用于清除水、工業(yè)廢水和土壤中耐降解化學(xué)品的生物制品及使用該制品的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種新型的生物制品，用于水、土壤、工業(yè)廢水的凈化去除諸如農(nóng)藥和油的耐降解化學(xué)品，其中該生物制品為按重量比(1-2):(1-2):1的菌株惡臭假單胞菌VKPM?B-10997、枯草芽孢桿菌VKPM?B-10999和紅串紅球菌VKPM?Ac-1882的組合。該生物制品可進(jìn)一步包含吸附劑、有機(jī)和礦物補(bǔ)充劑和促進(jìn)劑。所述生物制品可用于耐降解農(nóng)藥和油的分解。該生物制品具有植物生長促進(jìn)和殺菌活性。本發(fā)明還涉及所提供的生物制品的應(yīng)用。
【專利說明】用于清除水、工業(yè)廢水和土壤中耐降解化學(xué)品的生物制品及使用該制品的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種新型生物制品，該制品用于被耐降解的、歸類為危險品的、諸如廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥的化學(xué)品污染的水、土壤和工業(yè)廢水的凈化。
【背景技術(shù)】
[0002]專利RU2323970和RU2237711中描述了生物制劑-生物分解劑(biodestruktors)以及其處理土壤和土地、去除包含短桿菌(Bacillus brevis)和節(jié)桿菌種屬(Arthrobacter species)的油和石油產(chǎn)品的用途。專利RU208667描述了包括微生物惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)和枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)的混合菌群。
[0003]還已知有效用于除去油中的脂肪族餾分的生物制劑:基于菌株深紅紅球菌VKMAc_1513D 和紅串紅球菌(Rhodococcu erythropolis) VKMAc_1514D 的“Roder”產(chǎn)品，基于細(xì)菌菌株假單胞菌和酵母的“Lenoil ”、“DevoroiI ”、“Ekobel ”產(chǎn)品。
[0004]已知使用假產(chǎn)堿假單胞菌菌株NRRL B-18087(專利US4804629)分解氯代芳香族農(nóng)藥(2，4- 二氯苯氧乙酸和2，4，5-三氯苯氧乙酸)，通過細(xì)菌菌株放射形土壤桿菌(發(fā)明人證書SU1250572)中和有機(jī)磷農(nóng)藥殘留和其有毒代謝物。發(fā)明人證書SU1560487描述了使用小球藻 BKM-A-10 和柵藻類(Scenedesmus acuminalus) UA_2_7a 破壞 3，4- 二氯苯胺的方法。專利US4803166中描述了使用細(xì)菌惡臭假單胞菌YNK-1分解2-氯苯甲酸；專利DE3729127中記載了單獨或組合使用微生物莫拉克斯氏菌屬和節(jié)細(xì)菌屬分解磷酸鹽污染物和氯化烴。
[0005]已知使用擔(dān)子菌類的黃孢原毛平革菌降解諸如DDT、聚氯苯酚類、苯并芘類、二惡英類的化合物(專利US4891320)。
[0006]菌株惡臭假單胞菌-106是二甲基苯基甲醇和苯酚[1，2]的活性分解劑，細(xì)菌假單胞菌破壞芳香族和雜環(huán)化合物，最近常見于廢水中[3，4，5]，并且菌株假單胞菌破壞固體和液體介質(zhì)中的芳香族化合物。
[0007]—些博物館菌株諾卡氏菌屬、節(jié)細(xì)菌屬、小單孢菌屬[7，8，9]具有破壞如西瑪津和莠去津的氯代三嗪衍生物的能力。
[0008]專利US6632363描述了包括疏水載體和細(xì)菌枯草芽孢桿菌的組合物及其用于提高含有諸如農(nóng)藥的水的質(zhì)量的使用方法。
[0009]Ksenofontova O等描述了作為最活性的降解菌的從芽孢桿菌和假單胞菌屬得到的需氧菌菌株，其破壞如下農(nóng)藥:氯噻嗪、胡桃醌、半醌、nitrolon、kartocid和karate (〃農(nóng)藥影響下的土壤微生物演化〃，薩拉托夫州立大學(xué)學(xué)報出版社，化學(xué)和生物生態(tài)學(xué)部，2007, vol.7, N0.2, p.66)。
[0010]專利RU2410170描述了凈化有機(jī)化合物污染的土壤的方法，該有機(jī)化合物包括農(nóng)藥，例如，二氯聯(lián)苯(DHB)，該凈化方法通過加入在200-300°C預(yù)處理的海綠石的吸附劑和紅球菌屬細(xì)菌菌株完成。
[0011]在所有這些中和有毒化學(xué)品(有毒物質(zhì))的方法中，都通過提供某些種類的微生物來分解特定化學(xué)品。通常描述的是在水培養(yǎng)基中通過利用作為碳和能量唯一來源的異生物質(zhì)的微生物分解農(nóng)藥，或者需要額外使用吸附劑。所有這些培養(yǎng)物的顯著缺點是它們針對特定物質(zhì)的狹隘的特異性，以及它們不具有預(yù)備形式并且不能實際用于處理被諸如農(nóng)藥的難降解化學(xué)品污染的水、工業(yè)廢水和土壤。
[0012]專利RU2093478描述了細(xì)菌菌株惡臭假單胞菌VKM1301、枯草芽孢桿菌VKMB-1742D和紅串紅球菌VKM Ac_1339D以1:1:1的比例的組合，用以凈化水和土壤、去除油和石油產(chǎn)品以及鉆井泥漿中含有的聚合物添加劑，及其應(yīng)用。然而，該組合凈化被諸如農(nóng)藥的頑固抗降解化學(xué)品污染的水、土壤和工業(yè)廢水的應(yīng)用目前尚不可知。
[0013]已知提高土壤肥力并促進(jìn)介質(zhì)的自然微生物群落的生物制品“Biava”(專利RU2248255)。生物制品包含淀粉糖化的、解蛋白的和固氮的微生物，如細(xì)菌屬假單胞菌、芽孢桿菌。該制品的缺點是其復(fù)雜成分，包括超過25種不同的不適于結(jié)合相互作用的有機(jī)體，這使得生產(chǎn)和保持菌株變得困難。所述專利中還描述了通過將生物制品“Biava”引入土壤的應(yīng)用。該制品 不是植物生長的促進(jìn)劑，并且不具有對諸如農(nóng)藥或除草劑的頑固化學(xué)品的降解能力，農(nóng)藥或除草劑選自如下氯苯氧乙酸:2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-0)、三氯苯氧乙酸(2，4，5-T)、苯酚、2，4- 二氯苯酚、CPAA和下面描述的其他化合物。這些化合物是環(huán)境中最持久和最頑固的。如人類等攝入這些化學(xué)品可導(dǎo)致器官、組織和神經(jīng)系統(tǒng)的嚴(yán)重疾病。食物中存在這些化學(xué)品被認(rèn)為是不可接受的(例如，參見Tinsley, 1.污染行為中的化學(xué)概念.從英文翻譯.M.:Mir, 1992，p.281)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明的目的是提供一種用于處理(中和)被諸如農(nóng)藥、苯酚的頑固化學(xué)品污染的土壤、水和工業(yè)廢水的新型生物制品，同時提供應(yīng)用該制品的方法。本發(fā)明的制品“ΡΗΕΝ0Χ”改善環(huán)境的凈化、去除有毒物質(zhì)，并因此提高生長在處理過的土壤中的消費(fèi)品的質(zhì)量。此外，由細(xì)菌細(xì)胞實施的將有毒物質(zhì)微生物降解為無害化合物發(fā)生在土壤中。該生物制品在工業(yè)廢水的處理中顯示出高效性。
[0015]本發(fā)明涉及用于處理土地、土壤、工業(yè)廢水去除諸如農(nóng)藥的耐降解的化學(xué)品的生物制品(“PHENOX”)。提供的生物制品是新菌株惡臭假單胞菌、枯草芽孢桿菌和紅串紅球菌按照質(zhì)量比(1-2): (1-2): (1)的比例的組合，該制品可進(jìn)一步包括吸附劑或者被固化于吸附劑上，以及包括礦物質(zhì)、有機(jī)或促進(jìn)添加劑。
[0016]所述新菌株惡臭假單胞菌被保藏在俄羅斯國家工業(yè)微生物保藏中心(RussianNational Collection of Industrial Microorganisms) (VKPM),保藏號為:B_10997 (SEQID N0.3)。
[0017]所述新菌株枯草芽孢桿菌被保藏在俄羅斯國家工業(yè)微生物保藏中心(VKPM)，保藏號為:B-10999 (SEQ ID N0.1)。
[0018]所述新菌株紅串紅球菌被保藏在俄羅斯國家工業(yè)微生物保藏中心(VKPM)，保藏號為:Ac-1882 (SEQ ID N0.2)。
[0019]要求保護(hù)的制品“ΡΗΕΝ0Χ”與現(xiàn)有技術(shù)方案相比的區(qū)別是細(xì)菌菌株的特定組合和給出的優(yōu)選質(zhì)量比?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0020]圖1是菌株的質(zhì)粒圖譜:2-9是惡臭假單胞菌VKPM B-10997,10-17是紅串紅球菌VKPM Ac-1882。
[0021]在用于分解頑固農(nóng)藥時，該制品特別有效，頑固農(nóng)藥選自:諸如2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、三氯苯氧乙酸(2，4，5-T)、2，4-二氯苯氧基-α -丙酸(Dichloroprop，2，4-DR)、
2-甲基-4-氯苯氧基-α -丙酸(Mekoprop，2M-4HP，MSRR)、2，4，5-三氯苯氧基-α -丙酸(2, 4, 5-TP, Silvex)、2, 4- 二氯苯氧基-α -油(2，4-dichlorophenoxy- a -oil, 2, 4-DV)> 甲基-[1-[(丁基氨基)羰基]-1H-苯并咪唑-2-基]氨基甲酸酯的氯苯氧乙酸類和基于氯苯氧乙酸類的制品(苯菌靈、多菌靈、草除靈(benazol)) ;imidor,其中活性物質(zhì)為新煙堿吡蟲啉；zontran,其中活性物質(zhì)為賽克嗪、HCCH (即，六氯環(huán)己燒、hexachloranhexatox、dolmix、或sineks)CPAA (氯苯氧乙酸)、PAA (苯氧乙酸)、六氯苯酹、1，1-二(4’-氯苯基)-2，2-二氯乙烷(DDT)和2，4- 二氯苯酚，以及酚類。特別地，當(dāng)用于持久性農(nóng)藥的分解、去除諸如2，4- 二氯苯氧基乙酸(2，4-D)、三氯苯氧乙酸(2，4，5-T)、氯苯氧基乙酸(CPAA)、苯氧基乙酸(PAA)的氯苯氧乙酸類，以及2，4- 二氯苯酚和苯酚，和吡蟲啉時，該制品非常有效。 [0022]與在先已知制品不同，本發(fā)明的制品對種子發(fā)芽和栽培植物生長具有額外生長促進(jìn)作用，并且還具有殺菌活性。
[0023]本發(fā)明還包括所提供的生物制品“ΡΗΕΝ0Χ”的應(yīng)用方法。該方法包括在污染的土地、土壤或廢水中引入有效量的所述制品。
[0024]優(yōu)選地，向室溫耕作中的田地引入每公頃IOkg干物質(zhì)的量的所述制品，優(yōu)選地，在15-35°C的溫度。優(yōu)選使用方法是以水溶液的形式進(jìn)行灌溉。還可以通過添加諸如蚯蚓糞的生物發(fā)生元素的用所述制品懸浮液處理的種子將所述制品引入土地，或者在犁地或播種期間將干劑型的所述制品以粉末形式引入土地。
[0025]還可通過播種添加了諸如蚯蚓糞的添加劑的用所述制品懸浮液處理的種子，將所述制品引入土壤。在添加了蚯蚓糞、氮和磷肥的容器中用水稀釋所述制品。
[0026]在犁地或播種期間將所述制品的干劑型以粉末形式引入土地是可能的。根據(jù)本發(fā)明的所述制品“ΡΗΕΝ0Χ”對植物生長具有促進(jìn)作用，并且對土壤具有良好改良能力的所述制品的菌株給環(huán)境帶來有效中和。菌株惡臭假單胞菌和紅串紅球菌攜帶降解的D-質(zhì)粒，并且可以將對農(nóng)藥和其他有害物質(zhì)的破壞能力傳遞給土壤、水、廢水中的原有細(xì)菌種群，從而加大清除污染物。使用該制品的優(yōu)點是土壤中農(nóng)藥的分解率高達(dá)86%并且在液體介質(zhì)中高達(dá)99%。
[0027]所提供的制品的活性基礎(chǔ)是土壤細(xì)菌菌株惡臭假單胞菌、枯草芽孢桿菌、紅串紅球菌的組合。所有這些培養(yǎng)物具有同時針對多種異生物質(zhì)的polisubstratum特異性,異生物質(zhì)為:諸如2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、三氯苯氧乙酸(2，4，5-T)的氯苯氧乙酸類，苯酚，2，4-二氯苯酚，CPAA和實施例中指出的其他物質(zhì)。它們的混合物確保提升環(huán)境除去有毒化合物的凈化功能。作為吸附劑的高嶺土和壓碎的細(xì)泥炭還被用作有機(jī)添加劑；作為有機(jī)礦物質(zhì)和生長促進(jìn)補(bǔ)充劑的蚯蚓糞，其提取物和甲殼質(zhì)包含基質(zhì)。使用前，所述制品的干粉用溫水(25-30°C)在容器(水桶、罐)中攪勻至均勻懸浮液。IOg所述制品攪拌至10升水中。推薦加入氮磷鉀肥(azophoska)-基于硝酸銨的復(fù)合肥料(5g/101)或堆肥(5g/101),在使用(通過噴壺澆灌土壤(10-201/10m2)或處理種子100-150ml/100g)前，1_3小時內(nèi)懸浮液定期攪拌以通氣和微生物活化。
[0028]所述生物制品通過獨立的深層培養(yǎng)獲得的，通常在標(biāo)準(zhǔn)生物技術(shù)設(shè)備上20-30小時內(nèi)培養(yǎng)所述細(xì)菌的3個菌株獲得的。種子通過在加入農(nóng)藥的合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株獲得，并且該材料被用于播散在大體積發(fā)酵器中。
[0029]菌株惡臭假單胞菌、枯草芽孢桿菌、紅串紅球菌細(xì)胞的累積干生物量(accumilated dry biomass)是以(1-2): (1-2):1的比率混合的。加入載體-吸附劑和其他添加劑(IOich11的源濃縮物和至少5X108CFU/mL的液體制品)后，干制品的總滴度為至少5X108CFU/g。對于所提出的制品的工業(yè)生產(chǎn)和包裝，使用標(biāo)準(zhǔn)生物技術(shù)和包裝設(shè)備和材料。
[0030]所提供的生物制品(“ΡΗΕΝ0Χ”)消除化學(xué)品滲入植物、蔬菜和漿果植物中，促進(jìn)種子萌發(fā)和植物生長，抑制植物病原真菌的生長。
[0031]“ΡΗΕΝ0Χ”用于處理被諸如農(nóng)藥、苯酚、或許油的化學(xué)品污染的水、工業(yè)廢水、土壤和植物種子。“ΡΗΕΝ0Χ”中包含所述菌株是新穎的。
[0032]所述菌株枯草芽孢桿菌B-10999是通過富集培養(yǎng)法從南烏拉爾的化學(xué)工業(yè)企業(yè)的工業(yè)區(qū)的土壤樣品中分離出的。所述菌株枯草芽孢桿菌被保藏在俄羅斯國家工業(yè)微生物保藏中心(VKPM)，保藏號為:B-10999?？莶菅挎邨U菌的菌株在16S rRNA基因(SEQ IDN0.1)的核苷酸序列分析的基礎(chǔ)上被鑒定。編碼16S rRNA基因的DNA片段的核苷酸序列(長度不小于500個堿基對)與聲明的類型具有99%的相似度。
[0033]培養(yǎng)-形態(tài)特征。菌株枯草芽孢桿菌具有該種類的典型的培養(yǎng)-形態(tài)特征。桿菌，其尺寸是0.2-0.5乘以1.5-3 μ m，單個，通常成對出現(xiàn)。它們形成橢圓形和圓形的內(nèi)生孢子。鞭毛被置于整個細(xì)胞的表面。當(dāng)生長在肉類-胨發(fā)酵液中時，培養(yǎng)物形成展開的消光膜，然而，培養(yǎng)基依然清澈。當(dāng)振動液體培養(yǎng)基時，不發(fā)生生物質(zhì)的完全分散。菌落是干燥的、帶有波狀邊緣細(xì)微起皺的。馬鈴薯切片上的生長是豐富的奶油色光滑的、極大尺寸褶皺的菌落形態(tài)。革蘭氏陽性。
[0034]牛理和牛物化學(xué)特征。菌株枯草芽孢桿菌在28°C溫度下在葡萄糖-蛋白胨培養(yǎng)基、LB瓊脂和發(fā)酵液、葡萄糖-礦質(zhì)培養(yǎng)基中生長良好。該菌株在作為唯一碳源的含有L-脯氨酸、DL-亮氨酸、α -酮戊二酸、DL- α -丙氨酸、L-谷氨酰胺、D (+)-木糖、L-天門冬酰胺、甲殼質(zhì)、DL-絲氨酸、葡萄糖、苯酚和氯苯氧苯酚的培養(yǎng)基中生長。菌株枯草芽孢桿菌可在凍干狀態(tài)下被貯藏。核查菌株的存活能力是通過每12個月一次在Μ9和LB的葡萄糖-蛋白胨瓊脂中栽培來實施的。當(dāng)其在5°C下貯藏在這些培養(yǎng)基的斜面培養(yǎng)基上時-每3個月實施一次重栽。菌株枯草芽孢桿菌是非病原性和非毒性微生物。靜脈注射感染小白鼠不顯示動物病原特性。
[0035]菌株紅串紅球菌Ac-1882通過富集培養(yǎng)法從南烏拉爾的化學(xué)工業(yè)企業(yè)工業(yè)區(qū)的土壤樣品中分離出的。所述菌株紅串紅球菌被保藏在俄羅斯國家工業(yè)微生物保藏中心(VKPM)，保藏號為:Ac-1882。菌株紅串紅球菌在16S rRNA基因(SEQ ID N0.2)的核苷酸序列分析的基礎(chǔ)上被鑒定。編碼16S rRNA基因的DNA片段的核苷酸序列(長度不小于500個堿基對)與聲明的類型具有99%的相似度。
[0036]培養(yǎng)-形態(tài)特征。菌株紅串紅球菌具有該種類的典型的培養(yǎng)-形態(tài)特征。細(xì)胞為桿狀、很少分叉，直徑為0.6-0.8 μ m、長度為3-8 μ m。細(xì)胞呈適度多態(tài)，常排列成V形，具有明確的球菌-桿菌-球菌生長周期:在24-36小時的時候桿狀細(xì)胞開始縮短，并且球狀和卵圓細(xì)胞的比例增加。長成的菌落被染色為橙色。菌落的稠度是糊狀的。革蘭氏陽性。
[0037]牛理和牛物化學(xué)特征。菌株紅串紅球菌在28°C溫度下在葡萄糖-蛋白胨培養(yǎng)基、LB瓊脂和發(fā)酵液、葡萄糖-礦質(zhì)培養(yǎng)基中生長良好。該菌株在作為唯一碳源的含有L-脯氨酸、D-阿拉伯糖、DL- α -丙氨酸、L-谷氨酰胺、D (+)-木糖、L-天門冬酰胺、DL-絲氨酸、酪蛋白、葡萄糖、苯酚和氯苯氧苯酚的培養(yǎng)基中生長。菌株紅串紅球菌可在凍干狀態(tài)下被貯藏。核查菌株的存活能力是通過每12個月一次在Μ9和LB的葡萄糖-蛋白胨瓊脂中栽培來實施的。當(dāng)其在5°C下貯藏在這些培養(yǎng)基的斜面培養(yǎng)基上時-每3個月實施一次重栽。菌株紅串紅球菌是非病原性和非毒性微生物。靜脈注射感染小白鼠不顯示動物病原特性。
[0038]菌株惡臭假單胞菌B-10997通過富集培養(yǎng)法從南烏拉爾的化學(xué)工業(yè)企業(yè)工業(yè)區(qū)的土壤樣品中分離出的。所述菌株惡臭假單胞菌被保藏在俄羅斯國家工業(yè)微生物保藏中心(VKPM)，保藏號為:B-10997。菌株惡臭假單胞菌在16S rRNA基因(SEQ ID N0.3)的核苷酸序列分析的基礎(chǔ)上被鑒定。編碼16S rRNA基因的DNA片段的核苷酸序列(長度不小于500個堿基對)與聲明的類型具有99%的相似度。
[0039]培養(yǎng)-形態(tài)特征。菌株惡臭假單胞菌具有該種類的典型的培養(yǎng)-形態(tài)特征。能動的桿菌，極性位于鞭毛。細(xì)胞的尺寸是1-4乘1.3-5.4 μ m。肉-蛋白胨瓊脂上的菌落呈淺灰色，菌落內(nèi)，在其背面有一個紅褐色的色素。不產(chǎn)生孢子。菌落的稠度是半流體的。革蘭氏陽性。
[0040]生理和生物化學(xué)特征。菌株惡臭假單胞菌在28°C溫度下在葡萄糖-蛋白胨培養(yǎng)基、LB瓊脂和發(fā)酵液、葡萄糖-礦質(zhì)培養(yǎng)基中生長良好。該菌株在作為唯一碳源的含有L-酪氨酸、DL-色氨酸、D (+)-木糖、D (-)-甘露醇、L-谷氨酸、DL-亮氨酸、α -酮戊二酸、DL-α-丙氨酸、D-核糖、L(+)_阿拉伯糖、L-谷氨酰胺、纖維素、L-天門冬酰胺、甲殼質(zhì)、DL-絲氨酸、果膠、葡萄糖、酪蛋白、和苯酚和氯苯氧苯酚的培養(yǎng)基中生長。菌株惡臭假單胞菌可在凍干狀態(tài)下被貯藏。核查菌株的存活能力是通過每12個月一次在M9和LB的葡萄糖-蛋白胨瓊脂中栽培來實施的。當(dāng)其在5°C下貯藏在這些培養(yǎng)基的斜面培養(yǎng)基上時-每3個月實施一次重栽。菌株惡臭假單胞菌是非病原性和非毒性微生物。靜脈注射感染小白鼠不顯示動物病原特性。
【具體實施方式】
[0041]實施例1
[0042]菌株中質(zhì)粒降解農(nóng)藥的鑒定。細(xì)菌的破壞性可通過染色體外的元素決定[Don, Pemberton, 1985;Ghosaletal., 1985]。這些兀素-質(zhì)粒在菌株惡臭假單胞菌VKPMB-10997和紅串紅球菌VKPM Ac-1882中找到。它們通過堿裂解法從這些菌株中分離出(Maniatis T.，F(xiàn)ritsch, E.，和Sambrook, J.Methods of genetic engineering.Molecularcloning:Trans, from English./Ed.AA Baev.-M.:Mir, 1984.p.480),并且隨后質(zhì)粒產(chǎn)品在標(biāo)準(zhǔn)條件下在瓊脂糖膠中分懼(Maniatis等，1984)-(參見圖1菌株的質(zhì)粒圖譜:2_9是惡臭假單胞菌VKPM B-10997，10-17是紅串紅球菌VKPM Ac-1882)。
[0043]實施例2
[0044] 制品中包含的菌株的兼容性。產(chǎn)品的細(xì)菌枯草芽孢桿菌VKPM B-1099、紅唇紅球菌VKPM Ac-1882和惡臭假單胞菌VKPM B-10997的菌株間不存在拮抗活性是通過基質(zhì)中接觸線中的菌株的生長和通過瓊脂塊的方法決定的。在LB瓊脂培養(yǎng)基上，涂一下菌株枯草芽孢桿菌VKPM B-10999，并且垂直于它涂一下菌株紅串紅球菌VKPM Ac-1882和惡臭假單胞菌VKPMB-10997。在下一個營養(yǎng)培養(yǎng)基的杯體上，涂沖程紅串紅球菌Ac-1882，并且垂直于它涂菌株枯草芽孢桿菌B-10999和惡臭假單胞菌B-10997。在培養(yǎng)基的第三個杯體上，涂一下惡臭假單胞菌B-10997，并且垂直于它涂菌株枯草芽孢桿菌B-10999和紅串紅球菌Ac-1882。在接觸線附近，未觀察到任何抑制菌株生長的現(xiàn)象。當(dāng)使用瓊脂塊進(jìn)行實驗時，在LB培養(yǎng)基上的其中一種菌株的菌苔上放置另外兩種菌株的3天培養(yǎng)物的塊。無實驗示出抑制菌株的生長。這表明菌株間不存在拮抗活性以及它們可能有效結(jié)合的應(yīng)用。
[0045]生物制品“ΡΗΕΝ0Χ”的組合物的實施例
[0046]實施例3
[0047]生物制品“ΡΗΕΝ0Χ”，其形式為干燥粉末。細(xì)胞的干生物量(濃縮)_枯草芽孢桿菌 VKPM B-10999 為不小于 5X 109CFU/g，惡臭假單胞菌 VKPMB-10997 為至少 5X 109CFU/g并且紅串紅球菌VKPM Ac-1882為至少5X108CFU/g，三者比例為(1-2):1: (1-2)(質(zhì)量份數(shù)-76.5-90%);不引入或引入1-10%的吸附劑-細(xì)磨泥灰和/或0.1-1%的還包含的礦物鹽和微量元素-蚯蚓糞的促進(jìn)添加劑；水，不多于10.0% ;活細(xì)胞的總滴度為至少101(lCFU/g。
[0048]實施例4 [0049]生物制品“ PHENOX ”，其形式為干燥粉末。5_30%的細(xì)胞的干生物量-枯草芽孢桿菌VKPM B-10999、惡臭假單胞菌VKPM B-10997和紅串紅球菌VKPM Ac-1882的比例為1:1:1 ；1-10%的吸附劑-細(xì)磨泥灰和/或0.1-1%的還含有礦物鹽和微量元素-蚯蚓糞的促進(jìn)添加劑；水，不多于10.0% ;吸附劑和填料高嶺土 -加至100% ;活細(xì)胞的總滴度為至少5X108CFU/g。
[0050]實施例5
[0051]生物制品“ΡΗΕΝ0Χ”，其形式為-干燥粉末。5_30%的細(xì)胞的干生物量-枯草芽孢桿菌VKPM B-10999、紅串紅球菌VKPM Ac-1882和惡臭假單胞菌VKPM B-10997的比例為1:1:1 ;水，不多于10.0% ;高嶺土 -加至100% ;活細(xì)胞的總滴度為至少5 X 108CFU/g。
[0052]實施例6
[0053]液體形式的生物制品“ΡΗΕΝ0Χ”:細(xì)菌枯草芽孢桿菌VKPM B-10999、紅串紅球菌VKPM Ac-1882和惡臭假單胞菌VKPM B-1099的細(xì)胞以1:1:1的比例(總滴度_109CFU/ml)在不加添加劑或加入生物活性物質(zhì)(培養(yǎng)料或蚯蚓糞提取物-l_5ml/l或細(xì)磨培養(yǎng)料或蚯蟲引糞0.1%和/或甲殼質(zhì)或殼聚糖或含有放射物質(zhì)的甲殼質(zhì)-0.05-0.4%)的培養(yǎng)基中?？少A藏在0-8°C至少3個月，在18-25°C時多達(dá)15天。當(dāng)在18_25°C的溫度貯藏時，可將活細(xì)胞的數(shù)量降低到107CFU/ml滴度。
[0054]通過以下實施例解釋所提供的制品的使用方法。
[0055]實施例7
[0056]制品“ΡΗΕΝ0Χ”處理水中的吡蟲啉的應(yīng)用。將IOOmg量的以下組分的干粉形式的制品“ΡΗΕΝ0Χ”:比例為1:2:1的細(xì)菌細(xì)胞濃縮物，總滴度為5xl01(lCFU/g (根據(jù)實施例1的制品的組合物)，引入200ml的被活性成分的濃度為lmg/L和2mg/L的農(nóng)藥(殺蟲劑)吡蟲啉污染的自來水中。此外，在水培養(yǎng)基中加入礦物鹽添加劑(g/1) =Na2HPO4.7H20-6.4g/l ；KH2PO4-L 5g/l ；NaCl-0.25g/l ；NH4Cl0.5g/l。為了對照，使用被以濃度為 lmg/L和 2mg/L 的吡蟲啉污染的、有礦物鹽、無生物制品的水樣品。這些樣品在室溫下用混合器(120rpm)持續(xù)攪拌下培養(yǎng)。該實驗重復(fù)3次。水中吡蟲啉的含量在第1、3、5、7、10天通過標(biāo)準(zhǔn)柱層析法確定(Rudakov等，2004)。數(shù)據(jù)的變異系數(shù)不超過5%。
[0057]表1
[0058]使用制品“ΡΗΕΝ0Χ”時水中吡蟲啉含量的動態(tài)
[0059]
【權(quán)利要求】
1.保藏在俄羅斯國家工業(yè)微生物保藏中心(VKPM)保藏號為B-10997的菌株惡臭假單胞菌、保藏在俄羅斯國家工業(yè)微生物保藏中心(VKPM)保藏號為B-10999的菌株枯草芽孢桿菌、和保藏在俄羅斯國家工業(yè)微生物保藏中心(VKPM)保藏號為Ac-1882的菌株紅串紅球菌的組合。
2.含有菌株惡臭假單胞菌VKPMB-10997、枯草芽孢桿菌VKPMB-10999和紅串紅球菌VKPM Ac-1882的組合的制品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制品，包括按重量比(1-2): (1-2):1的菌株惡臭假單胞菌VKPM B-10997、枯草芽孢桿菌VKPM B-10999和紅串紅球菌VKPM Ac-1882的組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3的制品，所述制品進(jìn)一步包括吸附劑或被固化在吸附劑上，并且可選地包括礦物、有機(jī)和/或促進(jìn)添加劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一項權(quán)利要求所述的制品凈化土地、土壤、水或工業(yè)廢水去除耐降解農(nóng)藥或油的用途，該用途通過將有效量的根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一項權(quán)利要求所述的制品引入污染的土壤、土地、水或廢水中實現(xiàn)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制品的用途，其中，耐降解農(nóng)藥選自:如2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)、三氯苯氧乙酸(2，4，5-T)、氯苯氧基乙酸(CPAA)、苯氧基乙酸(PAA)的氯苯氧基乙酸類，2，4- 二氯苯酚和苯酚、吡蟲啉。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-4任中一項權(quán)利要求所述的制品促進(jìn)植物生長活性和/或作用殺真菌制劑的用途。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制品的用途，其中，所述制品的干組合物在耕作、耕種或播種時被引入土地，優(yōu)選以I公頃土地IOkg的量引入。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制品的用途，其中，所述制品以水溶液形式的通過灌溉引入土地中。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制品的用途，其中，所述制品引入土壤中是通過將所述制品的懸浮液處理的種子引入土壤來實施的，可選擇地，加入諸如蚯蚓糞的營養(yǎng)物。
【文檔編號】C12R1/01GK103748214SQ201280034498
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2012年2月8日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月13日
【發(fā)明者】利利婭·阿尼西莫娃, 塔季揚(yáng)娜·馬爾庫舍娃, 亞歷山大·庫拉科夫, 安德烈·扎庫塔耶夫 申請人:生物地帶有限公司, 加琳娜·扎庫塔葉娃