沙門氏菌和大腸桿菌的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法以及用于檢測沙門氏菌和大腸桿菌的方法
【專利摘要】在實施例中公開了培養(yǎng)基、用于補充培養(yǎng)基的成分和用于培養(yǎng)生物樣品的方法。在實施例中，所述方法是用于檢測細菌的方法，并且在實施例中所述細菌包含沙門氏菌(salmonellaspp)，并且在實施例中包括大腸桿菌(E.coli?spp)。在實施例中所述培養(yǎng)基和成分包含烷醇胺和復合鈷胺素。
【專利說明】沙門氏菌和大腸桿菌的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法以及用于檢測沙門氏菌和大腸桿菌的方法
【背景技術】
[0001]1.【技術領域】
[0002]本發(fā)明公開的主題涉及用來培養(yǎng)微生物和檢測微生物的培養(yǎng)基和方法。
[0003]2.相關文獻
[0004]1.Roof, D.M., and J.R.Roth.1988.Ethanolamine utilization in Salmonellatyphimurium.J.Bacteriol.170:3855-3863.[0005]2.Roof，D.M.，and J.R.Roth.1989.Functions required for vitaminB12_dependent ethanolamine utilization in Salmonella typhimurium.J.Bacteriol.171:3316-3323.[0006]3.Chang, G.W., and J.T.Chang.1975.Evidence for the B12_dependent enzymeethanolamine deaminase in Salmonella.Nature254:150-151.[0007]4.Garsinj D.A.2010.Ethanolamine utilization in bacterial pathogens:roleand regulation.Nat.Rev.Microbiol.8 (4): 290-295.[0008]5.Kofoidj E.，C.Rappleyej 1.Stojiljkovicj and J.Roth.1999.Thel7_geneethanolamine(eut)operon of Salmonella typhimurium encodes five homologues ofcarboxysome shell proteins.J.Bacteriol.181:5317-5329.[0009]6.Brinsmade S.R.，Pal don T.，Escal ante-Semerena J.C.2005.Minimal functions and physiological conditions required for growth ofsalmonella enterica on ethanolamine in the absence of the metabolosome.J.Bacteriol.187(23):8039-46.[0010]7.Chapter4entitled Isolation and identification of Salmonellafrom, meat, poultry and eggs products in USDA/FSIS Microbiology Laboratoryguidebook, 3rd Edition, Rev.#4，http://www.fsis.usda.gov/PDF/MLG 4 05.pdf [0011]8.Chapter5B entitled Detection and Isolation of non-0157Shiga_toxinProducing Escherichia coli(STEC) from Meat Products in USDA/FSIS MicrobiologyLaboratory guidebook，3rd Edition, Rev.#1，http://www.fsis.usda.rov/PDF/Mlg 5B 01.pdf
[0012]9.Chapter5entitled Salmonella in FDA Bacterial Analytical Manual, 8thEdition, November201IVersionj
[0013]http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalManualBAM/ucm070149.htm

【發(fā)明內容】

[0014]在第一個實施例中公開了包含具有生物有效濃度的復合鈷胺素和烷醇胺的培養(yǎng)基。[0015]在實施例中，所述復合鈷胺素選擇由鈷胺素、甲基鈷胺素、腺苷鈷胺素、羥鈷胺素和氰鈷胺素組成的組。
[0016]在實施例中，所述烷醇胺是乙醇胺。
[0017]在實施例中，公開了細菌培養(yǎng)基。
[0018]在實施例中所述細菌為沙門氏菌(salmonella spp)或大腸桿菌(E.coli spp)。
[0019]在實施例中，所述細菌為鼠傷寒沙門氏菌(salmonella typhimurium)、大腸桿菌157(E.colil57)、志賀毒素大腸桿菌(Shigatoxin E.coli)或腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic E.coli)。
[0020]在實施例中復合鈷胺素大于0.002M濃度存在且所述烷醇胺以大于0.001mg/l的
濃度存在。
[0021]在進一步的一系列實施例中公開了用于培養(yǎng)生物樣品的方法，所述方法包括在具有生物有效濃度的復合鈷胺素和烷醇胺存在的情況下孵育樣品的步驟。
[0022]在實施例中，所述復合鈷胺素選自由鈷胺素、甲基鈷胺素、腺苷鈷胺素、羥鈷胺素和氰鈷胺素組成的組。
[0023]在實施例中，所述烷醇胺為乙醇胺。
[0024]在實施例中，所述方 法用于培養(yǎng)細菌。
[0025]在實施例中，所述細菌為沙門氏菌(salmonella spp)或大腸桿菌(E.coli spp)。
[0026]在實施例中，所述細菌為鼠傷寒沙門氏菌(salmonella typhimurium)、大腸桿菌157(E.colil57)、志賀毒素大腸桿菌(Shigatoxin E.coli)或腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic E.coli)。
[0027]志賀毒素大腸桿菌在實施例中，所述烷醇胺以大于0.002M的濃度存在且所述復合鈷胺素-以大于0.001mg/l的濃度存在。
[0028]所述方法用于檢測樣品中的沙門氏菌或大腸桿菌。
[0029]在實施例中，所述方法用于檢測樣品中的沙門氏菌或大腸桿菌且所述烷醇胺為乙醇胺。
[0030]在實施例中，所述方法進一步包含PCR、凝集素結合、樣品擴散、側向擴散、抗體結合、側向層析或分步層析。
[0031]在進一步一系列的實施例中，公開了用于在培養(yǎng)基中優(yōu)先培養(yǎng)沙門氏菌和大腸桿菌的方法，所述方法包括向培養(yǎng)基補充具有生物有效濃度的復合鈷胺素和烷醇胺。
[0032]在進一步一系列的實施例中，公開了用于補充培養(yǎng)基的配方，所述配方包含復合鈷胺素和烷醇胺。
[0033]在實施例中，所述復合鈷胺素選自由鈷胺素、甲基鈷胺素、腺苷鈷胺素、羥鈷胺素和氰鈷胺素組成的組。
[0034]在實施例中所述烷醇胺為乙醇胺。
[0035]在實施例中所述配方的用途是用于細菌的生長。
[0036]在實施例中，細菌為沙門氏菌(salmonella spp)或大腸桿菌(E.coli spp)。
[0037]在進一步一系列的實施例中公開了用于檢測生物樣品中志賀毒素大腸桿菌鼠傷寒沙門氏菌(salmonella typhimurium)、大腸桿菌157 (E.colil57)、志賀毒素大腸桿菌(Shigatoxin E.coli)或腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic E.coli)的方法，所述方法包含在具有生物有效濃度的乙醇胺和復合鈷胺素存在的情況下培養(yǎng)樣品，所述復合鈷胺素選自由鈷胺素、甲基鈷胺素、腺苷鈷胺素、羥鈷胺素和氰鈷胺素組成的組。
[0038]此處所述主題的特征和優(yōu)勢將通過下述優(yōu)選的實施例的詳細描述而變得更加明顯，如附圖所示。將認識到，公開和請求保護的主題可在各方面進行修改，只要不脫離權利要求的范圍。因此，附圖和說明書被認為是說明性的，而不是限制性的且所述主題的完整范圍記錄在權利要求書中。
[0039]優(yōu)選實施例的詳細說明
[0040]術語
[0041]在本公開中，“包含”一詞被用在非限制性句子中表示緊接著該詞的內容被包括進來，但是沒有特別提及的內容不代表被排除了。能被理解的是當實施例表示包含或可能包含特征或特點時，它也可以設想成在實施例替代變體中，所述實施例可以包括或基本包括符合所討論的特征。提到某種元素不排除其他元素存在的可能，除非文章明確要求一種和只有一種元素。
[0042]本公開中,通過端點敘述的數(shù)值范圍包括此范圍內所有的數(shù)字,包括所有的整數(shù)，所有的小數(shù)(例如，I到5包括1、1.5、2、2.75,3,3.80,4和5等)。
[0043]本公開中，單數(shù)形式包括復數(shù)的指示對象除非內容另有明確規(guī)定。因此，例如，提及包含“化合物”的配方，包括兩種或更多化合物的混合物。
[0044]本公開中，“或者” 一詞在句中包括了 “和/或”的含義，除非內容另有明確規(guī)定。
[0045]本公開中，除非另有指明，所有說明書和權利要求書中列出的用于表示數(shù)量或成分，性質測定等的數(shù)字可在所有例證中通過“約”一詞進行修改。因此，除非有根據(jù)上下文相反的或必要的指示，本公開中·列出的數(shù)值參數(shù)為可以基于所需性質進行改變的近似值，本領域技術人員利用現(xiàn)有公開的內容并根據(jù)測量和定量的不準確性可試圖獲得所述性質。在不限制等同原則適用于權利要求的范圍的情況下，至少應該根據(jù)已報道的顯著位數(shù)的數(shù)量以及利用普通的四舍五入方法對每一個數(shù)值參數(shù)進行分析。盡管本公開寬范圍中列出的數(shù)值范圍和參數(shù)為近似值，列于具體實施例中所列的數(shù)值被廣義地理解到一個程度，該程度兼顧本公開的有效性以及本公開和請求保護的主題與現(xiàn)有技術的區(qū)別并存。
[0046]本公開中，“培養(yǎng)基”、“肉湯”、“培養(yǎng)液”等均涉及適于培養(yǎng)所需微生物(可以是細菌或微生物菌株或品種)的營養(yǎng)混合物。在實施例中可以是或者可以包含如本文所定義的任何核心培養(yǎng)基并且可以用粉末或濃縮形式來制備。
[0047]在實施例中，培養(yǎng)基含有pH緩沖液。在一系列的實施例中，所述pH緩沖液是磷酸二氫鈉和磷酸氫二鉀的混合物,但是也可以是替代的生物相容的緩沖液,例如MOPS (也叫3- (N-嗎啉)丙磺酸、3-嗎啉代丙烷-1-磺酸、3-N-嗎啉丙磺酸、4-嗎啉丙磺酸)、和適當?shù)奶妓徕}緩沖液，并且能被本領域技術人員熟練選擇和操作以獲得所需的培養(yǎng)基PH值。
[0048]在實施例中，培養(yǎng)基可以以粉末或濃縮的形式被提供，通常也被稱為“粉末”、“濃縮物”、“粉末培養(yǎng)基”、“培養(yǎng)基粉末”、“培養(yǎng)基濃縮物”、“濃縮培養(yǎng)基”等，它包含多種成分并適于與定量的水結合以制成特定成分具有所需濃度的液體培養(yǎng)基。這樣的粉末培養(yǎng)基或濃縮培養(yǎng)基可能是完整的，這意味著只需在使用前將它溶于適量的水(一般是無菌水)。在實施例中另一種情況是，粉末或濃縮培養(yǎng)基可能是不完整的，這意味著需要添加額外的成分來獲得適于使用的完整的培養(yǎng)基。在實施例中，粉末或濃縮的培養(yǎng)基也包括濃縮的至少部分水合的培養(yǎng)基，它在溶解后形成用于培養(yǎng)細菌的培養(yǎng)基?？梢岳斫獾氖?，除非文章另有要求，本文所用的“培養(yǎng)基”不僅包括成分濃度適合培養(yǎng)細菌和微生物的最終培養(yǎng)基，還包括適于稀釋的粉末或濃縮培養(yǎng)基?！癆cteiO沙門氏菌/STEC”擴繁培養(yǎng)基或“AEM”培養(yǎng)基及其近似詞語通常指基于實施例的培養(yǎng)基。
[0049]本公開中，“維生素B12”和“鈷胺素”具有它們正常的含義且二者都是指擁有圖1A中所示結構式的維生素。其中R代表任何與基本正常維生素B12活性或與用于此處請求保護的主題的實施例中的活性相兼容的組。在特定的實施例中但不限于的情況下，以上配位到中央Co2+離子的配體R可以是Me、0H、CN和5’-脫氧腺苷基。為進一步確定且不限制的情況下，維生素B12的其它名稱和具有生物活性的相關衍生物包括:B-12、B12、B群維生素、Bedumil、鈷胺素、氰鈷胺素、維生素B12、維他命B12、B群維他命、氰鈷維生素、氰鈷胺、維生素B12氰鈷胺、復合鈷胺素、輕鈷胺素、輕鈷胺、Hydroxocobalaminum、輕鈷胺維生素B12、Hydroxocobemine>Idrossocobalamina> 甲基鉆胺素、甲鉆胺、維生素 B12 a、Vitadurine、維生素B12、維他命B12、核黃素、維他命B2、啶黃素、黃素、印黃素、乳黃素、維生素B-2和維生素G。
[0050]相似地，“鈷胺化合物”應被理解為包括所有與維生素B12或鈷胺素的生物性質基本相當?shù)幕衔?。例如但不限于，本領域技術人員熟知，在實施例中，關于維生素B12或復合鈷胺素應被理解為包括氰鈷維生素、甲基鈷胺素、腺苷鈷胺素、羥鈷胺素和其他功能相當?shù)幕瘜W物質，本領域技術人員能熟練地鑒別這些物質。
[0051]可進一步理解的是，在實施例中，各種鈷胺素的修飾或共軛形式可能具有生物有效性并且為本領域技術人員所熟知，并且可以理解地被包括在“復合鈷胺素”中。廣義上，復合鈷胺素可以包括任何具有圖1B中所示的一般結構的化合物，其中Rl，R2, R3, R4, R5, R6，R7, R9, RIO, Rll, R12, R13, R14, R15可以是相同的或各異的，并且可以獨立地是H或可以是直鏈或支鏈的烷基、 環(huán)基、環(huán)烷基并且可以是本領域技術人員所熟知的各種方式的支鏈的或替代的，并且可以獨立包含或者包含至少0，I, 2，3，4，5，6，7，8或更多碳原子。在特定的實施例中且不限于的情況下，以上配位到中央Co2+離子的配體R15可以是Me、OH、CN和5’ -脫氧腺苷基。
[0052]本公開中，“烷醇胺”也被稱為“氨基醇”指在烷烴主干上包含醇基和氨基的有機化合物。非限制性實施例中，烷醇胺包括甲基乙醇胺、乙醇胺、二甲乙醇胺、N-甲基乙醇胺、氨甲庚醇、乙基異丙腎上腺素、正腎上腺素、丙醇胺、戊胺、鞘氨醇、具有結構式N(H)R1，R2的二烷醇胺和具有結構式NR1，R2, R3的三烷醇胺。在特定的實施例中，烷醇胺可以是乙醇胺或者可以包含具有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多的碳原子的主干并且可以包含一種以上的氨基或一種以上的羥基或一種以上的氨基和一種以上的羥基。在實施例中，烷醇胺可以是替代的烷醇胺。在特定的實施例中，烷醇胺可以是乙醇胺。為進一步明確，乙醇胺的其他名字包括單乙醇胺、2-氨基乙醇、膽胺、氨基乙醇、2-羥基乙胺、環(huán)氧丙醇、乙醇胺、氨基乙醇、2-氨基-1-乙醇。在特定的實施例中，鏈烷醇胺選自由丙二醇、單異丙醇、乙二醇、2-1氨基乙醛、氨基丙腈、乙二胺、2-氨基丙醇、1，2-二氨基丙烷、N-甲氨基乙醇、2-羥乙基肼、3-氨基-1-丙醇、2-氟乙醇、2-羥乙酰胺、2-氨基乙醇、(R) -(_) I, 2-丙二醇組成的組。
[0053]本公開中應被理解的是，除文義另有所指外，提及的培養(yǎng)基或溶液包含烷醇胺或復合鈷胺素或烷醇胺或復合鈷胺素等可以包括兩份、三份或多分烷醇胺或復合鈷胺素或烷醇胺和復合鈷胺素。因此根據(jù)實施例和非限制性的說明書，培養(yǎng)基包含每升I克的烷醇胺說明I克可以包含不同烷醇胺的混合物，它們加起來總的重量為I克。同樣地，再次根據(jù)實施例和非限制性的說明書，包含I克復合鈷胺素的混合物應當被理解為:所述I克包含一種或多種復合鈷胺素成分，例如甲基鈷胺素、氰鈷維生素和/或其它復合鈷胺素，它們加起來的總量為I克。
[0054]本公開中，動詞“緩沖”表示在預定范圍內，以對本領域技術人員來說顯而易見的方式穩(wěn)定溶液的PH，所述溶液可以是培養(yǎng)基。名詞“緩沖液”指適于穩(wěn)定溶液pH的化學制
品O
[0055]本公開中，“基礎”或“核心”培養(yǎng)基或肉湯指包含某些為本領域技術人員所熟知的基本需要的成分的部分培養(yǎng)液，并且它的具體配方組成是可以變動的只要仍然適合于所培養(yǎng)的微生物生長。因此在實施例中但無限制性的情況下，核心培養(yǎng)基可以包含鹽、緩沖液和蛋白提取物，并且在實施例中可以包含氯化鈉、磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉、硫酸鎂和氯化鈣。在實施例中一升核心培養(yǎng)基可以具有表1所示的通用配方但是在替代實施例中，核心培養(yǎng)基將或可以包含水、瓊脂、蛋白、氨基酸、酪蛋白水解物、鹽類、脂類、碳水化合物、鹽類、礦物質、和PH緩沖液中的一種或多種，并且可以包括提取物例如肉提取物、酵母提取物、胰蛋白胨、植物蛋白胨、蛋白胨、麥芽提取物，并且在實施例中，培養(yǎng)基可以是或者可以包含LB培養(yǎng)基；低鹽LB培養(yǎng)基(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物和0.5%NaCl)，SOB培養(yǎng)基(2%蛋白胨、0.5%酵母提取物、IOmM NaCl,2.5mM KClUOmM MgCl2UOmM MgSO4), SOC 培養(yǎng)基(2% 蛋白胨、0.5%酵母提取物、IOmM NaCl,2.5mM KClUOmM MgCl2UOmM MgS04、20mM葡萄糖)，超級肉湯(3.2%蛋白胨、2%酵母提取物和0.5%NaCl), 2xTY培養(yǎng)基(1.6%蛋白胨、1%酵母提取物和
0.5%NaCl), Terrific 肉湯(TB)(1.2% 蛋白胨、2.4% 酵母提取物、72mM K2HP04、17mM KH2P04和0.4%甘油)，LB或LB Lennox肉湯(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物和l%NaCl)。應被理解的是，在特定實施例中，一種或多種成分可以從所述核心培養(yǎng)基中省去。在實施例中，培養(yǎng)基可以是簡單的、復雜的或指定的培養(yǎng)基并且可以是擴繁培養(yǎng)基并且可以是以各種本領域技術人員所熟知的不同方式進行補 充的。廣義地，本領域技術人員了解所述培養(yǎng)基包含基本適于支持一種或多種微生物生長的任何成分。
[0056]表1:基于實施例的核心培養(yǎng)基的基本配方
[0057]
【權利要求】
1.培養(yǎng)基，包含具有生物有效濃度的: 復合鈷胺素，和 烷醇胺。
2.根據(jù)權利要求1所述的所述培養(yǎng)基，其中所述復合鈷胺素選自由鈷胺素、甲基鈷胺素、腺苷鈷胺素、羥鈷胺素和氰鈷胺素組成的組。
3.根據(jù)權利要求1所述的所述培養(yǎng)基，其中所述烷醇胺為乙醇胺。
4.根據(jù)權利要求1所述的細菌培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權利要求4所述的培養(yǎng)基,其中所述細菌是沙門氏菌(salmonellaspp)或大腸桿菌(E.coli spp.)。
6.根據(jù)權利要求5所述的培養(yǎng)基，其中所述細菌是鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimurium)、大腸桿菌 157 (E.colil57)、志賀毒素大腸桿菌(Shigatoxin E.coli)或腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic E.col1.)。
7.根據(jù)權利要求2中的所述培養(yǎng)基，其中所述烷醇胺以大于約0.002M的濃度存在并且所述復合鈷胺素以大于約0.001mg/l的濃度存在。
8.用于培養(yǎng)生物樣品的方法，所述方法包括在存在以下生物有效濃度的成分的情況下孵育生物樣品的步驟: 復合鈷胺素，和 烷醇胺。
9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中所述復合鈷胺素選自由鈷胺素、甲基鈷胺素、腺苷鈷胺素、羥鈷胺素和氰鈷胺素組成的組。
10.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中所述烷醇胺是乙醇胺。
11.根據(jù)權利要求8中的所述方法用于培養(yǎng)細菌。
12.權利要求12中的所述方法，其中所述細菌是沙門氏菌或大腸桿菌其中所述細菌是沙門氏菌(salmonella spp)或大腸桿菌(Ε.coli spp.)。
13.根據(jù)權利要求12所述的方法，其中所述細菌是鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimurium)、大腸桿菌 157 (E.colil57)、志賀毒素大腸桿菌(Shigatoxin Ε.coli)或腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic E.col1.)。
14.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中所述烷醇胺以大于約0.002M的濃度存在并且所述復合鈷胺素以大于約0.001mg/l的濃度存在。
15.權利要求8所述的方法用于在樣品中檢測沙門氏菌或大腸桿菌。
16.權利要求8所述的方法用于在樣品中檢測沙門氏菌或大腸桿菌并且其中所述烷醇胺為乙醇胺。
17.根據(jù)權利要求16所述的方法，進一步包含PCR、凝集素結合、簡單擴散、側向擴散、抗體結合、側向層析或分步層析。
18.用于在培養(yǎng)基中優(yōu)先培養(yǎng)沙門氏菌和大腸桿菌的方法，所述方法包含利用具有生物有效濃度的復合鈷胺素和烷醇胺補充所述培養(yǎng)基。
19.用于補充培養(yǎng) 基的成分，包含: 復合鈷胺素，和 烷醇胺。
20.根據(jù)權利要求19中所述的成分，其中所述復合鈷胺素選自由鈷胺素、甲基鈷胺素、腺苷鈷胺素、羥鈷胺素和氰鈷胺素組成的組。
21.根據(jù)權利要求19所述的成分，其中所述烷醇胺是乙醇胺。
22.權利要求18所述的成分用于細菌生長。
23.權利要求22所述的成分，其中所述細菌是沙門氏菌或大腸桿菌。
24.用于在樣品中檢測鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌157、志賀毒素大腸桿菌和腸出血性大腸桿菌的方法，所述方法包含在具有生物有效濃度的乙醇胺；和選自由甲基鈷胺素、腺苷鈷胺素、羥鈷胺素和氰鈷胺素組成`的組的復合鈷胺素存在的情況下培養(yǎng)所述樣品。
【文檔編號】C12Q1/10GK103797110SQ201280034793
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年7月10日 優(yōu)先權日:2011年7月12日
【發(fā)明者】馬汀內茲·加布里耶拉, 特朗布萊·雷諾, 拉羅謝爾·賈尼金 申請人:食品安全測試系統(tǒng)公司