的。因此，這些試劑，確切地說，Taq DNA聚合酶，不可避免地包含了由源細(xì)菌引起的某種水平的DNA污染。污染性DNA通常包括了超過一種的無法被鑒別為水生棲熱菌(Thermus aquaticus)或大腸桿菌(Escherichia coli)的菌株或種類,但是,它們與突光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、銅綠假單胞菌(Pseduomonas aeruginosa)、幾產(chǎn)喊菌(Alcaligenesfaecalis)或棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)種類具有密切的同源性,所有這些在臨床上都很重要。結(jié)果是，常規(guī)的PCR經(jīng)常將這些污染物與靶微生物DNA共擴(kuò)增，產(chǎn)生了極其高的假陽性率，由此使得PCR測定不可靠以致于妨礙了它們的臨床應(yīng)用。
[0008]在過去的20年中，已經(jīng)試過眾多的嘗試來解決這一問題。一些實(shí)例包括UV照射、限制性內(nèi)切核酸酶消化、超濾以及用DNase I對試劑進(jìn)行預(yù)處理(參考文獻(xiàn)20-23)。不幸的是，所有先前的嘗試不是因?yàn)閷τ诜磻?yīng)條件的固有限制而無法完全地消除假陽性，就是因?yàn)镻CR反應(yīng)伴隨的抑制作用而無法達(dá)到所需的靈敏度水平。結(jié)果是，一般認(rèn)為廣譜PCR是臨床上不相關(guān)的，使得大多數(shù)的研究者追求多重PCR或其他昂貴、難以優(yōu)化并且執(zhí)行起來很繁瑣的非PCR方法。
[0009]因此，對于克服這些利用PCR用于臨床檢測微生物的挑戰(zhàn)的需求仍未得到滿足。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0010]鑒于上述，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于檢測樣品中的微生物的基于PCR的方法，該方法靈敏、準(zhǔn)確、廉價(jià)并且易于執(zhí)行。
[0011]本發(fā)明的另一目的是提供使基于PCR的分子診斷學(xué)能夠臨床應(yīng)用，特別是用于危重護(hù)理環(huán)境中的試劑和診斷試劑盒。
[0012]本發(fā)明的又一目的是提供一種用于執(zhí)行基于PCR的診斷測定以檢測臨床試樣和其他生物樣品中的微生物的系統(tǒng)。
[0013]本發(fā)明的以上目的是通過一種在此稱為PE-PCR的新穎策略來滿足，該策略克服了 PCR試劑中長期存在的內(nèi)源性污染的問題。
[0014]簡單地說，PE-PCR策略認(rèn)識(shí)到，解決內(nèi)源性污染問題的所有先前的努力都曾通過嘗試去除或破壞污染物來正面處理該問題。在近20年中，此種正面處理(head-onapproach)得到了極少的成功。在PE-PCR中，本發(fā)明人摒棄了常規(guī)的想法并且想出了一種間接的方法，該方法巧妙地避開了內(nèi)源性污染的問題。具體地說，PE-PCR策略在將任何PCR試劑添加到反應(yīng)混合物中之前，使用了一種DNA融合探針將一種非細(xì)菌性序列添加到靶模板的5’端。以這種方式，使這些靶模板因其5’端的非細(xì)菌性序列而與污染序列區(qū)分開來。借助于與這些非細(xì)菌性標(biāo)記序列互補(bǔ)的一種引物，可以通過標(biāo)準(zhǔn)PCR對這些經(jīng)過標(biāo)記的模板進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。由于非細(xì)菌性融合引物(又稱融合探針)將僅擴(kuò)增5’端經(jīng)過標(biāo)記的模板，故這使得細(xì)菌源性污染物不成為問題。
[0015]因此，本發(fā)明的一個(gè)第一方面是針對一種用于選擇性擴(kuò)增樣品中的一種或多種靶微生物DNA的方法。根據(jù)本發(fā)明這一方面的方法將利用一種或多種DNA融合探針，該一種或多種探針由具有一個(gè)非細(xì)菌性序列的一個(gè)5’端部分和具有與該靶微生物DNA的一部分互補(bǔ)的一個(gè)序列的一個(gè)3’端部分組成。這些方法一般將包括以下步驟:使該一種或多種融合探針與該樣品中的靶微生物DNA雜交；將未雜交的融合探針和該靶微生物DNA的未結(jié)合的3’端部分去除；使這些融合探針的3’端和該靶微生物DNA延伸以形成呈雙鏈的引物延伸的模板；并且執(zhí)行一種PCR方法以用一個(gè)引物集對這些引物延伸的模板進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，該引物集包括了具有與這些融合探針的非細(xì)菌性序列互補(bǔ)的一個(gè)非細(xì)菌性序列的至少一種引物。
[0016]本發(fā)明的一個(gè)第二方面是針對一種用于檢測受試者中的微生物感染的方法。根據(jù)本發(fā)明這一方面的方法也將需要多個(gè)如以上所描述的DNA探針。它們一般將包括以下步驟:將這些融合探針添加到從該受試者取得的樣品中；使這些融合探針與該樣品中的微生物DNA雜交；將未雜交的融合探針和該微生物DNA的任何未結(jié)合的3’端部分去除；使這些融合探針的3’端和該微生物DNA延伸以形成呈雙鏈的引物延伸的模板；通過用一個(gè)引物集執(zhí)行一種PCR方法來對這些引物延伸的模板進(jìn)行擴(kuò)增，該引物集包括了具有與該融合探針的非細(xì)菌性序列互補(bǔ)的一個(gè)非細(xì)菌性序列的至少一個(gè)正向引物；并且對這些擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析以確定一種微生物的存在或不存在。
[0017]本發(fā)明的一個(gè)第三方面是針對一種用于由樣品中的靶微生物DNA產(chǎn)生引物延伸的DNA模板以通過PCR方法進(jìn)行選擇性擴(kuò)增的融合探針。根據(jù)本發(fā)明這一方面的融合探針一般由具有一個(gè)非細(xì)菌性序列的一個(gè)5’端部分和具有與該靶微生物樣品的一部分互補(bǔ)的一個(gè)序列的一個(gè)3’端部分組成。
[0018]本發(fā)明的一個(gè)第四方面是針對一種用于由靶微生物DNA產(chǎn)生引物延伸的DNA模板以進(jìn)行選擇性PCR擴(kuò)增和檢測的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明這一方面的試劑盒一般將包括多個(gè)如以上所描述的融合探針；以及以易于使用的形式包裝的3’到5’外切核酸酶與克列諾聚合酶的一種混合物。
[0019]本發(fā)明的一個(gè)第五方面是針對一種用于檢測樣品中的靶微生物的系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明這一方面的系統(tǒng)一般包括一個(gè)用于接收該樣品的樣品接收單元；一個(gè)用于將試劑添加到該樣品中并且維持反應(yīng)條件的樣品處理單元；以及一個(gè)用于分析該經(jīng)過處理的樣品的樣品分析單元。該樣品處理單元優(yōu)選被自動(dòng)化并且配置成執(zhí)行以下步驟:將多個(gè)融合探針添加到該樣品中并且維持一種條件以允許這些融合探針與該樣品中的微生物DNA雜交；添加一種降解/延伸試劑以去除未雜交的融合探針和該雜交的靶微生物DNA的未結(jié)合的3’端部分，并且使這些雜交的融合探針的3’端和該靶微生物DNA以3’到5’方向延伸，由此產(chǎn)生呈雙鏈的引物延伸的模板；并且添加PCR試劑并維持反應(yīng)條件以執(zhí)行這些引物延伸的模板的擴(kuò)增；并且將該經(jīng)過處理的樣品轉(zhuǎn)送到該分析單元進(jìn)行分析。
[0020]本發(fā)明的其他方面和益處將從以下說明和所附權(quán)利要求顯而易見。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1示出了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的PE-PCR方法的示意圖。
[0022]圖2示出了一個(gè)凝膠電泳圖像，圖示了可商購的聚合酶的純度不足以用于進(jìn)行細(xì)菌DNA的敏感并且特異性的廣譜擴(kuò)增。
[0023]圖3示出了多個(gè)凝膠電泳圖像，證實(shí)了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的PE-PCR方法能夠特異性地?cái)U(kuò)增靶細(xì)菌DNA，而不共擴(kuò)增污染性細(xì)菌DNA。(A)使用融合探針M13_TstaG422以及引物集M13和TstaG765對指定量的金黃色葡萄球菌(S.aureus)基因組DNA進(jìn)行PE-PCR。(B)如圖A中所描述(泳道I)、在不存在M13引物的情況下(泳道2)以及在通過將IOOfg的金黃色葡萄球菌基因組DNA添加到EK混合物(泳道3)或PCR混合物(泳道4)中的人工污染的條件下，對金黃色葡萄球菌基因組DNA (IOOfg)進(jìn)行PE-PCR (上圖)。也在不存在模板DNA的情況下執(zhí)行PE-PCR(泳道5)。金黃色葡萄球菌基因組DNA的存在是通過種類特異性PCR來確定，該P(yáng)CR對金黃色葡萄球菌特異性染色體DNA片段進(jìn)行了擴(kuò)增(下圖)。(C)使用了指定量的金黃色葡萄球菌基因組DNA作為模板以使用融合探針M13-16S-p201F以及引物集M13和pl370進(jìn)行廣譜PE-PCR。(D)如圖C (泳道I)中所描述(泳道I)以及在通過將IOOfg的金黃色葡萄球菌基因組DNA添加到EK混合物(泳道2)或PCR混合物(泳道3)中的人工污染的條件下，對金黃色葡萄球菌基因組DNA (IOOfg)進(jìn)行廣譜PE-PCR (上圖)。也在不存在模板DNA的情況下執(zhí)行廣譜PE-PCR (泳道4)。金黃色葡萄球菌基因組DNA的存在是通過種類特異性PCR對金黃色葡萄球菌的染色體DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增來確定(下圖)。NTC代表無模板對照。
[0024]圖4示出了在用DNase I對PCR試劑預(yù)處理之后進(jìn)行的模板細(xì)菌DNA的廣譜實(shí)時(shí)PE-PCR與廣譜實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增的比較。(A)使用融合探針M13-16S-p201F以及引物集M13和P1370，在LCGreen I plus HRM染料的存在下對指定量的金黃色葡萄球菌基因組DNA進(jìn)行廣譜實(shí)時(shí)PE-PCR。(C)作為替代方案，使用了用或未用DNase I (IU和2.5U)預(yù)處理的PCR反應(yīng)混合物進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR以擴(kuò)增指定量的金黃色葡萄球菌基因組DNA。使用HR-1儀器對PCR產(chǎn)物進(jìn)行HRMA。示出了擴(kuò)增(左邊一列上的所有圖式)和微分曲線(右邊一列上的所有圖式)。NTC代表無模板對照。
[0025]圖5示出了針對12種不同的細(xì)菌種類的廣譜實(shí)時(shí)PE-PCR和HRMA的熔解曲線圖。使用融合探針M13-16S-p201F以及引物集M13和pl370，在LCGreen I plus的存在下對來自12種不同的細(xì)菌種類的指定量的基因組DNA進(jìn)行廣譜實(shí)時(shí)PE-PCR。使用HR-1儀器對PCR產(chǎn)物進(jìn)行HRMA并且示出了微分曲線。NTC代表無模板對照。
[0026]圖6示出了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的系統(tǒng)的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]現(xiàn)將通過參照如隨附圖式中圖示的具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。盡管將根據(jù)具體的示例性實(shí)施例和實(shí)例來描述本發(fā)明，但應(yīng)理解，在此披露的實(shí)施例只是出于說明性目的，并且本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以在不偏離如所附權(quán)利要求中所陳述的本發(fā)明的精神和范圍的情況下作出不同的修改和改變。
[0028]定義
[0029]除非另外指示，否則在此使用的所有術(shù)語都具有以下所給的含義，并且與本發(fā)明領(lǐng)域的技術(shù)人員所知的這些術(shù)語所具有的含義總體上一致。有關(guān)本領(lǐng)域的定義和術(shù)語，從業(yè)人員特別地參照薩姆布魯克(Sambrook)等人(1989)分子克隆:實(shí)驗(yàn)手冊(MolecularCloning:A Laboratory Manual)(第二版)，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press),紐約州普萊恩維尤(Plainview，N.Y.)以及奧蘇貝爾F M (Ausubel F Μ)等人(1993)現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(Current Protocols in Molecular Biology),約翰威立父子公司(John Wiley and Sons), 紐約州紐約(New York, N.Y.)。應(yīng)了解，本發(fā)明不局限于所描述的特定方法、方案以及試劑，因?yàn)檫@些可以變化。
[0030]在此引用的所有出版物都以引用明確地結(jié)合于此用于描述并且披露可以結(jié)合本發(fā)明使用的組合物和方法的目的。
[0031]如在此所使用，術(shù)語“基因”是指包含了產(chǎn)生多肽、前體或RNA (例如，rRNA、tRNA)必需的編碼序列的一種核酸(例如DNA)序列。多肽可以由一個(gè)全長編碼序列或由該編碼序列的任何部分來編碼，只要保持了該全長或片段的所希望的活性或功能特性(例如，酶促活性、配體結(jié)合、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫原性等)即可。該術(shù)語還涵蓋一個(gè)結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)以及鄰近于該編碼區(qū)在5’和3’端上距任一端約Ikb或更遠(yuǎn)距離定位以使得該基因?qū)?yīng)于全長mRNA的長度的序列。位于該編碼區(qū)的5’并且存在于mRNA上的序列被稱為5’不翻譯序列。位于該編碼區(qū)的3’或下游并且存在于mRNA上的序列被稱為3’不翻譯序列。術(shù)語“基因”涵蓋一種基因的cDNA和基因組形式兩者。一種基因的基因組形式或克隆包含了間雜有稱為“內(nèi)含子”或“插入?yún)^(qū)”或“插入序列”的非編碼序列的編碼區(qū)。內(nèi)含子是一種基因的被轉(zhuǎn)錄成核RNA (hnRNA)的區(qū)段；內(nèi)含子可以包含調(diào)控元件，如增強(qiáng)子。內(nèi)含子從核或初級轉(zhuǎn)錄物中被去除或“剪接掉”;因此，內(nèi)含子不存在于信使RNA (mRNA)轉(zhuǎn)錄物中。mRNA在翻譯期間起到指明新生多肽中氨基酸的序列或次序的作用。
[0032]如在此所使用的“探針和/或引物”可以是RNA或DNA。DNA可以是cDNA或基因組DNA0多核苷酸探針和引物是單鏈或雙鏈的DNA或RNA，一般是合成的寡核苷酸，但可以由克隆的cDNA或基因組序列或其補(bǔ)體產(chǎn)生。分析探針一般將為至少20個(gè)核苷酸長，不過可以使用稍微更短的探針(14-17個(gè)核苷酸)。PCR引物是至少5個(gè)核苷酸長，優(yōu)選是15或更多個(gè)nt，更優(yōu)選是20-30個(gè)nt。當(dāng)靶向該基因的一小段區(qū)域進(jìn)行分析時(shí)，可以使用較短的多核苷酸。對于基因的總量分析來說，一個(gè)多核苷酸探針可以包含整個(gè)外顯子或更多。探針可以使用本領(lǐng)域中眾所周知的技術(shù)，如用一種酶、生物素、一種放射性核素、熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光、順磁性粒子等進(jìn)行標(biāo)記以提供一種可檢測的信號，它們可商購自許多來源，如俄勒岡州尤金的分子探針有限公司(Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg.)和伊利諾伊州阿靈頓海茲海特的安瑪西亞公司(Amersham Corp., Arlington Heights, 111)。
[0033]DNA分子被認(rèn)為具有“5’端”和“3’端”，因?yàn)閱魏塑账嵋砸欢ǚ绞椒磻?yīng)得到寡核苷酸或多核苷酸，這樣使得一個(gè)單核苷酸戊糖環(huán)的5’磷酸在一個(gè)方向上經(jīng)由磷酸二酯鍵附接到其鄰居的3’氧。因此，如果一個(gè)寡核苷酸或多核苷酸的一端的5’磷酸未連接到一個(gè)單核苷酸戊糖環(huán)的3’氧，那么它被稱為“5’端”，并且如果其3’氧未連接到下一個(gè)單核苷酸戊糖環(huán)的5’磷酸，那么稱為“3’端”。如在此所使用，一個(gè)核酸序列，即使是在一個(gè)更大的寡核苷酸或多核苷酸的內(nèi)部，也可以被認(rèn)為具有5’和3’端。在線性或環(huán)形DNA分子中，不連續(xù)的元件被稱為是“下游”或3’元件的“上游”或5’。這一術(shù)語反映了以下事實(shí):轉(zhuǎn)錄是沿DNA鏈以5’到3’的方式進(jìn)行的。
[0034]如在此所使用，術(shù)語“互補(bǔ)”或“互補(bǔ)性”是用于指通過堿基配對規(guī)則相關(guān)聯(lián)的多核苷酸(即，一個(gè)核苷酸序列)。舉例來說，對于序列“A-G-T”，與序列“T-C-A”互補(bǔ)?；パa(bǔ)性可以是“部分的”，其中僅一些核酸的堿基根據(jù)堿基配對規(guī)則是匹配的?；蛘?，在多個(gè)核酸之間可以存在“完全”或“全部”的互補(bǔ)性。核酸鏈之間的互補(bǔ)性程度對于核酸鏈之間雜交的效率和強(qiáng)度具有顯著影響。這在擴(kuò)增反應(yīng)以及取決于核酸之間的結(jié)合的檢測方法中特別重要。
[0035]如在此所使用，術(shù)語“雜交”是用于指互補(bǔ)核酸的配對。雜交和雜交的強(qiáng)度(即，核酸之間締合的強(qiáng)度)受到如核酸之間的互補(bǔ)程度、所涉及的條件的嚴(yán)格度、形成的雜交物的Tm以及核酸內(nèi)的G:C比率等因素的影響。在結(jié)構(gòu)內(nèi)包含互補(bǔ)核酸配對的單一分子被認(rèn)為是“自雜交的”。
[0036]“擴(kuò)增”是涉及到模板特異性的一種特殊的核酸復(fù)制情形。它與非特異性模板復(fù)制(即，具有模板依賴性但不取決于一個(gè)特定模板的復(fù)制)形成對比。模板特異性在此與復(fù)制的保真度(即，適當(dāng)多核苷酸序列的合成)和核苷酸(核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸)特異性相區(qū)別。模板特異性常常用“靶”特異性來描述。靶序列從試圖將其自其他核酸中分選出來的意義上講是“靶”。擴(kuò)增技術(shù)被設(shè)計(jì)成主要用于此分選。
[0037]如在此所使用，術(shù)語“聚合酶鏈反應(yīng)”(“PCR”)是指K.B.穆利斯(K.B.Mullis)美國專利號4，683，1954，683，202以及4，965，188 (以引用結(jié)合于此)的方法，它描述了一種在不進(jìn)行克隆或純化的情況下使基因組DNA混合物中一段靶序列的濃度增加的方法。這種用于擴(kuò)增靶序列的方法由以下各項(xiàng)組成:將大量過量的兩個(gè)寡核苷酸引物引入到包含了所希望的靶序列的DNA混合物中，隨后在一種DNA聚合酶的存在下進(jìn)行一種精確順序的熱循環(huán)。這兩個(gè)引物與它們在雙鏈靶序列中的對應(yīng)鏈互補(bǔ)。為了實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，使該混合物變性，并且接著使引物與靶分子內(nèi)的其互補(bǔ)序列退火。退火后，用一種聚合酶使這些引物延伸，從而形成一對新的互補(bǔ)鏈。變性、引物退火以及聚合酶延伸的步驟可以重復(fù)許多次(即，變性、退火以及延伸構(gòu)成一個(gè)“循環(huán)”;可以存在多個(gè)“循環(huán)”)以獲得較高濃度的所希望的靶序列的擴(kuò)增區(qū)段。所希望的靶序列的擴(kuò)增區(qū)段的長度是由引物關(guān)于彼此的相對位置決定的，并且因此，此長度是一個(gè)可控制的參數(shù)。由于該過程的重復(fù)特性，故該方法被稱為“聚合酶鏈反應(yīng)”(以下為“PCR”)。因?yàn)榘行蛄械乃Ｍ臄U(kuò)增區(qū)段變?yōu)榛旌衔镏械闹饕蛄?就濃度來說)，所以它們被稱為“PCR擴(kuò)增的”。
[0038]如在此所使用的術(shù)語“實(shí)時(shí)PCR”意思指，在反應(yīng)期間監(jiān)測由PCR測定發(fā)出的信號作為對每一個(gè)PCR擴(kuò)增循環(huán)期間擴(kuò)增子產(chǎn)生的指示(即，“實(shí)時(shí)的”)，與常規(guī)的PCR方法相對，在這些PCR方法中，測定信號是在PCR反應(yīng)的終點(diǎn)檢測的。實(shí)時(shí)PCR —般是基于熒光報(bào)告子的檢測和定量。該信號隨反應(yīng)中PCR產(chǎn)物的量呈正比例增加。通過記錄每一個(gè)循環(huán)下熒光發(fā)射的量，有可能在指數(shù)期的期間監(jiān)測PCR反應(yīng)，其中PCR產(chǎn)物量的首次顯著增加與靶模板的初始量相關(guān)。有關(guān)“實(shí)時(shí)PCR”的總體說明，參見迪赫(Dehee)等人，病毒學(xué)方法雜志(J.Virol.Meth.) 102:37-51 (2002);和奧德拉(Aldea)等人，臨床微生物學(xué)雜志(J.Clin.Microbiol.)40:1060-1062 (2002)(參考“LightCycler”，其中實(shí)時(shí)、動(dòng)力學(xué)定量允許在 PCR的對數(shù)線性期的期間進(jìn)行測量)。
[0039]利用PCR，有可能將基因組DNA中單一拷貝的一個(gè)特定靶序列擴(kuò)增到通過若干不同的方法可檢測的水平(例如，與經(jīng)過標(biāo)記的探針雜交；并入生物素化的引物隨后進(jìn)行抗生物素蛋白-酶結(jié)合物檢測；將如dCTP或dATP等32P標(biāo)記的脫氧核苷酸三磷酸并入擴(kuò)增的區(qū)段中)。除基因組DNA外，任何寡核苷酸或多核苷酸序列也可以用適當(dāng)?shù)囊锓肿蛹瘉頂U(kuò)增。確切地說，由PCR過程所產(chǎn)生的擴(kuò)增的區(qū)段本身就是后續(xù)PCR擴(kuò)增的有效模板。
[0040]如在此所使用，術(shù)語“PCR產(chǎn)物”、“PCR片段”及“擴(kuò)增產(chǎn)物”是指在PCR步驟變性、退火及延伸的兩個(gè)或更多個(gè)循環(huán)完成之后所得到的化合物的混合物。這些術(shù)語涵蓋一個(gè)或多個(gè)靶序列的一個(gè)或多個(gè)區(qū)段已經(jīng)擴(kuò)增的情形。
[0041]如在此所使用，術(shù)語“樣品”是以其最廣泛的意義使用的。在一種意義中，它意圖包括從任何來源獲得的試樣或培養(yǎng)物，以及生物和環(huán)境樣品。生物樣品可以從動(dòng)物(包括人類)獲得，并且涵蓋流體、固體、組織及氣體。生物樣品包括血液制品，如血漿、血清等。環(huán)境樣品包括環(huán)境材料，如表面物質(zhì)、土壤、水、晶體及工業(yè)樣品。然而，這些實(shí)例不應(yīng)解釋為限制了適用于本發(fā)明的樣品類型。
[0042]PE-PCR策略的總體說明
[0043]圖1示意性圖示了一項(xiàng)示例性PE-PCR實(shí)驗(yàn)是如何工作的。以步驟Ia開始，將包含了靶DNA模板(如一種微生物的基因組DNA)的樣品分析物與過量的量的融合探針混合。每一個(gè)融合探針由具有一個(gè)非細(xì)菌性序列的一個(gè)5’端部分繼之以具有與該靶DNA模板上的一個(gè)位點(diǎn)互補(bǔ)的一個(gè)序列的一個(gè)3’端部分組成。
[0044]在步驟Ib中，對樣品混合物進(jìn)行加熱以使DNA模板變性，以使得這些融合探針可以與這些靶DNA模板雜交(步驟2a)。
[0045]一旦這些融合探針與其期望的靶雜交，就將3’端外切核酸酶與克列諾DNA聚合酶的混合物(EK混合物)添加到該樣品中(步驟2b)。如步驟2a中所示，如果雜交位點(diǎn)不是在模板3’端的最后,那么將形成一個(gè)散損端(frayed end),因?yàn)樵撊诤咸结樀姆羌?xì)菌性部分將不會(huì)與該模板結(jié)合。
[0046] 在步驟3a中，通過3’端外切核酸酶將靶DNA的3’端的未結(jié)合部分(散損端)連同未結(jié)合的過量融合探針消化掉。在外切核酸酶消化之后，在融合探針上產(chǎn)生了一個(gè)5’突出端。[0047]在步驟3b中，克列諾DNA聚合酶接著將使融合探針鏈與模板鏈兩者在5’ 一 3’方向上延伸，由此形成帶鈍端的雙鏈模板。由融合探針延伸的鏈將具有非細(xì)菌性標(biāo)記序列位于其5’端處，而由靶DNA模板延伸的鏈將具有非細(xì)菌性標(biāo)記序列位于其3’端處。這一引物延伸步驟可以通過EK混合物的熱滅活來終止。
[0048]在這一階段，模板都已經(jīng)用有區(qū)別的序列標(biāo)記并且準(zhǔn)備好通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增。為了確保僅經(jīng)過標(biāo)記的模板擴(kuò)增，用于在步驟4中運(yùn)行PCR的引物集必須包括至少一個(gè)與該非細(xì)菌性標(biāo)記序列互補(bǔ)的正向引物(在圖1中稱為non-bac-F)以及一個(gè)與在該融合探針下游的靶DNA模板上的序列互補(bǔ)的反向引物(在圖1中稱為bac-R)。
[0049]以上略述的PE-PCR策略很簡單并且可以在單一反應(yīng)容器中執(zhí)行，無需進(jìn)行試劑的任何其他預(yù)處理。它提供了一種統(tǒng)包解決方案，解決了長期存在的內(nèi)源性細(xì)菌DNA污染的問題，并且與現(xiàn)有的PCR方案相容。基于這一策略，本發(fā)明人想出了不同的方法、系統(tǒng)、組合物及試劑盒。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，PE-PCR策略可以有利地結(jié)合任何分析程序使用以進(jìn)一步定量或表征PCR產(chǎn)物。這一策略的一些示例性應(yīng)用可以包括用于細(xì)菌、病毒或真菌感染的早期檢測的臨床試樣的分子診斷學(xué)。其他應(yīng)用可以包括法醫(yī)學(xué)應(yīng)用、生物武器檢測或考古學(xué)樣品定量，但不局限于此。
[0050]融合探針
[0051]一般說來，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的融合探針優(yōu)選是一種正向引物。它將具有兩種組分，一種編碼一個(gè)非細(xì)菌性序列，另一種編碼與靶DNA的一部分互補(bǔ)的序列。該非細(xì)菌性序列充當(dāng)標(biāo)記序列以與PCR試劑中的內(nèi)源性細(xì)菌污染物相區(qū)分。該互補(bǔ)序列充當(dāng)一個(gè)靶向序列，它在雜交條件下將該融合探針結(jié)合到靶DNA。
[0052]有關(guān)設(shè)計(jì)一種有效的融合探針的規(guī)則一般是本領(lǐng)域中已知的。該融合探針由在5’端處的非細(xì)菌性DNA序列和與微生物靶序列互補(bǔ)的序列組成。由于在PCR擴(kuò)增期間可能存在人類基因組DNA，故5’端的非細(xì)菌性DNA序列優(yōu)選不與人類基因組DNA序列互補(bǔ)。類似策略適用于與來自其他物種的樣品中細(xì)菌DNA檢測有關(guān)的應(yīng)用。3’端細(xì)菌DNA序列與微生物DNA中普遍存在的靶基因序列互補(bǔ)。3’-細(xì)菌序列的Tm是至少37°C并且最多95°C。弓丨物設(shè)計(jì)(如非發(fā)夾序列)的總體規(guī)則被應(yīng)用于序列選擇。
[0053]標(biāo)記序列可以是源自于一種非細(xì)菌來源的序列，或它可以是一種人工設(shè)計(jì)的序列。在一些優(yōu)選的實(shí)施例中，該標(biāo)記序列是一種病毒序列，優(yōu)選是源自于M13曬菌體的序列。
[0054]該靶序列可以是將融合探針結(jié)合到一個(gè)特定的靶模板的一種獨(dú)特序列，或?qū)⑷诤咸结樈Y(jié)合到廣泛范圍的微生物DNA的一種保守序列。在一些示例性實(shí)施例中，該靶序列優(yōu)選是來自16S rRNA基因的一種保守序列。
[0055]融合探針可以通過本領(lǐng)域中通常已知的任何方法制造，但不局限于化學(xué)合成。
[0056]檢測方法
[0057]以低豐度存在于樣品中的微生物DNA由于檢測方法和儀器的限制而難以檢測。使用標(biāo)準(zhǔn)PCR來檢測一份樣品中的低豐度DNA—般涉及到針對很多的嘈雜背景來選擇性擴(kuò)增靶DNA模板。通過將靶DNA模板復(fù)制到足夠大的數(shù)量，接著可以容易地對其進(jìn)行檢測。如以上所描述的融合探針提供了一種有效地區(qū)分靶DNA與背景噪聲和不希望的污染的方式，由此允許對靶DNA進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。一旦擴(kuò)增，則可以應(yīng)用多種分析工具來對擴(kuò)增的核酸產(chǎn)物進(jìn)行表征。
[0058]因此，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的用于檢測受試者中的微生物感染的方法一般將包括以下步驟:將融合探針添加到從該受試者取得的樣品中；使這些融合探針與該樣品中的微生物DNA雜交；將未雜交的融合探針和該微生物DNA的任何未結(jié)合的3’端部分去除；使這些融合探針的3’端和該微生物DNA延伸以形成呈雙鏈的引物延伸的模板；通過用一個(gè)引物集執(zhí)行一種PCR方法來對這些引物延伸的模板進(jìn)行擴(kuò)增，該引物集包括了具有與該融合探針的非細(xì)菌性序列互補(bǔ)的一個(gè)非細(xì)菌性序列的至少一個(gè)正向引物；并且對擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析以確定一種微生物的存在或不存在。
[0059]優(yōu)選地是，該樣品是從受試者的體液，如血液、尿液、腦脊髓液、唾液、痰液等取得的。從該受試者取得的樣品的類型不受特別地限制，但一般將對應(yīng)于懷疑該受試者罹患的臨床病狀的類型。舉例來說，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，該樣品是來自懷疑罹患細(xì)菌血癥的一位受試者的血液樣品。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，該樣品是來自懷疑罹患難以在體外培養(yǎng)的細(xì)菌感染(例如肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae))的一位受試者的腦脊髓液。
[0060]樣品的制備典型地需要從微生物中釋放出DNA。用于釋放/提取微生物DNA的方法一般是本領(lǐng)域中已知的并且可以有利地用于制備樣品。然而，取決于測定的應(yīng)用和具體目標(biāo)，這些制備步驟并非總是必需的。
[0061]融合探針與靶DNA的雜交一般是通過以下方式實(shí)現(xiàn):首先將樣品加熱到高于靶DNA的熔解溫度(Tm)以使得它們變性成單鏈的DNA，并且隨后逐漸地冷卻到低于Tm以使結(jié)合和退火發(fā)生。適合的雜交條件也是本領(lǐng)域中已知的并且可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員常規(guī)地確定。
[0062]過量融合探針和靶DNA的3’端未結(jié)合部分的去除可以通過3’外切核酸酶實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，該3’外切核酸酶是大腸桿菌外切核酸酶I。也可以適合地使用其他3’外切核酸酶。
[0063]模板的延伸可以通過使用5’到3’聚合酶來實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，使用了5’到3’克列諾聚合酶。
[0064]為方便起見，3’外切核酸酶和3’到5’聚合酶可以按單一混合物(EK混合物)的形式提供。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，外切核酸酶與聚合酶的最佳比率將取決于融合探針的設(shè)計(jì)以及所使用的具體外切核酸酶和聚合酶。這些比率可以通過常規(guī)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定，并且應(yīng)優(yōu)選地在臨床環(huán)境中開展該檢測方法之前進(jìn)行。為了終止外切核酸酶和聚合酶的活性，可以添加淬滅劑，或可以簡單地將樣品加熱以使這些酶滅活。
[0065]PCR方法優(yōu)選為使用可商購的Taq DNA聚合酶和一組引物進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)PCR，這些引物包括了具有與融合探針的標(biāo)記序列互補(bǔ)的一個(gè)序列的至少一個(gè)正向引物。也可以適合地使用其他常規(guī)PCR方案，只要該方案與引物延伸的模板相容即可。用于執(zhí)行這些常規(guī)PCR的方法一般是本領(lǐng)域中已知的并且可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員調(diào)適成與本發(fā)明的PE-PCR策略一起使用。舉例來說，還可以 使用實(shí)時(shí)PCR同時(shí)地進(jìn)行引物延伸的模板的擴(kuò)增和微生物DNA豐度的定量。
[0066]最后但并非最不重要的是，可以通過本領(lǐng)域中已知的許多常規(guī)分析方法對擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析以表征并鑒別其起源。舉例來說，可以將熔解曲線分析應(yīng)用于擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物以生成一個(gè)熔解曲線型式。來自不同微生物的DNA因?yàn)槠湎喈惖暮塑账岷慷话銓⒕哂幸环N獨(dú)特的熔解曲線型式。這些熔解曲線型式可以充當(dāng)一種“指紋”用于鑒別一份樣品的起源。
[0067]可以使用的其他分析方法包括(但不限于)測序、微陣列測定、質(zhì)譜法、熔解曲線(包括高分辨率熔解分析)、變性的HPLC、毛細(xì)管電泳、瓊脂糖和/或聚丙烯酰胺凝膠電泳、異源雙鏈體遷移率測定(HMA)以及NMR光譜法。
[0068]系統(tǒng)和試劑盒
[0069]為了執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的PE-PCR方法，除用于常規(guī)或?qū)崟r(shí)PCR的試劑之外，還需要融合探針和用于去除過量探針以及使雜交的探針/模板延伸的試劑。因此，本發(fā)明的試劑盒將在一個(gè)常規(guī)包裝中(如在一個(gè)小瓶或一個(gè)藥包中，但不局限于此)包括多個(gè)預(yù)先制造的融合探針以及降解/延伸試劑(例如，EK混合物)。該試劑盒可以另外包括有關(guān)指導(dǎo)其使用的說明指南或用于促進(jìn)PCR擴(kuò)增的另外的試劑。
[0070]為了促進(jìn)高通量分析，還可以構(gòu)造自動(dòng)化系統(tǒng)來執(zhí)行本發(fā)明的檢測方法。圖6示出了本發(fā)明的示例性系統(tǒng)的示意圖。
[0071]參看圖6，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的系統(tǒng)具有一個(gè)用于接收有待分析的樣品的樣品接收單元1，一個(gè)配置成將不同試劑添加到樣品中并維持適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件的處理單元2。舉例來說，微生物DNA可以從樣品儲(chǔ)集器3提取到反應(yīng)室4和5中，向這些反應(yīng)室中，可以添加融合探針和EK混合物，由此形成引物延伸的模板。接著，可以在PCR室6中通過PCR對引物延伸的模板進(jìn)行擴(kuò)增。接著，PCR反應(yīng)室可以被轉(zhuǎn)送到一個(gè)樣品分析單元7。
[0072]該處理單元可 以按多種不同的方式配置。實(shí)施該處理單元的示例性構(gòu)件可以是一系列微計(jì)算機(jī)控制的致動(dòng)器，或一種微流體裝置。該分析單元也可以取決于有待應(yīng)用的具體分析模式而以許多方式實(shí)施。舉例來說，它可以是一個(gè)質(zhì)譜儀、一個(gè)DNA測序裝置、一個(gè)毛細(xì)管電泳裝置或一個(gè)熔解溫度分析設(shè)備。優(yōu)選地是，本發(fā)明的系統(tǒng)是由如來自貝克頓迪肯森(Becton Dickinson)(新澤西州富蘭克林湖(Franklin Lakes, NJ))的 BD Max? 系統(tǒng)等現(xiàn)有的自動(dòng)化PCR系統(tǒng)改造而成。
[0073]還可以使用下架(off-shelf)的組件組裝非自動(dòng)化系統(tǒng)。舉例來說，在一個(gè)示例性實(shí)施例中，樣品處理可以手工地或在一個(gè)單獨(dú)的樣品處理/制備單元中執(zhí)行。PCR反應(yīng)可以使用一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的熱循環(huán)儀，如由羅氏診斷公司(Roche Diagnostics Corporation)(印第
安納州印第安納波利斯(Indianapolis, IN))制造的LightCycler—? 480系統(tǒng)來執(zhí)行。物種
鑒別分析可以通過高分辨率熔解曲線分析，使用LightScannef:]2系統(tǒng)(猶他州鹽湖城的愛達(dá)荷技術(shù)公司(Idaho Technologies, Salt Lake City, Utah))執(zhí)行。
[0074]為了進(jìn)一步幫助讀者完全并且完整地理解本發(fā)明，提供以下說明性具體實(shí)例。
[0075]實(shí)例
[0076]通過PE-PCR進(jìn)行低豐度細(xì)菌的廣譜檢測
[0077]若干“低DNA (low-DNA)”和熱啟動(dòng)(HotStart) Taq DNA聚合酶是從商業(yè)來源可獲得的。作為一個(gè)起始點(diǎn)，首先檢查4種可商購的低DNA或熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶以證實(shí)它們不適合使用通用引物集p201-pl370進(jìn)行細(xì)菌DNA的廣譜擴(kuò)增。
[0078]利用這些聚合酶，執(zhí)行經(jīng)典的PCR來對包含IOOfg的代表性金黃色葡萄球菌細(xì)菌基因組DNA (相當(dāng)于20個(gè)細(xì)菌基因組拷貝)的一份樣品和一份“無模板對照(NTC)”進(jìn)行擴(kuò)增。如圖2中所示，在該NTC反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)了大量的擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物，由此使其與該樣品反應(yīng)難以區(qū)分。這一結(jié)果確定了可商購的Taq DNA聚合酶和PCR試劑的純度不足以用于在通常需要呈飛克水平的檢測限的臨床環(huán)境中進(jìn)行廣譜細(xì)菌DNA檢測。
[0079]作為對PE-PCR策略的一種原理循證，通過該策略對連續(xù)稀釋的金黃色葡萄球菌基因組DNA進(jìn)行分析。具體地說，選擇金黃色葡萄球菌的翻譯延長因子Tu (Tuf)基因作為PE-PCR擴(kuò)增的靶。設(shè)計(jì)出在5’端具有M13正向引物并且在3’端具有Tuf序列(登錄號AF298796)的一種融合探針(M13_TstaG422)(表 I)。在使 M13_TstaG422 與模板 DNA 退火之后，將EK混合物添加到該反應(yīng)中以使未結(jié)合的融合探針降解并啟始引物延伸。然后，使用M13和對應(yīng)于Tuf基因組序列的下游引物TstaG765對弓丨物延伸產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果是，用50fg的細(xì)菌DNA (相當(dāng)于樣品中的10個(gè)金黃色葡萄球菌基因組拷貝)獲得了 391bp的單一 PCR產(chǎn)物。相比之下，在該NTC對照中未觀測到PCR產(chǎn)物(圖3A)。這一結(jié)果指示，我們的PE-PCR對于低到飛克范圍仍是準(zhǔn)確并且敏感的。
[0080]為了模擬PCR試劑和酶的細(xì)菌DNA污染，將IOOfg的金黃色葡萄球菌基因組DNA對應(yīng)地?fù)饺隕K混合物和Taq DNA聚合酶-PCR反應(yīng)混合物中。只有當(dāng)在引物延伸期間存在模板細(xì)菌DNA時(shí)，才產(chǎn)生大量的PE-PCR產(chǎn)物(圖3B，泳道I)。在該NTC反應(yīng)中(圖3B，泳道5)或當(dāng)在不存在M13引物的情況下進(jìn)行PCR時(shí)(圖3B，泳道2)，沒有產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。很明顯，PE-PCR促進(jìn)了模板細(xì)菌DNA的擴(kuò)增，而未共擴(kuò)增摻入的細(xì)菌DNA。
[0081 ] EK混合物或PCR反應(yīng)混合物(圖3B，泳道3和4)中摻入的DNA的存在是通過金黃色葡萄球菌種類特異性PCR核實(shí)的(圖3B，下圖)。這些數(shù)據(jù)指示了 PCR試劑和酶中的污染性細(xì)菌DNA對于模板細(xì)菌DNA的特異性擴(kuò)增沒有干擾，并且提供了對于我們的PE-PCR策略的原理循證。
[0082]為了證實(shí)PE-PCR在細(xì)菌DNA的廣譜擴(kuò)增中的可行性，我們設(shè)計(jì)了用于進(jìn)行16S rRNA基因的廣譜PE-PCR的一種通用的融合探針M13-16S-p201F，該16S rRNA基因在不同細(xì)菌種類間是高度保守的。在不應(yīng)用任何去污染預(yù)處理的情況下，使用融合探針M13-16S-p201F、M13正向引物、pl370反向引物(表1)以及慣常使用的熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶(普羅泰克公司(Protech))對連續(xù)稀釋的金黃色葡萄球菌基因組DNA進(jìn)行廣譜PE-PCR。獲得了 237bp的單一 PCR產(chǎn)物，并且通過PE-PCR可以檢測到少到IOfg的模板DNA，相當(dāng)于2個(gè)金黃色葡萄球菌基因組DNA拷貝。在該NTC反應(yīng)中未觀測到PCR產(chǎn)物(圖3C)。因此，來自多種臨床上重要的細(xì)菌種類的基因組DNA已經(jīng)得到了測試，并且被顯示是通過廣譜PE-PCR可擴(kuò)增的。
[0083]我們還通過將IOOfg的金黃色葡萄球菌基因組DNA對應(yīng)地?fù)饺隕K混合物和TaqDNA聚合酶-PCR混合物模擬了細(xì)菌DNA污染。如所預(yù)期的，在IOOfg的模板細(xì)菌DNA的存在下獲得了陽性PE-PCR信號(圖3D，泳道1)，而在人工污染條件和NTC反應(yīng)中未產(chǎn)生PCR產(chǎn)物(圖3D，泳道2-4)。再一次，在反應(yīng)混合物中摻入的DNA的存在是通過金黃色葡萄球菌種類特異性PCR核實(shí)的(圖3D，下圖)。這些數(shù)據(jù)一起證實(shí)了我們的PE-PCR策略即使在PCR試劑引起的內(nèi)源性污染的存在下也能夠進(jìn)行細(xì)菌DNA的廣譜檢測。這是到目前為止未能實(shí)現(xiàn)的一項(xiàng)創(chuàng)舉。
[0084]為了探索我們的策略的檢測限，對范圍從IOOfg到IOfg的不同濃度的金黃色葡萄球菌基因組DNA進(jìn)行廣譜PE-PCR。對于100、50、25以及IOfg的模板細(xì)菌DNA，獲得陽性PCR信號的概率對應(yīng)地為100%、95%、65%以及55% (n=20)。因此，易于執(zhí)行廣譜PE-PCR以在不損害檢測限和特異性的情況下對模板細(xì)菌DNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增。
[0085]通過結(jié)合PE-PCR與熔解曲線分析進(jìn)行特異性檢測
[0086]為了進(jìn)一步增強(qiáng)我們的PE-PCR策略的能力，我們修改了該方案，將實(shí)時(shí)PCR和HRMA并入到了以上描述的廣譜PE-PCR檢測方法中。為進(jìn)行證實(shí)，在HRM染料LCGreen Iplus的存在下，對連續(xù)稀釋的金黃色葡萄球菌基因組DNA進(jìn)行廣譜實(shí)時(shí)PE-PCR。如由擴(kuò)增曲線所揭露的，IOfg的模板DNA引起了擴(kuò)增子特異性擴(kuò)增并且在NTC反應(yīng)中無PCR產(chǎn)物(圖4A和4B)。金黃色葡萄球菌的PCR擴(kuò)增子中獨(dú)特核苷酸的含量產(chǎn)生了一個(gè)明顯不同的微分曲線，而對于NTC反應(yīng)，未觀測到熔解峰。對于100、50、25以及IOfg的模板DNA，獲得陽性PCR信號的概率對應(yīng)地為100%、90%、50%以及30% (n=10)。
[0087]為了比較，用DNase I對PCR試劑進(jìn)行預(yù)處理，隨后使用引物對p201和pl370進(jìn)行模板金黃色葡萄球菌基因組DNA的廣譜PCR擴(kuò)增。如由擴(kuò)增和微分曲線(圖4C)所揭露的，DNase I的添加顯著抑制了 PCR擴(kuò)增。在IU的DNase下，內(nèi)源污染性DNA未得到完全消除。將DNase I的濃度增加到2.5U引起了進(jìn)一步的PCR抑制，并且妨礙了針對細(xì)菌DNA的廣譜PCR擴(kuò)增的檢測限。
[0088]為了進(jìn)一步驗(yàn)證我們的策略，我們應(yīng)用了廣譜實(shí)時(shí)PE-PCR來分析另外的12種常見細(xì)菌種類(表2)。使用微分曲線和熔解溫度對PCR產(chǎn)物進(jìn)行HRMA易于區(qū)分大多數(shù)的細(xì)菌種類(圖5和表2)。使用這一方法，可以在很大程度上消除模板的測序，由此提供更多的節(jié)省和便利。
[0089]材料和方法
[0090]材料
[0091]外切核酸酶I和克列諾DNA聚合酶是購自新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室(New EnglandBiolab)(馬薩諸塞州伊普斯維奇(Ipswich, MA))。LCGreen I plus試劑組和HR-1儀器是購自愛達(dá)荷技術(shù)公司(猶他州鹽湖城)。熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶是購自普羅泰克公司(臺(tái)灣臺(tái)北(Taipei, Taiwan))?？焖贌釂?dòng)(Fast Hot Start)Taq DNA聚合酶是購自卡帕生物系統(tǒng)公司(ΚΑΡΑ Biosystems)(馬薩諸塞州沃本(Woburn, MA))。“低DNA”Taq DNA聚合酶是購自寶生物公司(Takara)(日本山內(nèi)(Shiga, Japan))。ULTRATOOLS Taq DNA聚合酶是購自生物工具有限公司(Biotools Inc.)(西班牙馬德里(Madrid, Spain))。LightCycler毛細(xì)管是購自羅氏應(yīng)用科技公司(Roche Applied Science)(印第安納州印第安納波利斯)。DNase I是購自普洛麥格公司(Promega)(威斯康星州麥迪遜(Madison, WI))。細(xì)菌菌株是如先前所描述的臨床分離株(參考文獻(xiàn)11)。引物和融合探針序列的完整清單示于表1中。
[0092]細(xì)菌基因組DNA的分離
[0093]將整夜培養(yǎng)的細(xì)菌懸浮液(4ml)在10，OOOrpm下離心10分鐘，并且將沉淀物再懸浮于 4ml 的溶液 1 緩沖液(25mM Tris-HCl，ρΗ7.5、50mM 葡萄糖、1OmM EDTA 以及 40 μ g/ml溶葡萄球菌素)中。將細(xì)菌懸浮液在37°C下孵育2小時(shí)，并將包含280 μ 1的20%SDS以及40 μ 1的蛋白酶K (10mg/ml)和RNaseA (10mg/ml)的反應(yīng)緩沖液添加到該細(xì)菌懸浮液中，并在55°C下孵育整夜。在苯酚/氯仿萃取后，將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)清潔的微量離心管中，并且用乙醇使DNA 沉淀。在用75%的乙醇洗滌兩次后，將DNA沉淀物再懸浮于水中以進(jìn)行定量和后續(xù)的PCR測定。[0094]PE-PCR
[0095]常規(guī)的PE-PCR是在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)執(zhí)行的。簡單地說，退火步驟由一種20 μ I的退火混合物組成，該混合物包含8 μ I的Η20、5 μ I的融合探針(2ng/ μ 1)>5μ I指定濃度的細(xì)菌基因組DNA以及2 μ I的IOX PCR緩沖液。將反應(yīng)混合物加熱到95°C，保持5分鐘，并保持在37°C。然后，將由3μ I的&0、1“ I的IOX PCR緩沖液、5 μ I的dNTP (2πιΜ)、1μ1的克列諾DNA聚合酶(5U/y I)以及I μ I的外切核酸酶I (20υ/μ I)組成的11 μ I的EK混合物添加到退火混合物中并且在37°C下孵育2小時(shí)。在80°C下熱滅活20分鐘之后，通過添加14 μ I的&0、2“ I的IOX PCR緩沖液、I μ I的正向引物Μ13 (5 μ Μ)、I μ I的反向引物(5 μ Μ)以及1μ I的熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶(5U/μ I)使反應(yīng)混合物達(dá)到50 μ I。PCR循環(huán)條件是I個(gè)循環(huán)的在95°C下10分鐘、45個(gè)循環(huán)的在95°C下15秒，以及在60°C下I分鐘。對于摻入的金黃色葡萄球菌基因組DNA的檢測，通過特異性擴(kuò)增金黃色葡萄球菌基因組DNA片段的SA-F和SA-R的引物集(表1)來替換M13和該反向引物(參考文獻(xiàn)43)。
[0096]對于實(shí)時(shí)PE-PCR，在融合探針結(jié)合和引物延伸期間，將該反應(yīng)按比例縮減至8μ I。然后，通過添加1.5μ I ^Η20,2μ I的IOX牛血清白蛋白(BSA)、2y I的IOX LCGreenI plus、0.8μ I的IOX PCR緩沖液、0.4μ I的正向引物Μ13 (5 μ Μ)、0.4 μ I的反向引物(5μΜ)以及0.5μ I的熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶(5U/μ I)使反應(yīng)混合物達(dá)到20 μ I并將其轉(zhuǎn)移到毛細(xì)管中。實(shí)時(shí)PCR是使用LightCyclerl.5儀器執(zhí)行的，并且循環(huán)條件是在20°C /s的轉(zhuǎn)變速率下，I個(gè)循環(huán)的在95°C下10分鐘，45個(gè)循環(huán)的在95°C下15秒，以及在60°C下I分鐘。
[0097]高分辨率熔解曲線采集和分析
[0098]將包含擴(kuò)增產(chǎn)物的玻璃毛細(xì)管轉(zhuǎn)移到HR-1儀器(愛達(dá)荷技術(shù)公司)中，并以
0.30C /s的速率在64°C _96°C下使PCR片段熔解。用HR-1軟件對熔解曲線圖進(jìn)行評估，該軟件利用了熒光標(biāo)準(zhǔn)化和溫度覆蓋來重疊在0%-20%熒光度下的曲線。
[0099]DNase I預(yù)處理以用于去污染和廣譜PCR擴(kuò)增[0100]在37 °C 下，將包含了 2μ I 的 IOX BSA, 2 μ I 的 dNTP (2πιΜ)、2μ I 的 IOXLCGreenI plus、lyl的IOX PCR緩沖液、0.5μ I的熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶(5U/μ I)的PCR試劑與DNase I (IU或2.5U) 一起孵育30分鐘。在85°C下對DNase I進(jìn)行熱滅活15分鐘之后，通過添加1μ I的IOX PCR緩沖液、2 μ I的正向引物ρ201 (5 μ Μ)、2 μ I的反向引物ρ1370(5 μ Μ)以及5 μ I的模板DNA使反應(yīng)混合物達(dá)到20 μ I。PCR循環(huán)條件是在20°C /s的轉(zhuǎn)變速率下，I個(gè)循環(huán)的在95°C下10分鐘、45個(gè)循環(huán)的在95°C下15秒，以及在60°C下I分鐘。
[0101]示例性診斷試劑盒
[0102]在一種優(yōu)選的應(yīng)用中，可以使用PE-PCR作為臨床診斷測定的基礎(chǔ)以針對細(xì)菌血癥或敗血病進(jìn)行測試。下表列出了可以被納入這種診斷試劑盒中的試劑:
[0103]
【權(quán)利要求】
1.一種用于選擇性擴(kuò)增一個(gè)樣品中的一種或多種靶微生物DNA的方法，包括: 使多個(gè)融合探針與所述靶微生物DNA雜交，其中所述融合探針各自由具有一個(gè)非細(xì)菌性DNA序列的一個(gè)5’端部分和具有與所述靶微生物DNA的一部分互補(bǔ)的一個(gè)序列的一個(gè)3’端部分組成； 將未雜交的融合探針和該靶微生物DNA的任何未結(jié)合的3’端部分去除； 使這些融合探針的3’端和該靶微生物DNA延伸，以形成呈雙鏈的引物延伸的模板；并且 執(zhí)行一種PCR方法以用一個(gè)引物集選擇性擴(kuò)增這些引物延伸的模板，該引物集包括具有與這些融合探針的非細(xì)菌性序列互補(bǔ)的一個(gè)非細(xì)菌性序列的至少一種引物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該去除步驟和該延伸步驟包括添加外切核酸酶I與克列諾DNA聚合酶的一種混合物。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中這些融合探針的所述5’端部分的非細(xì)菌性序列選自一種病毒DNA序列或一種人工設(shè)計(jì)的序列。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中這些融合探針的所述3’端部分的序列與16SrRNA基因序列的一個(gè)保守部分是互補(bǔ)的。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該祀微生物DNA選自一種細(xì)菌、一種真菌或一種病毒的基因組DNA。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述PCR方法選自標(biāo)準(zhǔn)PCR或?qū)崟r(shí)PCR。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品是針對細(xì)菌DNA污染未加處理的。
8.一種用于檢測一位受試者中的微生物感染的方法，包括: 將多個(gè)融合探針添加到該受試者的一個(gè)樣品中，其中所述融合探針各自由具有一個(gè)非細(xì)菌性DNA序列的一個(gè)5’端部分和具有與一種靶微生物DNA的一部分互補(bǔ)的一個(gè)序列的一個(gè)3’端部分組成； 使這些融合探針與該樣品中的微生物DNA雜交； 將未雜交的融合探針和該微生物DNA的任何未結(jié)合的3’端部分去除； 使這些融合探針的3’端和該微生物DNA延伸，以形成呈雙鏈的引物延伸的模板； 通過用一個(gè)引物集執(zhí)行一種PCR方法來對這些引物延伸的模板進(jìn)行擴(kuò)增，該引物集包括具有與該融合探針的非細(xì)菌性序列互補(bǔ)的一個(gè)非細(xì)菌性序列的至少一種正向引物；并且 對這些擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析以確定一種微生物的存在或不存在。
9.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述樣品是針對細(xì)菌DNA污染未加處理的。
10.如權(quán)利要求9所述的方法,其中所述一種或多種微生物選自一種細(xì)菌、一種真菌或一種病毒。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其中這些融合探針的所述5’端部分的非細(xì)菌性序列選自一種病毒序列或一種人工設(shè)計(jì)的序列。
12.如權(quán)利要求9所述的方法，其中這些融合探針的所述3’端部分的序列與16SrRNA基因序列的一個(gè)保守部分是互補(bǔ)的。
13.一種用于由一個(gè)樣品中的靶微生物DNA產(chǎn)生引物延伸的DNA模板以通過PCR方法進(jìn)行選擇性擴(kuò)增的融合探針，所述融合探針由以下各項(xiàng)組成: 具有一個(gè)非細(xì)菌性序列的一個(gè)5’端部分；和具有與該靶微生物樣品的一部分互補(bǔ)的一個(gè)序列的一個(gè)3’端部分。
14.如權(quán)利要求13所述的融合探針，其中所述非細(xì)菌性序列是一種病毒序列。
15.如權(quán)利要求13所述的融合探針，其中所述非細(xì)菌性序列是M13正向引物序列。
16.如權(quán)利要求13所述的融合探針，其中該融合探針的所述3’端部分的序列與該16SrRNA基因的一個(gè)保守序列是互補(bǔ)的。
17.一種用于由靶微生物DNA產(chǎn)生引物延伸的DNA模板以進(jìn)行選擇性PCR擴(kuò)增和檢測的試劑盒，包括: 多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求13所述的融合探針。
18.如權(quán)利要求17所述的試劑盒，另外包括3’到5’外切核酸酶與克列諾DNA聚合酶的一種混合物。
19.一種用于檢測一個(gè)樣品中的祀微生物的系統(tǒng)，包括: 一個(gè)用于接收該樣品的樣品接收單元； 一個(gè)樣品處理單元；以及 一個(gè)用于分析該樣品的樣品分析單元， 其中所述樣品處理單元是一種計(jì)算機(jī)控制的單元，該單元被配置成執(zhí)行以下步驟:將多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求13所述的融合探針添加到該樣品中，并維持一種反應(yīng)條件以允許這些融合探針與該樣品中的微生物DNA雜交； 添加一種降解/延伸試劑，從而: 將未雜交的融合探針和該雜交的靶微生物DNA的未結(jié)合的3’端部分去除，并且使這些雜交的融合探針的3’端和該靶微生物DNA以3’到5’方向延伸，從而產(chǎn)生呈雙鏈的引物延伸的模板； 添加PCR試劑并且維持反應(yīng)條件以執(zhí)行這些引物延伸的模板的PCR擴(kuò)增，其中所述PCR試劑包括具有與這些融合探針的非細(xì)菌性序列互補(bǔ)的一個(gè)序列的至少一種引物；并且將該經(jīng)過處理的樣品轉(zhuǎn)送到該分析單元進(jìn)行分析。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的系統(tǒng)，其中所述分析單元是一種高分辨率熔解曲線分析單元。
【文檔編號】C12Q1/68GK103917660SQ201280031294
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2012年5月18日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月19日
【發(fā)明者】曾慶平, 張世申 申請人:丹尼克博投資有限公司, 曾慶平