基于探針的核酸檢測的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于通過以下檢測靶核苷酸序列的方法：用核苷酸標(biāo)簽將核苷酸序列加標(biāo)簽，提供包含調(diào)節(jié)序列和核苷酸標(biāo)簽識別序列的具有解鏈溫度Tm1的探針寡核苷酸；在多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)中將探針寡核苷酸摻入加標(biāo)簽的多核苷酸，提供包含與調(diào)節(jié)序列至少部分互補(bǔ)的序列區(qū)段的具有解鏈溫度Tm2的調(diào)節(jié)寡核苷酸，使用探針寡核苷酸作為引物在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增加標(biāo)簽的靶核酸序列，并檢測該擴(kuò)增產(chǎn)物；其中Tm1和Tm2高于與多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)相關(guān)的退火溫度。
【專利說明】基于探針的核酸檢測
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年5月9日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?1/484，198的優(yōu)先權(quán)，通過引用將其全部內(nèi)容并入本文。
[0003]作為ASCII文本文件提交的“序列表”、表格或計(jì)算機(jī)程序列表附件的引用
[0004]機(jī)器格式IBM-PC、MS-Windows操作系統(tǒng)，2012年5月9日創(chuàng)建的、13，706字節(jié)、被寫入文件85665-838605_ST25.TXT的序列表，在此通過引用整體被并入用于所有目的。
發(fā)明領(lǐng)域
[0005]本發(fā)明涉及適于核苷酸多態(tài)性(SNP)基因分型和其他基因分析的基于PCR的檢測系統(tǒng)。
[0006]發(fā)明背景
[0007]熒光報(bào)告物分子-猝滅劑分子對已被摻入探針寡核苷酸上以便基于被分開或置于彼此最小的猝滅距離內(nèi)的熒光報(bào)告物分子和猝滅劑分子監(jiān)測生物事件。例如，已開發(fā)了探針，其中由于報(bào)告物分子從猝滅劑分子的分開，報(bào)告物分子熒光的強(qiáng)度增加。還開發(fā)了因?yàn)殁鐒┍灰肱c報(bào)告物分子接近而失去它們的熒光的探針。這些報(bào)告物-猝滅劑分子對探針已被用于通過監(jiān)測由報(bào)告物分子產(chǎn)生的熒光信號的出現(xiàn)或消失而監(jiān)測雜交分析和核酸擴(kuò)增反應(yīng)，特別地聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。
[0008]關(guān)于包含報(bào)告物-猝滅劑分子對的探針的一個(gè)特別重要的應(yīng)用是它們在核酸擴(kuò)增反應(yīng)，諸如聚合·酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中檢測靶核酸序列的存在和擴(kuò)增的用途。通常，核酸擴(kuò)增技術(shù)為基因檢測和DNA分析打開了廣泛的新方法。Arnheim 和 Erlich, Ann.Rev.Biochem.，61:131-156 (1992)。 特別地，PCR 已成為至關(guān)重要的研究工具，在例如，克隆、基因表達(dá)分析、DNA測序、基因作圖和藥物發(fā)現(xiàn)中應(yīng)用。Arnheim 和 Erlich, Ann.Rev.Biochem.，61:131-156 (1992)；Gilliland 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.87:2725-2729 (1990) ；Bevan 等人，PCRMethods and Applications, 1:222-228 (1992) ；Green 等人，PCR Methods andApplications, 1:77-90(1991) ；Blackwell 等人，Science, 250:1104-1110(1990)。
[0009]因此，對當(dāng)與靶核酸序列雜交和未雜交時(shí)呈現(xiàn)可區(qū)別的熒光特征的探針存在需求。對其中報(bào)告物分子和猝滅劑分子被定位在檢測對上如此以致猝滅劑能夠有效猝滅報(bào)告物分子的熒光的探針存在另外的需求。對被有效合成的探針存在另外的需求。對檢測方法存在另外的需求，其中少數(shù)合成的探針可被用于大量的分析。對具有高特異性的檢測方法存在又另外的需求。對報(bào)告物分子和猝滅劑分子定位在檢測對上如此以致當(dāng)序列特異性雜交時(shí)報(bào)告物和猝滅劑分子足夠靠近彼此的基于接近的猝滅存在另外的需求。
[0010]本發(fā)明的探針和方法提供了這些和另外的目的。
[0011]發(fā)明概述
[0012]在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于檢測靶核苷酸序列的方法，包括:
[0013]a)用核苷酸標(biāo)簽序列將所述靶核苷酸序列加標(biāo)簽，從而制備加標(biāo)簽的靶核酸序列；
[0014]b)提供包含與所述核苷酸標(biāo)簽序列互補(bǔ)的核苷酸標(biāo)簽識別序列和所述核苷酸標(biāo)簽識別序列的5’端的調(diào)節(jié)序列的探針寡核苷酸，其中所述探針寡核苷酸包含第一標(biāo)記物并具有解鏈溫度Tml ；
[0015]c)使用所述探針寡核苷酸作為引物在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增所述加標(biāo)簽的靶核酸序列，其中所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)由退火溫度Ta表征；
[0016]其中在包含與所述調(diào)節(jié)序列互補(bǔ)的序列區(qū)段的調(diào)節(jié)寡核苷酸存在下實(shí)施該P(yáng)CR擴(kuò)增反應(yīng)，其中所述調(diào)節(jié)寡核苷酸包含第二標(biāo)記物并具有解鏈溫度Tm2 ;和
[0017]d)檢測所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物；
[0018]其中所述第一標(biāo)記物和所述第二標(biāo)記物構(gòu)成熒光報(bào)告物/猝滅劑對；且其中Tml和Tm2 二者都高于Ta。
[0019]在實(shí)施方案中，使用PCR反應(yīng)將標(biāo)簽序列摻入加標(biāo)簽的靶核酸序列。
[0020]在實(shí)施方案中，核苷酸標(biāo)簽識別序列與核苷酸標(biāo)簽序列完全互補(bǔ)。在實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)寡核苷酸包含與調(diào)節(jié)序列完全互補(bǔ)的序列區(qū)段。在實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)寡核苷酸具有15-45個(gè)核苷酸范圍的長度。在實(shí)施方案中，Ta呈55°C-62°C的范圍。在實(shí)施方案中，Ta呈60°C-64°C的范圍。在實(shí)施方案中，Ta呈60°C-62°C的范圍。在一些實(shí)施方案中，Tml比退火溫度(Ta)高至少25°C。在一些實(shí)施方案中，Tm2比退火溫度(Ta)高至少2°C、至少3°C、至少4°C、至少5°C、或至少 10°C。在一些實(shí)施方案中，Tm2呈60°C-75°C的范圍。在一些實(shí)施方案中，通過式:Tm(°C )=4(G+C)+2 (A+T)計(jì)算Tml和Tm2。
[0021]在一些實(shí)施方案中，在大于500nL或大于lyL的反應(yīng)體積中實(shí)施PCR擴(kuò)增反應(yīng)。例如，在一些實(shí)施方案中，在包含96-1536孔的多孔板中實(shí)施PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，Ta為約57°C。
[0022]在一些實(shí)施方案中，在小于100nL的反應(yīng)體積中實(shí)施PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，在微流控裝置(microfluidic device)中實(shí)施PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，Ta 為約 60°C。
[0023]在某些實(shí)施方案中，Ta是生產(chǎn)(yielding)退火溫度。在一些實(shí)施方案中，PCR擴(kuò)增反應(yīng)包含在退火溫度(Ta)下的至少20個(gè)循環(huán)。
[0024]附圖簡述
[0025]圖1說明使用本分析用于基因分型。T=靶序列或互補(bǔ)物；Χ、Υ=標(biāo)簽序列或互補(bǔ)物，Rg、Re=報(bào)告物，Q=猝滅劑，Z,w=調(diào)節(jié)序列或互補(bǔ)物。
[0026]詳述
[0027]A.定義
[0028]除非另有說明，如以下闡明的定義權(quán)利要求和說明書中使用的術(shù)語。為了清楚，特定地定義這些術(shù)語，但所有的定義都與本領(lǐng)域技術(shù)人員將如何理解這些術(shù)語一致。
[0029]除非上下文另有清楚規(guī)定，還指出，如本文和所附權(quán)利要求中所用的，單數(shù)形式“一(a)”、“一(an)”和“該(the)”包括復(fù)數(shù)所指。因此，例如，提及“一個(gè)細(xì)胞”是提及一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等同物。
[0030]如本文所用的，“固定的”指不溶的或包含、附著至或可操作地絡(luò)合至不可溶的、部分不可溶的、膠質(zhì)的、粒子的、分散的、懸浮的和/或脫水的物質(zhì)或包含或附著至固體支持體的分子或固相。
[0031]如本文所用的，“固體支持體”指包含固定基質(zhì)的組合物，諸如但不限于，不溶的物質(zhì)、固相、表面、基底、層、涂層(coating)、織造纖維或非織造纖維、基質(zhì)、晶體、膜、不可溶聚合物、塑料、玻璃、生物或生物相容或生物可蝕解或生物可降解的聚合物或基質(zhì)、微米粒子或納米粒子。固體支持體包括，且不限制，例如單層、雙層、商業(yè)膜、樹脂、基質(zhì)、纖維、分離介質(zhì)、色譜支持體、聚合物、塑料、玻璃、云母、金、珠、微球、納米球、硅、砷化鎵、有機(jī)和無機(jī)金屬、半導(dǎo)體、絕緣體、微米結(jié)構(gòu)和納米結(jié)構(gòu)。微米結(jié)構(gòu)和納米結(jié)構(gòu)可包括，不限制，微型化、納米級及超分子的探針、管尖、條(bar)、銷釘(peg)、塞子、棒(rod)、套筒(sleeve)、金屬絲(wire)、細(xì)絲和管。
[0032]當(dāng)本文用于指核酸中的兩個(gè)核苷酸序列時(shí)，術(shù)語“鄰近的”可以指由0至約20個(gè)核苷酸、更具體地在約1至約10個(gè)核苷酸范圍內(nèi)的核苷酸分開的核苷酸序列，或直接鄰接彼此的序列。
[0033]術(shù)語“核酸”指核苷酸聚合物，且除非另外限制，包括能夠以與天然存在的核苷酸相似的方式行使功能(例如，雜交)的天然的核苷酸的類似物。除非另外限制，“核酸”可包括，除了標(biāo)準(zhǔn)的堿基腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶之外，多種天然存在的和合成的堿基(例如，肌苷)、核苷酸和/或骨架。
[0034]術(shù)語核酸包括任何形式的DNA或RNA，包括，例如，基因組DNA ;通常通過信使RNA(mRNA)的逆轉(zhuǎn)錄或通過擴(kuò)增獲得的互補(bǔ)DNA (cDNA)，其是mRNA的DNA表示；合成或通過擴(kuò)增產(chǎn)生的DNA分子；和mR NA。
[0035]術(shù)語核酸包含雙鏈或三鏈核酸，及單鏈分子。在雙鏈或三鏈核酸中，核酸鏈不需要是同延的(即，雙鏈核酸不需要是沿著兩條鏈的整體長度的雙鏈)。
[0036]術(shù)語核酸還包含其任何化學(xué)修飾，諸如通過甲基化和/或通過加帽。核酸修飾可包括針對單個(gè)核酸堿基或針對核酸作為整體摻入額外的電荷、極化性、氫鍵、靜電相互作用和功能的化學(xué)基團(tuán)的添加。此類修飾可包括堿基修飾，諸如2-位置糖修飾、5-位置嘧啶修飾、8-位置嘌呤修飾、在胞嘧啶環(huán)外胺的修飾、5-溴尿嘧啶的取代、骨架修飾、異常堿基配對組合諸如異堿基(isobase)異胞嘧唳核苷(isocytidine)和異胍(isoguanidine),等等。
[0037]更特別地，在某些實(shí)施方案中，核酸可包含聚脫氧核糖核苷酸(包含2-脫氧-D-核糖)、聚核糖核苷酸(包含D-核糖)、和為嘌呤或嘧啶堿基的N-或C-糖苷的任何其他類型的核酸，及包含normucleotidic骨架的其他聚合物,例如,聚酰胺(例如，肽核酸(PNA))和多嗎啉基寡核苷酸(polymorpholino)(從 the Ant1-Virals, Inc., Corvallis, Oreg.商業(yè)可得，如Neugene)聚合物，和其他合成的序列特異性的核酸聚合物，條件是該核酸聚合物包含處于允許諸如見于DNA和RNA中的堿基配對和堿基堆積的構(gòu)型中核酸堿基。術(shù)語核酸還包含鎖核酸(LNA)，其在美國專利號6，794，499,6, 670，461,6, 262，490和6，770，748中被描述，通過引用將這些專利的每一個(gè)并入本文。
[0038]核酸可源自完全化學(xué)合成的過程，諸如固相介導(dǎo)的化學(xué)合成，源自生物來源，諸如通過從產(chǎn)生核酸的任何物種的分離，或源自包括通過分子生物學(xué)工具操作核酸的過程，諸如DNA復(fù)制、PCR擴(kuò)增、逆轉(zhuǎn)錄，或源自那些過程的組合。
[0039]本文所用的術(shù)語“靶核酸”是指本發(fā)明方法中待被檢測的特定的核酸。
[0040]如本文所用的術(shù)語“靶核苷酸序列”指感興趣的核苷酸序列，諸如，例如，通過擴(kuò)增靶核酸獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物或當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄RNA靶核酸時(shí)產(chǎn)生的cDNA。在RNA的情況下，靶核苷酸序列可用尿嘧啶(U)取代胸腺嘧啶(T)。
[0041]如本文所用的，術(shù)語“互補(bǔ)的”指兩個(gè)核苷酸之間精確配對的能力。即，如果在核酸的給定位置處，核苷酸能夠與另一個(gè)核酸的核苷酸氫鍵鍵合，那么這兩個(gè)核酸被認(rèn)為在那個(gè)位置處與彼此互補(bǔ)。“互補(bǔ)物”可以是完全地或部分地互補(bǔ)的序列。兩個(gè)單鏈核酸分子之間的互補(bǔ)性可以是“部分的”，其中只有一些核苷酸結(jié)合，或當(dāng)單鏈分子之間存在總的互補(bǔ)性時(shí)其可以是完全的。核酸鏈之間的互補(bǔ)性的程度對核酸鏈之間的雜交的效率和強(qiáng)度具有顯著影響。部分互補(bǔ)的兩條序列可具有，例如跨至少7個(gè)核苷酸、更典型地10-30個(gè)核苷酸的范圍的序列且通?？缰辽?4-25個(gè)核苷酸的序列的至少90%同一性、或至少95%、96%、97%,98%或99%同一性的序列。將被理解的是，引物序列的3’端堿基將預(yù)期地與靶核酸序列的對應(yīng)的堿基完全互補(bǔ)以允許引導(dǎo)(priming)的發(fā)生。
[0042]“特異性雜交”指在限定的嚴(yán)格條件下，與存在于雜交混合物中的其他核苷酸序列的基本結(jié)合不存在時(shí)，核酸與靶核苷酸序列的結(jié)合。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到放松雜交條件的嚴(yán)格性允許容忍序列錯(cuò)配。在特定實(shí)施方案中，在嚴(yán)格雜交條件下實(shí)施雜交。
[0043]“Tm”指“解鏈溫度”，其是雙鏈核酸分子的群體半-離解為單鏈所處的溫度。如本文所用的，單鏈寡核苷酸的^指包含該寡核苷酸和其完全的互補(bǔ)物的雙鏈分子的Tm。報(bào)告物或猝滅劑不被包含在^的確定中。如本文所用的，可通過計(jì)算確定Tm。具體地，寡核苷酸的 ^可以是根據(jù)方程 K。。) =4 (G+C)+2 (Α+Τ) ” (Thein 和 Wallace, 1986，于 Humangenetic disorders,第 33-50 頁，IRL Press, Oxford UK,通過引用并入本文)計(jì)算的 Tm。
[0044]術(shù)語“寡核苷酸”被用于指相對短的，通常短于200個(gè)核苷酸，更具體地短于100個(gè)核苷酸，最具體地短于50個(gè)核苷酸的核酸。典型地，寡核苷酸是單鏈DNA分子。本發(fā)明使用的寡核苷酸可被化學(xué)修飾?；瘜W(xué)修飾可使寡核苷酸具備額外的功能，諸如化學(xué)活性、親和力或免受例如核酸酶的降解的保護(hù)。
[0045]術(shù)語“引物”指在適當(dāng)條件下(例如，在4種不同的核苷三磷酸和用于聚合的劑諸如DNA或RNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶的存在`下)在適當(dāng)?shù)木彌_液中并在適宜的溫度下，能夠與核酸雜交(還稱為“退火”)并作為核苷酸(RNA或DNA)聚合的起始位點(diǎn)的寡核苷酸。引物的適當(dāng)?shù)拈L度取決于引物的預(yù)期用途，但引物典型地至少7個(gè)核苷酸長且、更典型地為10至30個(gè)核苷酸、或甚至更典型地從15至30個(gè)核苷酸的范圍的長度。其他引物某種程度上可以更長，例如，30至60個(gè)核苷酸長。在這個(gè)背景下，“引物長度”指與互補(bǔ)的“靶”序列雜交并引導(dǎo)核苷酸合成的寡核苷酸或核酸的部分。短的引物分子通常要求較低的溫度以與模板形成足夠穩(wěn)定的雜交復(fù)合體。引物不需要反映模板的確切序列但必須足夠互補(bǔ)以與模板雜交。術(shù)語“引物位點(diǎn)”或“引物結(jié)合位點(diǎn)”指弓丨物與其雜交的靶核酸的區(qū)段。
[0046]引物被稱為與另一個(gè)核酸退火，如果該引物或其部分與該核酸內(nèi)的核苷酸序列雜交。引物與特定核苷酸序列的雜交的陳述并不預(yù)期暗示該引物完全地或?qū)ｉT地與該核苷酸序列雜交。例如，在某些實(shí)施方案中，本文使用的擴(kuò)增引物被稱為“與核苷酸標(biāo)簽退火”。該描述包含與核苷酸標(biāo)簽完全退火的探針/引物，及與核苷酸標(biāo)簽部分退火和與鄰近的核苷酸序列部分退火，例如，靶核苷酸序列的探針/引物。此雜交引物可增加擴(kuò)增反應(yīng)的特異性。
[0047]如本文所用的，選擇引物“以避免與靶核酸基本退火”指選擇引物以使得擴(kuò)增之后檢測的大部分?jǐn)U增子在它們由在靶核酸的每一個(gè)末端的預(yù)期位點(diǎn)的引導(dǎo)造成的意義上講是“全長”，如與靶核酸內(nèi)的引導(dǎo)造成的擴(kuò)增子相反，其產(chǎn)生短于預(yù)期的擴(kuò)增子。在多種實(shí)施方案中，選擇引物以使得至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%的擴(kuò)增子是全長。
[0048]術(shù)語“引物對”指包含與待被擴(kuò)增的DNA序列的5’末端的互補(bǔ)物雜交的5’ “上游弓丨物”或“正向引物”和與待被擴(kuò)增的序列的3’末端雜交的3’ “下游引物”或“反向引物”的一組引物。如將被本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識的，術(shù)語“上游”和“下游”或“正向”和“反向”并不預(yù)期限制，而是在特定的實(shí)施方案中提供說明性方向。
[0049]“探針”是通過一種或多種類型的化學(xué)鍵，一般通過互補(bǔ)堿基配對能夠與具有互補(bǔ)序列的靶核酸結(jié)合因此形成雙鏈體結(jié)構(gòu)的核酸，該互補(bǔ)堿基配對通常通過氫鍵形成。探針與“探針結(jié)合位點(diǎn)”結(jié)合或雜交?？梢杂每蓹z測的標(biāo)記物標(biāo)記探針以允許探針、特別是在探針已與其互補(bǔ)靶結(jié)合之后的簡便的檢測?？蛇x地，然而，探針可以是非標(biāo)記的，但通過與標(biāo)記的配體直接地或間接地特異性結(jié)合可以是可檢測的。探針的大小可顯著不同。通常，探針的長度至少為7至15個(gè)核苷酸。其他探針為至少20、30或40個(gè)核苷酸長。仍然其他的探針某種程度上更長，為至少50、60、70、80或90個(gè)核苷酸長。又其他探針仍然更長，且為至少100、150、200或更多的核苷酸長。探針還可以是由任何以上的值限定的任何范圍(例如，15-20個(gè)核苷酸長)內(nèi)的任何長度。
[0050]引物或探針序列可和與其雜交的序列完全互補(bǔ)或可以是少于完全互補(bǔ)的。在某些實(shí)施方案中，引物或探針序列跨至少7個(gè)核苷酸的序列、更典型地跨10-30個(gè)核苷酸的范圍的序列、且通?？缰辽?4-25個(gè)核苷酸的序列與靶核酸序列的互補(bǔ)物具有至少65%的同一性、且更通常具有至少75%的同一性、至少85%的同一性、至少90%的同一性、或至少95%、96%、97%、98%或99%的同一性。將被理解的是某些堿基(例如，引物的3’端堿基)通常與靶核酸序列的對應(yīng)堿基預(yù)期地完全互補(bǔ)。
[0051]本文所用的術(shù)語“核苷酸標(biāo)簽序列”、“核苷酸標(biāo)簽”和“標(biāo)簽序列”是指被添加至靶核苷酸序列的預(yù)先確定的核苷·酸序列。核苷酸標(biāo)簽可編碼關(guān)于靶核苷酸序列的一項(xiàng)信息，諸如靶核苷酸序列的身份或靶核苷酸序列所源自的樣品的身份。在某些實(shí)施方案中，可以在一個(gè)或多個(gè)核苷酸標(biāo)簽中編碼此信息，例如，兩個(gè)核苷酸標(biāo)簽的組合，在靶核苷酸序列的任一末端各一個(gè)，可編碼該靶核苷酸序列的身份。
[0052]如本文所用的，術(shù)語“編碼反應(yīng)”指其中至少一個(gè)核苷酸標(biāo)簽被添加至靶核苷酸序列的反應(yīng)。該過程可被稱為“加標(biāo)簽”。例如可通過“編碼PCR”添加核苷酸標(biāo)簽，其中至少一條引物包含靶特異性部分和位于靶特異性部分的5’末端的核苷酸標(biāo)簽，和僅包含靶特異性部分或靶特異性部分和位于該靶特異性部分的5’末端的核苷酸標(biāo)簽的第二引物。關(guān)于適于編碼PCR的PCR操作說明的說明性實(shí)例，見，例如PCT公布號W02004/051218和TOUS03/37808及美國專利號6，605, 451，其在此通過引用整體被并入。還可通過可包含連接反應(yīng)的“編碼連接”反應(yīng)添加核苷酸標(biāo)簽，該連接反應(yīng)中至少一條引物包含靶特異性部分和位于靶特異性部分的5’末端的核苷酸標(biāo)簽，和僅包含靶特異性部分或靶特異性部分和位于該靶特異性部分的5’末端的核苷酸標(biāo)簽的第二引物。說明性的編碼連接反應(yīng)在例如美國專利號7，601, 821和專利公布號2005/0260640中被描述，其在此通過引用整體且特別地關(guān)于連接反應(yīng)被并入。還可通過其他擴(kuò)增方法添加核苷酸標(biāo)簽；見以下。[0053]如本文所用的，“編碼反應(yīng)”產(chǎn)生“加標(biāo)簽的靶核苷酸序列”或“加標(biāo)簽的靶多核苷酸”，其包含與靶核苷酸序列連接的核苷酸標(biāo)簽。
[0054]如本文所用的關(guān)于引物的部分，術(shù)語“靶特異性”核苷酸序列指在適當(dāng)?shù)耐嘶饤l件下能夠與靶核酸或靶核苷酸序列特異性退火的序列。
[0055]如本文所用的關(guān)于探針/引物的部分，術(shù)語“核苷酸標(biāo)簽識別序列”指在適當(dāng)?shù)耐嘶饤l件下能夠與核苷酸標(biāo)簽特異性退火的序列。
[0056]根據(jù)本教導(dǎo)，“擴(kuò)增”包含通過其復(fù)制了至少一種靶核酸的至少一部分的任何方法，典型地以模板依賴性的方式，包括且不限于，用于線性地或指數(shù)地?cái)U(kuò)增核酸序列的廣泛范圍的技術(shù)。用于執(zhí)行擴(kuò)增步驟的說明性方法包括連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、連接酶檢測反應(yīng)(LDR)、連接隨后通過Q-復(fù)制酶擴(kuò)增、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、引物延伸、鏈置換擴(kuò)增(SDA)、超支化鏈置換擴(kuò)增、多重置換擴(kuò)增(MDA)、基于核酸鏈的擴(kuò)增(NASBA)、兩步多重?cái)U(kuò)增、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)，等等，包括多重版本和其組合，例如，但不限于 OLA/PCR、PCR/OLA、LDR/PCR、PCR/PCR/LDR、PCR/LDR、LCR/PCR、PCR/LCR (還稱為聯(lián)合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-CCR)，等等。除了其他的來源之外，此類技術(shù)的描述可見于Ausbel等人；PCR Primer:A Laboratory Manual, Diffenbach, Ed., Cold Spring HarborPress(1995) ；The Electronic Protocol Book,Chang Bioscience(2002) ；Msuih 等人，J.Clin.Micr0.34:501-07 (1996) ；The Nucleic Acid Protocols Handbook, R.Rap ley, ed., Humana Press, Totowa, N.J.(2002) ；Abramson 等人，Curr Opin Biotechnol.1993February;4(l):41-7,美國專利號 6, 027, 998 ;美國專利號 6,605,451，Barany 等人，PCT 公布號 W097/31256 ；ffenz 等人，PCT 公布號 W001/92579 ；Day 等人，Genomics, 29 (1):152-162(1995), Ehrlich 等人，Science252:1643-50 (1991)；Innis 等人，PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, AcademicPress (1990) ；F avis 等人，Nature Biotechnology18:561-64(2000)；和 Rabenau 等人，Infection28:97-102(2000) ；PHILLIP BELGRADER, MICHAEL M.MARINO, MATTHEWLUBIN, FRANCIS BARANY.Genome Science and Technology.1 (2):77-87, (1996)；Belgrader, Barany和 Lubin, Development of a Multiplex Ligation Detection ReactionDNA Typing Assay, Sixth International Symposium on Human Identification, 1995(在萬維網(wǎng)的:promega.comigeneticidproc/ussymp6proc/blegrad.html-可得)；LCR KitInstruction Manual,Cat.#200520, Rev#050002, Stratagene, 2002 ；Barany, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:188-93(1991) ；Bi 和 Sambrook, Nuc1.Acids Res.25:2924-2951(1997)；Zirvi 等人，Nucl.Acid Res.27: e401-viii (1999) ；Dean 等人，Proc Natl Acad SciUSA99:5261-66 (2002) ;Barany 和 Gelfand, Genel09:1-11 (1991) ;Walker 等人，Nucl.AcidRes.20:1691-96(1992) ；Polstra 等人，BMC Inf.Dis.2:18-(2002) ；Lage 等人，GenomeRes.2003February;13(2):294-307，和 Landegren 等人，Science241:1077-80 (1988)，Demidov, V., Expert Rev Mol Diagn.2002November; 2 (6): 542-8., Cook 等人，J MicrobiolMethods.2003May; 53 (2): 165-74, Schweitzer 等人,Curr Opin Biotechnol.2001February;12 (I): 21-7，美國專利號 5，830，711，美國專利號 6，027，889，美國專利號 5，686，243, PCT公布號W00056927A3和PCT公布號W09803673A1。通過引用將每一個(gè)在前列出的參考文獻(xiàn)并入本文。在一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增包含以下順序程序的至少一個(gè)循環(huán):至少一條引物與互補(bǔ)的或基本上互補(bǔ)的序列在至少一個(gè)靶核酸處退火；使用聚合酶以模板依賴性方式合成核苷酸的至少一條鏈；和變性新形成的核酸雙鏈體以分開鏈?？梢曰蚩梢圆恢貜?fù)循環(huán)。擴(kuò)增可包含熱循環(huán)或可被等溫地執(zhí)行。
[0057]“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增”或“PCR”指其中由用于DNA解鏈和DNA的酶促復(fù)制的反應(yīng)的重復(fù)的加熱和冷卻的循環(huán)組成的熱循環(huán)的擴(kuò)增方法。PCR熱循環(huán)操作說明是本領(lǐng)域眾所周知的。典型地，PCR由一系列20-40個(gè)循環(huán)組成。例如，且不限于，循環(huán)可包含變性步驟、退火步驟(允許引物與單鏈DNA模板退火)和延伸/延長步驟。每一個(gè)步驟都可在特定的溫度、持續(xù)特定長度的時(shí)間并在特定反應(yīng)條件下發(fā)生。例如，且不用于限制，變性步驟的溫度可以為95°C，退火步驟(Ta)的溫度可以為62°C及延伸/延長步驟的溫度可以為72°C。在一些PCR操作說明(例如，降落式PCR)中，初始循環(huán)中的高退火溫度可在初始循環(huán)的增加的循環(huán)中被降低。為了本發(fā)明的目的，在此操作說明中，將Ta定義為在大部分循環(huán)中使用的退火溫度。
[0058]本文所用的術(shù)語“qPCR”是指定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，其還被稱為“實(shí)時(shí)PCR”或“動(dòng)態(tài)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”。
[0059]“試劑”廣泛地指用于反應(yīng)的、除了分析物(例如，被分析的核酸)之外的任何劑。用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的說明性試劑包括，但不限于，緩沖液、金屬離子、聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、模板核酸、核苷酸、標(biāo)記物、染料、核酸酶，等等。用于酶反應(yīng)的試劑包括，例如，底物、輔因子、緩沖液、金屬離子、抑制劑和激活劑。
[0060]如本文所用的術(shù)語“標(biāo)記物”指可被用于提供可檢測的和/或可定量的信號的任何原子或分子。特別地，可將標(biāo)記物直接地或間接地附著至核酸或蛋白。可被附著至探針的適合的標(biāo)記物包括，但不限于，放射性同位素、熒光團(tuán)、生色團(tuán)、質(zhì)量(mass)標(biāo)記物、電子致密粒子、磁粒子、自旋標(biāo)記物、發(fā)射化學(xué)發(fā)光的分子、電化學(xué)活性分子、酶、輔因子和酶底物。
[0061]術(shù)語“染料”具有其在本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)含義。如本文所用的術(shù)語“熒光染料”通常指當(dāng)被電磁輻射源諸如，燈、光電二極管或激光照射時(shí)，通過熒光機(jī)制發(fā)射較長波長的電磁輻射的任何染料。
`[0062]術(shù)語“報(bào)告物分子”指能夠產(chǎn)生熒光信號的分子?！扳鐒┓肿印敝改軌蛭毡患ぐl(fā)的報(bào)告物分子的熒光能量，從而猝滅否則將從被激發(fā)的報(bào)告物分子釋放的熒光信號的分子。為了猝滅劑猝滅被激發(fā)的熒光團(tuán)，在起始于報(bào)告物分子的激發(fā)但在報(bào)告物分子釋放儲(chǔ)存的熒光能量之前的一段時(shí)間，猝滅劑在被激發(fā)的報(bào)告物分子的最小猝滅距離內(nèi)通常是有利的。在基于接近的猝滅應(yīng)用中，報(bào)告物和猝滅劑分子定位與彼此足夠近如此以致無論何時(shí)該報(bào)告物分子被激發(fā)，激發(fā)態(tài)的能量都轉(zhuǎn)移至猝滅劑分子，其中猝滅劑非輻射地消散或在不同于報(bào)告物分子的發(fā)射頻率的發(fā)射頻率發(fā)射。一些非放射性能量轉(zhuǎn)移機(jī)制跨較短的距離起作用并是用于基于接近的猝滅應(yīng)用合適的。
[0063]術(shù)語“高彈體”具有用于本領(lǐng)域的一般含義。因此，例如，Allcock等人(Contemporary Polymer Chemistry,第2版)描述了通常作為在它們的玻璃轉(zhuǎn)化溫度和液化溫度之間的溫度存在的聚合物的高彈體。彈體材料呈現(xiàn)彈性性能，因?yàn)榫酆衔镦溔菀捉?jīng)受扭轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)以允許響應(yīng)于力展開骨架鏈，而骨架鏈反沖(recoiling)以假定不存在力時(shí)的先驗(yàn)形狀。通常，當(dāng)施加力時(shí)使得高彈體變形，但隨后當(dāng)去除力時(shí)恢復(fù)到它們的初始形狀。
[0064]“多態(tài)性標(biāo)記”或“多態(tài)性位點(diǎn)”是核苷酸序列趨異(divergence)發(fā)生所在的位點(diǎn)。說明性的標(biāo)記具有至少兩個(gè)等位基因，每一個(gè)都以典型地大于選擇的群體的1%、或更典型地大于選擇的群體的10%或20%的頻率出現(xiàn)。多態(tài)性位點(diǎn)可小至一個(gè)堿基對。多態(tài)性標(biāo)記包括限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)(VNTR)、高變區(qū)、小衛(wèi)星、雙核苷酸重復(fù)、三核苷酸重復(fù)、四核苷酸重復(fù)、簡單序列重復(fù)、缺失和插入元件諸如Alu。首先鑒定的等位基因形式被任意地指定為參考形式且其他等位基因形式被指定為可替代的或變體等位基因。在選擇的群體中最高頻率存在的等位基因形式有時(shí)被稱為野生型形式。二倍體生物體可以是等位基因形式純合的或雜合的。雙等位基因的多態(tài)性具有兩種形式。三等位基因的多態(tài)性具有三種形式。
[0065]“單核苷酸多態(tài)性(SNP)”發(fā)生在由單個(gè)核苷酸占有的多態(tài)性位點(diǎn)，其是等位基因序列之間變化的位點(diǎn)。該位點(diǎn)之后和之前通常是等位基因的高度保守的序列(例如，在小于1/100或1/1000群體成員中不同的序列)。SNP通常由于將多態(tài)性位點(diǎn)處的一個(gè)核苷酸取代為另一個(gè)而引起。轉(zhuǎn)換是一個(gè)嘌呤被另一個(gè)嘌呤或一個(gè)嘧啶被另一個(gè)嘧啶的取代。顛換是嘌呤被嘧啶或相反的取代。SNP還可由相對于參考等位基因的核苷酸的缺失或核苷酸的插入引起。
[0066]B.描述
[0067]在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于檢測靶核苷酸序列的方法，包括:a)用核苷酸標(biāo)簽序列將靶核苷酸序列加標(biāo)簽，從而制備加標(biāo)簽的靶核酸序列；b)提供包含與核苷酸標(biāo)簽序列互補(bǔ)的核苷酸標(biāo)簽識別序列和核苷酸標(biāo)簽識別序列5’的調(diào)節(jié)序列的探針寡核苷酸，其中所述探針寡核苷酸包含第一標(biāo)記物并具有解鏈溫度Tml ；c)使用探針寡核苷酸作為引物在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增加標(biāo)簽的靶核酸序列，其中所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)通過退火溫度Ta被表征；其中在包含與調(diào)節(jié)序列互補(bǔ)的序列區(qū)段的調(diào)節(jié)寡核苷酸的存下實(shí)施PCR擴(kuò)增反應(yīng)，其中所述調(diào)節(jié)寡核苷酸包含第二標(biāo)記物并具有解鏈溫度Tm2 ;和(1)檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物；其中該第一標(biāo)記物和該第二標(biāo)記物構(gòu)成熒光報(bào)告物/猝滅劑對；且其中Tml和Tm2都高于Ta。不希望被特定的機(jī)制限制，實(shí)施其中探針寡核苷酸的Tm和調(diào)節(jié)寡核苷酸的Tm 二者都超過Ta的反應(yīng)，降低了背景信號(熒光)并提供了優(yōu)越的分析結(jié)果。
·[0068]在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于通過以下檢測具有靶核苷酸序列的多核苷酸的方法:用核苷酸標(biāo)簽將包含期望的靶核苷酸序列的多核苷酸加標(biāo)簽，提供包含調(diào)節(jié)序列和核苷酸標(biāo)簽識別序列的具有解鏈溫度Tml的探針寡核苷酸；在多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)中將該探針寡核苷酸摻入加標(biāo)簽的多核苷酸，提供包含與調(diào)節(jié)序列至少部分互補(bǔ)的序列區(qū)段的具有解鏈溫度Tm2的調(diào)節(jié)寡核苷酸；其中Tml和Tm2高于與多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)相關(guān)的退火溫度。
[0069]加標(biāo)簽
[0070]在該方法中，核苷酸標(biāo)簽序列(“標(biāo)簽序列”或“NTS”)與靶核苷酸序列(TNS)在稱為“加標(biāo)簽”的過程中締合。在一個(gè)實(shí)施方案中，不限制，標(biāo)簽序列在擴(kuò)增反應(yīng)中與靶核苷酸序列締合。例如，可使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增TNS，其中第一(例如，“正向”)引物包含靶特異性部分5’的核苷酸標(biāo)簽序列，導(dǎo)致包含標(biāo)簽序列和TNS (例如，TNS的5’和鄰近TNS的標(biāo)簽序列)二者的擴(kuò)增子。在一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增反應(yīng)使用第二(例如，“反向”)引物。
[0071 ] 在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于將每一個(gè)標(biāo)簽核苷酸序列引入一個(gè)或多個(gè)靶核酸的擴(kuò)增方法。本方法需要擴(kuò)增典型地多個(gè)樣品中的一個(gè)或多個(gè)核酸。樣品可以以任何方式與另一個(gè)樣品不同，例如，不同的樣品可來自不同的組織、受試者、環(huán)境來源，等等?？梢霕?biāo)簽序列作為加標(biāo)簽寡核苷酸的部分。在擴(kuò)增反應(yīng)，例如PCR中，加標(biāo)簽寡核苷酸可行使包括靶核苷酸識別序列和核苷酸標(biāo)簽的加標(biāo)簽引物的功能。識別可由靶核苷酸序列和靶核苷酸識別序列之間的部分或全部互補(bǔ)性編碼。此外，核苷酸標(biāo)簽可被選擇與靶核苷酸識別序列締合并可編碼靶核酸中的靶核苷酸序列。可提供在感興趣的序列的側(cè)翼的反向引物。
[0072]標(biāo)簽序列可被摻入為直接鄰近靶特異性序列或其間具有有限數(shù)目的連接基核苷酸。連接基核苷酸的數(shù)目優(yōu)選小于25、更優(yōu)選小于10、仍然更優(yōu)選小于5。在特定的實(shí)施方案中，可通過與加標(biāo)簽的核酸靶雜交從調(diào)節(jié)寡核苷酸救出(rescue)探針寡核苷酸。雜交可以針對加標(biāo)簽的靶核酸上的核苷酸標(biāo)簽，該核苷酸標(biāo)簽被探針寡核苷酸上的核苷酸標(biāo)簽識別序列識別。
[0073]根據(jù)本發(fā)明，標(biāo)簽序列和TNS定義了復(fù)合序列串(composite sequence stretch,CSS)，其更通常被稱為“加標(biāo)簽的靶核酸序列”，并有時(shí)被稱為“加標(biāo)簽的多核苷酸靶”。包含加標(biāo)簽的靶核酸序列的擴(kuò)增子可以是雙鏈或單鏈的。
[0074]包含靶核苷酸識別序列和標(biāo)簽序列的加標(biāo)簽引物被用于將核苷酸標(biāo)簽序列締合進(jìn)入“加標(biāo)簽的靶核酸序列”。優(yōu)選地，加標(biāo)簽引物呈15-60個(gè)核苷酸范圍的長度。更優(yōu)選地，加標(biāo)簽引物呈18-45個(gè)核苷酸范圍的長度。加標(biāo)簽引物的精確的序列和長度部分取決于加標(biāo)簽引物與其結(jié)合的靶核苷酸序列的性質(zhì)。序列和長度可不同以實(shí)現(xiàn)用于特定實(shí)施方案的適合的退火和解鏈特征。優(yōu)選地，加標(biāo)簽引物具有50-85°C范圍內(nèi)的解鏈溫度Tm。更優(yōu)選地，加標(biāo)簽引物具有60-75°C范圍內(nèi)的解鏈溫度Tm。在特定實(shí)施例中，靶核苷酸識別序列的序列和長度可不同以實(shí)現(xiàn)與探針的適合的退火和解鏈特征。
[0075]在擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增子產(chǎn)物是雙鏈的實(shí)施方案中，第一鏈將包含標(biāo)簽序列和TNS，且互補(bǔ)鏈將包含第一鏈中序列的互補(bǔ)物。為了清楚的目的，以下的討論指標(biāo)簽序列和TNS，但將被領(lǐng)會(huì)的是使用互補(bǔ)序列可實(shí) 施等效的分析。被本公開內(nèi)容指導(dǎo)的技術(shù)人員將立即認(rèn)識到如何用對引物和探針序列的適合調(diào)整通過檢測任一鏈進(jìn)行本發(fā)明的分析。
[0076]將被領(lǐng)會(huì)的是，取決于其中標(biāo)簽序列與靶核苷酸序列締合的步驟的性質(zhì)，加標(biāo)簽的靶核酸序列可包含另外的序列元件，例如，如果正向引物包含除了標(biāo)簽序列和靶特異性部分之外的序列和/或反向引物包含除了靶特異性序列之外的序列。
[0077]探針寡核苷酸
[0078]本發(fā)明還涉及與加標(biāo)簽的靶核酸序列(CSS)的部分締合的探針寡核苷酸(有時(shí)稱為“寡核苷酸探針”)。即，探針寡核苷酸包含與加標(biāo)簽的靶核酸序列的核苷酸標(biāo)簽序列部分互補(bǔ)的“核苷酸標(biāo)簽識別序列”部分，如此以致寡核苷酸探針可與加標(biāo)簽的靶核酸序列雜交并在擴(kuò)增反應(yīng)中用作引物。核苷酸標(biāo)簽識別序列可與核苷酸標(biāo)簽序列或其互補(bǔ)物部分地或完全地一致。探針寡核苷酸通常還包含調(diào)節(jié)序列，通常在核苷酸標(biāo)簽序列的5’，如以下討論的。
[0079]在一個(gè)實(shí)施方案中，探針寡核苷酸的核苷酸標(biāo)簽識別序列與核苷酸標(biāo)簽序列的互補(bǔ)物雜交。即，核苷酸標(biāo)簽序列可以在加標(biāo)簽的靶核酸序列(或“加標(biāo)簽的多核苷酸”)的一條鏈的5’末端，且探針寡核苷酸可與在加標(biāo)簽的多核苷酸的第二條鏈的3’末端的核苷酸標(biāo)簽序列的互補(bǔ)物雜交。[0080]優(yōu)選地，探針寡核苷酸呈15-60個(gè)核苷酸范圍的長度。更優(yōu)選地，探針寡核苷酸呈18-45個(gè)核苷酸范圍的長度。探針寡核苷酸的精確的序列和長度部分取決于探針寡核苷酸與其結(jié)合的核苷酸標(biāo)簽的性質(zhì)。整體序列和長度可不同以實(shí)現(xiàn)用于特定實(shí)施方案的適合的退火和解鏈特征。探針寡核苷酸的解鏈溫度可以大于95°C。探針寡核苷酸的解鏈溫度可落入 50-85 V、55-80 V、60-75 V、65-70°C、75°C、60_120°C、75-115°C或更多的范圍內(nèi)或其可落入具有這些值中的一個(gè)作為端點(diǎn)的范圍(例如，50-75°C)內(nèi)。優(yōu)選地，探針寡核苷酸具有55-85°C范圍內(nèi)的解鏈溫度Tm。更優(yōu)選地，探針寡核苷酸具有65_75°C范圍內(nèi)、甚至更優(yōu)選地>75°C的解鏈溫度Tm。在一些實(shí)施方案中，關(guān)于探針寡核苷酸的計(jì)算的Tm可以>100°C。在特定實(shí)施例中，核苷酸標(biāo)簽識別序列和長度可以不同以當(dāng)探針首先被摻入多核苷酸時(shí)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)的初始循環(huán)中的適合的退火和解鏈特征。[0081]通過探針寡核苷酸擴(kuò)增加標(biāo)簽的靶核酸序列
[0082]在一些實(shí)施方案中，使用探針寡核苷酸作為引物在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增加標(biāo)簽的靶核酸序列(或其部分)。通常，擴(kuò)增反應(yīng)包含3’(反向)引物。將被認(rèn)識到的是，當(dāng)探針寡核苷酸包含調(diào)節(jié)序列時(shí)，擴(kuò)增的產(chǎn)物將包含調(diào)節(jié)序列、核苷酸標(biāo)簽序列和靶核苷酸序列。
[0083]在加標(biāo)簽的靶核酸依賴的方法中，還可將探針寡核苷酸摻入較長的核酸構(gòu)建體。例如，可通過經(jīng)由與加標(biāo)簽的靶核酸雜交的接近促進(jìn)將探針寡核苷酸連接至另一個(gè)核酸。更通常地，探針寡核苷酸可用作擴(kuò)增反應(yīng)中的引物，其中其被摻入加標(biāo)簽的靶核酸。
[0084]通過退火溫度Ta表征PCR擴(kuò)增反應(yīng)(見以下)。根據(jù)本發(fā)明，探針寡核苷酸的解鏈溫度(Tml)大于擴(kuò)增反應(yīng)的Ta。在一些實(shí)施方案中，Tml比退火溫度高至少1°C、至少2°C、至少3°C、至少4°C、至少5°C、至少6°C、至少7°C、至少8°C、至少9°C、至少10°C、至少11 °C、至少12°C、至少13°C、至少14°C、至少15°C、至少16°C、至少17°C、至少18°C、至少19°C、至少20°C、至少21°C、至少22°C、至少23°C、至少24°C、至少25°C、至少35°C或至少50°C。在一些實(shí)施方案中，Tml比退火溫度(Ta)高至少50°C。在一些實(shí)施方案中，Tml比Tm2高至少 25。。。
[0085]在調(diào)節(jié)寡核苷酸存在下實(shí)施PCR擴(kuò)增反應(yīng)，如以下討論的。
[0086]調(diào)節(jié)寡核苷酸
[0087]本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)寡核苷酸，其包含與探針寡核苷酸的調(diào)節(jié)序列互補(bǔ)的序列區(qū)段。在擴(kuò)增反應(yīng)過程中，調(diào)節(jié)寡核苷酸的序列區(qū)段與探針寡核苷酸的調(diào)節(jié)序列的退火與探針寡核苷酸和加標(biāo)簽的靶核酸序列(或“CSS”)的締合競爭。
[0088]優(yōu)選地，調(diào)節(jié)寡核苷酸呈6-60個(gè)核苷酸范圍的長度。更優(yōu)選地，調(diào)節(jié)寡核苷酸呈15-45個(gè)核苷酸范圍的長度。甚至更優(yōu)選地，調(diào)節(jié)寡核苷酸呈18-30個(gè)核苷酸范圍的長度。
[0089]在一些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)寡核苷酸可包含在該序列區(qū)段側(cè)翼的核苷酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10個(gè)核苷酸)。見實(shí)施例2。在一些實(shí)施方案中，序列區(qū)段包含調(diào)節(jié)寡核苷酸的全部或大部分(例如，至少80%或至少90%)的長度。在一些實(shí)施方案中，序列區(qū)段呈6-60個(gè)核苷酸范圍的長度，更優(yōu)選地，呈15-45個(gè)核苷酸范圍的長度且甚至更優(yōu)選地呈18-30個(gè)核苷酸范圍的長度。調(diào)節(jié)寡核苷酸的精確的序列和長度部分取決于調(diào)節(jié)寡核苷酸與其結(jié)合的探針寡核苷酸的性質(zhì)。序列和長度可不同以實(shí)現(xiàn)用于特定實(shí)施方案的適合的退火和解鏈特征。
[0090]調(diào)節(jié)寡核苷酸的解鏈溫度(Tm2)可落入45-85 °C、50-80°C、55-75 °C、60-70°C、65-75 °C的范圍內(nèi)或其可落入具有這些值中的一個(gè)作為端點(diǎn)的范圍(例如，50-75 °C )內(nèi)。優(yōu)選地，調(diào)節(jié)寡核苷酸具有50-85°C范圍內(nèi)的解鏈溫度Tm。更優(yōu)選地，調(diào)節(jié)寡核苷酸具有60-75°C范圍內(nèi)的解鏈溫度Tm。在特定實(shí)施例中，識別調(diào)節(jié)序列的區(qū)段的序列和長度可不同以實(shí)現(xiàn)與探針的適合的退火和解鏈特征。在一些實(shí)施方案中，可添加競爭性輔助序列以增加探針寡核苷酸對加標(biāo)簽的靶核酸的特異性。
[0091]根據(jù)本發(fā)明，調(diào)節(jié)寡核苷酸的解鏈溫度(Tm2)大于擴(kuò)增反應(yīng)的Ta。在一些實(shí)施方案中，Tm2比退火溫度高至少1°C、至少2°C、至少3°C、至少4°C、至少5°C、至少6°C、至少7°C、至少8°C、至少9°C、至少10°C、至少11°C、至少12°C、至少13°C、至少14°C、至少15°C、至少16°C、至少17°C、至少18°C、至少19°C、至少20°C、至少21°C、至少22°C、至少23°C、至少24°C或至少25 °C。
[0092]優(yōu)選地，調(diào)節(jié)寡核苷酸的3’端核苷酸被封閉或使得不能夠被核酸聚合酶延伸。通過將報(bào)告物或猝滅劑分子通過連接部分附著至探針寡核苷酸的3’端碳方便地實(shí)施此封閉。
[0093]典型地，探針寡核苷酸將具有與被靶向的加標(biāo)簽的多核苷酸互補(bǔ)的序列，其比調(diào)節(jié)序列長的多，所述調(diào)節(jié)寡核苷酸與所述調(diào)節(jié)序列互補(bǔ)。如此，調(diào)節(jié)寡核苷酸與被靶向的加標(biāo)簽的多核苷酸競爭與探針寡核苷酸雜交，但從互補(bǔ)性方面將典型地處于劣勢。然而，調(diào)節(jié)寡核苷酸從互補(bǔ)性方面將與未被靶向的核酸具有較高的成功的競爭，探針寡核苷酸可與該未被靶向的核酸非特異 性地結(jié)合，并因此減少反應(yīng)中探針的非特異性摻入。另外，可以以較高的濃度提供調(diào)節(jié)寡核苷酸，進(jìn)一步增加其與未被靶向的核酸的競爭。
[0094]在多種實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)寡核苷酸的濃度可超過探針寡核苷酸。在一些實(shí)施方案中，可根據(jù)反應(yīng)中總的核酸調(diào)整調(diào)節(jié)寡核苷酸的濃度。可以以超過反應(yīng)中的寡核苷酸探針或總的核酸至少10%、50%、100%、500%、1000%或更多提供調(diào)節(jié)寡核苷酸。
[0095]輔助序列
[0096]調(diào)節(jié)寡核苷酸可具有用作對靶核酸/探針寡核苷酸雜交的競爭性序列的輔助序列。當(dāng)沿著調(diào)節(jié)序列比對探針寡核苷酸和調(diào)節(jié)寡核苷酸時(shí)，輔助序列區(qū)段可與探針寡核苷酸、更典型地與核苷酸標(biāo)簽識別序列至少部分重疊。即，調(diào)節(jié)寡核苷酸可包含與調(diào)節(jié)序列和探針寡核苷酸的核苷酸標(biāo)簽識別序列的至少部分二者互補(bǔ)的序列。換句話說，調(diào)節(jié)寡核苷酸的序列區(qū)段可以與調(diào)節(jié)序列和探針寡核苷酸的核苷酸標(biāo)簽識別序列的至少部分是互補(bǔ)的?？烧{(diào)整輔助序列和探針寡核苷酸之間互補(bǔ)性的程度以調(diào)節(jié)特異性。在其中探針寡核苷酸在擴(kuò)增反應(yīng)中被摻入加標(biāo)簽的多核苷酸的實(shí)施方案中，輔助序列甚至在擴(kuò)增反應(yīng)的初始循環(huán)中就可競爭非特異性位點(diǎn)，更具體地未加標(biāo)簽的核酸。由于與游離的核酸相比輔助序列將以增加的局部濃度存在，調(diào)節(jié)寡核苷酸與探針寡核苷酸沿著調(diào)節(jié)序列的雜交可增強(qiáng)輔助序列與探針寡核苷酸的雜交。另外，可調(diào)整調(diào)節(jié)寡核苷酸和因此輔助序列的濃度以允許其有效競爭未加標(biāo)簽的核酸。在特定的實(shí)施方案中，可以以1.5至4倍過量、I至10倍過量、4至10倍過量、1.5至50倍過量、4至50、100倍過量或具有任何這些值作為端點(diǎn)的任何其他范圍(例如，1.5至10倍過量)提供調(diào)節(jié)寡核苷酸。具有這些優(yōu)勢，輔助序列可以以甚至低至O的互補(bǔ)性調(diào)節(jié)對探針寡核苷酸的特異性。在輔助序列和探針寡核苷酸之間低至無互補(bǔ)性下，探針寡核苷酸與加標(biāo)簽的核酸的雜交將成功地勝過調(diào)節(jié)寡核苷酸上的輔助序列。[0097]此外，猝滅劑序列可被摻入調(diào)節(jié)寡核苷酸序列以增強(qiáng)猝滅。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)脫氧鳥苷核苷酸將被摻入至探針寡核苷酸上的報(bào)告物分子的雜交位點(diǎn)附近的猝滅劑序列。在一些實(shí)施方案中，可將脫氧鳥苷尾添加至調(diào)節(jié)序列雜交的3’的猝滅劑序列。
[0098]信號和靶序列存在的對應(yīng)件
[0099]與調(diào)節(jié)寡核苷酸的締合影響與探針寡核苷酸締合的信號。因此，探針寡核苷酸與CSS的相互作用防止探針寡核苷酸與調(diào)節(jié)寡核苷酸的雜交。結(jié)果，探針寡核苷酸相關(guān)的信號的變化幫助檢測靶核苷酸序列。
[0100]標(biāo)簽序列的摻入設(shè)計(jì)為依賴于特異性TNS的存在。結(jié)果，本發(fā)明將樣品中特異性核苷酸序列(即，特異性靶核酸序列)的存在與信號的變化聯(lián)系起來?？稍谟帽景l(fā)明的檢測方法詢問(interrogate)樣品之前和之后采集信號。因此，信號的變化被解讀為與特異性TNS的存在有關(guān)。此外，本發(fā)明還涉及監(jiān)測靶多核苷酸序列的擴(kuò)增。因此，本發(fā)明涉及用于通過追蹤隨時(shí)間推移信號中的變化監(jiān)測靶序列的核酸擴(kuò)增的方法。
[0101]在本發(fā)明的多種實(shí)施方案中，與將探針寡核苷酸摻入加標(biāo)簽的核苷酸有關(guān)的變化的信號涉及探針寡核苷酸從調(diào)節(jié)寡核苷酸的釋放。調(diào)節(jié)寡核苷酸與未摻入的探針寡核苷酸的締合形成報(bào)告物/猝滅劑對，以致在適于該締合的條件下猝滅可能的信號。將探針寡核苷酸摻入加標(biāo)簽的靶核酸破壞了此報(bào)告物/猝滅劑對的形成，導(dǎo)致信號的變化。在多種實(shí)施方案中，用報(bào)告物分子標(biāo)記探針寡核苷酸并用猝滅劑分子標(biāo)記調(diào)節(jié)寡核苷酸。示例性的報(bào)告物/猝滅劑對包含熒光染料和它們的猝滅劑。
[0102]在一些實(shí)施方案中，多個(gè)探針寡核苷酸將特異性針對不同的標(biāo)簽序列。與每一個(gè)標(biāo)簽序列有關(guān)的信號通過連接識別特定核苷酸標(biāo)簽的每一個(gè)探針寡核苷酸至特異性報(bào)告物或猝滅劑區(qū)分。
[0103]在本分析方法中，當(dāng)存在互補(bǔ)的靶序列時(shí)，探針與互補(bǔ)的靶序列的雜交破壞了調(diào)節(jié)寡核苷酸與探針的雜交，其中猝滅劑分子不再足夠靠近報(bào)告物分子以猝滅報(bào)告物分子。結(jié)果，當(dāng)與靶序列雜交時(shí)探針提供`了比當(dāng)未雜交時(shí)增強(qiáng)的熒光信號。
_4] 退火溫度
[0105]在多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)的退火階段過程中，引物與多核苷酸退火以引導(dǎo)在延長溫度時(shí)的延長反應(yīng)。擴(kuò)增反應(yīng)的“退火溫度”通常通過實(shí)驗(yàn)確定以獲得具有期望的特異性的最高產(chǎn)量。通常，較高的退火溫度增加對被靶向的多核苷酸的特異性。反應(yīng)中在靶位點(diǎn)處的被退火的引物的比例(fraction)直接影響總的產(chǎn)量并取決于許多因素，包括反應(yīng)中靶和其他多核苷酸的競爭性位點(diǎn)、退火時(shí)間、與引物和靶位點(diǎn)的互補(bǔ)區(qū)相關(guān)的解鏈溫度和退火溫度。較高的退火溫度影響反應(yīng)中引物與非特異性競爭位點(diǎn)的結(jié)合能并因此可將該引物群體轉(zhuǎn)至特異性靶位點(diǎn)。較高的退火溫度還增加可被用于引物結(jié)合的反應(yīng)中的單鏈靶多核苷酸的比例。然而，較高的退火溫度通過影響用于靶位點(diǎn)與特異性引物結(jié)合的結(jié)合自由能對該相互作用具有禁用作用。期望的退火溫度通過增加至被靶向的位點(diǎn)的被退火的引物的比例促進(jìn)反應(yīng)產(chǎn)量。
[0106]“生產(chǎn)退火溫度”落入導(dǎo)致反應(yīng)中期望的靶以高于非期望的多核苷酸序列的擴(kuò)增的速率擴(kuò)增的溫度范圍。用于每一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)的生產(chǎn)退火溫度可被獨(dú)立選擇。生產(chǎn)退火溫度可選自溫度范圍，例如，退火溫度可以在15°C -80°c、30V -75°C、40V -75°C、50V -72°C、60°C -64°C、55°C -62°C、63°C、64°C、65°C的范圍內(nèi)或可落入具有這些溫度的一個(gè)作為端點(diǎn)的任何范圍(例如，50°C -62°C)內(nèi)。
[0107]通過減少寡核苷酸與非特異性位點(diǎn)的結(jié)合增加寡核苷酸與靶位點(diǎn)的雜交特異性。非特異性靶位點(diǎn)通常是具有較低的互補(bǔ)性的位點(diǎn)，但為了反應(yīng)的目的，它們通常是其中寡核苷酸的結(jié)合不是期望的位點(diǎn)。
[0108]存在滿足在給定的退火溫度下的增加的特異性要求的一些技術(shù)。這些技術(shù)允許使用較低的退火溫度并采用引物和祀核酸結(jié)合的競爭性抑制劑。Puskas等人，GenomeResearch5:309-311 (1995)和 Harry 等人，BioTechniques, 24:445-450 (1998)，在此通過引用被并入，提供了與靶核苷酸序列互補(bǔ)的引物和與所述靶核苷酸序列部分互補(bǔ)并且3’被修飾以防止延長的寡核苷酸。這些寡核苷酸通過占據(jù)引物將與其退火的非特異性位點(diǎn)并反而使得引物群體轉(zhuǎn)向靶核苷酸序列增加特異性。由于它們與靶核苷酸序列部分互補(bǔ)，引物能夠與部分互補(bǔ)的寡核苷酸成功地競爭靶核苷酸序列。Kong等人，BiotechnologyLetters, 26:277-280 (2004)，其在此通過引用被并入，采用與引物部分互補(bǔ)的寡核苷酸作為競爭抑制劑。這些寡核苷酸與非特異性位點(diǎn)成功地競爭引物并通過使得引物較少地可用于所述位點(diǎn)增加特異性。由于它們的減少的互補(bǔ)性，靶核苷酸序列在引物結(jié)合的競爭中可勝過所述寡核苷酸。
[0109]可選擇多種寡核苷酸以實(shí)現(xiàn)在所選擇的退火溫度下的特異性的期望的程度。加標(biāo)簽引物上的靶核苷酸識別序列可在適合條件下并在所選擇的退火溫度下與靶核苷酸序列特異性退火?？蛇x擇條件如此以致引物退火將對靶核苷酸序列中的變化是靈敏的。通常，針對引物3’末端的核苷酸錯(cuò)配大大影響了從引物的延長。為了序列變體之間的區(qū)分，可設(shè)計(jì)引物如此以致其3’末端將針對多態(tài)性位點(diǎn)?？蛇x地，可選擇具有較高解鏈溫度的序列，實(shí)現(xiàn)與較廣泛的多種靶核苷酸序列的較低特異性退火。
[0110]具有高特異性的序列，引物可在靶核酸中多態(tài)性之間有效區(qū)分。多態(tài)性可包含一個(gè)或多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的單個(gè)或多個(gè)核苷酸變化。多態(tài)性位點(diǎn)的變化可包括單個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失、插入和取代。從引·物的延長對引物3’末端的雜交穩(wěn)定性特別敏感。設(shè)計(jì)為與多態(tài)性位點(diǎn)在它們的3’末端對齊的引物因此對不同等位基因之間的區(qū)分是特別有用的。[0川]加標(biāo)簽和檢測反應(yīng)
[0112]可在單獨(dú)的反應(yīng)中進(jìn)行靶核苷酸加標(biāo)簽和檢測?？蛇x地，可在共同的反應(yīng)體積中執(zhí)行這兩個(gè)步驟?？蓪㈦p擴(kuò)增方法用于摻入包含靶核苷酸識別序列和核苷酸標(biāo)簽的加標(biāo)簽引物和包含核苷酸標(biāo)簽識別序列、調(diào)節(jié)序列和信號部分的寡核苷酸引物/探針。
[0113]報(bào)告物和猝滅劑對
[0114]在多種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與彼此特異性退火的探針寡核苷酸和調(diào)節(jié)寡核苷酸的一個(gè)或多個(gè)對，其中用報(bào)告物分子標(biāo)記它們中的一個(gè)，并用報(bào)告物-猝滅劑對的猝滅劑分子標(biāo)記另一個(gè)。當(dāng)沿著調(diào)節(jié)序列比對探針寡核苷酸和調(diào)節(jié)寡核苷酸時(shí)，報(bào)告物分子和猝滅劑分子定位在與彼此足夠近的寡核苷酸上如此以致無論何時(shí)該報(bào)告物分子被激發(fā)，激發(fā)態(tài)的能量非輻射地轉(zhuǎn)移至猝滅劑分子，其中猝滅劑分子非輻射地消散或在不同于報(bào)告物分子的發(fā)射頻率的發(fā)射頻率發(fā)射。典型地，探針寡核苷酸將包含報(bào)告物分子且調(diào)節(jié)寡核苷酸將包含猝滅劑分子，然而該定位可以是相反的且該修飾對本領(lǐng)域的技術(shù)人員將是明顯的。[0115]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的分析使用包含報(bào)告物分子的探針寡核苷酸和包含猝滅劑分子的調(diào)節(jié)寡核苷酸，所述報(bào)告物和猝滅劑分子是報(bào)告物-猝滅劑對的成員。調(diào)節(jié)寡核苷酸包含與探針寡核苷酸中的調(diào)節(jié)序列雜交的序列。探針寡核苷酸與具有靶核苷酸序列的靶加標(biāo)簽的多核苷酸的區(qū)特異性退火，如此以致核苷酸標(biāo)簽識別序列與加標(biāo)簽的多核苷酸中的核苷酸標(biāo)簽雜交。典型地使用包含核苷酸標(biāo)簽序列和靶核苷酸識別序列的加標(biāo)簽引物將核苷酸標(biāo)簽摻入靶多核苷酸，其中靶核苷酸識別序列與靶核苷酸序列雜交。實(shí)施擴(kuò)增反應(yīng)，典型地PCR以將加標(biāo)簽引物摻入靶多核苷酸(即，產(chǎn)生包含核苷酸標(biāo)簽序列和靶核苷酸序列的擴(kuò)增子)。
[0116]當(dāng)調(diào)節(jié)寡核苷酸與探針寡核苷酸沿著調(diào)節(jié)序列雜交時(shí)，報(bào)告物分子和猝滅劑分子被定位與彼此足夠近，如此以致無論何時(shí)該報(bào)告物分子被激發(fā)，激發(fā)態(tài)的能量非輻射地轉(zhuǎn)移至猝滅劑分子，其中猝滅劑分子非輻射地消散或在不同于報(bào)告物分子的發(fā)射頻率的發(fā)射頻率發(fā)射。在通過DNA聚合酶的鏈延伸過程中，探針寡核苷酸與模板退火并用作引物。結(jié)果，探針被摻入擴(kuò)增子并從猝滅劑分子有效分離報(bào)告物分子，如此以致猝滅劑分子不再與報(bào)告物分子足夠近以猝滅報(bào)告物分子的熒光。因此，由于擴(kuò)增過程中越來越多的探針寡核苷酸被摻入雙鏈多核苷酸，較大數(shù)目的報(bào)告物分子從與猝滅劑分子極為接近的相互作用中被釋放出，因此導(dǎo)致遞增數(shù)目的未被猝滅的報(bào)告物分子，產(chǎn)生越來越強(qiáng)的熒光信號。典型地在其中高于未被摻入的探針寡核苷酸的期望的比例與調(diào)節(jié)寡核苷酸雜交的條件下實(shí)施檢測。在檢測的任何階段的過程中，與調(diào)節(jié)寡核苷酸雜交的未被摻入的探針寡核苷酸的量優(yōu)選地大于總的未被摻入的探針寡核苷酸的50%、80%、90%、95%、99%、99.5%,99.9%,99.95%或更多。還選擇檢測條件，如此以致與摻入的探針寡核苷酸相比，不與調(diào)節(jié)寡核苷酸締合的未被摻入的探針寡核苷酸的量是低的。在檢測的任何階段的過程中，不與調(diào)節(jié)寡核苷酸締合的未被摻入的寡核苷酸的量優(yōu)選地小于被摻入的探針寡核苷酸的50%、20%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05% 或更少。
[0117]在多種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用一種或多種探針寡核苷酸檢測一種或多種靶核酸、典型地一種或多種靶多核苷酸的方法。通過從識別探針上調(diào)節(jié)序列的調(diào)節(jié)寡核苷酸救出探針可調(diào)節(jié)探針寡核苷酸的信號?？稍诰哂信c探針寡核苷酸上的調(diào)節(jié)序列部分或完全互補(bǔ)的調(diào)節(jié)寡核苷酸中的序列區(qū)段中編碼識別。
[0118]多種因素影響雜交和擴(kuò)增試驗(yàn)中報(bào)告物-猝滅劑分子對的利用。第一因素是猝滅劑分子猝滅報(bào)告物分子的效率。該第一個(gè)因素，本文指定為“RQ-”，可通過當(dāng)探針不與完全互補(bǔ)的多核苷酸雜交時(shí)報(bào)告物分子與猝滅劑分子的熒光發(fā)射比被表征。即，RQ_是當(dāng)探針寡核苷酸與調(diào)節(jié)寡核苷酸雜交時(shí)，報(bào)告物分子的熒光發(fā)射與轉(zhuǎn)移至猝滅劑分子的能量的比。對RQ-值的影響包括，例如，使用的特定的報(bào)告物和猝滅劑分子、雜交復(fù)合物中報(bào)告物和猝滅劑分子之間的間距、核苷酸序列特異性作用和結(jié)構(gòu)的靈活性的程度和雜質(zhì)的存在。相關(guān)的數(shù)量RQ+，指當(dāng)探針寡核苷酸與互補(bǔ)的多核苷酸雜交時(shí)，報(bào)告物分子的熒光發(fā)射與轉(zhuǎn)移至猝滅劑分子的能量的比。
[0119]第二因素是探針與互補(bǔ)的多核苷酸雜交的效率。該第二因素取決于探針的解鏈溫度Tm、探針或靶多核苷酸中二級結(jié)構(gòu)的存在、反應(yīng)的溫度和其他反應(yīng)條件。[0120]第三因素是調(diào)節(jié)寡核苷酸與探針寡核苷酸雜交的效率。
[0121]該第三因素取決于調(diào)節(jié)寡核苷酸的解鏈溫度Tm、調(diào)節(jié)寡核苷酸和探針寡核苷酸之間互補(bǔ)性的程度、探針或調(diào)節(jié)寡核苷酸中二級結(jié)構(gòu)的存在、反應(yīng)的溫度和其他反應(yīng)條件。
[0122]第四因素是報(bào)告物分子附近的寡核苷酸序列。取決于序列，探針的熒光強(qiáng)度被雜交增強(qiáng)或減弱。通過與包含脫氧鳥苷核苷酸(Gs)的序列的雜交觀察到猝滅的強(qiáng)烈程度，給出突光中序列特異性的減弱。關(guān)于該效應(yīng)另外的討論，見Crocket等人，AnalyticalBiochemistry, 290:89-97 (2001)和 Behlke 等人，F(xiàn)luorescence Quenching by ProximalG-bases (在萬維網(wǎng):http: double backslash cdn.1dtdna.com/Support/Technical/TechnicalBulIetinPDF/Fluorescence_quench ing_by_proximal_G_bases.pdf 可得X
[0123]優(yōu)選地，報(bào)告物分子是衍生化用于通過連接部分附著至探針寡核苷酸和調(diào)節(jié)寡核苷酸的3’端碳或5’端碳的熒光有機(jī)染料。優(yōu)選地，猝滅劑分子也是有機(jī)染料，其可以是或可以不是熒光的，取決于本發(fā)明的實(shí)施方案。例如，在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，猝滅劑分子是熒光的。通常無論猝滅劑分子是熒光的還是通過非放射性衰變僅僅釋放從報(bào)告物分子轉(zhuǎn)移的能量，猝滅劑的吸收譜帶與報(bào)告物分子的熒光發(fā)射譜帶應(yīng)基本上重疊。吸收來自被激發(fā)的報(bào)告物分子的能量但并不輻射地釋放能量的非熒光猝滅劑分子(NFQM)，諸如Black Hole粹滅劑是本領(lǐng)域已知的并可被使用。 [0124]文獻(xiàn)中具有可得的用于選擇用于特定探針的適合的報(bào)告物-猝滅劑對的大量的實(shí)用指導(dǎo)，如通過下面的參考文獻(xiàn)示例的:Clegg (以上引用)；Wu等人(以上引用)；Pesce等人，編者，F(xiàn)luorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971) ;White 等人，F(xiàn)luorescence Analysis:A Practical Approach(Marcel Dekker, New York, 1970)；等等。文獻(xiàn)還包含提供熒光分子和NFQM和用于選擇報(bào)告物-猝滅劑對的它們的相關(guān)的光學(xué)性質(zhì)的詳細(xì)列表的參考文獻(xiàn)，例如，Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra ofAromatic Molecules,第 2版(Academic Press, New York, 1971) !Griffiths, Colour andConstitution of Organic Molecules (Academic Press, Mew York, 1976) ;Bishop,編者，Indicators(Pergamon Press, Oxford, 1972) ；Haugland, Handbook of Fluorescent Probesand Research Chemicals(Molecular Probes, Eugene, 1992)Pringsheim, Fluorescenceand Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949);等等。此外，文獻(xiàn)中具有關(guān)于衍生化報(bào)告物分子和猝滅劑分子，用于通過可被添加至寡核苷酸的常見的反應(yīng)基團(tuán)的共價(jià)附著廣泛的指導(dǎo)，如通過以下的參考文獻(xiàn)示例的=Haugland (以上引用)；Ullman等人，美國專利號3，996，345 ；Khanna等人，美國專利號4，351，760 ;等等。
[0125]報(bào)告物-猝滅劑對的示例可選自咕噸染料，包括熒光素和若丹明染料。具有對它們的苯基部分的取代的這些化合物的許多適合的形式是商業(yè)廣泛可得的，其可被用作用于鍵合的位點(diǎn)或用作用于附著至寡核苷酸的鍵合官能。另一組熒光化合物是在α或β位置具有氨基的萘胺。被包括在此萘胺化合物中的是1-二甲氨基萘基-5-磺酸鹽、1-苯胺基-8-萘磺酸鹽和2-對-甲苯胺基-6-萘磺酸鹽。其他染料包括3-苯基-7-香豆素異氰酸酯、吖啶，諸如9-異硫氰酸吖啶和吖啶橙；Ν-(對-(2-苯并惡唑基)苯基)馬來酰亞胺；苯并惡二唑、均二苯乙烯、芘，等等。
[0126]優(yōu)選地，報(bào)告物和猝滅劑分子選自熒光素和若丹明染料。這些染料和用于附著至寡核苷酸的適合的連接方法在許多參考文獻(xiàn)中被描述，例如，Khanna等人(以上引用)；Marshall, Histochemical J.，7:299-303 (1975) ;Menchen 等人，美國專利號 5，188,934 ；Menchen等人，歐洲專利申請87310258.0 ;和Bergot等人，國際申請PCT/US90/05565。在此通過引用并入后4個(gè)文件。
[0127]在特定實(shí)施方案中，可被用作用于探針的可檢測標(biāo)記物的熒光團(tuán)包括，但不限于， 若丹明、花青 3 (Cy3)、花青 5 (Cy5)、熒光素、VicTM、LizTM、Tami'aTM、5-FamTM、6-FamTM、6-HEX、 CAL Fluor Green520. CALFluor Gold540、CAL Fluor 0range560、CAL Fluor Red590、CAL Fluor Red610、CAL Fluor Red615、CAL Fluor Red635 和 Texas Red (Molecular Probes)。 (VicTM、LizTM、TamraTM、5-FamTM、6_FamTM 從 Applied Biosystems, Foster City, Calif 都是可 得的。6-HEX 和 CAL Fluor 染料從 Biosearch Technologies 可得）。
[0128]在特定實(shí)施方案中，用作猝滅劑的分子包括，但不限于四甲基若丹明 (TAMRA)、DABCYL (DABSYL、DABMI或甲基紅）蒽醌、硝基噻唑、硝基咪唑、孔雀綠、Black
Hole Quenchers?，例如，BHQ1 (Biosearch Technologies)、Iowa Black? 或 ZEN 粹滅劑
(來自 Integrated DNA Technologies，Inc. )、TIDE Quencher2 (TQ2)和 TIDE Quencher3 (TQ3)(來自 AAT Bioquest)。
[0129]具有用于將報(bào)告物或猝滅劑分子附著至寡核苷酸的5’或3’端的許多連 接部分和方法，如通過以下參考文獻(xiàn)示例的：Eckstein，編者，Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach(IRL Press, Oxford, 1991) ；Zuckerman 等 人，Nucleic Acids Research, 15:5305-5321 (1987)(寡核音酸上的 3’ 硫醇基團(tuán)）； Sharma 等人，Nucleic Acids Research, 19:3019(1991) (3，疏基）；Giusti 等人，PCR Methods and Applications，2:223-227 (1993)和 Fung 等人，美國專利號 4，757，141 (經(jīng)由從 Applied Biosystems, Foster City, Calif.可得的 Aminolink?II 的 5，憐 酸氨基）；Stabinsky,美國專利號4，739，044 (3’氨焼基磷酸基團(tuán)）；Agrawal等人， Tetrahedron Letters, 31:1543-1546 (1990)(通過氨基憐酸酯連接鍵附著）；Sproat 等 人，Nucleic Acids Research, 15:4837(1987) (5，疏基）；Nelson 等人，Nucleic Acids Research, 17:7187-7194(1989) (3，氨基）；等等。
[0130]優(yōu)選地，在合成過程中釆用可附著至寡核苷酸的商業(yè)可得的連接部分， 例如，從 Integrated DNA Technologies(Coralvlille,Iowa)或 Eurofins MWG Operon (Huntsville, Alabama)可得的。
[0131]若丹明和熒光素染料還通過用亞磷酰胺部分衍生化染料的方式在固相合成的 結(jié)束時(shí)方便地附著至寡核苷酸的5’羥基，例如，Woo等人，美國專利號5，231，191 ;和 Hobbs, Jr.，美國專利號 4，997，928。
[0132]通過審慎地選擇標(biāo)記物，可進(jìn)行分析，其中在單個(gè)反應(yīng)中不同的波長下激 活和/或檢測不同的標(biāo)記物。見，例如，F(xiàn)luorescence Spectroscopy (Pesce等人， 編者）Marcel Dekker,New York, (1971) ；White 等人，F(xiàn)luorescence Analysis:A Practical Approach, Marcel Dekker,New York, (1970) ;Berlman，Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules， 第 2 片反，Academic Press,New York, (1971) ;Griffiths，Colour and Constitution of Organic Molecules, Academic Press,New York, (1976) ;Indicators(Bishop，Ed. )? Pergamon Press,Oxford,19723 ； 和 Haugland，Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Eugene (1992)?？蓪?bào)告物和猝滅劑策略性地定位在探針寡核苷酸和調(diào)節(jié)寡核苷 酸上以維持這些標(biāo)記物之間的期望的距離。典型地，報(bào)告物和猝滅劑分子之間的距離將被
18最小化以增加猝滅劑分子的效率?？刹呗孕缘剡x擇報(bào)告物和猝滅劑分子的定位，如此以致當(dāng)探針寡核苷酸與調(diào)節(jié)寡核苷酸雜交時(shí)，報(bào)告物和粹滅劑分子相距小于20nm、10nm、7.5nm、6nm、5nm、4nm、3nm、lnm、0.8nm、0.6nm、0.4nm或更少。優(yōu)選地，在探針寡核苷酸/調(diào)節(jié)寡核苷酸雜交的情況下，報(bào)告物分子和猝滅劑分子可沿著調(diào)節(jié)序列被定位在互補(bǔ)核苷酸處。更優(yōu)選地，報(bào)告物和猝滅劑分子可定位在寡核苷酸探針的5’末端和調(diào)節(jié)寡核苷酸的3’末端。
[0133]擴(kuò)增方法
[0134]總述
[0135]在說明性實(shí)施方案中，可在兩個(gè)或多個(gè)不同的樣品的每一個(gè)中擴(kuò)增靶核酸的相同的組。樣品可以以任何方式與另一個(gè)樣品不同，例如，樣品可來自不同的組織、受試者、環(huán)境來源，等等。
[0136]與加標(biāo)簽引物和/或反向引物的豐度相比，可以以不同的豐度在擴(kuò)增混合物中提供探針寡核苷酸。更具體地，探針寡核苷酸可以以超過加標(biāo)簽引物存在。在說明性實(shí)施方案中，反向引物可以以超過加標(biāo)簽引物的濃度在擴(kuò)增混合物中存在。例如，相對于加標(biāo)簽引物和/或反向引物的濃度，擴(kuò)增混合物中探針寡核苷酸的濃度可以是至少1.5倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1O3倍、至少5 X 1O3倍、至少1O4倍、至少5X104倍、至少1O5倍、至少5X105倍、至少1O6倍或更高。在說明性實(shí)施方案中，加標(biāo)簽引物可以以皮摩爾至納摩爾的濃度存在，例如，約500nM至5μ Μ、約1OOnM至5 μ Μ、約50nΜ 至 5 μ M、約 1OnM 至 5 μ M、約 5nΜ 至 5 μ M、約 1nM 至 10μuM、約50uM至 500 μ M、約100 μ M或具有任何這些值作為端點(diǎn)的任何其他范圍(例如，1OnM至50 μ M )。可在與正向引物的任何這些濃度組合使用的探針寡核苷酸的適合、說明性濃度包括約1OnM至約10 μ Μ、約 25nΜ 至約 7.5 μ M、約 50nΜ 至約 5 μ M、約 75nΜ 至約 2.5 μ M、約 1OOnM 至約 1 μ M、約250nΜ至約750nΜ、約500nΜ或具有任何這些值作為端點(diǎn)的任何其他范圍(例如，1OnM至50 μ M )。
[0137]可使每一個(gè)擴(kuò)增混合物經(jīng)受擴(kuò)增以制備包含加標(biāo)簽的靶核苷酸序列的靶擴(kuò)增子，該加標(biāo)簽的靶核苷酸序列包含核苷酸標(biāo)簽。在某些實(shí)施方案中，選擇核苷酸標(biāo)簽以避免與靶核酸的基本退火。在此類實(shí)施方案中，加標(biāo)簽的靶核苷酸序列可包括具有以下元件的分子:5’ -(來自加標(biāo)簽引物的核苷酸標(biāo)簽)-(靶核苷酸序列)_3’。
[0138]在說明性的實(shí)施方案中，核苷酸標(biāo)簽序列鑒定特定的多態(tài)性變體。因此，例如，可擴(kuò)增一組T個(gè)靶核酸，各包含S個(gè)多態(tài)性變體，其中S和T是整數(shù)，典型地大于1。在此類實(shí)施方案中，可單獨(dú)地執(zhí)行關(guān)于每一個(gè)靶核酸的擴(kuò)增，其中不同的加標(biāo)簽引物被用于每一個(gè)多態(tài)性變體。具有對應(yīng)的核苷酸標(biāo)簽的不同的探針寡核苷酸可被用于每一個(gè)多態(tài)性變體。該實(shí)施方案具有減少將需要被合成以鑒定所產(chǎn)生的關(guān)于多個(gè)靶序列的擴(kuò)增子中多態(tài)性變異的不同的探針寡核苷酸數(shù)目的優(yōu)勢?？蛇x地，可采用不同組的加標(biāo)簽引物和反向引物用于每一個(gè)靶，其中每一個(gè)組具有用于每一個(gè)多態(tài)性變體的不同于其他組中的引物的一組核苷酸標(biāo)簽，且不同的探針寡核苷酸被用于每一個(gè)樣品，其中探針寡核苷酸具有對應(yīng)組的核苷酸標(biāo)簽序列和不同的報(bào)告物分子。在任何一種情況下，擴(kuò)增產(chǎn)生來自每一個(gè)樣品的具有等位基因特異性的報(bào)告物分子的一組T個(gè)擴(kuò)增子。特異性識別每一個(gè)探針寡核苷酸中不同的調(diào)節(jié)序列的調(diào)節(jié)寡核苷酸提供對應(yīng)的猝滅劑分子。[0139]在實(shí)施方案中，其中相同組的加標(biāo)簽引物和反向引物被用于每一個(gè)樣品，用于每一個(gè)靶的加標(biāo)簽引物和反向引物可以最初與樣品分開地組合，且每一個(gè)探針寡核苷酸/調(diào)節(jié)寡核苷酸組可最初與其對應(yīng)的樣品組合。最初組合的加標(biāo)簽引物和反向引物的等份可隨后被添加至樣品和探針寡核苷酸/調(diào)節(jié)寡核苷酸組的最初組合的等份?？稍谀軌蚪?jīng)受適于擴(kuò)增的條件的任何物品中形成這些擴(kuò)增混合物。例如，在擴(kuò)增之前，擴(kuò)增混合物可在微流控裝置的分開的室中形成或分配入微流控裝置的分開的室中。在說明性實(shí)施方案中，適合的微流控裝置包括矩陣型微流控裝置，諸如以下描述的那些。
[0140]可采用任何擴(kuò)增方法以從擴(kuò)增混合物中制備擴(kuò)增子。在說明性實(shí)施方案中，采用PCR。
[0141]PCR熱循環(huán)操作說明是本領(lǐng)域眾所周知的。典型地，PCR由一系列20-40個(gè)循環(huán)組成。例如，且不限制，循環(huán)可包含變性步驟、退火步驟(允許引物與單鏈DNA模板退火)和延伸/延長步驟。
[0142]通常持續(xù)至少3個(gè)循環(huán)實(shí)施擴(kuò)增以引入核苷酸標(biāo)簽。在多種實(shí)施方案中，持續(xù)5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個(gè)循環(huán)，或持續(xù)落入具有任何這些值作為端點(diǎn)的范圍(例如，5-10個(gè)循環(huán))內(nèi)的任何數(shù)目的循環(huán)實(shí)施擴(kuò)增。在特定實(shí)施方案中，持續(xù)足夠數(shù)目的循環(huán)實(shí)施擴(kuò)增以根據(jù)靶并根據(jù)樣品標(biāo)準(zhǔn)化靶擴(kuò)增子拷貝數(shù)(例如，15、20、25、30、35、40、45或50個(gè)循環(huán)，或持續(xù)落入具有任何這些值作為端點(diǎn)的范圍內(nèi)的任何數(shù)目的循環(huán))。
[0143]為了說明且不限制，一個(gè)示例性的操作說明包含熱啟動(dòng)步驟[95°C，持續(xù)5min]、35個(gè)循環(huán)的降落式PCR策略[95°C持續(xù)15sec、64°C持續(xù)45sec和72°C持續(xù)15sec的I個(gè)循環(huán)；95°C持續(xù) 15sec、63°C持續(xù) 45sec 和 72°C持續(xù) 15sec 的一個(gè)循環(huán)；95°C持續(xù) 15sec、62°C持續(xù)45sec和72°C持續(xù)15sec的I個(gè)循環(huán)；95°C持續(xù)15sec、61°C持續(xù)45sec和72°C持續(xù)15sec的I個(gè)循環(huán)；和95°C持續(xù)15sec、62°C持續(xù)45sec和72°C持續(xù)15sec的34個(gè)循環(huán)]、和冷卻步驟[25°C持續(xù)IOsec的I個(gè)循環(huán)]。
·[0144]以上描述的方法的特定的實(shí)施方案提供了基本上一致的擴(kuò)增，產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)靶擴(kuò)增子，其中大部分?jǐn)U增子以相對接近于對一個(gè)或多個(gè)靶擴(kuò)增子計(jì)算的平均拷貝數(shù)的水平存在。因此，在多種實(shí)施方案中，至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的靶擴(kuò)增子以大于靶擴(kuò)增子的拷貝的平均數(shù)的50%并小于靶擴(kuò)增子的拷貝的平均數(shù)的2倍存在。
[0145]在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了用于擴(kuò)增多個(gè)靶核苷酸的方法，其中探針寡核苷酸的摻入任選地被省略且在擴(kuò)增過程中靶核苷酸序列被加標(biāo)簽。更具體地，本發(fā)明提供了用于擴(kuò)增典型地多個(gè)樣品中的多個(gè)靶核酸的方法，其需要制備用于每一個(gè)靶核酸的擴(kuò)增子混合物。每一個(gè)擴(kuò)增混合物包含含有靶特異性序列的加標(biāo)簽引物和含有靶特異性序列的反向引物。使擴(kuò)增混合物經(jīng)受擴(kuò)增以產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)靶核苷酸的擴(kuò)增子。靶核苷酸序列隨后被提供了一個(gè)或多個(gè)組的探針寡核苷酸/調(diào)節(jié)寡核苷酸，其中探針寡核苷酸識別與每一個(gè)多態(tài)性變體相關(guān)的核苷酸標(biāo)簽。在多種實(shí)施方案中，可執(zhí)行第二擴(kuò)增反應(yīng)以摻入探針寡核苷酸。在可選的實(shí)施方案中，探針寡核苷酸與加標(biāo)簽的靶核酸雜交，其中調(diào)節(jié)寡核苷酸用作競爭性劑。在此類實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)寡核苷酸具有與探針寡核苷酸上的核苷酸標(biāo)簽識別序列部分重疊的輔助序列將是特別有利的。當(dāng)沿著調(diào)節(jié)序列比對探針寡核苷酸和調(diào)節(jié)寡核苷酸時(shí)，沿著相同的核苷酸，與加標(biāo)簽的靶核酸相比，輔助序列具有與探針寡核苷酸的減少的互補(bǔ)性將是進(jìn)一步有利的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該輔助序列將位于調(diào)節(jié)寡核苷酸的5，末端。
[0146]可根據(jù)調(diào)節(jié)寡核苷酸和探針寡核苷酸之間的相互作用、及核苷酸標(biāo)簽和探針寡核苷酸之間的相互作用的強(qiáng)度的不同調(diào)整調(diào)節(jié)寡核苷酸對探針寡核苷酸的競爭性?？蓸?biāo)準(zhǔn)化競爭，如此以致所采集的信號相對于具有特定的多態(tài)性變體的加標(biāo)簽的靶核酸的平均拷貝數(shù)是成比例的。
[0147]長-范闈PCR
[0148]在多種實(shí)施方案中，被擴(kuò)增的靶核苷酸序列可以是，例如25個(gè)堿基、50個(gè)堿基、100個(gè)堿基、200個(gè)堿基、500個(gè)堿基或750個(gè)堿基。在以上描述的方法的某些實(shí)施方案中，可采用長-范圍擴(kuò)增方法，諸如長-范圍PCR以從擴(kuò)增混合物中產(chǎn)生擴(kuò)增子。長-范圍PCR允許從I或幾千堿基(kb)至超過50kb的范圍的靶核苷酸序列的擴(kuò)增。在多種實(shí)施方案中，被長-范圍PCR擴(kuò)增的靶核苷酸序列的長度至少約lkb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、llkb、12kb、13kb、14kb、15kb、20kb、25kb、30kb、35kb、40kb、45kb 或 50kb。革巴核苷酸序列還可落入具有任何這些值作為端點(diǎn)的任何范圍(例如,25個(gè)堿基至100個(gè)堿基或5kb_15kb)內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，在以上描述的方法中使用長-范圍PCR可產(chǎn)生多個(gè)革巴擴(kuò)增子，其中至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、或至少70%的靶擴(kuò)增子以大于靶擴(kuò)增子的拷貝的平均數(shù)的50%并小于靶擴(kuò)增子的拷貝的平均數(shù)的2倍存在。
[0149]長-范圍PCR是本領(lǐng)域眾所周知的。見，例如，Cheng S，F(xiàn)ockler C, Barnes WM, Higuchi R(1994 年 6 月)"Effective amplification of long targets from clonedinserts and human genomic DNA〃.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.91 (12): 5695-9。適于在此處描述的方法中使用的用于長-范圍PCR的酶、操作說明和試劑盒是商業(yè)可得的；實(shí)例包括:SequalPrep?Long PCR Kit (Invitrogen, USA) > PfuUltra? II Fusion HS DNA 聚合
酶(Stratagene)、Phusioil? DNA 聚合酶、Phusioil? Flash High Fidelity PCR MasterMix (Finnzymes)。
[0150]在某些實(shí)施方案中，在擴(kuò)增過程中或之后可，例如，通過定量實(shí)時(shí)PCR定量擴(kuò)增混合物中產(chǎn)生的靶擴(kuò)增子的量。
[0151]數(shù)字PCR
[0152]在一些實(shí)施方案中，以包含平均0.8至1.6的擴(kuò)增模板范圍每孔，或在一些實(shí)施方案中，一個(gè)擴(kuò)增模板每孔或每室的樣品濃度將樣品裝載入擴(kuò)增裝置中，例如，PCR板或微流控裝置。制備裝置中每一個(gè)孔或室，如此以致其包含適合的加標(biāo)簽引物和反向引物和探針寡核苷酸/調(diào)節(jié)寡核苷酸組的相關(guān)組合。關(guān)于“數(shù)字PCR”的討論，見，例如，Vogelstein和Kinzler, 1999, Proc Natl Acad Sci USA96:9236-41 ;McBride 等人,美國專利申請公布號20050252773，特別是實(shí)施例5 (這些出版物的每一個(gè)在此都通過引用整體被并入)。數(shù)字?jǐn)U增方法可利用適于數(shù)字PCR的特定-高-通量裝置，諸如典型包括大量的和/或高密度的小體積反應(yīng)位點(diǎn)的微流控裝置(例如，納米體積反應(yīng)位點(diǎn)或反應(yīng)室)。在說明性實(shí)施方案中，使用微流控裝置諸如以下描述的數(shù)字陣列微流控裝置(Digital Array microfluidicdevice)執(zhí)行數(shù)字?jǐn)U增。數(shù)字?jǐn)U增可限定分配或劃分放置在反應(yīng)/分析平臺(tái)或微流控裝置中的數(shù)以百計(jì)至數(shù)以千計(jì)的反應(yīng)混合物中的樣品。在計(jì)數(shù)例如在反應(yīng)端點(diǎn)處的陽性擴(kuò)增結(jié)果的數(shù)目時(shí)，技術(shù)人員逐個(gè)計(jì)數(shù)存在于輸入的樣品中的個(gè)體模板分子。數(shù)字?jǐn)U增的主要優(yōu)勢是定量獨(dú)立于擴(kuò)增效率的變化一成功的擴(kuò)增被計(jì)數(shù)為I分子，獨(dú)立于產(chǎn)物的實(shí)際的量。
[0153]在某些實(shí)施方案中，可在樣品核酸的預(yù)擴(kuò)增之后實(shí)施數(shù)字?jǐn)U增。典型地，持續(xù)有限數(shù)目的熱循環(huán)(例如，5個(gè)循環(huán)或10個(gè)循環(huán))執(zhí)行在數(shù)字?jǐn)U增之前的預(yù)擴(kuò)增。在某些實(shí)施方案中，預(yù)擴(kuò)增過程中熱循環(huán)數(shù)可從約4至15個(gè)熱循環(huán)或約4-10個(gè)熱循環(huán)的范圍。在某些實(shí)施方案中，熱循環(huán)數(shù)可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或大于15。以上描述的產(chǎn)生用于DNA測序的包含接頭序列的擴(kuò)增子的擴(kuò)增可被典型的預(yù)擴(kuò)增步驟取代。
[0154]數(shù)字?jǐn)U增方法在美國專利號20090239308中被描述，其在此通過引用整體且特別地關(guān)于其數(shù)字?jǐn)U增方法和裝置的公開被并入。通常，在數(shù)字?jǐn)U增中，相同的(或基本上相似的)擴(kuò)增反應(yīng)在核酸樣品諸如基因組DNA上運(yùn)行。對于給定的核酸樣品的個(gè)體反應(yīng)的數(shù)目可從約2至超過1，000, 000而不同。典型地，在樣品上執(zhí)行的反應(yīng)數(shù)為約100或更大、更典型地約200或更大且甚至更典型地約300或更大。還可執(zhí)行較大規(guī)模的數(shù)字?jǐn)U增，其中在樣品上執(zhí)行的反應(yīng)數(shù)為約500或更大、約700或更大、約765或更大、約1，000或更大、約2，500或更大、約5，000或更大、約7，500或更大、或約10，000或更大。執(zhí)行的反應(yīng)數(shù)還可以顯著較高，諸如直至約25，000、直至約50，000、直至約75，000、直至約100，000、直至約250，000、直至約500，000、直至約750，000、直至約I, 000，000或甚至大于I, 000，000分析每基因組樣品。
[0155]在特定的實(shí)施方案中，通常選擇使經(jīng)受數(shù)字?jǐn)U增的核酸的量，如此以致當(dāng)分布在不連續(xù)的反應(yīng)混合物中時(shí)，每一個(gè)個(gè)體擴(kuò)增反應(yīng)預(yù)期包括一個(gè)或更少的可擴(kuò)增的核酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定如以上描述產(chǎn)生的靶擴(kuò)增子的濃度并計(jì)算用于在數(shù)字?jǐn)U增中使用的適合的量。更方便地，可檢測一組連續(xù)稀釋的祀擴(kuò)增子。例如，從Fluidigm Corp.商業(yè)可得的裝置，如12.765數(shù)字陣列微流控裝置允許12個(gè)不同的稀釋物被同時(shí)檢測。任選地，可通過產(chǎn)生線性回歸圖確定適合的稀釋。對于最佳的稀釋，線應(yīng)是直的并經(jīng)過原點(diǎn)。隨后，可從圖計(jì)算初始樣品的濃度。
[0156]可將靶擴(kuò)增子的適合的量分布進(jìn)入不連續(xù)的位置或反應(yīng)孔或室，如此以致每一個(gè)反應(yīng)包括，例如平均不超過約I個(gè)擴(kuò)增子每體積。在分布之前或之后，可將靶擴(kuò)增子與探針
寡核苷酸/調(diào)節(jié)寡核苷酸組組合。
[0157]分配之后，使反應(yīng)混合物經(jīng)受擴(kuò)增以鑒定包含靶擴(kuò)增子的那些反應(yīng)混合物?？刹捎萌魏螖U(kuò)增方法，但方便地，使用PCR，例如，實(shí)時(shí)PCR或終點(diǎn)PCR。該擴(kuò)增可采用能夠擴(kuò)增靶擴(kuò)增子的探針寡核苷酸。在特定實(shí)施方案中，提供了所有的或一些探針寡核苷酸、調(diào)節(jié)寡核苷酸、加標(biāo)簽引物和反向引物。在可選的實(shí)施方案中，探針寡核苷酸可與先前擴(kuò)增步驟中引入的核苷酸標(biāo)簽退火。
[0158]任何靶擴(kuò)增子的濃度(拷貝/μ I)與陽性(即，包含擴(kuò)增產(chǎn)物)反應(yīng)混合物的數(shù)量相關(guān)。見美國專利公布號20090239308，其通過引用被并入用于所有目的，且特別地用于數(shù)字 PCR 結(jié)果的分析。還見 Bube 等人，2008，"Mathematical Analysis of Copy NumberVariation in a DNA Sample Using Digital PCR on a Nanofluidic Device^PLoS0NE3 (8):e2876.do1:10.1371/journal, pone.0002876，其通過引用被并入用于所有目的且特別地用于數(shù)字PCR結(jié)果的分析。
[0159]在通過數(shù)字PCR用于DNA測序的樣品校準(zhǔn)的說明性實(shí)施方案中，包含粗略地100-360個(gè)擴(kuò)增子每μ I的PCR反應(yīng)混合物可被裝載至以下描述的數(shù)字陣列微流控裝置，諸如 Fluidigm Corporation (South San Francisco, Calif.)的 12.765 數(shù)字陣列微流控裝置。微流控芯片具有12塊板，且每一塊包含765個(gè)室?？煞治鰯?shù)字芯片上的重復(fù)的板以獲得靶核酸的初始濃度的絕對定量。
[0160]樣品核酸
[0161]可從生物來源獲得并使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法制備核酸制品(“樣品”)。特別地，在本文描述的方法中有用的DNA或RNA可從任何來源提取和/或擴(kuò)增，包括細(xì)菌、原生動(dòng)物、真菌、病毒、細(xì)胞器和高等生物諸如植物或動(dòng)物，特別地哺乳動(dòng)物、且更特別地人。還可從環(huán)境來源(例如，池塘水、空氣樣品)、從人造產(chǎn)品(例如，食物)、從法醫(yī)樣品，等等獲得適合的核酸?？赏ㄟ^多種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)的任一種從細(xì)胞、體液(例如，血液、血液級分、尿，等)或組織樣品中提取或擴(kuò)增核酸。說明性的樣品包括血漿、血清、脊髓液、淋巴液、腹膜液、胸膜液、口液(oral fluid)和皮膚的外部切片的樣品；來自呼吸器官、腸道、生殖器和尿路的樣品；淚液、唾液、血細(xì)胞、干細(xì)胞或腫瘤的樣品。例如，胎兒DNA的樣品可從胚胎或從母血中獲得。可從活的或死亡的生物體或從體外培養(yǎng)物中獲得樣品。說明性的實(shí)例可包括單個(gè)細(xì)胞、石蠟包埋的組織樣品和針吸活檢。本發(fā)明中有用的核酸還可源自一種或多種核酸文庫，包括cDNA、粘粒、YAC、BAC、PU PAC文庫，等等。
[0162]可使用本領(lǐng)域眾所周知的方法分離感興趣的核酸，特定方法的選擇取決于核酸的來源、性質(zhì)和相似的因素。樣品核酸不需要呈純化形式，但典型地足夠純以允許本發(fā)明方法的擴(kuò)增步驟被執(zhí)行。當(dāng)靶核酸是RNA時(shí)，可通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法并如例如在Sambrook, J., Fritsch, E.F.和 Maniatis, T., Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY,第 1、2、3 卷(1989)中描述的將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。隨后根據(jù)本發(fā)明 的方法分析cDNA。
[0163]靶核酸
[0164]可使用本發(fā)明的方法，檢測可在本發(fā)明的(本文描述的)編碼反應(yīng)中加標(biāo)簽的任何靶核酸。在典型的實(shí)施方案中，關(guān)于靶核酸的至少一些核苷酸序列信息將是已知的。例如，如果采用的編碼反應(yīng)是PCR，關(guān)于給定的靶核酸的每一個(gè)末端的足夠的序列信息通常是可用的以允許設(shè)計(jì)適合的擴(kuò)增引物。在可選的實(shí)施方案中，引物中的靶特異性序列可被隨機(jī)或簡并核苷酸序列取代。
[0165]靶可包括，例如，與病原體諸如病毒、細(xì)菌、原生動(dòng)物或真菌相關(guān)的核酸；RNA，例如其過量或低表達(dá)指示疾病的RNA、呈組織或發(fā)育特異性的方式表達(dá)的RNA ;或被特定刺激誘導(dǎo)的RNA ;可例如，在基因分型中分析其特定的多態(tài)性(諸如SNP)、等位基因或單體型的基因組DNA。具有特定興趣的是在遺傳疾病或其他病理中被改變(例如，擴(kuò)增、缺失和/或突變)的基因組DNA ;與期望的或非期望的性狀相關(guān)的序列；和/或獨(dú)特地鑒定個(gè)體(例如，法醫(yī)或親子鑒定中)的序列。
[0166]引物設(shè)計(jì)
[0167]適于核酸擴(kuò)增的引物足夠長以引導(dǎo)在用于聚合的劑的存在下延伸產(chǎn)物的合成。引物的確切長度和組成將取決于許多因素，包括，例如，退火反應(yīng)的溫度、引物的來源和組成，且當(dāng)采用探針時(shí)，將應(yīng)用與探針寡核苷酸和核苷酸標(biāo)簽的退火相同的原理設(shè)計(jì)加標(biāo)簽引物的核苷酸標(biāo)簽部分。還可以考慮引物:探針濃度的比。例如，取決于靶核酸序列的復(fù)雜性，寡核苷酸引物典型地包含識別靶向的核苷酸序列的約15至約30個(gè)核苷酸的范圍，盡管其可包含更多或更少的核苷酸。引物應(yīng)足夠互補(bǔ)以與它們各自的鏈選擇性地退火并形成穩(wěn)定的雙鏈體。本領(lǐng)域技術(shù)人員通曉如何選擇適合的引物對以擴(kuò)增感興趣的靶核酸。
[0168]可通過任何適合的方法制備引物，包括，例如，適合的序列的克隆和限制性或通過諸如Narang等人(1979) Meth.Enzymol.68:90-99的磷酸三酯方法；Brown等人(1979)Meth.Enzymol.68:109-151 的憐酸二酯方法；Beaucage 等人(1981) Tetra.Lett.，22:1859-1862的二乙基亞磷酰胺方法；美國專利號4，458，066的固體支持體方法，等等的方法直接的化學(xué)合成，或可從商業(yè)來源提供。
[0169]使用Sephadex 柱(Amersham Biosciences, Inc., Piscataway, N.J.)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法純化引物。引物純化可改進(jìn)本發(fā)明方法的靈敏性。
[0170]分析格式
[0171]可呈多種格式包括多孔格式和微流控格式諸如，但不限于，液滴系統(tǒng)(見，例如，Kiss等人，2008，Anal Chem80:8975-81.)和整合的微流控裝置實(shí)施本發(fā)明的分析。在一些實(shí)施方案中，在大于500nL或大于IyL的反應(yīng)體積中實(shí)施PCR擴(kuò)增反應(yīng)。例如，在一些實(shí)施方案中，在包含96-1536個(gè)孔的多孔板中實(shí)施PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，Ta為約57°C。在其他實(shí)施方案中，在小于IOOnL的反應(yīng)體積中實(shí)施PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，在微流控裝置中實(shí)施PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，Ta為約60°C。
[0172]微流控裝置
[0173]在某些實(shí)施方案中，可使用微流控裝置實(shí)施本發(fā)明的任何方法。在說明性實(shí)施方案中，該裝置是矩陣-型的，微流控裝置是允許在分開單獨(dú)的反應(yīng)室中多種基質(zhì)溶液和試劑溶液的同時(shí)組合的裝置。將被認(rèn)識的是，基質(zhì)溶液可包含一種或多種基質(zhì)且試劑溶液可包含一種或多種試劑。例如，微流控裝置可允許多種不同的擴(kuò)增引物和樣品的同時(shí)成對組合。在某些實(shí)施方案中，該裝置被配置以在每一個(gè)不同的室中包含引物和樣品的不同的組合。在多種實(shí)施方案中，分開的反應(yīng)室的數(shù)目可以大于50、通常大于100、更通常大于500、甚至更通常大于1000、且有時(shí)大于5000或大于10，000。
[0174]在特定實(shí)施方案中，矩陣-型微流控裝置是動(dòng)態(tài)陣列(“DA”)微流控裝置，該微流控裝置的一個(gè)實(shí)例在W005/107938A2的附圖21中顯示并在其中被描述。DA微流控裝置是旨在隔離樣品和試劑(例如，擴(kuò)增引物、檢測探針，等)的成對組合并適用于實(shí)施定性和定量PCR反應(yīng)包括實(shí)時(shí)定量PCR分析的矩陣-型微流控裝置。在一些實(shí)施方案中，至少部分從高彈體制造DA微流控裝置。DA微流控裝置在PCT公布W005/107938A2 (Thermal ReactionDevice and Method For Using The Same)和美國專利公布US20050252773A1 中被描述，關(guān)于它們的DA微流控裝置的描述，通過引用將二者整體并入本文。DA微流控裝置可包括高密度矩陣設(shè)計(jì)，該設(shè)計(jì)利用微流控裝置的層之間的流體連通孔(fluid communication via)以編織通過裝置的和層之間的控制線和流體線。憑借彈性塊的多層中的流體線，高密度反應(yīng)池排列是可能的?？蛇x地，DA微流控裝置可被設(shè)計(jì)以致所有的試劑和樣品通道在相同的彈性層，對照通道在不同的層。
[0175]美國專利公布號2008/0223721和PCT公布號W005/107938A2，通過應(yīng)用將二者并入本文，描述了可被用于實(shí)行本文描述的方法的說明性的矩陣-型裝置。W005/107938A2的附圖21顯示了具有第I彈性層2110 (第I層)和第二彈性層2120 (第2層)的說明性矩陣設(shè)計(jì)，每一個(gè)層具有在其中形成的流體通道。例如，將第I層2110中的試劑流體通道通過通孔2130連接至第2層2120中的試劑流體通道，同時(shí)第2層2120還具有樣品通道在其中，樣品通道和試劑通道分別終止于樣品和試劑室2180中。樣品和試劑室2180通過接口通道2150與彼此流體連通，接口通道2150具有與其連接的接口閥2140以控制反應(yīng)池2160的每一個(gè)室2180之間的流體連通。在使用中，首先關(guān)閉接口，隨后將試劑從試劑進(jìn)口引入試劑通道并通過樣品進(jìn)口將樣品引入樣品通道；隨后關(guān)閉密閉閥2170以隔離每一個(gè)反應(yīng)池2160與其他反應(yīng)池2160。隔離反應(yīng)池2160之后，打開接口閥2140以造成樣品室和試劑室與彼此流體連通使得期望的反應(yīng)可發(fā)生。從這個(gè)(和W005/107938A2中描述)將是明顯的是DA微流控裝置可被用于將M數(shù)目的不同樣品和N數(shù)目的不同試劑反應(yīng)。
[0176]盡管W005/107938中的以上描述的DA微流控裝置充分地適用于進(jìn)行本文描述的方法，但本發(fā)明不限于任何特定的裝置或設(shè)計(jì)?？蓪⒎珠_樣品和/或允許試劑和樣品獨(dú)立地成對地組合的任何裝置都可被使用。美國專利公布號20080108063 (其在此通過引用被整體并入)包含圖解說明的48.48動(dòng)態(tài)陣列IFC (Integrated Fluidic Circuit), 一個(gè)從Fluidigm Corp.(South San Francisco Calif.)商業(yè)可得的裝置。
[0177]將被理解的是其他配置是可能的并涉及諸如，例如，48X96 ；96X96 ；30X120,
坐寸ο
[0178]在特定實(shí)施方案中，微流控裝置可以是數(shù)字陣列微流控裝置，其適于執(zhí)行數(shù)字?jǐn)U增。此類裝置可具有將樣品和試劑的混合物分開進(jìn)入納升體積反應(yīng)室中的整合的通道和閥。在一些實(shí)施方案中，至少部分從高彈體制造數(shù)字陣列微流控裝置。說明性數(shù)字陣列微流控裝置在Fluidigm，Inc.擁有的待審美國專利諸如美國專利公布號20090239308中被描述。一個(gè)說明性的實(shí)施方案具有對應(yīng)于輸入至裝置的12個(gè)分開的樣品的12個(gè)輸入端口。裝置可具有12塊板，且12塊·板的每一塊都可包含765個(gè)6nL的反應(yīng)室，總的4.59 μ I體積每板。微流控通道可將板上不同的反應(yīng)室連接至流體源?？墒┘訅毫χ晾奂悠饕源蜷_和關(guān)閉將反應(yīng)室連接至流體源的閥。在說明性的實(shí)施方案中，可提供12個(gè)進(jìn)口用于裝載樣品試劑混合物?？墒褂?8個(gè)進(jìn)口以提供用于試劑的源，當(dāng)施加壓力至累加器時(shí)其被提供給芯片。此外，可提供兩個(gè)或多個(gè)進(jìn)口以提供與生物芯片的水化。水化進(jìn)口與裝置流體連通以促進(jìn)與反應(yīng)室有關(guān)的濕度控制。作為將被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的是，可被用于本裝置的制造的一些彈性材料是透氣性的，允許從反應(yīng)室蒸發(fā)的氣體或蒸汽通過彈性材料進(jìn)入周圍的大氣中。在特定實(shí)施方案中，位于裝置的外圍部分的流體線提供了水化流體的屏障，例如，生物芯片的外圍的緩沖液或主要的混合物包圍反應(yīng)室的板，因此減少或防止存在于反應(yīng)室中的液體蒸發(fā)。因此，通過向水化進(jìn)口添加揮發(fā)性液體例如水，可增加裝置的外圍部分的濕度。在特定的實(shí)施方案中，第一進(jìn)口與包圍生物芯片的第一側(cè)上的板的水化流體線流體連通且第二進(jìn)口與包圍生物芯片的另一側(cè)上的板的水化流體線流體連通。
[0179]盡管數(shù)字陣列微流控裝置完全適于實(shí)施本文描述的數(shù)字?jǐn)U增方法，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識到這些裝置的許多變化形式和替代選擇。從Fluidigm Corp.(South SanFrancisco, Calif.)商業(yè)可得的12.765動(dòng)態(tài)陣列的微流控裝置，包括12塊板，每一塊都具有6nL體積每反應(yīng)室、765個(gè)反應(yīng)室。然而，本文描述的數(shù)字?jǐn)U增方法不需要該幾何結(jié)構(gòu)(geometry)。給定的數(shù)字陣列微流控裝置的幾何結(jié)構(gòu)將取決于特定的應(yīng)用。涉及適于在本文描述的方法中使用的裝置的另外的描述在美國專利申請公布號2005/0252773中提供，通過引用將其關(guān)于數(shù)字陣列微流控裝置的公開并入本文。
[0180]在某些實(shí)施方案中，可使用提供用于反應(yīng)產(chǎn)物的回收的微流控裝置執(zhí)行本文描述的方法。此類裝置在2009年4月2日提交的同時(shí)待審的美國申請?zhí)?1/166，105中被詳細(xì)描述，在此通過引用將其整體和特別地將其關(guān)于允許反應(yīng)產(chǎn)物回收的微流控裝置和相關(guān)方法的描述并入。
[0181]
[0182]在特定實(shí)施方案中，使用實(shí)時(shí)定量方法。例如，可使用“定量實(shí)時(shí)PCR”方法以通過測量擴(kuò)增過程本身的過程中形成的擴(kuò)增產(chǎn)物的量確定存在于樣品中的靶核酸的量。監(jiān)測擴(kuò)增產(chǎn)物的形成的該方法包括在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的PCR產(chǎn)物積累的測量。
[0183]已開發(fā)了可用包含熒光指示劑的組合物執(zhí)行熱循環(huán)反應(yīng)，發(fā)射特定波長的光束、讀取熒光染料的強(qiáng)度并展示每一個(gè)循環(huán)之后的熒光的強(qiáng)度的裝置。包含熱循環(huán)儀、光束發(fā)射器和熒光信號檢測器的裝置已在例如美國專利號5，928，907,6, 015，674和6，174，670中被描述。
[0184]在一些實(shí)施方案中，可通過單獨(dú)的裝置執(zhí)行這些功能的每一個(gè)。例如，如果技術(shù)人員采用Q-β復(fù)制酶反應(yīng)用于擴(kuò)增，反應(yīng)可不在熱循環(huán)儀中發(fā)生，但可包括在特定波長發(fā)射的光束、熒光信號的檢測和擴(kuò)增產(chǎn)物的量的計(jì)算和展示。
[0185]在特定實(shí)施方案中，組合的熱循環(huán)和熒光檢測裝置可被用于靶核酸的精確定量。在一些實(shí)施方案中，可在一個(gè)或多個(gè)熱循環(huán)過程中或在一個(gè)或多個(gè)熱循環(huán)之后檢測并展示熒光信號，因此允許監(jiān)測作為呈“實(shí)時(shí)”發(fā)生的反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，技術(shù)人員可使用擴(kuò)增產(chǎn)物的量和擴(kuò)增循環(huán)數(shù)計(jì)算擴(kuò)增之前有多少靶核酸序列存在于樣品中。
[0186]根據(jù)一些實(shí)施方案，技術(shù)人員可容易監(jiān)測預(yù)先確定的循環(huán)數(shù)之后擴(kuò)增產(chǎn)物的量，該預(yù)先確定的循環(huán)數(shù)足夠指示樣品中靶核酸序列的存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易確定對于任何給定的樣品類型、引物序列和反應(yīng)條件，多少循環(huán)是足夠確定給定靶核酸的存在。
[0187]典型地在有助于報(bào)告物分子和猝滅劑分子締合的條件下執(zhí)行檢測?？蛇x擇適合的溫度以改進(jìn)用于信號采集的探針寡核苷酸和調(diào)節(jié)寡核苷酸的雜交。在特定實(shí)施方案中，選擇采集溫度，如此以致未被摻入的探針寡核苷酸的顯著比例與調(diào)節(jié)寡核苷酸雜交。該顯著比例的限制可根據(jù)本申請中另行規(guī)定的范圍確定。
[0188]根據(jù)某些實(shí)施方案，技術(shù)人員可采用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)以定量由熒光信號指示的擴(kuò)增產(chǎn)物。見，例如，美國專利號5，736，333。
[0189]在采用預(yù)擴(kuò)增的多種實(shí)施方案中，預(yù)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)足夠?qū)⒁粋€(gè)或多個(gè)核苷酸標(biāo)簽添加至靶核苷酸序列，以致加標(biāo)簽的靶核苷酸序列的相對拷貝數(shù)基本上代表樣品中靶核酸的相對拷貝數(shù)。例如，可持續(xù)2-20個(gè)循環(huán)實(shí)施預(yù)擴(kuò)增以引入樣品特異性核苷酸標(biāo)簽。在其他實(shí)施方案中，在指數(shù)擴(kuò)增結(jié)束時(shí)，即，在“穩(wěn)定”階段期間，實(shí)施檢測，或?qū)嵤┒它c(diǎn)PCR。在此情況下，預(yù)擴(kuò)增將根據(jù)靶并根據(jù)樣品標(biāo)準(zhǔn)化擴(kuò)增子拷貝數(shù)。在多種實(shí)施方案中，可持續(xù)約:2、4、10、15、20、25、30、35或40個(gè)循環(huán)或持續(xù)落入由任何這些值限定的任何范圍內(nèi)的循環(huán)數(shù)實(shí)施預(yù)擴(kuò)增和/或擴(kuò)增。
[0190]非期望的反應(yīng)成分的去除
[0191]將被領(lǐng) 會(huì)的是其中采用了多個(gè)反應(yīng)步驟的包括核酸的復(fù)雜混合物的反應(yīng)，可導(dǎo)致多種未被摻入的反應(yīng)成分，并且通過多種清除過程的任一種去除此類未被摻入的反應(yīng)成分或減少它們的濃度可改進(jìn)隨后發(fā)生的反應(yīng)的效率和特異性。在一些實(shí)施方案中，例如，在實(shí)施本文描述的擴(kuò)增步驟之前去除或減少預(yù)擴(kuò)增引物或加標(biāo)簽引物的濃度可以是需要的。
[0192]在某些實(shí)施方案中，非期望的成分的濃度可通過簡單的稀釋被降低。例如，在擴(kuò)增之前可將預(yù)擴(kuò)增的樣品稀釋約2、5、10、50、100、500、1000倍以改進(jìn)隨后擴(kuò)增步驟的特異性。
[0193]在一些實(shí)施方案中，可通過多種酶促方法去除非預(yù)期的成分?？蛇x地，或除了以上描述的方法之外，可通過純化去除非期望的成分。例如，可將純化標(biāo)簽摻入任何以上描述的引物(例如，摻入條形碼核苷酸序列中)以促進(jìn)加標(biāo)簽的靶核苷酸的純化。
[0194]在特定的實(shí)施方案中，清除包括期望的核酸的選擇固定。例如，期望的核酸可優(yōu)先地固定在固相支持體上。在說明性實(shí)施方案中，親和部分，諸如生物素(例如，光敏生物素)被附著至期望的核酸，且所得的生物素標(biāo)記的核酸固定在包含親和部分結(jié)合物諸如鏈霉親和素的固相支持體上?？捎锰结槻樵?queried)經(jīng)固定的核酸,并通過洗漆去除未雜交的和/或未連接的探針(見，例如，公布的P.C.T.申請W003/006677和美國專利公布號20030036064?？蛇x地，可洗滌經(jīng)固定的核酸以去除其他成分并隨后從固相支持體釋放經(jīng)固定的核酸用于進(jìn)一步分析。在特定的實(shí)施方案中，親和部分諸如生物素可被附著至擴(kuò)增引物，如此以致擴(kuò)增產(chǎn)生親和部分標(biāo)記(例如，生物素標(biāo)記的)的擴(kuò)增子。因此，例如，如以上描述的，當(dāng)采用加標(biāo)簽引物、反向引物和探針寡核苷酸時(shí)，則所述寡核苷酸的至少一種可包含未和部分。
[0195]數(shù)據(jù)輸出和分析
[0196]在某些實(shí)施方案中，當(dāng)在矩陣-型的微流控裝置上實(shí)施本發(fā)明的方法時(shí)，可將數(shù)據(jù)輸出作為熱矩陣(還稱為“熱圖”)。在`熱矩陣中，代表矩陣上的反應(yīng)室的每一個(gè)方塊已被分配一個(gè)顏色值，其可以呈灰度顯示，但更典型地呈彩色顯示。在灰度中，黑色方塊指示沒有檢測到擴(kuò)增產(chǎn)物，而白色方塊指示最高水平的擴(kuò)增產(chǎn)物，灰色陰影指示兩者之間的擴(kuò)增產(chǎn)物的水平。在另外的方面，可使用軟件程序以將在熱矩陣中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)編輯為更易讀取的格式。
[0197]Sffl
[0198]本發(fā)明的方法適用于旨在檢測核酸樣品中一種或多種靶核酸的存在或量的任何技術(shù)。因此，例如，這些方法適于鑒定特定多態(tài)性(諸如SNP)、等位基因或單體型或染色體異常諸如擴(kuò)增、缺失或非整倍性的存在?？稍诨蚍中椭胁捎帽痉椒ǎ淇稍诎ㄟz傳疾病或疾患的診斷、藥物基因組學(xué)(個(gè)人化醫(yī)療)、農(nóng)業(yè)中的質(zhì)量控制(例如，關(guān)于種子或牲畜)、植物或動(dòng)物的群體(例如，水產(chǎn)養(yǎng)殖和漁業(yè)管理中或種群多樣性的確定中)的研究和管理、物種或菌種確定或親子或法醫(yī)鑒定的一些環(huán)境中被實(shí)施。本發(fā)明的方法可被應(yīng)用于指示生物或環(huán)境樣品中特定的病癥或生物體的序列的鑒定。例如，該方法可被用于鑒定病原體，諸如病毒、細(xì)菌和真菌的分析。該方法還可被用于旨在表征環(huán)境或微環(huán)境，例如，表征人類腸道中微生物種類的研究。
[0199]還可在確定DNA或RNA的拷貝數(shù)中采用這些方法?；蚪MDNA中異常的DNA拷貝數(shù)的確定，在例如遺傳缺陷和疾病諸如癌癥的診斷和/或預(yù)后中是有用的。RNA “拷貝數(shù)”，即，表達(dá)水平的確定對于例如，在不同的個(gè)體、組織或細(xì)胞中，在不同的條件下(例如，不同的外部刺激或疾病狀態(tài))和/或在不同的發(fā)育階段，感興趣的基因的表達(dá)監(jiān)測是有用的。[0200]此外，可采用該方法制備核酸樣品用于進(jìn)一步分析，諸如，DNA測序?？蓹z測具有遺傳組分的疾病以確定攜帶者狀態(tài)或受試者中疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及預(yù)測攜帶者狀態(tài)或受試者中疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。具有遺傳組分的疾病的列表在增長并包含血友病、半乳糖血癥、杜性肌營養(yǎng)不良、多囊性腎病、I型神經(jīng)纖維瘤病、遺傳性球形紅細(xì)胞癥、馬凡氏綜合征、亨廷頓病、腹主動(dòng)脈瘤、老年性黃斑變性、酒精依賴、斑禿、強(qiáng)直性脊柱炎、哮喘、異位性皮炎、心房顫動(dòng)、心房顫動(dòng):初步研究、注意力不集中的過度反應(yīng)癥、背痛、基底細(xì)胞癌、白塞氏病、雙相型障礙、雙相型障礙:初步研究、膀胱癌、腦動(dòng)脈瘤、乳腺癌、乳糜瀉、慢性腎病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、慢性阻塞性肺病(COPD)、唇裂和腭裂、叢集性頭痛、結(jié)腸直腸癌、Creutzfeldt-Jakob病、克羅恩病、發(fā)展性閱讀障礙、子宮內(nèi)膜異位、食管癌、食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)、特發(fā)性震顫、剝脫性青光眼、濾泡性淋巴瘤、膽結(jié)石、泛發(fā)的白癜風(fēng)、妊娠糖尿病、痛風(fēng) 、橋本氏甲狀腺炎、心臟病發(fā)作(Heart Attack)、高血壓、霍奇金淋巴瘤、高甘油三脂血癥、妊娠肝內(nèi)膽汁淤積癥、疤痕疙瘩、腎病、腎結(jié)石、喉癌、Lou Gehrig病(ALS)、肺癌、狼瘡(全身性紅斑狼瘡)、男性不育癥、黑色素瘤、多發(fā)性硬化、發(fā)作性睡病、鼻咽癌、神經(jīng)管缺陷、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、尼古丁依賴、非酒精性脂肪肝疾病、肥胖癥、強(qiáng)迫性精神障礙、口腔和咽喉癌、骨關(guān)節(jié)炎、耳硬化癥、Paget骨病、帕金森氏病、帕金森氏病:初步研究、外周動(dòng)脈疾病、胎盤早剝、多囊性卵巢綜合征、先兆子癇、原發(fā)性膽汁性肝硬化、進(jìn)行性核上性麻痹、前列腺癌、牛皮癬、多動(dòng)腿綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、精神分裂癥、局限性皮膚硬皮病型、選擇性IgA缺陷、Sj0greil綜合征、胃癌、賁門癌、中風(fēng)、遲發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙、甲狀腺癌、Tourette綜合征、I型糖尿病、2型糖尿病、潰瘍性結(jié)腸炎、子宮平滑肌瘤、和靜脈血栓栓塞、α 1-抗胰蛋白酶缺乏癥、癌癥、Bloom綜合征、卡納萬病、連接蛋白26相關(guān)的感音神經(jīng)性聽力損失、囊性纖維化病、因子XI缺乏癥、家族性自主神經(jīng)功能異常、家族性高膽固醇血癥B型、家族性地中海熱、FANCC相關(guān)的范可尼貧血、G6PD缺乏癥、戈謝病、糖原積累病Ia型、血色沉著病、肢節(jié)型肌營養(yǎng)不良癥、楓糖尿病IB型、粘脂沉積癥IV、尼-皮二氏病A型、苯丙酮尿癥、Rhizomelic軟骨發(fā)育異常點(diǎn)狀的I型(RCDP1)、鐮狀細(xì)胞性貧血和瘧疾耐藥性、泰-薩二氏病和扭轉(zhuǎn)張力障礙。還可檢測受試者中與遺傳性狀相關(guān)的基因型。本發(fā)明的又另一個(gè)方面涉及預(yù)測攜帶者狀態(tài)或受試者中性狀發(fā)生的可能性。與基因型相關(guān)的遺傳性狀包含脂聯(lián)素水平、飲酒臉紅反應(yīng)、蘆笑代謝物檢測、避免錯(cuò)誤(Avoidance of Errors)、出生體重、苦味的感知、血糖、依賴母乳喂養(yǎng)的IQ、C反應(yīng)性蛋白水平、慢性乙型肝炎、耳垢類型、眼睛顏色、食物偏好、長雀斑、HDL膽固醇水平、HIV進(jìn)展、頭發(fā)顏色、頭發(fā)卷曲、頭發(fā)密度、身高、尿道下裂、乳糖不耐癥、麻風(fēng)易感性、壽命、對瘧疾并發(fā)癥的易感性、瘧疾耐藥性(杜菲抗原)、男性型禿、非語言IQ、肥胖癥、情景記憶、月經(jīng)初潮年齡、早期絕經(jīng)、肌肉表現(xiàn)、Diego、Kidd、和凱爾血液型、諾瓦克病毒耐藥性、氣味檢測、疼痛敏感性、持續(xù)胎兒血紅蛋白、旋光性噴嚏反射、前列腺特異性抗原、閱讀能力、屈光不正、對HIV/AIDS耐受性、對飲食和鍛煉的響應(yīng)、性激素調(diào)節(jié)、吸煙行為和結(jié)核病易感性。
[0201]此外，個(gè)體對藥物治療的響應(yīng)可與特定的基因型有關(guān)。本發(fā)明的另外的方面涉及預(yù)測個(gè)體對與特定基因型相關(guān)的藥物治療的響應(yīng)?？深A(yù)測關(guān)于包含以下的藥物治療的列表的藥物應(yīng)答:α 1-抗胰蛋白酶缺乏癥、乳腺癌、Bloom綜合征、卡納萬病、連接蛋白26相關(guān)的感音神經(jīng)性聽力損失、囊性纖維化病、因子XI缺乏癥、家族性自主神經(jīng)功能異常、家族性高膽固醇血癥B型、家族性地中海熱、FANCC相關(guān)的范可尼貧血、G6PD缺乏癥、戈謝病、糖原積累病Ia型、血色沉著病、肢節(jié)型肌營養(yǎng)不良癥、楓糖尿病IB型、粘脂沉積癥IV、尼-皮二氏病A型、苯丙酮尿癥、Rhizomelic軟骨發(fā)育異常點(diǎn)狀的I型(RCDP1 )、鐮狀細(xì)胞性貧血和瘧疾耐藥性、泰-薩二氏病和扭轉(zhuǎn)張力障礙。
[0202]最后，在隨后的分析之前，作為第一步，核酸樣品可被加標(biāo)簽以減少將損害結(jié)果的樣品的錯(cuò)標(biāo)或交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。例如，任何醫(yī)師辦公室、實(shí)驗(yàn)室或醫(yī)院可在收集之后立即給樣品加標(biāo)簽，并可在分析時(shí)確認(rèn)標(biāo)簽。相似地，在可行的范圍內(nèi)盡快將在犯罪現(xiàn)場(crimescene)收集的包含核酸的樣品加標(biāo)簽以確保樣品不會(huì)被錯(cuò)標(biāo)或被篡改。當(dāng)樣品從一方轉(zhuǎn)移至另一方的每一次轉(zhuǎn)移時(shí)的標(biāo)簽的檢測可被用于建立樣品的保管鏈。
[0203]試劑盒
[0204]根據(jù)本發(fā)明的試劑盒包含用于實(shí)行本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)分析方法的一種或多種試劑。試劑盒通常包括具有容納作為一種或多種分開的組合物或當(dāng)試劑的相容性允許時(shí)任選地作為混合物的試劑(例如，引物和/或探針)的一個(gè)或多個(gè)容器的包裝。試劑盒還可包含從用戶的角度是期望的其他物質(zhì)，諸如緩沖液、稀釋劑、標(biāo)準(zhǔn)品、和/或用于樣品處理、洗滌或進(jìn)行任何其他分析步驟的任何其他物質(zhì)。
[0205]根據(jù)本發(fā)明的試劑盒通常包含用于實(shí)施本發(fā)明的一種或多種方法的使用說明。被包括在本發(fā)明的試劑盒中的使用說明可被粘帖在包裝材料上或可被包含作為包裝說明書。盡管使用說明典型地為書面或打印材料，但它們不限于此形式。能夠儲(chǔ)存此類使用說明并將它們傳播至最后的用戶的任何介質(zhì)被本發(fā)明所包含。此介質(zhì)包括，但不限于，電子儲(chǔ)存介質(zhì)(例如，磁盤、磁帶、磁帶盒(cartridge)、芯片)、光學(xué)介質(zhì)(例如，⑶ROM)、RF標(biāo)簽,等等。如本文所用的，術(shù)語“使用說明”可包括提供使用說明的互聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)站的網(wǎng)址。
[0206]被理解的是本文描述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅用于說明的目的，并且根據(jù)其的多種修飾或變化將是對本領(lǐng)域的技術(shù)人員暗示的并被包含在本申請的精神和范圍及所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
[0207]另外，本文引用的所有其他出版物、專利和專利申請?jiān)诖送ㄟ^引用整體被并入用于所有目的。
實(shí)施例
[0208]實(shí)施例1
[0209]圖1說明在基因分型分析中使用該方法以檢測樣品中特定等位基因的存在。在漫畫中，兩條靶核酸序列(T和T’ )存在于樣品中，T由特定SNP處的A等位基因表征且T’由G等位基因表征。使用一對加標(biāo)簽引物在PCR反應(yīng)中將T和T’加標(biāo)簽，一條引物包含核苷酸標(biāo)簽序列X和與A等位基因雜交并用作A等位基因的引物的靶核苷酸識別序列，且另一條引物包含核苷酸標(biāo)簽序列Y和與G等位基因雜交并用作G等位基因的引物的靶核苷酸識別序列。編碼或加標(biāo)簽PCR反應(yīng)(顯示為編碼PCR反應(yīng))將X標(biāo)簽“摻入”A等位基因的擴(kuò)增子(如果有的話)，并將I標(biāo)簽“摻入” G等位基因的擴(kuò)增子(如果有的話)。編碼擴(kuò)增可利用單個(gè)反向引物。
[0210]如在圖中顯示的，該反應(yīng)包 含兩個(gè)探針寡核苷酸-調(diào)節(jié)核苷酸對。首先，探針寡核苷酸包含報(bào)告物分子(Re)、調(diào)節(jié)序列(z)和與被摻入A等位基因擴(kuò)增子的標(biāo)簽序列雜交并用作PCR擴(kuò)增反應(yīng)的引物的引物序列，而調(diào)節(jié)寡核苷酸包含猝滅劑(Q)和與調(diào)節(jié)序列互補(bǔ)的序列區(qū)段(Z)。其次，探針寡核苷酸包含報(bào)告物分子(Rk)、調(diào)節(jié)序列(W)和與被摻入G等位基因擴(kuò)增子的標(biāo)簽序列雜交并用作PCR擴(kuò)增反應(yīng)的引物的引物序列，而調(diào)節(jié)寡核苷酸包含可以與第一對的猝滅劑相同或不同的猝滅劑(Q)和與調(diào)節(jié)序列互補(bǔ)的序列區(qū)段(W)。每一對的探針寡核苷酸和調(diào)節(jié)寡核苷酸都包含報(bào)告物-猝滅劑對，以致當(dāng)探針寡核苷酸與調(diào)節(jié)寡核苷酸雜交時(shí)報(bào)告物發(fā)射可檢測的(例如，熒光)信號，但當(dāng)探針和調(diào)節(jié)寡核苷酸與彼此雜交時(shí)則不發(fā)射信號，報(bào)告物分子被粹滅。
[0211]如在圖中顯示的，加標(biāo)簽的靶核酸序列的探針寡核苷酸引導(dǎo)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)生其中報(bào)告物分子被摻入的擴(kuò)增子，從而將報(bào)告物分子與猝滅劑分開?？蓹z測所得的報(bào)告物信號，并且該信號指示樣品中對應(yīng)的等位基因的存在。
[0212]實(shí)施例2
[0213]設(shè)計(jì)了用于不同的多態(tài)性位點(diǎn)的每一個(gè)多態(tài)性變體的加標(biāo)簽引物。除了靶特異性序列之外，設(shè)計(jì)加標(biāo)簽引物以在5’末端包含核苷酸標(biāo)簽序列。當(dāng)檢測多態(tài)性位點(diǎn)時(shí)，用于第一個(gè)等位基因的加標(biāo)簽引物包含與用于第二個(gè)等位基因的加標(biāo)簽引物不同的核苷酸標(biāo)簽序列。包含核苷酸標(biāo)簽序列和靶特異性序列二者的引物的序列在復(fù)I中列出。
[0214]設(shè)計(jì)反向引物以位于靶多核苷酸的側(cè)翼并且該反向引物在轟！中被列出。
[0215]設(shè)計(jì)了多組探針寡核苷酸/調(diào)節(jié)寡核苷酸對。探針寡核苷酸在3’末端包含對應(yīng)于加標(biāo)簽引物上的核苷酸標(biāo)簽序列的多種核苷酸標(biāo)簽序列。探針寡核苷酸在3’末端包含被對應(yīng)的調(diào)節(jié)寡核苷酸識別的調(diào)節(jié)序列。用熒光報(bào)告物分子在3’末端標(biāo)記探針寡核苷酸。熒光染料選自FAM、CalOrange和HEX。用對應(yīng)的猝滅劑在5’末端標(biāo)記調(diào)節(jié)寡核苷酸。
[0216]當(dāng)檢測多態(tài)性位點(diǎn)時(shí)，使用兩組探針寡核苷酸/調(diào)節(jié)寡核苷酸對。每一組包含不同的報(bào)告物粹滅劑對和對應(yīng)于加標(biāo)簽引物中的核苷酸標(biāo)簽序列的不同的核苷酸標(biāo)簽序列。
·[0217]探針寡核苷酸/調(diào)節(jié)寡核苷酸對的序列在表3和4中被列出。
[0218]寡核苷酸通過Operon以IOnmol規(guī)模合成,并以100 μ M的濃度重懸在TE緩沖液(Teknova)中提供。
[0219]將來自Coriell樣品收集的人基因組DNA樣品以60ng/μ I重懸在低-EDTA的TE緩沖液(Teknova)中，并將其如下制備用于PCR。
[0220]如下制備探針混合物:在具有30mM EDTA的DNA懸浮緩沖液(IOmMTris, ρΗ8.0, 0.1mM EDTA, TEKnova, PN Τ0221)中以6 μ M的終濃度制備每一種探針寡核苷酸。在相同的緩沖液中以30 μ M的終濃度制備每一種調(diào)節(jié)寡核苷酸。
[0221]如下制備樣品混合物:
[0222]如在表5 中描述的將 Biotium Fast Probe Master Mix (Biotium, PN31005)、20X SNPtype Sample Loading Reagent(Fluidigm, PN100-3425)、探針混合物、50XROX (Invitrogen, PN12223-012)和PCR-合格的水組合以制備樣品預(yù)混物。將2.5μ L、60ng/U L的每一種基因組DNA (gDNA)樣品添加至3.5 μ L的樣品預(yù)混物以制備總的6 μ L的樣品混合物溶液。持續(xù)最少20秒渦旋樣品混合物，并隨后持續(xù)至少30秒離心以旋轉(zhuǎn)沉降(spindown)所有成分。
[0223]如下制備分析混合物:
[0224]如在以下的表6中描述的制備包含兩種加標(biāo)簽引物，每一個(gè)等位基因一條引物，對應(yīng)的反向引物和DNA懸浮緩沖液緩沖液(IOmM Tris, pH8.0,0.1mM EDTA, TEKnova, PNT0221)的分析混合物。
[0225]如下制備IOX分析物:
[0226]使用在以下表7中的體積在無DNA的罩(hood)中制備等份的IOX分析物。將2XAssay Loading Reagent (Fluidigm, PN85000736)與PCR-合格的水組合以產(chǎn)生分析預(yù)混物。將4 μ L的分析預(yù)混物與I μ L的每一種單個(gè)分析預(yù)混物預(yù)混物組合以獲得總的5 μ LlOX分析混合物。
[0227]運(yùn)對丁 48.48Dynamic Array11IFC
[0228]用300 μ L 的對照線流體(Control Line Fluid,Fluidigm PN89000020)填充密閉和接口累加器儲(chǔ)液器。將5μ L的每一個(gè)樣品混合物裝載入樣品進(jìn)口，并將4 μ A的適合的10Χ 分析混合物裝載進(jìn)入 48.48Dynamic Array?IFC (Fluidigm, PN BMK-M-48.48)上的每一個(gè)分析進(jìn)口。
[0229]熱循環(huán)IFC 并使用由 Fluidigm Corporation 制造的 FCl?Cycler 成像 IFC。IFC熱循環(huán)操作說明包含熱啟動(dòng)步驟[95°C，持續(xù)5min]、35個(gè)循環(huán)的降落式PCR策略[95°C持續(xù) 15sec、64°C持續(xù) 45sec 和 72°C持續(xù) 15sec 的 I 個(gè)循環(huán)；95°C持續(xù) 15sec、63°C持續(xù) 45sec和72°C持續(xù)15sec的I個(gè)循環(huán)；95°C持續(xù)15sec、62°C持續(xù)45sec和72°C持續(xù)15sec的I個(gè)循環(huán)；95°C持續(xù)15sec、61°C持續(xù)45sec和72°C持續(xù)15sec的I個(gè)循環(huán)；和95°0持續(xù)15sec、62°C持續(xù)45sec和72°C持續(xù)15sec的34個(gè)循環(huán)]、和冷卻步驟[25°C持續(xù)IOsec的I個(gè)循環(huán)]。在由 Fluidigm Corporation 制造的 EPl?Reader 中采集數(shù)據(jù)并使用 SNP GenotypingAnalysis Software v.3.1.0 分析數(shù)據(jù)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測靶核苷酸序列的方法，所述方法包含:a)用核苷酸標(biāo)簽序列將所述靶核苷酸序列加標(biāo)簽，從而制備加標(biāo)簽的靶核酸序列；b)提供包含與所述核苷酸標(biāo)簽序列互補(bǔ)的核苷酸標(biāo)簽識別序列和在所述核苷酸標(biāo)簽識別序列的5’的調(diào)節(jié)序列的探針寡核苷酸，其中所述探針寡核苷酸包含第一標(biāo)記物并具有解鏈溫度Tml ；c)使用所述探針寡核苷酸作為引物在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增所述加標(biāo)簽的靶核酸序列，其中所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)由退火溫度Ta表征；其中在包含與所述調(diào)節(jié)序列互補(bǔ)的序列區(qū)段的調(diào)節(jié)寡核苷酸的存在下實(shí)施所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)，其中所述調(diào)節(jié)寡核苷酸包含第二標(biāo)記物并具有解鏈溫度Tm2 ;和d)檢測所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物；其中所述第一標(biāo)記物和所述第二標(biāo)記物構(gòu)成熒光報(bào)告物/猝滅劑對；且其中Tml和Tm2 二者都高于Ta。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中使用PCR反應(yīng)將所述標(biāo)簽序列摻入所述加標(biāo)簽的靶核酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核苷酸標(biāo)簽識別序列與所述核苷酸標(biāo)簽序列完全互補(bǔ)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)寡核苷酸包含與調(diào)節(jié)序列完全互補(bǔ)的序列區(qū)段。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)寡核苷酸具有15-45個(gè)核苷酸范圍的長度。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中Ta呈55-62°C的范圍。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中Ta呈60-64°C的范圍。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中Ta呈60°C-62°C的范圍。
9.根據(jù)權(quán)利要求權(quán)利要求1-5所述的方法，其中Tml比所述退火溫度(Ta)高至少25。。。
10.根據(jù)權(quán)利要求9權(quán)利要求所述的方法，其中Tm2比所述退火溫度(Ta)高至少至少2°C、至少3°C、至少4°C、至少5°C、或至少10°C。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中Tm2呈60-75°C的范圍。
12.根據(jù)權(quán)利要求6所述的 方法，其中在大于500nL、或大于1μ L的反應(yīng)體積中實(shí)施所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中在包含96-1536孔的多孔板中實(shí)施所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中Ta為約57°C。
15.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中在小于100nL的反應(yīng)體積中實(shí)施所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中在微流控裝置中實(shí)施所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中Ta為約60°C。
18.根據(jù)權(quán)利要求6、7或8所述的方法，其中所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)包含在退火溫度(Ta)下的至少20個(gè)循環(huán)。
【文檔編號】C12Q1/68GK103635594SQ201280033101
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年5月9日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月9日
【發(fā)明者】肯尼斯·J·里瓦克, 斯泰西·邁爾斯, 曉輝·王, 王軍 申請人:富魯達(dá)公司