Hla基因的dna分型方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供高精度的DNA分型方法和試劑盒，其排除了相位模糊引起的不明確。本發(fā)明提供了HLA的DNA分型方法，其特征為包含以下步驟：（1）制備對人基因組堿基序列中HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1和HLA-DPB1各基因的上游區(qū)域和下游區(qū)域分別特異性退火的引物組以及對HLA-DRB1的外顯子2和3'側非翻譯區(qū)域特異性退火的引物組的步驟；（2）應用前述引物組對被測試樣（DNA）進行PCR擴增的步驟；（3）確定PCR擴增產物的堿基序列的步驟；和（4）任選地，進行與數(shù)據庫的同源性檢索的步驟。
【專利說明】HLA基因的DNA分型方法和試劑盒
[0001]【技術領域】
本發(fā)明涉及應用大規(guī)模平行序列分析儀進行HLA基因的DNA分型的方法和試劑盒。
【背景技術】
[0002]作為人主要組織相容性復合物(MHC)的人白細胞抗原(HLA)通過向T細胞呈遞衍生自病原體等外來蛋白質的肽以及衍生自自身蛋白質的肽而深入地牽涉免疫應答的誘導，有6種抗原已知為主要的HLA。即，幾乎在所有細胞中表達的I類分子(HLA-A、HLA-B,HLA-C)與主要在免疫系統(tǒng)細胞中表達的II類分子(HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP)。
[0003]HLA I類抗原由表現(xiàn)高度多態(tài)性的α鏈和幾乎沒有多態(tài)性的β 2_微球蛋白組成，HLA II類抗原由存在高度多態(tài)的β鏈和多態(tài)性低的α鏈組成。I類分子的α鏈由HLA-A、HLA-B, HLA-C各基因編碼，II類抗原的β鏈由HLA-DRB1、HLA-DQBU HLA-DPBl基因編碼，α鏈由HLA-DRAl、HLA-DQA1、HLA-DPA1基因編碼。在基因水平，在HLA I類抗原中，編碼α鏈的基因的外顯子2和外顯子3顯示高度多態(tài)性，在HLA II類抗原中，編碼β鏈的基因的外顯子2顯示高度多態(tài)性。
[0004]編碼HLA的基因區(qū)域位于人6號染色體短臂6ρ21.3，從端粒側至著絲粒側，以I類區(qū)域(HLA-A、HLA-C, HLA-B 等)、III 類區(qū)域、II 類區(qū)域(HLA-DRA、HLA-DRBU HLA-DQAUHLA-DQB1、HLA-DPA1、HLA-DPBI等)的順序排列，許多基因以非常高的密度編碼，這些基因與輸血、移植和各種疾病的關聯(lián)被報告。在III類區(qū)域中不存在HLA基因，存在補體成分、腫瘤壞死因子(TNF)等的基因。
[0005]在編碼HLA-DR抗原的β鏈的HLA-DRB基因區(qū)域中，確認了 5種結構多態(tài)性。在DRl型和DRlO型中，在同一染色體上，除HLA-DRBl之外還定位HLA-DRB6和HLA-DRB9等假基因。在DR2型中，在同一染色體上，除HLA-DRBl之外還定位HLA-DRB5 (DR51)基因以及HLA-DRB6和HLA-DRB9等假基因。在DR3、DR5以及DR6型中，除HLA-DRBI之外，在同一染色體上還定位HLA-DRB3 (DR52)基因以及HLA-DRB2和HLA-DRB9等假基因。在DR4、DR7以及DR9型中，除HLA-DRBl之外，在同一染色體上還定位HLA-DRB4 (DR53)基因以及HLA-DRB7、HLA-DRB8和HLA-DRB9等假基因。與這些相對，在DR8型中，在同一染色體上沒有定位HLA-DRBl之外的HLA-DRB基因。
[0006]在各等位基因的外顯子中，存在顯示多態(tài)性的多個區(qū)域，在許多情況下，特定多態(tài)區(qū)域的堿基序列(氨基酸序列)在多個等位基因中是共同的。即，各HLA等位基因通過多個多態(tài)區(qū)域的組合而指定。在HLA I類抗原中，不僅外顯子內的多態(tài)區(qū)域、而且具有同一堿基序列的外顯子2或外顯子3有時在多個等位基因中是共同的。
[0007]由于HLA中存在高度多態(tài)，已知等位基因的種類極多，它們的表示法也得到確定。也即，辨別血清學HLA型的第I領域(2位數(shù)(two-digit)水平)、辨別同一血清學HLA型內伴有氨基酸置換的等位基因的第2領域(4位數(shù)水平)、辨別具有不伴有氨基酸突變的堿基置換的等位基因的第3領域 (6位數(shù)水平)、和辨別編碼HLA分子的基因區(qū)域外(內含子)中伴有堿基置換的等位基因的第4領域(8位數(shù)水平)。[0008]認為在骨髓移植時，如果希望移植者與供體的HLA型在4位數(shù)水平完全匹配，移植的成功率提高，重度GVHD頻率降低。相反，如果HLA型在4位數(shù)水平不匹配，產生引起排斥反應等失敗的風險增加。因此，準確且高精度地進行HLA分型在臨床上是極端重要的。
[0009]作為HLA基因中的DNA分型法，基于聚合酶鏈式反應(PCR)的SBT(基于序列分型)法和SSO (序列特異性寡核苷酸)-Luminex法是主流。
[0010]這些常規(guī)的DNA分型法具有可以對多數(shù)樣品迅速分型的優(yōu)勢，但是，有時不能準確確定多態(tài)區(qū)域和I類基因情況下外顯子在染色體上的順反位置關系，因此，產生相位模糊(phase ambiguity),有時難以進行高精度的HLA分型。
[0011]另外，常規(guī)方法是以各基因外顯子區(qū)域為中心應用PCR的DNA分型法，因此，忽略了內含子區(qū)域和啟動子區(qū)域中的堿基置換，其結果是，對基因結構與其它表達HLA基因一樣但表達抑制的無效等位基因的檢測有可能失敗。
[0012]現(xiàn)有技術文獻 專利文獻
專利文獻1:特開平11-216000號公報 非專利文獻
非專利文獻 1: Lind C.等，Human Immunology,第 71 卷，1033-1042 頁(2010 年)。

【發(fā)明內容】

[0013]發(fā)明要解決的課題
本發(fā)明的課題是，提供高精度的DNA分型方法和試劑盒，其排除了相位模糊引起的不明確。
[0014]解決課題的手段
本發(fā)明人基于新想法反復研究上述課題，從而完成本發(fā)明，所述新想法為，新設計能夠特異性擴增 I 類 HLA 分子 HLA-A、HLA-B 和 HLA-C 以及 II 類 HLA 分子 HLA-DRBl、HLA-DQA1、HLA-DQBU HLA-DPAl和HLA-DPBl這些HLA基因的PCR引物，設定合適的PCR條件，應用大規(guī)模平行測序技術。
[0015]也即，本發(fā)明提供了包含以下步驟的HLA的DNA分型方法。
[0016](I)制備對人基因組堿基序列中 HLA-A、HLA-B, HLA-C, HLA-DQAl、HLA-DQBl、HLA-DPAl和HLA-DPBl各基因的上游區(qū)域和下游區(qū)域分別特異性退火的引物組以及對HLA-DRBl的外顯子2和3’側非翻譯區(qū)域特異性退火的引物組的步驟；
(2)應用前述引物組對被測試樣(DNA)進行PCR擴增的步驟；
(3)確定PCR擴增產物的堿基序列的步驟；和
(4)進行與數(shù)據庫的同源性檢索的步驟。
[0017]發(fā)明效果
本發(fā)明方法得到對來自I分子的HLA基因進行DNA分型所需的全部堿基序列，因此為排除了順反位置關系不清楚的相位模糊的最終DNA分型法。通過該方法，實現(xiàn)了移植時希望移植者與供體候選者之間高精度的HLA匹配。
[0018]由于含有HLA基因 的啟動子區(qū)域、外顯子區(qū)域、內含子區(qū)域等周邊區(qū)域的基因全部喊基序列得到確定，可以檢測出完全不表達或表達抑制的無效等位基因和新穎的等位基因。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019][圖1](a)示出HLA I類基因結構與分子結構的關聯(lián)性的圖。(b)示出HLA I類基因的啟動子區(qū)域的結構的圖。引用自Transplantation/transfusion Examination,Hidetoshi Inoko、Takehiko Sasazuki 和 Takeo Juuji 編輯,Kodan-sha Scientific, 2004年，第35頁。
[0020][圖2](a)示出HLA II類基因結構與分子結構的關聯(lián)性的圖。(b)示出HLA II類基因的啟動子區(qū)域的結構的圖。引用自Transplantation/transfusion Examination,Hidetoshi Inoko、Takehiko Sasazuki 和 Takeo Juuji 編輯,Kodan-sha Scientific, 2004年，第46頁至第47頁。
[0021][圖 3]不出 HLA-DR 基因區(qū)域的圖。引用自 Transplantation/transfusionExamination, Hidetoshi Inoko>Takehiko Sasazuki 和 Takeo Juuji 編輯，Kodan-shaScientific，2004 年，第 48 頁。
[0022][圖4]示出實施例1中擴增的PCR產物的擴增狀況的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0023][圖5]示出HLA基因的基因結構與設計PCR引物的位置的示意圖(括號內指明在該區(qū)域設計的引物的序列編號)。
[0024][圖6]示出實施例2中擴增的HLA基因的PCR擴增狀況的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0025][圖7]示出實施例3中3種DNA提取法得到的各PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
【具體實施方式】
[0026]下文對本發(fā)明DNA分型方法按步驟詳細說明。
[0027](I)引物組制備步驟
在本發(fā)明的DNA分型方法中，首先，制備對人基因組堿基序列中HLA-A、HLA-B, HLA-C,HLA-DQAl、HLA-DQB1、HLA-DPAI和HLA-DPBl各基因的上游區(qū)域和下游區(qū)域分別特異性退火的引物組，以及對HLA-DRBl的外顯子2和3’側的非翻譯區(qū)域特異性退火的引物組。
[0028]包含HLA基因存在的區(qū)域的人第6號染色體(6p21.3)的基因組堿基序列已經闡明，其基因結構與表達產物(HLA分子)的結構的關聯(lián)也是已知的(參考圖1和圖2)。
[0029]也即，稱為經典HLA I類分子的HLA-A、HLA-B和HLA-C的基因含有7個或8個外顯子(圖1 (a))，外顯子I的外側有2種增強子和啟動子區(qū)域調節(jié)表達(圖1 (b))。
[0030]進一步地，外顯子2、3和4中存在多個多態(tài)區(qū)域也是已知的，因此，在常規(guī)的DNA分型方法中，應用尤其基于外顯子2和3制備的引物進行PCR，隨之產生如上述的相位模糊問題。
`[0031]另外，稱為經典的HLA II類分子的HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP由α鏈與β鏈構成，其各自基因包含5個或6個外顯子(圖2 (a))，外顯子I的外側有啟動子區(qū)域調節(jié)表達(圖 2 (b))。
[0032]進一步地，外顯子2和3中存在多個多態(tài)區(qū)域也是已知的，因此，在常規(guī)的DNA分型方法中，應用尤其基于外顯子2制備的引物進行PCR，隨之產生如上述的相位模糊問題。
[0033]本發(fā)明中，制備引物組，其能夠PCR擴增經典的I類分子(HLA-A，HLA_B，HLA-OW及經典的II類分子的HLA-DQAl、HLA-DQB1、HLA-DPAI和HLA-DPBl的基因區(qū)域的全部(不僅包含外顯子，也包含內含子、5’側與3’側非翻譯區(qū)域、啟動子區(qū)域)、HLA-DRBl的含有外顯子2至3’側非翻譯區(qū)域的基因區(qū)域，應用該引物組PCR擴增的PCR產物接受下述下一代測序(next-generation sequencing),因此能夠排除相位模糊等的不確定性，也能夠正確檢測無效等位基因的有無。
[0034]具體地，制備下述表1至表4中列出的PCR引物組。
[0035]表1中序列編號I至3是特異性擴增作為MHC I類α鏈的HLA-A基因的PCR引物組。這些引物組是在下列位直存在的喊基序列，其將人基因組喊基序列(參考序列:hgl9)中HLA-A基因全部區(qū)域(包含啟動子、外顯子和內含子)從上游側和下游側夾入(挾?込tr)。
[0036]序列編號I具有相應于人基因組堿基序列(參考序列:hgl9)中第29，909，487號至第29，909，514號的堿基序列。
[0037]序列編號2具有相應于人基因組堿基序列(參考序列:hgl9)中第29，909，487號至第29，909，514號的堿基序列。
[0038]序列編號3具有與相應于人基因組堿基序列(參考序列:1^19)中第29，914，925號至第29，914，952號的堿基序列互補的堿基序列。
[0039]應用這些引物組得到的PCR產物的預測長度是約5，500個堿基(bp)。
[0040]表1中序列編號4至5是特異性擴增作為MHC I類α鏈的HLA-B基因的PCR引物組。這些引物組是在下列位直存在的喊基序列，其將人基因組喊基序列(參考序列:hgl9)中HLA-B基因全部區(qū)域(包含啟動子、外顯子和內含子)從上游側和下游側夾入。
[0041]序列編號4具有 與相應于人基因組堿基序列(參考序列:hgl9)中第31，325，796號至第31，325，820號的堿基序列互補的堿基序列。
[0042]序列編號5具有相應于人基因組堿基序列(參考序列:hgl9)中第31，321，212號至第31，321，235號的堿基序列。
[0043]應用這些引物組得到的PCR產物的預測長度是約4，600個堿基(bp)。
[0044]表1中序列編號6至8是特異性擴增作為MHC I類α鏈的HLA-C基因的PCR引物組。這些引物組是在下列位直存在的喊基序列，其將人基因組喊基序列(參考序列:hgl9)中HLA-C基因全部區(qū)域(包含啟動子、外顯子和內含子)從上游側和下游側夾入。
[0045]序列編號6具有與相應于人基因組堿基序列(參考序列:1^19)中第31，240，868號至第31，240，892號的堿基序列互補的堿基序列。
[0046]序列編號7具有與相應于人基因組堿基序列(參考序列:1^19)中第31，240，868號至第31，240，892號的堿基序列互補的堿基序列。
[0047]序列編號8具有相應于人基因組堿基序列(參考序列:hgl9)中第31，236，991號至第31，236，114號的堿基序列。
[0048]應用這些引物組得到的PCR產物的預測長度是約4，800個堿基(bp)。
[0049][表 I]
【權利要求】
1.HLA的DNA分型方法，其特征為包含以下步驟: (1)制備對人基因組堿基序列中HLA-A、HLA-B, HLA-C, HLA-DQAl、HLA-DQBl、HLA-DPAl和HLA-DPBl各基因的上游區(qū)域和下游區(qū)域分別特異性退火的引物組以及對HLA-DRBl的外顯子2和3’側非翻譯區(qū)域特異性退火的引物組的步驟； (2)應用所述引物組對被測試樣(DNA)進行PCR擴增的步驟； (3)確定PCR擴增產物的堿基序列的步驟；和 (4)任選地，進行與數(shù)據庫的同源性檢索的步驟。
2.權利要求1的方法，其中所述基因是HLA-A基因，所述引物組選自具有序列編號:1、2和3的堿基序列的寡核苷酸。
3.權利要求1的方法，其中所述基因是HLA-B基因，所述引物組選自具有序列編號:4和5的堿基序列的寡核苷酸。
4.權利要求1的方法，其中所述基因是HLA-C基因，所述引物組選自具有序列編號:6、7和8的堿基序列的寡核苷酸。
5.權利要求1的方法，其中所述基因是HLA-DRBl基因的DRl型，所述引物組選自具有序列編號:9、10、11、31和32的堿基序列的寡核苷酸。
6.權利要求1的方法，其中所述基因是HLA-DRBl基因的DR2型，所述引物組選自具有序列編號:11、12、31和33的堿基序列的寡核苷酸。
7.權利要求1的 方法，其中所述基因是HLA-DRBl基因的DR3型，所述引物組選自具有序列編號:13、14、3 2和34的堿基序列的寡核苷酸。
8.權利要求1的方法，其中所述基因是HLA-DRBl基因的DR4型，所述引物組選自具有序列編號:15、16、31和32的堿基序列的寡核苷酸。
9.權利要求1的方法，其中所述基因是HLA-DRBl基因的DR5型，所述引物組選自具有序列編號:13、14、31、35和36的堿基序列的寡核苷酸。
10.權利要求1的方法，其中所述基因是HLA-DRBl基因的DR6型，所述引物組選自具有序列編號:13、14、31、32和37的堿基序列的寡核苷酸。
11.權利要求1的方法，其中所述基因是HLA-DRBl基因的DR7型，所述引物組選自具有序列編號:17、18、36和38的堿基序列的寡核苷酸。
12.權利要求1的方法，其中所述基因是HLA-DRBl基因的DR8型，所述引物組選自具有序列編號:13、14、31和39的堿基序列的寡核苷酸。
13.權利要求1的方法，其中所述基因是HLA-DRBl基因的DR9型，所述引物組選自具有序列編號:19、20、36和38的堿基序列的寡核苷酸。
14.權利要求1的方法，其中所述基因是HLA-DRBl基因的DRlO型，所述引物組選自具有序列編號:21、22、31和32的堿基序列的寡核苷酸。
15.權利要求1的方法，其中所述基因是HLA-DPAl基因，所述引物組選自具有序列編號:23、24、40和41的堿基序列的寡核苷酸。
16.權利要求1的方法，其中所述基因是HLA-DPBl基因，所述引物組選自具有序列編號:25、26、42、43、44和45的堿基序列的寡核苷酸。
17.權利要求1的方法，其中所述基因是HLA-DQAl基因，所述引物組選自具有序列編號:27、28、46和47的堿基序列的寡核苷酸。
18.權利要求1的方法，其中所述基因是HLA-DQBl基因，所述引物組選自具有序列編號:29、30、48、49和50的堿基序列的寡核苷酸。
19.用于HLA-A基因的DNA分型的引物組，其包含正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物選自具有序列編號:1、2和3的堿基序列的寡核苷酸。
20.用于HLA-B基因的DNA分型的引物組，其包含正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物選自具有序列編號:4和5的堿基序列的寡核苷酸。
21.用于HLA-C基因的DNA分型的引物組，其包含正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物選自具有序列編號:6、7和8的堿基序列的寡核苷酸。
22.用于HLA-DRBI基因的DRl型的DNA分型的引物組，其包含正向弓丨物和反向引物，所述正向引物和反向引物選自具有序列編號:9、10、11、31和32的堿基序列的寡核苷酸。
23.用于HLA-DRBl基因的DR2型的DNA分型的引物組，其包含正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物選自具有序列編號:11、12、31和33的堿基序列的寡核苷酸。
24.用于HLA-DRBI基因的DR3型的DNA分型的引物組，其包含正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物選自具有序列編號:13、14、32和34的堿基序列的寡核苷酸。
25.用于HLA-DRBI基因的DR4型的DNA分型的引物組，其包含正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物選自具有序列編號:15、16、31和32的堿基序列的寡核苷酸。
26.用于HLA-DRBI基因的DR5型的DNA分型的引物組，其包含正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物選自具有序列編號:13、14、31、35和36的堿基序列的寡核苷酸。
27.用于HLA-DRBI基因的DR6型的DNA分型的引物組，其包含正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物選自具有序 列編號:13、14、31、32和37的堿基序列的寡核苷酸。
28.用于HLA-DRBI基因的DR7型的DNA分型的引物組，其包含正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物選自具有序列編號:17、18、36和38的堿基序列的寡核苷酸。
29.用于HLA-DRBI基因的DR8型的DNA分型的引物組，其包含正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物選自具有序列編號:13、14、31和39的堿基序列的寡核苷酸。
30.用于HLA-DRBI基因的DR9型的DNA分型的引物組，其包含正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物選自具有序列編號:19、20、36和38的堿基序列的寡核苷酸。
31.用于HLA-DRBl基因的DRlO型的DNA分型的引物組，其包含正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物選自具有序列編號:21、22、31和32的堿基序列的寡核苷酸。
32.用于HLA-DPAl基因的DNA分型的引物組，其包含正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物選自具有序列編號:23、24、40和41的堿基序列的寡核苷酸。
33.用于HLA-DPBI基因的DNA分型的引物組，其包含正向弓丨物和反向引物，所述正向引物和反向引物選自具有序列編號:25、26、42、43、44和45的堿基序列的寡核苷酸。
34.用于HLA-DQAl基因的DNA分型的引物組，其包含正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物選自具有序列編號:27、28、46和47的堿基序列的寡核苷酸。
35.用于HLA-DQBI基因的DNA分型的引物組，其包含正向弓丨物和反向引物，所述正向引物和反向引物選自具有序列編號:29、30、48、49和50的堿基序列的寡核苷酸。
【文檔編號】C12N15/09GK103890190SQ201280036108
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年5月18日 優(yōu)先權日:2011年7月21日
【發(fā)明者】椎名隆, 鈴木進悟, 尾崎有紀, 光永滋樹, 豬子英俊 申請人:吉諾戴夫制藥株式會社