生物人工近端小管系統(tǒng)及使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種生物人工近端小管裝置，所述生物人工近端小管裝置通過以下方法構(gòu)成：制備脫細(xì)胞生物基質(zhì)、用哺乳動物腎源性細(xì)胞和任選地哺乳動物內(nèi)皮細(xì)胞來接種所述生物基質(zhì)。接著，可對所述裝置靜態(tài)培養(yǎng)或利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)使其成熟，以允許腎臟細(xì)胞分化成功能近端小管細(xì)胞。所述裝置能夠執(zhí)行近端小管功能。本申請還描述用于制造所述近端小管裝置的各種方法。本申請還描述使用生物人工近端小管裝置對小管細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、各種化合物的毒性效應(yīng)、或藥物化合物篩選進(jìn)行例如體外研究的方法。
【專利說明】生物人工近端小管系統(tǒng)及使用方法
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年5月27日提交的美國臨時申請N0.61/490，890的權(quán)益，該申請內(nèi)容全文以引用方式并入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明一般涉及一種生物人工近端小管裝置，所述生物人工近端小管裝置包括生物支架和一種或多種祖細(xì)胞(例如哺乳動物腎源性細(xì)胞)，所述一種或多種祖細(xì)胞在所述支架上分化成腎近端小管細(xì)胞單層。本發(fā)明還涉及用于在生物反應(yīng)器中制造和培養(yǎng)所述裝置的方法。本發(fā)明還提供使用所述裝置進(jìn)行體外腎毒性或藥物化合物篩選的方法。
【背景技術(shù)】
[0004]慢性腎臟疾病(chronic kidney disease ；CKD)和終末期腎臟疾病(end-stagerenal disease ；ESRD)由腎臟功能的衰竭來界定,主要由腎小球?yàn)V過率來界定。這會導(dǎo)致腎臟不能排泄由身體產(chǎn)生的有毒代謝廢物。在美國，CKD變得越來越普遍，與之伴隨的是不良的健康結(jié)果和高的醫(yī)療成本。美國腎臟基金會估計2000萬美國人患有CKD，且至少還有另外的2000萬人民存在患上CKD的風(fēng)險。ESRD則困擾著超過50萬患者，而患有CKD的高危人群達(dá)到150萬患者。用于CKD和ESRD的總成本占總醫(yī)療保險成本的幾乎30%，然而這類患者僅占總醫(yī)療保險人口的8.1% (2008年美國腎病數(shù)據(jù)服務(wù)，2008年年度報告)。ESRD的發(fā)生率在過去的10年中增長了超過50%，且患有CKD或存在患上CKD風(fēng)險的患者人數(shù)持續(xù)增長。因此，亟需能夠修復(fù)損傷腎臟的新的治療方式以及可判斷所關(guān)注化合物的腎毒性的體外系統(tǒng)。
[0005]許多異生物質(zhì)或因降解產(chǎn)生的分子通過向?yàn)V液的主動運(yùn)轉(zhuǎn)而從血液中清除，所述濾液經(jīng)由腎臟的腎近端小管細(xì)胞而被運(yùn)往膀胱。作為執(zhí)行這種重要功能的結(jié)果，腎近端小管細(xì)胞常常會由于這些化合物的毒性作用而`受損。因此，在體外系統(tǒng)中對潛在治療性化合物的腎毒性測試已引起重大關(guān)注，此種測試可能會取代動物測試。
[0006]當(dāng)前用于測試腎近端小管上皮細(xì)胞單層形成和功能的基于細(xì)胞培養(yǎng)的模型利用原代細(xì)胞，或者已利用從各種源(例如MDCK (犬腎傳代細(xì)胞)、LLC-PK1 (Lewis肺癌豬腎I)、或HK-2細(xì)胞)建立起的細(xì)胞系進(jìn)行主要開發(fā)，所述細(xì)胞系是通過用人類乳頭狀瘤病毒16E6/E7基因轉(zhuǎn)導(dǎo)而永生化的人類腎臟細(xì)胞系。利用這些細(xì)胞的測定系統(tǒng)通常利用多孔過濾器(例如Transwelli!過濾器)，所述多孔過濾器允許在細(xì)胞的頂點(diǎn)和基底外側(cè)上發(fā)生流體接觸，從而促進(jìn)上皮細(xì)胞分化。
[0007]然而，利用這些細(xì)胞系具有若干缺點(diǎn)。這些細(xì)胞系中有許多是從腫瘤轉(zhuǎn)化或衍生而來的，可能會改變其生長、分化、并最終改變功能特性。此外，這些細(xì)胞系中有許多不是來自人類的。因此，這些細(xì)胞在功能上和對各種化合物的反應(yīng)上可存在種族差異。原代細(xì)胞的使用是繁重的，這是因?yàn)榧?xì)胞通常是新鮮分離的，且在用于實(shí)驗(yàn)之前進(jìn)行最低限度地增殖。在不期望細(xì)胞群的污染下進(jìn)行分離過程可為費(fèi)力的。此外，供體來源材料可具有顯著可變性。
[0008]另一個常見的問題是原代細(xì)胞形成未受損單層的時間限制；此限制了進(jìn)行體外研究的細(xì)胞實(shí)用性。原代細(xì)胞常常會過度生長、掙脫表面并形成三維聚集體，從而需要添加額外的因子(例如MEK抑制劑)來保持接觸抑制(例如，如美國公開申請2009/0209019中所
公開者)。多孔過濾器(例如Traiisweir過濾器)雖然有一定效果，但是由合成材料制成，因此不能精確地表示腎小管細(xì)胞在體內(nèi)所通常暴露于其中的底層基質(zhì)。
[0009]其他人中已描述了依賴于三維小管結(jié)構(gòu)的形成或依賴于對從動物分離的腎小管的培養(yǎng)的替代篩選方法，所述三維管結(jié)構(gòu)的形成利用原代細(xì)胞在3D膠(例如MATRIGEL?)內(nèi)的固態(tài)表面上的上述過度生長而形成(參見WO 2010/064995 Al)。后者由于費(fèi)力的分離技術(shù)和所需考慮的物種差異而存在問題。這些替代方法的另一缺點(diǎn)在于，其僅能測定施加到培養(yǎng)基的外源化 合物向腎小管官腔中的轉(zhuǎn)運(yùn)。無法測定這些化合物對腎小管正常功能(例如葡萄糖重吸收或白蛋白攝取)的影響，這是因?yàn)椴淮嬖诳煽康姆椒▽?biāo)記的測試物質(zhì)引入到管腔中或?qū)δI小管的腔液進(jìn)行取樣以進(jìn)行測定。此外，無法測定流的變化以及可能在各種體外情景中發(fā)生的生理動態(tài)條件的影響。
[0010]因此，在本領(lǐng)域中需要開發(fā)一種能夠更佳地反映腎近端小管上皮的正常生理機(jī)能的生物測定法。此最終能夠開發(fā)出針對腎臟疾病的新的、更有效的療法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本申請包括生物人工近端小管裝置，所述裝置具有脫細(xì)胞生物基質(zhì)支架，在所述支架上由前體細(xì)胞(例如哺乳動物(例如人類)腎源性細(xì)胞)形成單層腎近端小管。
[0012]本發(fā)明描述一種生物人工近端小管裝置，所述生物人工近端小管裝置通過以下方法構(gòu)成:制備脫細(xì)胞生物基質(zhì)、用哺乳動物腎源性細(xì)胞和任選地哺乳動物內(nèi)皮細(xì)胞來接種所述生物基質(zhì)。接著，可對所述裝置靜態(tài)培養(yǎng)或利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)使其成熟，以允許腎臟細(xì)胞分化成功能近端小管細(xì)胞。所得裝置能夠執(zhí)行近端小管功能，例如能夠?qū)⒎肿訌纳锬さ娜我粋?cè)轉(zhuǎn)運(yùn)到另一側(cè)。本發(fā)明還描述用于制造所述生物人工近端小管裝置并使其成熟的各種方法。本發(fā)明還描述使用所述生物人工近端小管裝置對小管細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、各種化合物的毒性效應(yīng)、或藥物化合物篩選進(jìn)行體外研究的方法。
[0013]在一個實(shí)施例中，所述生物人工近端小管裝置包括脫細(xì)胞生物基質(zhì)支架，所述脫細(xì)胞生物基質(zhì)支架在足以允許細(xì)胞分化成腎近端小管細(xì)胞的條件下用可分化成腎細(xì)胞的一種或多種細(xì)胞(例如可分化成腎細(xì)胞的前體細(xì)胞)來接種，其中這些分化細(xì)胞在所述支架上形成上皮細(xì)胞單層。所述生物人工近端小管裝置還可任選地包括血管內(nèi)皮細(xì)胞。
[0014]在另一個實(shí)施例中，所述生物人工近端小管裝置包括脫細(xì)胞生物支架，所述脫細(xì)胞生物支架具有至少兩個表面，其中至少一個表面在足以允許細(xì)胞分化成腎近端小管上皮細(xì)胞的條件下用可分化成腎細(xì)胞的一種或多種細(xì)胞(例如可分化成腎細(xì)胞的前體細(xì)胞)來接種，其中所述細(xì)胞在所述支架的表面上形成細(xì)胞單層。
[0015]在替代實(shí)施例中，所述生物人工近端小管裝置包括脫細(xì)胞生物支架和位于所述支架表面上的腎近端小管上皮細(xì)胞單層，所述脫細(xì)胞生物支架來源于哺乳動物組織且具有一個或多個表面，其中所述上皮細(xì)胞單層是通過以下方法形成:在足以允許腎源性細(xì)胞分化成腎近端小管細(xì)胞的條件下用一種或多種哺乳動物腎源性細(xì)胞來接種所述表面并形成單層。可在生物反應(yīng)器中執(zhí)行對所述表面的接種。此種生物反應(yīng)器可具有上部本體元件、具有供細(xì)胞生長的區(qū)域的下部本體元件、和一個或多個連接器。
[0016]所述可分化成腎細(xì)胞的一種或多種細(xì)胞(例如前體細(xì)胞)可為原代腎小管上皮細(xì)胞、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞或分化成腎細(xì)胞的祖細(xì)胞或腎祖細(xì)胞、從腎臟分離的干細(xì)胞或從腎臟分離的祖細(xì)胞、以及它們的混合物。在一個實(shí)施例中，所述可分化成腎細(xì)胞的一種或多種細(xì)胞是來自哺乳動物(例如人類)的腎源性細(xì)胞。這些腎源性細(xì)胞可從腎皮質(zhì)、腎髓質(zhì)、腎包膜下區(qū)域及其混合區(qū)域獲得。
[0017]在又一個實(shí)施例中，所述生物人工近端小管裝置包括具有至少兩個表面的脫細(xì)胞生物支架，其中在足以允許腎源性細(xì)胞分化成腎近端小管細(xì)胞的條件下用一種或多種哺乳動物腎源性細(xì)胞來接種至少一個表面，所述細(xì)胞在所述支架的表面上形成上皮細(xì)胞單層。所述哺乳動物可為人類，且所述細(xì)胞可從腎皮質(zhì)、腎髓質(zhì)或腎包膜下區(qū)域獲得。[0018]在某些實(shí)施例中，所述脫細(xì)胞生物基質(zhì)支架來源于哺乳動物組織。所述支架可來源于哺乳動物組織(例如豬組織)。例如，所述支架可來源于哺乳動物的胃、十二指腸、空腸、回腸或結(jié)腸。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所述支架來源于小腸粘膜下層在另一個實(shí)施例中，所述脫細(xì)胞生物基質(zhì)可來源于粘膜或粘膜下組織。
[0019]在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，腎源性細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中自我更新和擴(kuò)增，對Oct-4、Pax-2和Rex-1中的一種或多種的表達(dá)為陽性，且對Sox2、FGF4、hTert和Wnt_4中的一種或多種的表達(dá)為陰性。在另一個實(shí)施例中，腎源性細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中自我更新和擴(kuò)增，對Oct-4和Pax-2中的一種或多種的表達(dá)為陽性，且對Sox2、FGF4、hTert和Wnt_4中的一種或多種的表達(dá)為陰性。
[0020]在另一個實(shí)施例中，腎源性細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中自我更新和擴(kuò)增，對Eyal、Pax-2,WT1、FoxD1、BMP7、BMP2、⑶F5、EpoR或Rex-1中的至少一種的表達(dá)為陽性，且對Sox2、FGF4、hTert或Wnt-4中的至少一種的表達(dá)為陰性。在某些實(shí)施例中，腎源性細(xì)胞也可對細(xì)胞表面標(biāo)志 HLA 1、CD24、CD29、CD44、CD49c、CD73、CD90、CD166 或 SSEA-4 中的至少一種為陽性，且對細(xì)胞表面標(biāo)志 HLA I1、CD31、CD34、CD45、CD56、CD80、CD86、CD104、CD105、CD117、CD133、⑶138、⑶141或E-鈣粘素中的至少一種為陰性。
[0021]在一些實(shí)施例中，可用哺乳動物血管內(nèi)皮細(xì)胞來接種支架的第二表面。例如，所述血管內(nèi)皮細(xì)胞可為內(nèi)皮細(xì)胞系、內(nèi)皮祖細(xì)胞、原代內(nèi)皮細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞以及它們的混合物。
[0022]本發(fā)明的替代實(shí)施例是如下生物人工近端小管裝置:所述生物人工近端小管裝置包括脫細(xì)胞生物基質(zhì)支架，所述脫細(xì)胞生物基質(zhì)支架在足以允許前體細(xì)胞分化成腎近端小管上皮細(xì)胞的條件下用一種或多種前體細(xì)胞(即可分化成腎細(xì)胞的前體細(xì)胞)來接種，其中所述分化細(xì)胞在所述支架上形成上皮細(xì)胞單層。脫細(xì)胞生物基質(zhì)支架可來源于哺乳動物組織(例如豬組織)，例如粘膜或粘膜下組織。在一個實(shí)施例中，脫細(xì)胞生物基質(zhì)支架來源于哺乳動物消化道。在另一個實(shí)施例中，所述脫細(xì)胞生物基質(zhì)支架來源于(例如得自)哺乳動物的胃、十二指腸、空腸、回腸或結(jié)腸。所述一種或多種前體細(xì)胞選自:原代腎小管上皮細(xì)胞、分化成腎細(xì)胞或腎祖細(xì)胞的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞、分化成腎細(xì)胞或腎祖細(xì)胞的祖細(xì)胞、從腎臟分離的干細(xì)胞或從腎臟分離的祖細(xì)胞、以及它們的混合物。在一個實(shí)施例中，所述祖細(xì)胞可為人類腎源性細(xì)胞。在一個實(shí)施例中，人類腎源性細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中自我更新和擴(kuò)增，對 Oct-4、Rex-1、Pax-2、鈣粘素-1 1、FoxDUffTUEyaU HNF3B、CXC-R4、Sox-17、EpoR、BMP2、BMP7或⑶F5中的至少一種的表達(dá)為陽性；且對Sox2、FGF4、hTert、Wnt_4、SIX2、E-鈣粘素或GATA-4中的至少一種的表達(dá)為陰性。任選地，這些細(xì)胞對細(xì)胞表面標(biāo)志HLA-1、⑶24、CD29、CD44、CD49c、CD73、CD90、CD166或SSEA-4中的至少一種為陽性；且對細(xì)胞表面標(biāo)志HLA I1、CD31、CD34、CD45、CD56、CD80、CD86、CD104、CD105、CD117、CD133、CD 138 和 CD141中的至少一種為陰性。此外，所述細(xì)胞還任選地分泌營養(yǎng)因子FGF2、HGF、TGFa、TIMP-U--ΜΡ-2、MMP-2或VEGF中的至少一種；且不分泌營養(yǎng)因子TOGF_bb或IL12p70中的至少一種。
[0023]本發(fā)明的另一個實(shí)施例是如下生物人工近端小管裝置:所述生物人工近端小管裝置包括脫細(xì)胞生物支架，所述脫細(xì)胞生物支架具有至少兩個表面，其中至少一個表面在足以允許細(xì)胞分化成腎近端小管上皮細(xì)胞的條件下用一種或多種前體細(xì)胞(即可分化成腎細(xì)胞的前體細(xì)胞)來接種，其中所述細(xì)胞在所述支架的表面上形成上皮細(xì)胞單層。所述脫細(xì)胞生物基質(zhì)支架來源于哺乳動物組織(例如豬組織)。在一個實(shí)施例中，所述脫細(xì)胞生物基質(zhì)支架來源于粘膜或粘膜下組織。作為另一種選擇，脫細(xì)胞生物基質(zhì)支架來源于哺乳動物消化道。在另一個實(shí)施例中，所述脫細(xì)胞生物基質(zhì)支架來源于(例如得自)哺乳動物的胃、十二指腸、空腸、回腸或結(jié)腸。所述一種或多種前體細(xì)胞選自:原代腎小管上皮細(xì)胞、分化成腎細(xì)胞或腎祖細(xì)胞的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞、分化成腎細(xì)胞或腎祖細(xì)胞的祖細(xì)胞、從腎臟分離的干細(xì)胞或從腎臟分離的祖細(xì)胞、以及它們的混合物。在一個實(shí)施例中，所述祖細(xì)胞可為人類腎源性細(xì)胞。在一個實(shí)施例中，人類腎源性細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中自我更新和擴(kuò)增，對Oct-4、Rex-1、Pax-2、鈣粘素-11、FoxDl、WTl、Eyal、HNF3B、CXC-R4、Sox-17, EpoR、BMP2、BMP7或⑶F5中的至少一種的表達(dá)為陽性；且對Sox2、FGF4、hTert、Wnt_4、SIX2、E-鈣粘素或GATA-4中的至少一種的表達(dá)為陰性。任選地，這些細(xì)胞對細(xì)胞表面標(biāo)志HLA-1、⑶24、CD29、CD44、CD49c、CD73、CD90、CD166或SSEA-4中的至少一種為陽性；且對細(xì)胞表面標(biāo)志HLA I1、CD31、CD34、CD45、CD56、CD80、CD86、CD104、CD105、CD117、CD133、CD 138 和 CD141中的至少一種為陰性。此外，所述細(xì)胞還任選地分泌營養(yǎng)因子FGF2、HGF、TGFa、TIMP-U--ΜΡ-2、MMP-2或VEGF中的至少一種；且不分泌營養(yǎng)因子TOGF_bb或IL12p70中的至少一種。在另一個實(shí)施例中，用哺乳動物的血管內(nèi)皮細(xì)胞來接種支架的第二表面。這些血管內(nèi)皮細(xì)胞可選自內(nèi)皮細(xì)胞系、內(nèi)皮祖細(xì)胞、原代內(nèi)皮細(xì)胞或微血管內(nèi)皮細(xì)胞。
`[0024]本發(fā)明的又一實(shí)施例是一種使用所述近端小管裝置的方法。因此，一個實(shí)施例是一種使一種或多種前體細(xì)胞分化成腎細(xì)胞的方法，所述方法包括:用一種或多種前體細(xì)胞來接種脫細(xì)胞生物基質(zhì)支架(即可分化成腎細(xì)胞的前體細(xì)胞)；以及在足以允許前體細(xì)胞分化成腎近端小管上皮細(xì)胞的條件下在所述支架上培養(yǎng)所述細(xì)胞，其中所述分化細(xì)胞在所述支架上形成上皮細(xì)胞單層。所述脫細(xì)胞生物基質(zhì)支架可具有兩個表面。在一個實(shí)施例中，所述脫細(xì)胞生物基質(zhì)支架來源于哺乳動物(例如豬組織)。因此，所述脫細(xì)胞生物基質(zhì)支架可來源于(例如得自)粘膜組織或粘膜下組織。在另一個實(shí)施例中，所述脫細(xì)胞生物基質(zhì)支架來源于(例如得自)哺乳動物的胃、十二指腸、空腸、回腸或結(jié)腸。所述方法選所利用的一種或多種前體細(xì)胞可選自:原代腎小管上皮細(xì)胞、分化成腎細(xì)胞或腎祖細(xì)胞的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞、分化成腎細(xì)胞或腎祖細(xì)胞的祖細(xì)胞、從腎臟分離的干細(xì)胞或從腎臟分離的祖細(xì)胞、以及它們的混合物。在一個實(shí)施例中，所述方法中所用的祖細(xì)胞是人類腎源性細(xì)胞。[0025]在一個實(shí)施例中，所述方法中所用的人類腎源性細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中自我更新和擴(kuò)增，對 Oct-4、Rex-1、Pax-2、鈣粘素-11、FoxDl、WTl、Eyal、HNF3B、CXC-R4、Sox-17, EpoR、BMP2、BMP7或⑶F5中的至少一種的表達(dá)為陽性；且對Sox2、FGF4、hTert、Wnt_4、SIX2、E-鈣粘素或GATA-4中的至少一種的表達(dá)為陰性。在另一個實(shí)施例中，這些細(xì)胞對細(xì)胞表面標(biāo)志 HLA-1、CD24、CD29、CD44、CD49c、CD73、CD90、CD166 或 SSEA-4 中的至少一種為陽性；且對細(xì)胞表面標(biāo)志 HLA I1、CD31、CD34、CD45、CD56、CD80、CD86、CD104、CD105、CD117、CD133、⑶138和⑶141中的至少一種為陰性。在另一個實(shí)施例中，所述細(xì)胞分泌營養(yǎng)因子FGF2、HGF、TGF a、TIMP-U --ΜΡ-2、MMP-2或VEGF中的至少-種；且不分泌營養(yǎng)因子PDGF_bb或IL12p70中的至少一種。
[0026]本發(fā)明的另一個實(shí)施例是一種使可分化成腎近端小管上皮細(xì)胞的一種或多種細(xì)胞在足以進(jìn)行分化的條件下分化的方法，其中所述分化細(xì)胞形成上皮細(xì)胞單層，且所述細(xì)胞被施加張力。所述方法還可包括如下步驟:在使所述細(xì)胞分化之前，在脫細(xì)胞支架上接種所述細(xì)胞。當(dāng)所述方法包括此步驟時，所述方法可用于產(chǎn)生本發(fā)明的生物人工裝置。脫細(xì)胞生物基質(zhì)支架可來源于哺乳動物(例如豬)組織，例如粘膜或粘膜下組織。在一個實(shí)施例中，脫細(xì)胞生物基質(zhì)支架來源于哺乳動物消化道。在另一個實(shí)施例中，所述脫細(xì)胞生物基質(zhì)支架來源于(例如得自)哺乳動物的胃、十二指腸、空腸、回腸或結(jié)腸。所述一種或多種可分化成腎細(xì)胞的細(xì)胞選自:原代腎小管上皮細(xì)胞、分化成腎細(xì)胞或腎祖細(xì)胞的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞或祖細(xì)胞、從腎臟分離的干細(xì)胞或從腎臟分離的祖細(xì)胞、以及它們的混合物。在一個實(shí)施例中，所述可分化成腎細(xì)胞的一種或多種細(xì)胞是哺乳動物的腎源性細(xì)胞(例如人類腎源性細(xì)胞)。所述哺乳動物腎源性細(xì)胞可從腎皮質(zhì)、腎髓質(zhì)、腎包膜下區(qū)域及其混合區(qū)域獲得。在一個實(shí)施例中，腎源性細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中自我更新和擴(kuò)增，對Oct-4、Pax-2和Rex-1中的一種或多種的表達(dá)為陽性，且對Sox2、FGF4、hTert和Wnt_4中的一種或多種的表達(dá)為陰性。在替代實(shí)施例中，腎源性細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中自我更新和擴(kuò)增，對Eyal、Pax2、WT1、FoxD1、BMP7、BMP2、⑶F5、EpoR或Rex-1中的至少一種的表達(dá)為陽性，且對Sox2、FGF4、hTert或Wnt-4中的至少一種的表達(dá)為陰性。在又一個實(shí)施例中，腎源性細(xì)胞對細(xì)胞表面標(biāo)志 HLA 1、CD24、CD29、CD44、CD49c、CD73、CD166 或 SSEA-4 中的至少一種也是陽性，且對細(xì)胞表面標(biāo)志 HLAI1、CD31、CD34、CD45、CD56、CD80、CD86、CD104、CD105、CD117、CD133、CD138、⑶141或E-鈣粘素中的至少一種為陰性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]在結(jié)合附圖閱讀上述
【發(fā)明內(nèi)容】
以及以下對本發(fā)明的詳細(xì)說明時能夠更好地進(jìn)行理解。出于說明本發(fā)明的目的，附圖展示了本發(fā)明的實(shí)施例。然而應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不局限于不出的精確布置方式、實(shí)例和工具。
[0028]圖1至圖6顯示對人類腎源性細(xì)胞的代謝參數(shù)的分析結(jié)果。圖1A顯示人類腎源性細(xì)胞培養(yǎng)物(“SW培養(yǎng)物”)中乳酸釋放隨時間的變化。圖1B顯示SW培養(yǎng)物中葡萄糖消耗隨時間的變化。圖2A顯示SW培養(yǎng)物中LDH釋放隨時間的變化。圖2B顯示接種在脫細(xì)胞小腸粘膜下層(small intestine submucosa ；SIS)上的人類腎源性細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物(“SIS-SW培養(yǎng)物”)中`乳酸釋放隨時間的變化。圖3A顯示SIS-SW培養(yǎng)物中葡萄糖消耗隨時間的變化。圖3B顯示SIS-SW培養(yǎng)物中LDH釋放隨時間的變化。圖4A顯示從接種在脫細(xì)胞小腸粘膜下層上的人類腎源性細(xì)胞生長出的單層(“SIS-ML培養(yǎng)物”)中乳酸釋放隨時間的變化。圖4B顯示SIS-ML培養(yǎng)物中葡萄糖消耗隨時間的變化。圖5A顯示SIS-ML培養(yǎng)物中LDL釋放隨時間的變化。圖5B顯示ML培養(yǎng)物中乳酸釋放隨時間的變化。圖6A顯示ML培養(yǎng)物中葡萄糖消耗隨時間的變化。圖6B顯示ML培養(yǎng)物中LDH釋放隨時間的變化。在圖1至圖6中，n=3。
[0029]圖7和圖8顯示細(xì)胞外(即脫細(xì)胞)基質(zhì)支架上的人類腎源性細(xì)胞(hKDC)的組織學(xué)染色。將人類腎源性細(xì)胞以2.5X IO3細(xì)胞/支架的濃度接種到三個不同的支架構(gòu)型上，并培養(yǎng)三周。隨后，固定樣本并用蘇木精-伊紅(H&E)染色。圖7A顯示膠原夾層培養(yǎng)物的組織學(xué)染色。圖7B顯示膠原-脫細(xì)胞小腸粘膜下層(SIS)夾層培養(yǎng)物的組織學(xué)染色。圖8A顯示脫細(xì)胞SIS單層培養(yǎng)物的組織學(xué)染色。圖SB顯示膠原涂布的細(xì)胞小室培養(yǎng)物的組織學(xué)染色。
[0030]圖9顯示通過接種在細(xì)胞外(脫細(xì)胞)基質(zhì)支架上的hKDC對水通道蛋白-1進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測。將人類腎臟細(xì)胞接種到脫細(xì)胞SIS支架上，并使其附著過夜。將樣本培養(yǎng)三周，然后固定。隨后，將3μηι厚的切片與抗人體水通道蛋白-1抗體(Abeam, Cambridge)一起用于免疫組織化學(xué)(IHC)。箭頭指示細(xì)胞的頂端染色區(qū)域。
[0031]圖10顯示接種在脫細(xì)胞支架上的hKDC的組織學(xué)染色。以兩種不同的細(xì)胞濃度將人類腎源性細(xì)胞接種到脫細(xì)胞SIS支架上、培養(yǎng)三周、并固定。隨后，用蘇木精-伊紅(H&E)對3μπι厚的切片進(jìn)行染色。圖1OA顯示樣品的Η&Ε染色，該樣品接種有I X IO4個細(xì)胞。圖1OB顯示樣品的Η&Ε染色，該樣品接種有5 X IO4個細(xì)胞。
[0032]圖11顯示接種在 脫細(xì)胞支架上的hKDC的三周培養(yǎng)物的凝集素染色。將人類腎源性細(xì)胞接種到脫細(xì)胞SIS支架上、培養(yǎng)三周、并固定。隨后，用翅莢百脈根凝集素(圖11A)和雙花扁豆凝集素(圖11B)對3μπι厚的切片進(jìn)行染色。圖1lA中的箭頭和線指示陽性染色的區(qū)域。
[0033]圖12顯示接種在脫細(xì)胞支架上的hKDC的膠原IV染色。將人類腎源性細(xì)胞接種到脫細(xì)胞SIS支架上、培養(yǎng)三周、并固定。隨后，用抗IV型膠原抗體對3 μ m的切片進(jìn)行染色。
[0034]圖13顯示接種在脫細(xì)胞支架上的hKDC的Pgp-1染色。將人類腎源性細(xì)胞接種到脫細(xì)胞SIS支架上、培養(yǎng)三周、并固定。隨后，用抗人類P-糖蛋白-1抗體對3 μ m厚的切片進(jìn)行染色。
[0035]圖14顯示接種在脫細(xì)胞支架上的hKDC對熒光標(biāo)記的牛血清蛋白(BSA-FITC)的攝入。將人類腎源性細(xì)胞接種到脫細(xì)胞SIS支架上，培養(yǎng)兩周，然后在BSA-FITC的存在下培養(yǎng)I小時。隨后，用DAPI ( 二脒基-2-苯基吲哚)對細(xì)胞進(jìn)行復(fù)染色并對其成像。
[0036]圖15是細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器示意圖，其中顯示主要的反應(yīng)器組件。
[0037]圖16顯示生物反應(yīng)器的下部本體元件的詳細(xì)視圖。
【具體實(shí)施方式】
[0038]在本說明書和權(quán)利要求書通篇中使用與本發(fā)明的裝置、使用所述裝置的方法、和本發(fā)明的其他方面相關(guān)的各種術(shù)語。除非另外指明，否則此類術(shù)語被賦予本領(lǐng)域的通常含義。其他具體定義的術(shù)語應(yīng)按照與本文所提供的定義相符的方式理解。[0039]本發(fā)明基于如下發(fā)現(xiàn):當(dāng)可分化成腎細(xì)胞的前體細(xì)胞(可分化成腎細(xì)胞的細(xì)胞)(例如腎源性細(xì)胞)在允許分化的條件下被接種在脫細(xì)胞生物基質(zhì)支架上時，會在所述支架的表面上形成腎近側(cè)小管上皮細(xì)胞單層。
[0040]應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并非僅限于特定的方法、試劑、化合物、成分、或生物系統(tǒng)，當(dāng)然，所述方法、試劑、化合物、成分、或生物系統(tǒng)可發(fā)生變化。另外應(yīng)當(dāng)了解，本文所用的術(shù)語只是為了描述具體實(shí)施例的目的，并非旨在進(jìn)行限制。如本說明書和所附權(quán)利要求中所用，除非內(nèi)容另有明確說明，否則單數(shù)形式“一個”、“一種”和“所述”包括復(fù)數(shù)含義。因此，例如，對“一個細(xì)胞”的提及包括兩個或更多個細(xì)胞的組合等等。
[0041]如本文所用，用辭“約”在涉及可測量值例如量、時距等等時，意指涵蓋與指定值±20%或± 10%，更優(yōu)選地土 5%，甚至更優(yōu)選地±1%，還更優(yōu)選地±0.1%的變化，因?yàn)榇祟愖兓m合執(zhí)行本發(fā)明所公開的方法。
[0042]除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的含義相同。雖然與本文所述的那些方法和材料相似或等效的任意方法和材料都可以用于檢驗(yàn)本發(fā)明的實(shí)踐中，然而本文中描述優(yōu)選材料和方法。在描述和要求保護(hù)本發(fā)明時，將使用以下術(shù)語。
[0043]“分化”是非特化(“未定向的”)或特化程度較低的細(xì)胞獲得特化細(xì)胞(例如為腎臟細(xì)胞)特征的過程。“分化的細(xì)胞或誘導(dǎo)分化的細(xì)胞”是已經(jīng)在細(xì)胞譜系中占據(jù)更特化的(“定向的”)位置的細(xì)胞。當(dāng)應(yīng)用于分化過程時，術(shù)語“定向的”是指已經(jīng)在分化通路中進(jìn)行到一定程度的細(xì)胞，其中在正常情況下，該細(xì)胞將繼續(xù)分化成特定的細(xì)胞類型或一個亞群的細(xì)胞類型，并且在正常情況下，不能分化成不同的細(xì)胞類型或回復(fù)至分化程度更低的細(xì)胞類型?！叭シ只敝讣?xì)胞回復(fù)到細(xì)胞的譜系當(dāng)中特化(或定向)程度較低的地位的過程。如本文所用，細(xì)胞的“譜系”限定細(xì)胞的遺傳關(guān)系，即它來自哪些細(xì)胞和它能產(chǎn)生什么細(xì)胞。細(xì)胞譜系將細(xì)胞定位于發(fā)育和分化的遺傳計劃內(nèi)?！白V系特異性標(biāo)記”指與所關(guān)注譜系的細(xì)胞的表型明確相關(guān)的特性，可用來評估未定向細(xì)胞相對于所關(guān)注譜系的分化。
[0044]在廣義上，“祖細(xì)胞”是指能產(chǎn)`生比其自身分化程度更高的后代并保持補(bǔ)充祖細(xì)胞數(shù)目能力的細(xì)胞。根據(jù)此定義，因?yàn)楦杉?xì)胞是最終分化細(xì)胞的更直接前體，故其本身也是祖細(xì)胞。在指本文所公開的細(xì)胞時，可使用“祖細(xì)胞”的此種廣泛定義。分化細(xì)胞可來源于多能細(xì)胞，而多能細(xì)胞本身是來自多能細(xì)胞，以此類推。盡管每個這種多能細(xì)胞都可認(rèn)為是干細(xì)胞，然而每個細(xì)胞所能產(chǎn)生的細(xì)胞類型的范圍可顯著不同。一些分化細(xì)胞也具有產(chǎn)生更大發(fā)育潛能的細(xì)胞的能力。此種能力可為自然的或者可在各種因子的處理下人工誘導(dǎo)產(chǎn)生?！霸鲋场笔侵讣?xì)胞數(shù)目的增大。
[0045]本文所用的“腎臟祖細(xì)胞”是除產(chǎn)生具有同等潛能的子細(xì)胞之外、還可產(chǎn)生細(xì)胞(例如脂肪細(xì)胞或成骨細(xì)胞)或可產(chǎn)生一種或多種類型的組織(例如，腎組織)的哺乳動物(例如人類)腎源性細(xì)胞。“腎臟或腎祖細(xì)胞”是基本上起源于成人或胎兒腎臟組織的多向分化潛能細(xì)胞或多能細(xì)胞。已發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞具有多能干細(xì)胞的特征特性，包括快速增殖和分化成其他細(xì)胞譜系的潛能。“多向分化潛能”腎臟祖細(xì)胞可產(chǎn)生多個細(xì)胞譜系，例如，腎細(xì)胞譜系、脂肪細(xì)胞譜系、或成骨細(xì)胞譜系。腎臟祖細(xì)胞呈現(xiàn)早期發(fā)育基因標(biāo)記、腎臟發(fā)育基因標(biāo)記、后腎間充質(zhì)基因標(biāo)記、以及促進(jìn)后腎間充質(zhì)存活的基因的基因表達(dá)譜。例如，腎臟祖細(xì)胞(例如人類腎源性細(xì)胞)所呈現(xiàn)的基因表達(dá)譜對包括但不限于0ct-4、Pax-2和Rex-1的基因的表達(dá)為陽性，而對包括但不限于Sox2、FGF4、hTERT和Wnt_4的基因的表達(dá)為陰性。
[0046]“組織”是指特化程度相似的細(xì)胞組成的群組或?qū)樱@些細(xì)胞一起執(zhí)行某些特定的功能?！捌鞴佟笔侵竷蓚€或更多個相鄰的組織層，這些組織層保持某種形式的細(xì)胞-細(xì)胞和/或細(xì)胞-基質(zhì)相互作用，以形成微體系結(jié)構(gòu)。
[0047]“腎臟”是指腹腔中的一對器官其中之一。腎臟從血液中移除廢物(作為尿)、產(chǎn)生促紅細(xì)胞生成素以刺激紅細(xì)胞產(chǎn)生、且在血壓調(diào)節(jié)中起作用。腎臟的作用是維持適當(dāng)?shù)乃?電解液平衡、調(diào)節(jié)酸堿濃度、以及濾過血液中的代謝廢物，所述代謝廢物隨后以尿的形式被排泄。
[0048]“原代培養(yǎng)物”是指允許從組織分離的多種不同細(xì)胞類型相互作用的混合細(xì)胞群。詞語“原代”采用其在組織培養(yǎng)領(lǐng)域中的通常意義?！澳軌蛟谂囵B(yǎng)中自我更新和擴(kuò)增”涉及如下哺乳動物腎源性細(xì)胞群:所述細(xì)胞群在細(xì)胞培養(yǎng)中成長和分裂，且如細(xì)胞標(biāo)志所測量保持基本上相同的表型，并保持從母細(xì)胞到子細(xì)胞的營養(yǎng)因子分泌。在哺乳動物腎源性細(xì)胞群增殖過程中的某一時間點(diǎn)，所述表型可變化至腎源性細(xì)胞的特化或分化程度更高的狀態(tài)。
[0049]有多個術(shù)語用于描述培養(yǎng)中的細(xì)胞?！凹?xì)胞培養(yǎng)物”一般是指取自活體且在控制條件下生長(例如“培養(yǎng)中”的細(xì)胞。“原代細(xì)胞培養(yǎng)物”是直接取自有機(jī)體的細(xì)胞、組織或器官在第一繼代培養(yǎng)之前的培養(yǎng)物。當(dāng)在利于細(xì)胞生長和/或分裂的條件下將細(xì)胞放置在生長培養(yǎng)基中時，細(xì)胞會“擴(kuò)增”，從而產(chǎn)生更大的細(xì)胞群。當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)中擴(kuò)增時，有時通過細(xì)胞數(shù)目翻倍所需的時間量來測量細(xì)胞增殖率。此被稱為“倍增時間”。
[0050]“細(xì)胞系”是由原代細(xì)胞培養(yǎng)物的一個或多個繼代培養(yǎng)形成的細(xì)胞群。每一輪繼代培養(yǎng)都被稱為傳代。當(dāng)對細(xì)胞進(jìn)行繼代培養(yǎng)時，所述細(xì)胞稱為被“傳代”。有時特定的細(xì)胞群或細(xì)胞系是指被傳代的次數(shù)或以被傳代的次數(shù)為特征。例如，一個已傳代了十次的培養(yǎng)細(xì)胞群可以被稱為“P10”培養(yǎng)物。原代培養(yǎng)物(即，在將細(xì)胞從組織分離后的第一次培養(yǎng)物)被指定為PO。在第一次繼代培養(yǎng)后，細(xì)胞被描述為次代培養(yǎng)物(Pl或第I代)。在第二次繼代培養(yǎng)后，細(xì)胞變成三代培養(yǎng)物(P2或第2代)，依此類推。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在傳代期間，可以有多次群體倍增；因此，培養(yǎng)物的群體倍增數(shù)通常大于傳代數(shù)。細(xì)胞在各次傳代之間的期間中的擴(kuò)增(即群體倍增數(shù)目)取決于許多因素，包括但不限于接種密度、基底、培養(yǎng)基和各次傳代之間的時間。
[0051]一般來講，“營養(yǎng)因子”被定義為促進(jìn)細(xì)胞存活、生長、增殖、成熟、分化、和/或維持，或刺激細(xì)胞活動增強(qiáng)的物質(zhì)。本文所用的“營養(yǎng)支持”是指促進(jìn)細(xì)胞存活、生長、增殖、成熟、分化、和/或維持，或刺激細(xì)胞活動增強(qiáng)的能力。本發(fā)明的哺乳動物腎源性細(xì)胞群產(chǎn)生營養(yǎng)因子，包括但不限于:生長因子、細(xì)胞因子、和分化因子。所述營養(yǎng)因子包括但不限于:FGF2、HGF、TGF α、--ΜΡ-1、--ΜΡ-2、VEGF, MMP-2 或其組合。
[0052]“非免疫原性”是指在大部分哺乳動物治療對象中不會引起有害免疫反應(yīng)的細(xì)胞或細(xì)胞群，所述有害免疫反應(yīng)是危害哺乳動物對象的健康或干擾哺乳動物治療對象的治療反應(yīng)的免疫反應(yīng)。
[0053]“基因”是指核酸序列編碼基因產(chǎn)物?；蛉芜x地包括基因表達(dá)所需的序列信息(例如，啟動子、增強(qiáng)子等)。術(shù)語“基因組”是指有機(jī)體的基因組。[0054]“基因表達(dá)數(shù)據(jù)”是指包含與不同方面的基因表達(dá)相關(guān)的信息的一組或多組數(shù)據(jù)。所述數(shù)據(jù)組任選地包括與以下有關(guān)的信息:靶轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞或細(xì)胞源性樣品中的存在；靶轉(zhuǎn)錄的相對和絕對豐度水平；誘導(dǎo)特定基因表達(dá)的各種處理能力；和使特定基因的表達(dá)改變至不同水平的各種處理能力。
[0055]“基因表達(dá)譜”是指多個基因在無選定表達(dá)條件(即，基線或控制)的情況下、或響應(yīng)于選定的表達(dá)條件(例如，在一個或多個時間點(diǎn)處存在標(biāo)準(zhǔn)化合物或測試化合物的孵育)的表達(dá)水平的表示?？梢罁?jù)為每一基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的絕對數(shù)量將基因表達(dá)表示成測試細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄mRNA相對于對照細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄mRNA的比率。也涉及單個基因及由單個基因構(gòu)成的組合在受試者中的表達(dá)。
[0056]“分離”或“純化”是指“經(jīng)人手”從自然狀態(tài)改變，即自然中存在的任何事物從其原始環(huán)境被移除時便定義為“分離”，或者上述兩種情形?！胺蛛x”也定義與污染物(即與細(xì)胞不同的物質(zhì))分離的組合物，例如哺乳動物腎源性細(xì)胞群。在一方面，細(xì)胞群或組合物基本上不存在自然環(huán)境中可與其相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞和材料。關(guān)于哺乳動物腎源性細(xì)胞所述的“分離”或“純化”或“基本上純化”是指構(gòu)成總細(xì)胞群的哺乳動物腎源性細(xì)胞具有至少約50%、至少約75%、優(yōu)選地至少約85%、更優(yōu)選地至少約90%、最優(yōu)選地約95%的純度。另一種說法，術(shù)語“基本上純化”是指本發(fā)明的哺乳動物腎源性細(xì)胞群在后續(xù)培養(yǎng)和擴(kuò)增之前在初始分離的未擴(kuò)增群中包含少于約50%、優(yōu)選地少于約30%、優(yōu)選地少于約20%、更優(yōu)選地少于約10%、最優(yōu)選地少于約5%的譜系定向腎臟細(xì)胞。細(xì)胞群或組合物的純度可通過本領(lǐng)域中已知的適當(dāng)方法來測定。
[0057]如本文所用，術(shù)語“源性”也指獲得。因此，例如人類腎源性細(xì)胞是從人類腎臟組織分離和獲得的細(xì)胞。該術(shù)語也包含從組織獲得(例如分離)并隨后進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞。
[0058]本發(fā)明公開一種近端小管裝置，所述近端小管裝置包括脫細(xì)胞生物支架和腎近端小管細(xì)胞上皮單層，所述腎近端小管細(xì)胞上皮單層是由可分化成腎細(xì)胞的細(xì)胞形成。所述支架和細(xì)胞一起形成多組分二維近端小管裝置。此種腎近端小管細(xì)胞上皮單層由功能性近端小管細(xì)胞構(gòu)成。
[0059]本發(fā)明的近端小管裝置最佳地在不使用抑制劑(例如MEK抑制劑)的情況下促進(jìn)接觸抑制和未受損單層形成的自然調(diào)節(jié)機(jī)制的運(yùn)作。通過使用脫細(xì)胞生物支架，本發(fā)明的近端小管裝置也有利地表示和/或模仿腎細(xì)胞在體內(nèi)所通常暴露于其中的底層基質(zhì)。最佳地，在自然脫細(xì)胞支架上接種使細(xì)胞能夠分化并形成上皮細(xì)胞單層，所述上皮細(xì)胞單層比通過傳統(tǒng)方法產(chǎn)生的那些單層更穩(wěn)定。
[0060]本發(fā)明描述一種二維近端小管裝置，所述二維近端小管裝置可用作用于轉(zhuǎn)運(yùn)研究、腎毒性篩選、或用于篩選治療劑效果的體外測試系統(tǒng)。在一個實(shí)施例中，所述二維生物人工腎近端小管裝置通過以下方式構(gòu)成:用腎臟祖細(xì)胞來接種脫細(xì)胞生物支架，且任選地，在一些情況下也用微血管內(nèi)皮細(xì)胞來接種所述支架，隨后進(jìn)行靜態(tài)培養(yǎng)或在生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，以允許腎臟細(xì)胞分化成功能性近端小管細(xì)胞并保持用于體外測試的組裝裝置。這些功能性近端小 管細(xì)胞在所述支架的表面上形成單層。
[0061]本發(fā)明還描述了使用脫細(xì)胞生物支架作為所述生物人工近端小管裝置的組件?？捎眉?xì)胞來接種脫細(xì)胞生物支架的一個或多個表面。在一個實(shí)施例中，脫細(xì)胞支架可來源于任何哺乳動物組織，優(yōu)選地來源于消化道的某些部分，最優(yōu)選地來源于胃、十二指腸、空腸、回腸或結(jié)腸。在一個實(shí)施例中，支架最優(yōu)選地來源于空腸的一部分。在一個實(shí)施例中，所述脫細(xì)胞生物支架來源于粘膜或粘膜下組織。在另一個實(shí)施例中，所述脫細(xì)胞生物支架來源于哺乳動物小腸粘膜下層。脫細(xì)胞支架或其某些部分可固定在允許對支架表面的每一側(cè)進(jìn)行接種的裝置中。
[0062]用于形成脫細(xì)胞支架的源組織可為任何哺乳動物組織，包括但不限于人類、靈長類動物、牛、羊、豬或大鼠組織。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所述組織是從哺乳動物分離。在另一個實(shí)施例中，脫細(xì)胞支架來源于哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物。在另一個實(shí)施例中，所述源組織是豬組織。在優(yōu)選的實(shí)施例中，所述支架來源于從幼齡動物分離的豬組織，例如小于6個月大的幼齡動物或小于3個月大的動物。在更優(yōu)選的實(shí)施例中，所述支架是從約10到25kg重、(作為另一選擇)約10到20kg重、以及(作為另一選擇)約15到約20kg重的幼齡動物分離的豬組織。在最優(yōu)選的實(shí)施例中，支架來源于從約10到約15kg重的動物分離的豬組織。
[0063]可使用傳統(tǒng)的方法來執(zhí)行組織的去細(xì)胞(例如脫細(xì)胞)。在一個實(shí)施例中，在分離期間保留所分離組織的粘膜結(jié)構(gòu)。在優(yōu)選的實(shí)施例中，所述粘膜結(jié)構(gòu)隨后被部分或全部移除以暴露粘膜下層，從而進(jìn)行細(xì)胞附著。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，在粘膜結(jié)構(gòu)上培養(yǎng)腎臟祖細(xì)胞。據(jù)觀察，在粘膜下結(jié)構(gòu)上培養(yǎng)時采用上皮細(xì)胞形態(tài)的腎臟祖細(xì)胞的比例比在粘膜結(jié)構(gòu)上培養(yǎng)時更高。因此，在替代實(shí)施例中，最佳地在粘膜下結(jié)構(gòu)上培養(yǎng)腎臟祖細(xì)胞。
[0064]如本文所用，術(shù)語“可分化成腎細(xì)胞的細(xì)胞”是指可分化成腎細(xì)胞的前體細(xì)胞，例如可分化成腎細(xì)胞的任何祖細(xì)胞、前體細(xì)胞或原代細(xì)胞。在一個實(shí)施例中，細(xì)胞可選自以下細(xì)胞:原代腎小管上皮細(xì)胞、分化成腎細(xì)胞或腎祖細(xì)胞的祖(例如干)細(xì)胞(例如誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞)、人類腎源性細(xì)胞、從腎臟分離的干細(xì)胞或從腎臟分離的祖細(xì)胞、以及它們的混合物。可使用任何可分化成腎細(xì)胞或腎祖細(xì)胞的祖(例如干)細(xì)胞，包括但不限于例如胚胎干細(xì)胞、iPS細(xì)胞、臍源性細(xì)胞、胎盤源性細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0065]在本發(fā)明的一個實(shí)`施例中，可分化細(xì)胞是哺乳動物腎源性細(xì)胞。因此，本發(fā)明的一個實(shí)施例是使用從哺乳動物的腎臟(例如人類腎臟)分離的哺乳動物腎源性細(xì)胞作為所述生物人工腎系統(tǒng)的組成。前文已述，如授予Colter等人的美國公開申請2008/0112939所述，祖細(xì)胞可來源于人類腎臟組織以及可自我組織成小管結(jié)構(gòu)并可用于治療患病腎臟的那些腎源性細(xì)胞，該申請的公開內(nèi)容全文以引用的方式并入本文。
[0066]授予Colter等人的美國公開申請2008/0112939中描述了用于分離、培養(yǎng)和表征哺乳動物腎源性細(xì)胞的示例性技術(shù)。如美國公開申請2008/0112939所述，人類腎源性細(xì)胞是從人類腎臟分離且適于器官移植。在一個實(shí)施例中，在分離細(xì)胞之前，通過用任何適宜的介質(zhì)或緩沖液(例如磷酸鹽緩沖鹽水)沖洗而從腎臟組織移除血液和雜物。接著，通過酶消化法從哺乳動物腎臟組織分離腎源性細(xì)胞(例如人類腎源性細(xì)胞)。利用酶使細(xì)胞從哺乳動物(例如人類)腎臟組織游離。在一個實(shí)施例中，使用分散酶。作為另外一種選擇，可使用中性蛋白酶(例如分散酶)、金屬蛋白酶(例如膠原酶)和透明質(zhì)酸酶的組合使細(xì)胞從哺乳動物(例如人類)腎臟組織游離。隨后將分離的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到初始涂布有明膠的無菌組織培養(yǎng)皿。在能夠維持細(xì)胞生長的任意培養(yǎng)基中培養(yǎng)哺乳動物(例如人類)腎源性細(xì)胞，所述培養(yǎng)基例如為但不限于REGM?腎上皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基(Lonza，ffalkersville, MD)或Advanced?DMEM/F12(Invitrogen)。[0067]可分化成腎細(xì)胞的細(xì)胞(例如可分化成腎細(xì)胞的前體細(xì)胞)或哺乳動物腎源性細(xì)胞可為細(xì)胞群。在一個實(shí)施例中，使用人類腎源性細(xì)胞群。在另一個實(shí)施例中，該群為同質(zhì)群。在另一個實(shí)施例中，該群為基本上同質(zhì)的群。
[0068]在一些實(shí)施例中，所述腎源性細(xì)胞可從腎皮質(zhì)、腎髓質(zhì)、或腎包膜下區(qū)域及其混合區(qū)域獲得。
[0069]哺乳動物(例如人類)腎源性細(xì)胞由表型特性(例如形態(tài)、生長勢、表面標(biāo)志表型、早期發(fā)育基因表達(dá)、腎臟發(fā)育基因表達(dá)和營養(yǎng)因子分泌)表征。培養(yǎng)中的人類腎源性細(xì)胞群經(jīng)多次傳代之后保持表面標(biāo)志、基因表達(dá)和營養(yǎng)因子分泌表型。
[0070]在優(yōu)選的實(shí)施例中，分離的哺乳動物腎源性細(xì)胞(即細(xì)胞群)能夠在培養(yǎng)中自我更新和擴(kuò)增 ，并表現(xiàn)出獨(dú)特的表達(dá)譜(例如下述表達(dá)譜的任一種)。
[0071 ] 在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，人類腎源性細(xì)胞對Oct-4、Rex-1、Pax-2、鈣粘素-ll、FoxDl、WTl、Eyal、HNF3B、CXC-R4、Sox-17、EpoR、BMP2、BMP7 或⑶F5 中的至少一種的表達(dá)為陽性。在又一個實(shí)施例中，所述細(xì)胞對Sox2、FGF4、hTert、Wnt-4、SIX2或GATA-4中的至少一種的表達(dá)為陰性。在替代實(shí)施例中，所述細(xì)胞對0ct-4、ReX-l、Pax-2、鈣粘素-1 1、FoxDl、WTl、Eyal、HNF3B、CXC-R4、Sox-17、EpoR、BMP2、BMP7 或⑶F5 中的至少一種的表達(dá)為陽性，且對Sox2、FGF4、hTert、Wnt-4、SIX2或GATA-4中的至少一種的表達(dá)為陰性。在替代實(shí)施例中，所述細(xì)胞對Eyal、WTl、FoxDl、BMP7、BMP2、⑶F5、EpoR或Rex-1中的至少一種的表達(dá)為陽性。在又一個替代實(shí)施例中，所述細(xì)胞對Sox2、FGF4、hTert或Wnt-4中的至少一種的表達(dá)為陰性。在替代實(shí)施例中，所述細(xì)胞對Eyal、WTl、FoxDl、BMP7、BMP2、⑶F5、EpoR或Rex-1中的至少一種的表達(dá)為陽性,且對Sox2、FGF4、hTert或Wnt-4中的至少一種的表達(dá)為陰性。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，人類腎源性細(xì)胞對細(xì)胞表面標(biāo)志HLA 1、⑶24、⑶29、⑶44、⑶49c、⑶73、⑶166或SSEA-4中的至少一種也是陽性。在另一個實(shí)施例中，人類腎源性細(xì)胞對細(xì)胞表面標(biāo)志 HLA I1、CD31、CD34、CD45、CD56、CD80、CD86、CDl04、CDl05、CDl 17、⑶133、⑶138、⑶141或E-鈣粘素中的至少一種也是陰性。在替代實(shí)施例中，人類腎源性細(xì)胞對細(xì)胞表面標(biāo)志 HLA 1、CD24、CD29、CD44、CD49c、CD73、CD166 或 SSEA-4 中的至少一種也是陽性，且對細(xì)胞表面標(biāo)志 HLA I1、CD31、CD34、CD45、CD56、CD80、CD86、CD104、CD105、⑶117、⑶133、⑶138、⑶141或E-鈣粘素中的至少一種為陰性。在一個實(shí)施例中，人類腎源性細(xì)胞可分泌營養(yǎng)因子FGF2、HGF、TGFa、TIMP-U --ΜΡ-2、MMP-2或VEGF中的至少一種。在優(yōu)選的實(shí)施例中，所述細(xì)胞不分泌營養(yǎng)因子I3DGFbb和IL12p70中的至少一種。
[0072]在替代實(shí)施例中，和所述生物人工近端小管裝置一起使用的祖細(xì)胞是人類腎源性細(xì)胞。這些人類腎源性細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中自我更新和擴(kuò)增，對Oct-4、Rex-U Pax-2、鈣粘素-11、FoxDl、WTl、Eyal、HNF3B、CXC-R4、Sox-17, EpoR、BMP2、BMP7 或⑶F5 中的至少一種的表達(dá)為陽性；且對Sox2、FGF4、hTert、Wnt-4、SIX2、E-鈣粘素或GATA-4中的至少一種的表達(dá)為陰性。此外，人類腎源性細(xì)胞對細(xì)胞表面標(biāo)志HLA-1、⑶24、⑶29、⑶44、⑶49c、⑶73、⑶90、⑶166或SSEA-4中的至少一種也可為陽性；且對細(xì)胞表面標(biāo)志HLA I1、⑶31、⑶34、CD45、CD56、CD80、CD86、CD104、CD105、CD117、CD133、CD138 和 CD141 中的至少一種為陰性。此外，這些細(xì)胞任選地分泌營養(yǎng)因子FGF2、HGF、TGFa、--ΜΡ_1、--ΜΡ-2、MMP-2或VEGF中的至少一種；且不分泌營養(yǎng)因子H)GF-bb或IL12p70中的至少一種。
[0073]在又一個實(shí)施例中，人類腎源性細(xì)胞(I)對Oct-4、Rex-1、Pax-2、鈣粘素-11、FoxDl、WTl、Eyal、HNF3B、CXC-R4、Sox-17, EpoR、BMP2、BMP7 和⑶F5 的表達(dá)為陽性，且(2)對Sox2、FGF4、hTert、SIX2和Gata-4的表達(dá)為陰性。在替代實(shí)施例中，腎源性細(xì)胞(I)對Oct-4、Rex-1、Pax-2、鈣粘素-11、FoxDl、WTl、Eyal、HNF3B、CXC-R4、Sox-17, EpoR、BMP2、BMP7和⑶F5的表達(dá)為陽性；⑵對Sox2、FGF4、hTert、SIX2和Gata-4中的至少一種的表達(dá)為陰性；(3)對細(xì)胞表面標(biāo)志 HLA1、CD24、CD29、CD44、CD49c、CD73、CDl 66 和 SSEA-4 為陽性；且(4)對 HLA I1、CD31、CD34、CD45、CD56、CD80、CD86、CD90、CD104、CD105、CD117、CD133、CD138、CD141和E-鈣粘素為陰性。
[0074]在另一個實(shí)施例中，人類腎源性細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中自我更新和擴(kuò)增，對HLA I和⑶44的細(xì)胞表面標(biāo)志表達(dá)為陽性，對Oct-4、Pax-2和WTl的基因表達(dá)為陽性，且對⑶133的細(xì)胞表面標(biāo)志表達(dá)和Wtn-4的基因表達(dá)為陰性。在一個實(shí)施例中，人類腎源性細(xì)胞還對BMP7、BMP2、⑶F4、EpoR和Rex-1的基因表達(dá)為陽性，且對Sox2、FGF4和hTert的基因表達(dá)為陰性。
[0075]在替代實(shí)施例中，人類腎源性細(xì)胞滿足以下條件:(1)能夠在培養(yǎng)中自我更新和擴(kuò)增。(2)對 HLA-1 的表達(dá)和 Oct-4、Rex-1、Pax-2、鈣粘素-11、FoxDl、WTl、Eyal、HNF3B、CXC-R4、Sox-17、EpoR、BMP2、BMP7或⑶F5中的至少一種的表達(dá)為陽性；且(3)對CD133的表達(dá)和S0X2、FGF4、hTert、Wnt_4、SIX2、E-鈣粘素或GATA-4中的至少一種的表達(dá)為陰性。這些細(xì)胞還滿足以下條件:(4)對細(xì)胞表面標(biāo)志⑶24、⑶29、⑶44、⑶49c、⑶73、⑶90、⑶166或SSEA-4中的至少一種為陽性，且(5)對細(xì)胞表面標(biāo)志HLA I1、⑶31、⑶34、⑶45、⑶56、CD80、CD86、CD104、CD105、CDl 17、CD133、CD138、CD141 和 E-鈣粘素中的至少一種為陰性。這些細(xì)胞也可分泌營養(yǎng)因子FGF2、HGF、TGF α、--ΜΡ-1、--ΜΡ-2、MMP-2或VEGF中的至少一種，且不分泌營養(yǎng)因子I3DGFbb或IL12p70中的至少一種。在替代實(shí)施例中，人類腎源性細(xì)胞是細(xì)胞群。
[0076]可將哺乳動物(例如人類)腎源性細(xì)胞傳代到單獨(dú)的培養(yǎng)皿中，該培養(yǎng)皿包含與最初使用的培養(yǎng)基相同或不同類型的新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞群能夠在該培養(yǎng)皿中以有絲分裂方式擴(kuò)增。隨后，將哺乳動物(例如人類)腎源性細(xì)胞接種到生物基質(zhì)中并進(jìn)行培養(yǎng)，以使腎源性細(xì)胞分化成功能性近端小管細(xì)胞。`本發(fā)明的細(xì)胞可在零代和衰老之間的任何時間點(diǎn)使用。細(xì)胞優(yōu)選地傳代約3次至約20次、約5次至約10次、約15次至20次、約5次至約7次，更優(yōu)選地傳代約3次至約7次。
[0077]在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，在脫細(xì)胞生物支架的兩個或更多個表面上接種細(xì)胞。在一個實(shí)施例中，在支架的一個表面上接種血管內(nèi)皮細(xì)胞，在另一表面上接種哺乳動物腎源性細(xì)胞。隨后培養(yǎng)已接種的支架，以使腎源性細(xì)胞分化成功能性近端小管細(xì)胞，并使相對的表面上形成血管內(nèi)皮單層。
[0078]在一個實(shí)施例中，用于支架增殖的人類血管內(nèi)皮細(xì)胞可選自內(nèi)皮細(xì)胞系、骨髓或全血內(nèi)皮祖細(xì)胞、或原代內(nèi)皮或微血管內(nèi)皮細(xì)胞。利用傳統(tǒng)方法分離所用的血管內(nèi)皮細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施例中，用于支架增殖的細(xì)胞是原代微血管內(nèi)皮細(xì)胞。在一個實(shí)施例中，可從任何哺乳動物源分離所用的血管內(nèi)皮細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施例中，所分離的血管內(nèi)皮細(xì)胞來自人類。在替代的優(yōu)選實(shí)施例中，血管內(nèi)皮細(xì)胞是從哺乳動物(人類)腎臟分離的原代微血管內(nèi)皮細(xì)胞。
[0079]本發(fā)明的另一個實(shí)施例是一種用于制作所述近端小管裝置的設(shè)備。[0080]在一個實(shí)施例中，利用專門設(shè)計的設(shè)備(“冠”)完成對脫細(xì)胞支架的接種，脫細(xì)胞支架的一部分被插入到該設(shè)備中，使支架的邊緣置于兩個金屬或塑料片之間，從而有效地密封所述邊緣，以形成由支架隔開的上部凹槽和下部凹槽。冠還將一些拉伸和張力引入到脫細(xì)胞支架中。隨后，將細(xì)胞接種到上部凹槽中并使其安放在脫細(xì)胞支架上。也可將冠翻過來，以對支架的另一側(cè)接種，或者可將冠拆卸，將支架翻過來，并重新組裝到冠，以接種相對的表面?？梢匀缦旅芏葘⒛I細(xì)胞接種到支架上:約500個細(xì)胞/cm2至約350，000個細(xì)胞/cm2、(作為另一選擇)約I, 000個細(xì)胞/cm2至約100，000個細(xì)胞/cm2、(作為另一選擇)約750個細(xì)胞/cm2至約75，000個細(xì)胞/cm2、(作為另一選擇)約10，000個細(xì)胞/cm2至約300，000個細(xì)胞/cm2、(作為另一選擇)約7，500個細(xì)胞/cm2至約200，000個細(xì)胞/cm2、和優(yōu)選地約5，000個細(xì)胞/cm2至約70，000個細(xì)胞/cm2。
[0081]接著，利用傳統(tǒng)技術(shù)培養(yǎng)用所述設(shè)備接種細(xì)胞的支架，以允許腎細(xì)胞分化并形成連續(xù)的上皮細(xì)胞單層。培養(yǎng)時間可為培養(yǎng)I至6周、優(yōu)選地培養(yǎng)2至4周、最優(yōu)選地培養(yǎng)3至4周。然后，可利用所得的成熟近端小管裝置以傳統(tǒng)方法進(jìn)行腎轉(zhuǎn)運(yùn)研究、腎毒性測試、或治療劑的測試。[0082]在另一個實(shí)施例中，接種支架上的細(xì)胞以及體外測試系統(tǒng)的培養(yǎng)通過以下方式實(shí)現(xiàn):將支架放置在定制設(shè)計的生物反應(yīng)器中，使得支架在兩個隔室之間形成屏障。生物反應(yīng)器腔室連接至流體流系統(tǒng)，該流體流系統(tǒng)被設(shè)計成允許流體流穿過支架的兩個表面。通過改變流動系統(tǒng)的特性(例如流率)，可根據(jù)所接種的細(xì)胞類型為支架的每一側(cè)建立細(xì)胞特定流體力學(xué)條件，例如以支持基底外側(cè)的內(nèi)皮細(xì)胞的功能?？稍趯⒅Ъ芊胖玫缴锓磻?yīng)器中之前對支架預(yù)先接種細(xì)胞，或者在將支架放置到生物反應(yīng)器中之后在生物反應(yīng)器內(nèi)接種細(xì)胞。在另一方面，生物反應(yīng)器被設(shè)計成使施加到放置在生物反應(yīng)器內(nèi)的脫細(xì)胞構(gòu)造的張力可視需要改變，以利于細(xì)胞的接種和/或分化。
[0083]在一個實(shí)施例中，使用所述用于接種腎細(xì)胞和任選地內(nèi)皮細(xì)胞的設(shè)備用細(xì)胞來接種脫細(xì)胞支架。然后從所述設(shè)備移除接種有細(xì)胞的支架并將其轉(zhuǎn)移到生物反應(yīng)器腔室中以進(jìn)行培養(yǎng)或測定，如下文中的各實(shí)例所述。在轉(zhuǎn)移到生物反應(yīng)器腔室之前，可首先將接種有細(xì)胞的支架在所述設(shè)備中培養(yǎng)約O至4周?？梢匀缦旅芏葘⒛I細(xì)胞接種到支架上:約500個細(xì)胞/cm2至約350，000個細(xì)胞/cm2、優(yōu)選地約5000個細(xì)胞/cm2至約70，000個細(xì)胞/cm2。培養(yǎng)條件(包括在設(shè)備中的孵育時間長短)可根據(jù)細(xì)胞源和細(xì)胞培養(yǎng)基而改變。
[0084]在另一個實(shí)施例中，首先將脫細(xì)胞支架放置在生物反應(yīng)器腔室內(nèi)，然后通過將細(xì)胞懸液灌注到生物反應(yīng)器腔室中并孵育一段時間來對支架進(jìn)行接種，以允許細(xì)胞附著到脫細(xì)胞支架上。此種生物反應(yīng)器包括上部本體元件和下部本體元件，所述下部本體元件具有設(shè)計用于支架生長的區(qū)域。
[0085]圖15中顯示適用于本發(fā)明的一個示例性生物反應(yīng)器。結(jié)合圖15，生物反應(yīng)器100的組件為:主體元件、上部本體元件Iio和下部本體元件120、兩個夾子-前夾130和后夾160、外閉合蓋-下部外閉合蓋140和上部外閉合蓋150、和連接器170。前夾130和后夾160將生物反應(yīng)器100的主要反應(yīng)器上部本體元件110和下部本體元件120保持在一起。上部外閉合蓋150位于上部本體元件110的頂部上。下部外閉合蓋140位于下部本體元件120的下方。圖16是生物反應(yīng)器的下部本體元件120的視圖，其顯示溝槽180，該溝槽的深度可隨上部本體元件中的框架改變以調(diào)整脫細(xì)胞支架上的張力。下部本體元件120還包含供細(xì)胞生長的區(qū)域190。
[0086]在一個實(shí)施例中，可將未接種的支架放置在生物反應(yīng)器100的上部本體元件110和下部本體元件120之間(參見圖15)。利用下部本體元件120中的對應(yīng)溝槽結(jié)構(gòu)在上部本體元件110中研磨出圓形框架構(gòu)造，該圓形框架構(gòu)造使支架的固定相當(dāng)于細(xì)胞冠?？衫脺喜凵疃群涂蚣軜?qū)挷煌膶ｉT設(shè)計的框架/溝槽組合來調(diào)整張力。框架可運(yùn)動到溝槽180中的距離(參見圖16)決定支架的張力，且距離越大導(dǎo)致張力越高。必須考慮像支架直徑和支架厚度等因素。在將支架定位之后，生物反應(yīng)器的前夾130和后夾160將上部本體元件110和下部本體元件120保持在一起，且此構(gòu)造可像細(xì)胞冠那樣手持。下部外閉合蓋140和上部外閉合蓋能將系統(tǒng)閉合，且可經(jīng)由生物反應(yīng)器的連接器170將細(xì)胞懸液引入到支架的一側(cè)。細(xì)胞在細(xì)胞生長區(qū)域190中生長。在其中所接種細(xì)胞可進(jìn)行附著的細(xì)胞特異性時間段中，可將閉合的生物反應(yīng)器翻轉(zhuǎn)并在支架的另一側(cè)上接種第二種細(xì)胞類型或相同的細(xì)胞類型。在一個實(shí)施例中，用于接種的細(xì)胞懸液可介于約IO3個細(xì)胞/ml至約IO7個細(xì)胞/ml。為避免接種在第一側(cè)上的細(xì)胞失去生活力，可用培養(yǎng)基填充第一側(cè)的隔室。如果需要靜態(tài)條件，則可用細(xì)胞培養(yǎng)基填充隔室。作為另外一種選擇，可利用連接器170在各種流動條件下開始灌注培養(yǎng)基。
[0087]在細(xì)胞附著到支架之后，可僅通過用培養(yǎng)基灌注腔室隔室并閉合生物反應(yīng)器的連接器而對細(xì)胞進(jìn)行靜態(tài)培養(yǎng)。作為另外一種選擇，將流動系統(tǒng)的管聯(lián)接到生物反應(yīng)器并開始灌注。隨后培養(yǎng)在生物反應(yīng)器內(nèi)被接種到脫細(xì)胞支架上的細(xì)胞，以使細(xì)胞生長并分化成腎小管細(xì)胞的功能單層。細(xì)胞的培養(yǎng)可包括靜態(tài)培養(yǎng)，或更優(yōu)選地包括在動態(tài)條件(例如線性流或脈動流)下培養(yǎng)。流率、壓力和脈動條件均可發(fā)生改變以利于細(xì)胞生長和分化成功能腎細(xì)胞。培養(yǎng)基在生物反應(yīng)器中的平均流率可介于I至25ml/min、作為另一選擇介于約I至約10ml/min、作為另一選擇介于約2.5至約10ml/min、作為另一選擇介于約5至20ml/min。在優(yōu)選的實(shí)施例中，平均流率可介于約2.5至I 5ml/min。培養(yǎng)期可介于約I周至約4周、作為另一選擇介于約I周至約2周、作為另一選擇介于約I周至約3周、作為另一選擇介于約2周至約4周。在`優(yōu)選的實(shí)施例中，培養(yǎng)期可優(yōu)選地介于約2周至3周。在此期間，可利用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)來監(jiān)視細(xì)胞層整體性。在一個實(shí)施例中，可通過以下方式來監(jiān)視細(xì)胞層整體性:利用整合在生物反應(yīng)器的每一隔室中的電極測量跨上皮的電阻，或者測量各種熒光標(biāo)記分子(例如菊粉或肌酐酸)穿過單層的滲漏。在另一個實(shí)施例中，在每一腔室中使用不同的細(xì)胞培養(yǎng)基。在又一個實(shí)施例中，可在每一腔室中采用不同的流率、壓力和脈動條件，以經(jīng)由流動指數(shù)剪切應(yīng)力實(shí)現(xiàn)細(xì)胞特異性培養(yǎng)。也可在專利申請N0.DE102008056037.5-41和EP 2 184 344中找到對生物反應(yīng)器的描述，所述專利申請的公開內(nèi)容全文以引用方式并入本文。
[0088]本發(fā)明的另一個實(shí)施例是一種通過使細(xì)胞在張力下分化而使可分化成腎細(xì)胞的細(xì)胞(例如哺乳動物(人類)腎源性)細(xì)胞分化成穩(wěn)定的腎近端小管細(xì)胞單層的方法。此種方法還可包括使用本發(fā)明的支架產(chǎn)生本發(fā)明的近端小管裝置。
[0089]本發(fā)明的近端小管裝置可用作進(jìn)行腎毒性篩選或治療劑篩選的體外測試系統(tǒng)。在另一個實(shí)施例中，所述裝置可用于在暴露于化合物或顆粒期間或之后監(jiān)視小管細(xì)胞功能(例如轉(zhuǎn)運(yùn))。針對每一表面上方的流可采用不同的培養(yǎng)基配方，使得能夠研究穿過細(xì)胞和支架層從一個培養(yǎng)基隔室到另一個隔室的轉(zhuǎn)運(yùn)。此種培養(yǎng)基配方的一個例子將在接種有mvEC的隔室中遵循內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，且在包含腎小管單層的相對隔室中遵循模仿腎小球?yàn)V液的的培養(yǎng)基配方。
[0090]接著，可利用本領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和標(biāo)記分子來評估腎小管單層的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。可通過以下方式實(shí)現(xiàn)毒性篩選:將所關(guān)注的化合物或顆粒添加到為內(nèi)皮細(xì)胞提供營養(yǎng)素且接觸內(nèi)皮細(xì)胞的血管隔室流動路徑中，或者將化合物或顆粒引入到為腎小管細(xì)胞提供營養(yǎng)素且接觸腎小管細(xì)胞的小管隔室流動路徑，以分別模仿毒性異生化合物在血液和尿液中的出現(xiàn)?？赏ㄟ^測定所述流動路徑其中之一或二者的培養(yǎng)基來監(jiān)視化合物或顆粒的轉(zhuǎn)運(yùn)。此外，可通過在暴露至所關(guān)注的化合物之后測定細(xì)胞生活力、形態(tài)、或轉(zhuǎn)運(yùn)功能效果來監(jiān)視毒性。用于評估化合物或顆粒的毒性或治療作用的測定方法并不僅限于上述方法。
[0091]可通過首先損害生物人工裝置的腎源性細(xì)胞、然后用測試治療顆粒治療所述細(xì)胞來測定治療靶點(diǎn)。所述損害可以物理或化學(xué)方式引入，例如將細(xì)胞暴露在有毒化合物或顆粒(例如順鉬或鏈脲佐菌素)中?？赏ㄟ^將測試治療化合物或顆粒添加到裝置的血管隔室流動路徑中而使所述化合物或顆粒與細(xì)胞接觸，其濃度例如將模仿對治療劑進(jìn)行靜脈(IV)輸液之后細(xì)胞所暴露其中的濃度。隨后可利用對腎小管細(xì)胞功能的監(jiān)視來判斷所施用測試治療化合物的有效程度。
[0092]監(jiān)視小官功能包括但不限于檢測或評估以下內(nèi)容:腎小管細(xì)胞對化合物或顆粒的攝入；細(xì)胞所攝入的化合物或顆粒從近端小管裝置的一個培養(yǎng)基隔室到另一個隔室的轉(zhuǎn)運(yùn)；抑制劑對攝入或轉(zhuǎn)運(yùn)的影響；以及腎小管細(xì)胞基因或蛋白表達(dá)、形態(tài)、細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)、酶活性或成活率的變化。用于評估化合物或顆粒的毒性或治療作用的測定方法并不僅限于上述方法。
[0093]本發(fā)明的另一個實(shí)施例是包括本發(fā)明生物人工近端小管裝置的試劑盒。在一個實(shí)施例中，所述試劑盒包括生物人工小管裝置和產(chǎn)品說明書。
[0094]本發(fā)明的替代實(shí)施例是包括本發(fā)明的生物人工近端小管裝置的組合物。在一個實(shí)施例中，所述組合物包括本發(fā)明的生物人工近端小管裝置和藥學(xué)上可接受的載體。
[0095]無需進(jìn)一步描述，相信本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠利用前述說明和以下例示性實(shí)例制造和利用本發(fā)明并實(shí)踐本發(fā)明所主張的方法。因此，以下工作實(shí)例具體指出本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，且不應(yīng)被視為以任何方式限制本公開的其余內(nèi)容。另外，如以下實(shí)例和本說明書在別處所用，可用于本發(fā)明的裝置和方法的腎源性細(xì)胞(“hKDC”)可根據(jù)美國專利公布N0.2008/0112939的公開內(nèi)容來分離和表征，所述專利公布涉及hKDC的描述、分離和表征的全部內(nèi)容以引用方式并入本文。
[0096]實(shí)魁
[0097]實(shí)例1:hKDC在細(xì)胞外基質(zhì)支架上的接種和分化
[0098]本實(shí)驗(yàn)測試人類腎源性細(xì)胞(“hKDC”)在各種構(gòu)型的細(xì)胞外(即脫細(xì)胞)基質(zhì)支架上的附著、生長和分化以及測試在膠原涂布的細(xì)胞小室上的傳統(tǒng)培養(yǎng)。
[0099]將4次傳代的hKDC接種到三個不同的支架構(gòu)型上和細(xì)胞小室(Coming，ComingNY)上。用REGM?腎上皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基(Lonza，Walkersville MD)將細(xì)胞培養(yǎng)超過三周的時間。用三種不同的細(xì)胞濃度對每一種支架構(gòu)型進(jìn)行測試:2.5X103、5X103JP IXlO4個細(xì)胞。所測試的構(gòu)型為:1)膠原夾層培養(yǎng)；2)膠原-SIS夾層培養(yǎng)；3)SIS單層培養(yǎng)；和4)膠原涂布的細(xì)胞小室。
[0100]膠原夾層培養(yǎng)
[0101]在24孔培養(yǎng)板上將hKDC培養(yǎng)在兩個膠原凝膠層之間。通過以下方式澆鑄底部凝膠:首先將冷凝膠中和液與膠原(從大鼠尾腱分離的類型1，在0.1 %的乙酸中為6mg/ml)以I '2的比例混合，隨后在每個孔中添加500 μ I的這種溶液。在37°C /5% CO2的條件下孵育15分鐘，該溶液形成凝膠。之后，在每個孔中，將細(xì)胞接種在Iml培養(yǎng)基中。24小時后，澆鑄覆蓋凝膠。將培養(yǎng)基抽出，并用移液管將300 μ I的凝膠溶液(上文中所制備者)吸移到每個孔中。在37°C/5% CO2條件下孵育15分鐘，該溶液形成凝膠。最后，在每個孔中添加Iml的培養(yǎng)基。
[0102]小腸粘膜下層(SIS)單層培養(yǎng)[0103]通過以下方式制備支架:利用傳統(tǒng)方法將小嬋粘膜下層(SIS)的某些片段脫細(xì)胞化。簡言之，用物理方法將豬小腸的某些片段的黏液移除。之后，通過以下方式執(zhí)行脫細(xì)胞化:在4攝氏度下、3.4%的脫氧膽酸鈉中伴隨震蕩將所述腸片段I孵育小時。隨后用PBS大量沖洗脫細(xì)胞片段并用伽馬射線殺菌。對于SIS單層培養(yǎng)使用12孔培養(yǎng)板。在接種細(xì)胞的前一天，使脫細(xì)胞的SIS橫跨圓的金屬支架并在每個孔中對其覆蓋Iml的培養(yǎng)基。橫跨的SIS表面大小近似等于24孔培養(yǎng)板中的孔的表面。為將細(xì)胞接種到SIS上，移除細(xì)胞培養(yǎng)基，且在每個孔中將適量的細(xì)胞接種在Iml培養(yǎng)基中。
[0104]SIS夾層培養(yǎng)
[0105]如上所述制備SIS支架并接種hKDC。在使細(xì)胞附著24小時之后，像在膠原夾層培養(yǎng)中一樣在細(xì)胞上方澆鑄覆蓋凝膠(參見上文)。
_6] 細(xì)胞小室培養(yǎng)
[0107]將細(xì)胞小室轉(zhuǎn)移到12孔培養(yǎng)板中并將每一個涂布200 μ I的I型膠原(在0.1%乙Ife中為100yg/ml)。在室溫下將涂布溶液鮮育20分鐘，隨后抽出。在每個孔中將適量的細(xì)胞接種在1.5ml培養(yǎng)基中。
[0108]將多個樣品在上述每一種條件中培養(yǎng)三周。在一周、兩周、和三周之后移除樣品進(jìn)行組織學(xué)分析。此外，用RANDOX RX DAYTONA?臨床分析儀分析培養(yǎng)基樣品，已得到以下代謝參數(shù):葡萄糖濃度、乳酸和乳酸脫氫酶。用Bouin氏固定液將用于組織學(xué)分析的樣品固定I小時。接著將樣品在水中洗滌至少4小時，并將其埋置到石蠟中。隨后，制備3 μ m厚的切片。用蘇木精-伊紅(H&E)對切片染色，以評估細(xì)胞形態(tài)。此外，執(zhí)行免疫組織化學(xué)(IHC)以利用以下抗體來表征細(xì)胞的分化:Anti_hPAX2、Anti_hAQPl、Anti_Ki67、抗鈣粘素hE抗體和抗鈣粘素hN抗體(參見下表1)。為進(jìn)行免疫組織化學(xué)，將3 μ m的橫截面脫蠟。通過以下方式實(shí)現(xiàn)靶檢索:用蛋白酶K進(jìn)行酶處理或在檸檬酸鹽緩沖液pH 6(Dako，#S2369)或Tris/EDTA緩沖液pH9(Dako，#S2367)中加熱。包括用3%的過氧化氫酶進(jìn)行的阻斷步驟，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。接著，將一級抗體孵育I小時，隨后用ENVISION?檢測系統(tǒng)過氧化物酶/DAB兔/小鼠(Dako，#K5007)對其進(jìn)行檢測。用蘇木精對切片進(jìn)行復(fù)染色。
【權(quán)利要求】
1.一種生物人工近端小管裝置，包括脫細(xì)胞生物基質(zhì)支架，所述脫細(xì)胞生物基質(zhì)支架在足以允許前體細(xì)胞分化成腎近端小管上皮細(xì)胞的條件下用一種或多種前體細(xì)胞來接種，其中分化細(xì)胞在所述支架上形成上皮細(xì)胞單層。
2.一種生物人工近端小管裝置，包括脫細(xì)胞生物支架，所述脫細(xì)胞生物支架具有至少兩個表面，其中至少一個表面在足以允許細(xì)胞分化成腎近端小管上皮細(xì)胞的條件下用一種或多種前體細(xì)胞來接種，其中所述細(xì)胞在所述支架的表面上形成上皮細(xì)胞單層。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生物人工近端小管裝置，其中所述脫細(xì)胞生物基質(zhì)支架來源于哺乳動物組織。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物人工近端小管裝置，其中所述脫細(xì)胞生物基質(zhì)支架來源于粘膜或粘膜下組織。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物人工近端小管裝置，其中所述脫細(xì)胞生物基質(zhì)支架來源于哺乳動物消化道。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生物人工近端小管裝置，其中所述脫細(xì)胞生物基質(zhì)支架來源于哺乳動物的胃、十二指腸、空腸、回腸或結(jié)腸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的生物人工近端小管裝置，其中所述一種或多種前體細(xì)胞選自:原代腎小管上皮細(xì)胞、分化成腎細(xì)胞或腎祖細(xì)胞的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞、分化成腎細(xì)胞或腎祖細(xì)胞的祖細(xì)胞、從腎臟分離的干細(xì)胞或從腎臟分離的祖細(xì)胞、以及它們的混合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的生物人工近端小管裝置，其中所述祖細(xì)胞是人類腎源性細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的生物人工近端小管裝置，其中所述人類腎源性細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中自我更新和擴(kuò)增，并且對Oct-4、Rex-1、Pax-2、鈣粘素-11、FoxDU WT1、EyaU HNF3B、CXC-R4、Sox-17、EpoR、BMP2、BMP7或⑶F5中的至少一種的表達(dá)為陽性；且對Sox2、FGF4、hTert、Wnt-4、SIX2、E-鈣粘素或GATA-4中的至少一種的表達(dá)為陰性。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的生物人工近端小管裝置，其中所述人類腎源性細(xì)胞對細(xì)胞表面標(biāo)志 HLA-1、CD24、CD29、CD44、CD49c、CD73、CD90、CD166 或 SSEA-4 中的至少一種為陽性；且對細(xì)胞表面標(biāo)志 HLA I1、CD31、CD34、CD45、CD56、CD80、CD86、CD104、CD105、CD117、⑶133、⑶138和⑶141中的至少一種為陰性。
11.根據(jù)權(quán)利要求8至10中任一項(xiàng)所述的生物人工近端小管裝置，其中所述人類腎源性細(xì)胞分泌營養(yǎng)因子FGF2、HGF、TGFa、--ΜΡ-1、--ΜΡ-2、ΜΜΡ_2或VEGF中的至少一種；且不分泌營養(yǎng)因子H)GF-bb或IL12p70中的至少一種。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的生物人工近端小管裝置，其中所述人類腎源性細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中自我更新和擴(kuò)增，并且對HLA-1的表達(dá)以及0ct-4、Rex-l、Pax-2、鈣粘素-ll、FoxDl、WTl、Eyal、HNF3B、CXC-R4、Sox-17, EpoR、BMP2、BMP7 或⑶F5 中的至少一種的表達(dá)為陽性；且對CD133的表達(dá)以及Sox2、FGF4、hTert、Wnt-4、SIX2、E-鈣粘素或GATA-4中的至少一種的表達(dá)為陰性。
13.一種使一種或多種前體細(xì)胞分化成腎細(xì)胞的方法，包括:用一種或多種前體細(xì)胞來接種脫細(xì)胞生物基質(zhì)支架；以及在足以允許所述前體細(xì)胞分化成腎近端小管上皮細(xì)胞的條件下在所述支架上培養(yǎng)所述細(xì)胞，其中所述分化細(xì)胞在所述支架上形成上皮細(xì)胞單層。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述脫細(xì)胞生物基質(zhì)支架來源于哺乳動物組織。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述脫細(xì)胞生物基質(zhì)支架來源于粘膜或粘膜下組織。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述脫細(xì)胞生物基質(zhì)支架來源于哺乳動物的胃、十二指腸、空腸、回腸或結(jié)腸。
17.根據(jù)權(quán)利要求13至16所述的方法，其中所述一種或多種前體細(xì)胞選自:原代腎小管上皮細(xì)胞、分化成腎細(xì)胞或腎祖細(xì)胞的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞、分化成腎細(xì)胞或腎祖細(xì)胞的祖細(xì)胞、從腎臟分離的干細(xì)胞或從腎臟分離的祖細(xì)胞、以及它們的混合物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述祖細(xì)胞是人類腎源性細(xì)胞。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述人類腎源性細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中自我更新和擴(kuò)增，并且對 Oct-4、Rex-1、Pax-2、鈣粘素-1 1、FoxD1、WT1、Eyal、HNF3B、CXC-R4、Sox-17、EpoR、BMP2、BMP7或⑶F5中的至少一種的表達(dá)為陽性；且對Sox2、FGF4、hTert、Wnt_4、SIX2、E-鈣粘素或GATA-4中的至少一種的表達(dá)為陰性。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述人類腎源性細(xì)胞對細(xì)胞表面標(biāo)志HLA-1、CD24、CD29、CD44、CD49c、CD73、CD90、CD166 或 SSEA-4 中的至少一種為陽性；且對細(xì)胞表面標(biāo)志 HLA I1、CD31、CD34、CD45、CD56、CD80、CD86、CD 104、CD 105、CD 117、CD 133、CD 138 和⑶141中的至少一種為陰性。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述人類腎源性細(xì)胞分泌營養(yǎng)因子FGF2、HGF、TGF a、TIMP-U --ΜΡ-2、ΜΜΡ-2或VEGF中的至少一種；且不分泌營養(yǎng)因子PDGF_bb或IL12p70中的至少一種。
【文檔編號】C12N5/071GK103842497SQ201280036409
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年5月25日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月27日
【發(fā)明者】C.卡札內(nèi)基, D.C.科特, J.香茲, A.霍彭薩克, J.漢斯曼恩, H.瓦勒斯 申請人:德普伊新特斯產(chǎn)品有限責(zé)任公司