核酸分析法
【專利摘要】實施方式涉及對于樣本的核酸分析法。核酸分析法包括：將樣本用第1引物和第2引物進行擴增反應(yīng)，使擴增反應(yīng)產(chǎn)物與核酸探針反應(yīng)，測定雜交的有無和/或量，確定樣本中的目標核酸的有無和/或存在量。由第1引物和/或第2引物產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)體。通過檢出與環(huán)結(jié)構(gòu)的序列互補的核酸探針和擴增產(chǎn)物的雜交的有無和/或存在量，來對于樣本進行核酸分析。
【專利說明】核酸分析法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明的實施方式涉及核酸分析法。
【背景技術(shù)】
[0002]在基因分析中，作為檢出或定量具有特定序列的核酸的一般手法之一，有使用PCR擴增法的方法。在該方法中，將樣本進行PCR擴增之后，對于擴增產(chǎn)物檢出特定序列的有無
或定量其存在量。
[0003]在PCR擴增法中，使用用于擴增要檢出或定量的目的序列的引物組，以樣本所含的核酸作為模板核酸進行擴增。所得的擴增產(chǎn)物通過熱處理等分解或分離成單鏈之后，例如，與用于檢出目的序列的核酸探針反應(yīng)。以由此生成的雜交的有無或量作為指標而最終實現(xiàn)目的序列的檢出和/或定量。
[0004]來自擴增產(chǎn)物的單鏈具有通過其序列而形成二級結(jié)構(gòu)的傾向。另外，通過PCR擴增法獲得的擴增產(chǎn)物包含彼此互補的雙鏈。因此，為了供于檢出和/或定量而被單鏈化，但單鏈化后的樣品中存在包含彼此互補的序列的二種單鏈。因此，檢出和/或定量中或檢出和/或定量以前，有在樣品中相遇的互補鏈彼此之間自發(fā)地形成雙鏈的傾向。關(guān)于單鏈的這些傾向，可能在進行檢出和/或定量上形成障礙。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]發(fā)明所要解決的課題
[0006]本發(fā)明所要解決的課題是提供能夠正確、簡便且短時間地進行的核酸分析法。
[0007]用于解決課題的方法
[0008]實施方式涉及對于樣本的核酸分析法。核酸分析法包括:將樣本用第I引物和第2引物進行擴增反應(yīng)，使擴增反應(yīng)產(chǎn)物與核酸探針反應(yīng)，測定雜交的有無和/或量，確定樣本中的目標核酸的有無和/或存在量。由第I引物和/或第2引物產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)體。通過檢出與環(huán)結(jié)構(gòu)的序列互補的核酸探針和擴增產(chǎn)物的雜交的有無和/或存在量，來對于樣本進行核酸分析。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1是顯示實施方式中的擴增工序的I例的模式圖。
[0010]圖2是顯示實施方式中的擴增工序的I例的模式圖。
[0011]圖3是顯示實施方式中的擴增工序的I例的模式圖。
[0012]圖4是顯示實施方式中的擴增工序的I例的模式圖。
[0013]圖5是顯示實施方式中的擴增工序的I例的模式圖。
[0014]圖6是顯示實施方式中的擴增工序的I例的模式圖。
[0015]圖7是顯示實施例1的引物和探針的設(shè)計位置的圖。
[0016]圖8是顯示實施例1的電泳結(jié)果的圖。[0017]圖9是顯示實施例1的檢出結(jié)果的圖。
[0018]圖10是顯示實施例2的檢出結(jié)果的圖。
[0019]圖11是顯示實施例2的檢出結(jié)果的圖。
[0020]圖12是顯示實施例3的檢出結(jié)果的圖。
[0021]圖13是顯示實施方式中的DNA芯片的I例的圖。
[0022]圖14是顯示實施方式中的DNA芯片的I例的圖。
【具體實施方式】
[0023]以下，對于本發(fā)明的實施方式進行詳細說明。
[0024][定義]
[0025]“擴增”或“擴增反應(yīng)”是指使用引物組反復(fù)復(fù)制模板核酸，包含延伸工序和擴增工序等工序。擴增基本上可以是能夠使用包含2種引物、例如正向引物和反向引物的引物組復(fù)制模板核酸的、其本身公知的任何方法。例如，優(yōu)選PCR擴增方法、LCR擴增方法、RCA擴增方法、TMA擴增方法、NASBA擴增方法、SDA擴增方法和ICAN擴增方法。另外，根據(jù)需要，可以與該擴增反應(yīng)同時組合進行使用逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。同時進行擴增反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的技術(shù)可以利用 其本身公知的任何技術(shù)。
[0026]“核酸”是概括地表示DNA、RNA、PNA、LNA、S-寡核苷酸、膦酸甲酯寡核苷酸等可以將其一部分結(jié)構(gòu)用堿基序列表示的物質(zhì)的術(shù)語。例如，核酸可以是來源于天然的DNA和RNA等、一部分或完全人工合成和/或設(shè)計的人工核酸等、以及它們的混合物等。
[0027]“樣本”是指應(yīng)按照本實施方式進行分析方法的對象，只要是可能包含核酸的樣品就可以。樣本優(yōu)選是不妨礙擴增反應(yīng)和/或雜交反應(yīng)的狀態(tài)。例如，為了將從生物體等獲得的材料作為按照本實施方式的樣本使用，可以通過其本身公知的任何手段進行前處理。例如,樣本可以是液體。
[0028]將樣本所含的核酸稱為“受檢核酸”。將樣本核酸中包含要與引物退火而進行復(fù)制的多核苷酸的核酸稱為“模板”。將模板中由引物組所含的2種引物所規(guī)定的部分稱為“模板核酸”。進而對于“模板核酸”，將除了引物的結(jié)合區(qū)域(也稱為“退火區(qū)域”)以外的區(qū)域在這里稱為“模板序列”。
[0029]“目標序列”是要使用核酸探針進行檢出或定量的序列。
[0030]“目標核酸”是包含目標序列的核酸，且是指在由引物從模板核酸復(fù)制出的核酸中的包含目標序列的核酸。在利用引物的復(fù)制是延伸的情況下，是包含目標序列的延伸產(chǎn)物，在利用引物的復(fù)制是擴增的情況下，是指包含目標序列的“擴增產(chǎn)物”。另外，也將“延伸產(chǎn)物”和“擴增產(chǎn)物”稱為“復(fù)制鏈”。
[0031]“核酸探針”是包含相對于目標序列為互補的序列的核酸。核酸探針可以以游離的狀態(tài)使用，也可以固定化于其本身公知的固相。優(yōu)選的核酸探針被固定化于基體表面而使用。包含這樣的基體、和被固定化于基體的核酸探針的裝置一般可以通過DNA芯片來進行。
[0032]“DNA芯片”是利用具有與要檢出的核酸互補的序列的核酸探針、和檢出對象核酸之間的雜交反應(yīng)，來分析核酸的裝置。DNA芯片的術(shù)語與一般使用的“核酸芯片”、“微陣列”和“DNA陣列”等用語同義，可以互換地使用。
[0033]“來源于模板序列的序列”(或“來源于模板序列的互補序列的序列”)，是指反映了關(guān)于在引物組分別與模板核酸(或其互補序列)退火之后、由這些引物所規(guī)定的模板序列(或其互補序列)所含的區(qū)域的序列的序列信息，即，關(guān)于堿基序列和/或其序列的方向等信息的序列。
[0034]“互補”和“互補鏈”可以在2個單鏈核酸彼此具有至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95%或100%的互補性的情況下使用?！巴础焙汀巴存湣笨梢栽?個單鏈核酸彼此具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%的同源性的情況下使用。
[0035](I)模板核酸
[0036]首先，在進行實施方式的核酸分析方法之前調(diào)制樣本。樣本只要是可能包含核酸、希望對于其中所含的核酸進行分析的對象即可。樣本需要在其中適當?shù)剡M行擴增反應(yīng)，因而根據(jù)需要可以對于從要分析的對象得到的粗樣本進行前處理而作為樣本，另外，在適合擴增反應(yīng)的情況下，也可以不進行前處理而將粗樣本直接作為樣本使用。
[0037]在樣本中存在具有要分析的序列的核酸的情況下，它們被作為最初的模板核酸使用。被作為模板核酸使用的受檢核酸可以是單鏈也可以是雙鏈。即使在假設(shè)對于單鏈的受檢核酸開始擴增的情況下，擴增過程中其互補鏈也被復(fù)制。因此，當初存在的模板核酸作為第I模板核酸發(fā)揮功能，被復(fù)制，在擴增過程中形成的該模板核酸的互補鏈作為第2模板核酸發(fā)揮功能。
[0038](2)莖環(huán)結(jié)構(gòu)體
[0039]莖環(huán)結(jié)構(gòu)體具有 例如在圖1中用符號110表不的分子內(nèi)結(jié)構(gòu),具有單鏈環(huán)部分和包含莖部分的雙鏈部分。
[0040]在本實施方式中，形成2種莖環(huán)結(jié)構(gòu)體。I種是前述的符號110所示的、具有存在于5’末端側(cè)的莖部分、與該莖部分的3’側(cè)鄰接的環(huán)部分、以及包含與該莖部分互補的序列的存在于3’末端側(cè)的雙鏈部分、和直鏈的單鏈部分的莖環(huán)結(jié)構(gòu)體(圖1)。另一種是符號115所示的莖環(huán)結(jié)構(gòu)體。該莖環(huán)結(jié)構(gòu)體含有:包含環(huán)部分的單鏈區(qū)域、和包含莖部分的雙鏈區(qū)域。這2種莖環(huán)結(jié)構(gòu)體可以通過使用包含針對I種模板核酸的正向引物和反向引物的I組引物組進行擴增反應(yīng)來獲得。
[0041](3)核酸分析法
[0042]對于作為實施方式的I例的核酸分析法進行說明。
[0043]成為分析的對象的樣本首先被正向引物和反向引物擴增。接著，使由此得到的擴增產(chǎn)物與包含特定的目標序列的互補序列的核酸探針反應(yīng)。進而，檢出核酸探針與擴增產(chǎn)物的雜交，和/或測定雜交量。基于該結(jié)果，可以對于樣本所含的受檢核酸得到序列信息。
[0044]另外，所分析的項目例如是基因表達量的測定、來源于病毒和/或細菌等的核酸等的定量、對于多態(tài)性的基因型的鑒定和/或突變有無的檢出等。但不限于這些。
[0045]<擴增工序>
[0046]在擴增工序中，選擇反映要在本分析中得到信息的指標核酸，基于此設(shè)計模板核酸。
[0047]應(yīng)被擴增的雙鏈核酸101包含第I模板核酸102和作為其互補鏈的第2模板核酸。第I模板核酸102包含位于3’端的第I序列103a、與第I序列103a的5’側(cè)鄰接的第I模板序列105a、和與第I模板序列105a的5，側(cè)鄰接且位于5，端的第2序列104a。第2模板核酸包含位于3’端的第3序列104b、與第3序列104b的5’側(cè)鄰接的第2模板序列105b、和與第2模板序列105b的5，側(cè)鄰接且位于5，端的第4序列103b。
[0048]為了擴增這樣的模板核酸，適宜選擇正向引物和反向引物。在圖1中，顯示第I引物106、和第2引物109。第I引物106和第2引物109哪一個都可以是正向引物也可以是反向引物。任一情況下都可以通過同樣的手續(xù)獲得同樣的擴增產(chǎn)物。
[0049]另外第I引物106包含與第I模板核酸102的第I序列103a互補的SI序列、和與SI序列的5’側(cè)鄰接且連接于5’端側(cè)的S2序列108。在擴增反應(yīng)中，第I引物106與第I序列103a結(jié)合而被延伸，由此形成延伸鏈110。這里，S2序列108設(shè)計成具有與第I模板核酸102所含的模板序列105a的一部分互補的序列那樣。
[0050]另一方面，第2引物109在擴增反應(yīng)中與第2模板核酸的第3序列104b結(jié)合而被延伸，由此形成延伸鏈(未圖示)。
[0051]第I引物106的延伸鏈110通過變性而分離出2條單鏈復(fù)制鏈，形成與第I引物的延伸鏈對應(yīng)的第I復(fù)制鏈110。第I復(fù)制鏈110在反應(yīng)液中自發(fā)地形成分子內(nèi)結(jié)構(gòu)。該分子內(nèi)結(jié)構(gòu)是莖環(huán)結(jié)構(gòu)。第I復(fù)制鏈110中，在包含來源于第I引物的S2序列的莖部分108，與其互補序列、即作為第I模板序列的互補序列105b的一部分的S2’序列之間，形成雙鏈區(qū)域。隨著該雙鏈區(qū)域的形成，單鏈的環(huán)部分111形成。環(huán)部分111可以包含來源于第I引物的SI序列、和第I模板序列的互補序列105b的一部分。
[0052]環(huán)部分111所含的來源于第I模板序列的互補序列105b的序列的長度，通過選擇第I引物的序列S2的序列來確定。即，根據(jù)S2序列相對于從第I序列103a的5’端在3’方向離開多遠的位置的序列互補，來決定最終得到的莖環(huán)結(jié)構(gòu)體的環(huán)部分所含的來源于模板序列的序列的長度。環(huán)部分的序列中，如后所述，被設(shè)計了通過核酸探針檢出的目標序列。通過使目標序列包含來源 于模板序列的序列，從而對于排除由于檢出來源于未反應(yīng)的引物的檢出信號而引起的假陽性的檢出結(jié)果是有利的。
[0053]換言之，可以通過將位于第I序列103a的5’端的5’偵彳、在用“S2’”表示的S2’序列的3’端的3’側(cè)存在的識別序列114的長度設(shè)定為多長，來選擇環(huán)部分所含的來源于模板序列的序列的長度。識別序列114可以與SI序列的至少一部分的序列一起作為目標序列而被核酸探針檢出。因此，進一步優(yōu)選為能夠識別為來源于模板序列的序列的長度。
[0054]這樣，在I種實施方式中的擴增工序中，記載了使作為復(fù)制鏈的莖環(huán)結(jié)構(gòu)體的環(huán)部分包含作為來源于模板序列的序列的識別序列，進而使要用核酸探針檢出的目標序列包含該識別序列的例子。然而，識別序列也可以不包含在環(huán)部分中。即，也可以以不存在識別序列、環(huán)部分不包含來源于識別序列的序列的方式設(shè)計引物組。例如，如果利用能夠檢出包含莖序列的雙鏈那樣的檢出原理，則可以利用其雙鏈序列的存在，來區(qū)別來源于未反應(yīng)的弓丨物的檢出信號和來源于擴增產(chǎn)物的信號，從而檢出。因此，識別序列未必是必須的。此時，包含莖序列的雙鏈部分具有某種程度的長度，比具有較短的長度更為有利。
[0055]例如，識別序列114可以為O個堿基以上、I個堿基以上、2個堿基以上、3個堿基以上、4個堿基以上、5個堿基以上、6個堿基以上、7個堿基以上、8個堿基以上、9個堿基以上、IO個堿基以上、11個堿基以上、12個堿基以上、13個堿基以上、13個堿基以上、14個堿基以上、15個堿基以上、20個堿基以上、25個堿基以上、30個堿基以上或35個堿基以上，又可以為50個堿基以下、40個堿基以下、35個堿基以下、30個堿基以下或25個堿基以下、20個堿基以下，也可以是將這些中任一下限值和上限值組合而得的范圍。優(yōu)選為20~80個堿基，更優(yōu)選為30~50個堿基。另外，該長度也可以考慮要分析的模板核酸的長度來選擇。
[0056]模板核酸的長度，根據(jù)要分析的模板核酸和要分析的序列、以及后述的檢出工序中的檢出原理等來適宜選擇即可。例如，可以為15個堿基以上、20個堿基以上、25個堿基以上、30個堿基以上、35個堿基以上、40個堿基以上、45個堿基以上、50個堿基以上、60個堿基以上、70個堿基以上、80個堿基以上、90個堿基以上、100個堿基以上、150個堿基以上、200個堿基以上、250個堿基以上、300個堿基以上、400個堿基以上、500個堿基以上、600個堿基以上、800個堿基以上、900個堿基以上或1000個堿基以上，可以為1500個堿基以下、1000個堿基以下、900個堿基以下、800個堿基以下、700個堿基以下、600個堿基以下、500個堿基以下、400個堿基以下、300個堿基以下、200個堿基以下、150個堿基以下、100個堿基以下、90個堿基以下、80個堿基以下、70個堿基以下、65個堿基以下、60個堿基以下、55個堿基以下、50個堿基以下、45個堿基以下、40個堿基以下、35個堿基以下、30個堿基以下、25個堿基以下、20個堿基以下或15個堿基，也可以是將這些中任一下限值和上限值組合而得的范圍。優(yōu)選為50~1000個 堿基，更優(yōu)選為100~300個堿基。
[0057]另外，第I引物的長度，根據(jù)要分析的模板核酸和要分析的序列、以及后述的檢出工序中的檢出原理等來適宜選擇即可。第I引物的長度例如，可以為2個堿基以上、3個堿基以上、4個堿基以上、5個堿基以上、6個堿基以上、7個堿基以上、8個堿基以上、9個堿基以上、10個堿基以上、11個堿基以上、12個堿基以上、13個堿基以上、13個堿基以上、14個堿基以上、15個堿基以上、20個堿基以上、25個堿基以上、30個堿基以上、35個堿基以上、40個堿基以上、45個堿基以上、50個堿基以上、60個堿基以上、70個堿基以上、80個堿基以上、90個堿基以上、100個堿基以上、110個堿基以上、120個堿基以上、150個堿基以上或200個堿基以上，又可以為200個堿基以下、150個堿基以下、130個堿基以下、120個堿基以下、110個堿基以下、100個堿基以下、90個堿基以下、80個堿基以下、70個堿基以下、60個堿基以下、50個堿基以下、40個堿基以下、35個堿基以下、30個堿基以下或25個堿基以下、20個堿基以下，也可以是將這些中任一下限值和上限值組合而得的范圍。優(yōu)選為20~100個堿基，更優(yōu)選為30~60個堿基。或者，例如，第I引物的長度可以為13~40個堿基、例如15~30個堿基，也可以為16~47個堿基、例如18~37個堿基。
[0058]SI序列和S2序列的長度，分別可以為2個堿基以上、3個堿基以上、4個堿基以上、5個堿基以上、6個堿基以上、7個堿基以上、8個堿基以上、9個堿基以上、10個堿基以上、11個堿基以上、12個堿基以上、13個堿基以上、13個堿基以上、14個堿基以上、15個堿基以上、20個堿基以上、25個堿基以上、30個堿基以上、35個堿基以上、40個堿基以上、45個堿基以上、50個堿基以上、60個堿基以上、70個堿基以上，又可以為80個堿基以下、75個堿基以下、70個堿基以下、65個堿基以下、60個堿基以下、55個堿基以下、50個堿基以下、45個堿基以下、40個堿基以下、35個堿基以下、30個堿基以下或25個堿基以下、20個堿基以下，也可以是將這些中任一下限值和上限值組合而得的范圍。優(yōu)選為10~50個堿基，更優(yōu)選為15~30個堿基。
[0059]另外，第2引物的長度，例如，可以為2個堿基以上、3個堿基以上、4個堿基以上、5個堿基以上、6個堿基以上、7個堿基以上、8個堿基以上、9個堿基以上、10個堿基以上、11個堿基以上、12個堿基以上、13個堿基以上、13個堿基以上、14個堿基以上、15個堿基以上、20個堿基以上、25個堿基以上、30個堿基以上、35個堿基以上、40個堿基以上、45個堿基以上、50個堿基以上、55個堿基以上、60個堿基以上、65個堿基以上、70個堿基以上、80個堿基以上、90個堿基以上、100個堿基以上、110個堿基，又可以為150個堿基以下、120個堿基以下、110個堿基以下、100個堿基以下、90個堿基以下、80個堿基以下、70個堿基以下、60個堿基以下、50個堿基以下、40個堿基以下、35個堿基以下、30個堿基以下或25個堿基以下、20個堿基以下、15個堿基以下、IO個堿基以下，也可以是將這些中任一下限值和上限值組合而得的范圍。優(yōu)選為10~100個堿基，更優(yōu)選為15~60個堿基?；蛘撸?，第2引物的長度可以為13~40個堿基、例如15~30個堿基，也可以為16~47個堿基、例如
18~37個堿基。
[0060]具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的復(fù)制鏈的長度，根據(jù)要分析的模板核酸和要分析的序列、以及后述的檢出工序中的檢出原理等來適宜選擇即可。雖然不限于此，但例如，可以為約5個堿基以上、約10個堿基以上、約15個堿基以上、約20個堿基以上、約30個堿基以上、約35個堿基以上、約40個堿基以上、約45個堿基以上、約50個堿基以上、約55個堿基以上、約60個堿基以上或約65個堿基以上，又可以為約100個堿基以下、約95個堿基以下、約90個堿基以下、約85個堿基以下、約80個堿基以下、約75個堿基以下、約70個堿基以下、約65個堿基以下、約60個堿基以下、約55個堿基以下、約50個堿基以下、約45個堿基以下、約40個堿基以下、約35個堿基以下、約30個堿基以下、約25個堿基以下或約20個堿基以下，可以是將這些下限和上限的任一值組合而得的長度。例如，可以為約10個堿基~約80個堿基、約10個堿基~約60個堿基、約20個堿基~80個堿基、約20個堿基~60個堿基。例如，以能得到所需的分子內(nèi)結(jié)構(gòu)的方式設(shè)計即可。
[0061]另外，莖環(huán)結(jié)構(gòu)體中的包含莖部分的雙鏈的長度，根據(jù)要分析的模板核酸和要分析的序列、以及后述的 檢出工序中的檢出原理等來適宜選擇即可。雖然不限于此，但例如，可以為約5個堿基以上、約10個堿基以上、約15個堿基以上、約20個堿基以上、約30個堿基以上、約35個堿基以上、約40個堿基以上、約45個堿基以上、約50個堿基以上、約55個堿基以上、約60個堿基以上或約65個堿基以上、約70個堿基以上、約75個堿基以上、約80個堿基以上、約90個堿基以上、約100個堿基以上、約110個堿基以上、約120個堿基以上、約130個堿基以上、約140個堿基以上、約150個堿基以上、約200個堿基以上、約300個堿基以上、約500個堿基以上、約800個堿基以上、約1000個堿基以上，又可以為約1800個堿基以下、約1500個堿基以下、約1300個堿基以下、約1200個堿基以下、約1100個堿基以下、約1000個堿基以下、約900個堿基以下、約800個堿基以下、約700個堿基以下、約600個堿基以下、約500個堿基以下、約400個堿基以下、約350個堿基以下、約300個堿基以下、約250個堿基以下、約200個堿基以下、約150個堿基以下、約100個堿基以下、約95個堿基以下、約90個堿基以下、約85個堿基以下、約80個堿基以下、約75個堿基以下、約70個堿基以下、約65個堿基以下、約60個堿基以下、約55個堿基以下、約50個堿基以下、約45個堿基以下、約40個堿基以下、約35個堿基以下、約30個堿基以下、約25個堿基以下或約20個堿基以下，可以是將這些下限和上限的任一值組合而得的長度。優(yōu)選為10~1000個堿基，更優(yōu)選為15~300個堿基。
[0062]進而，莖環(huán)結(jié)構(gòu)體中的單鏈環(huán)部分的長度，根據(jù)要分析的模板核酸和要分析的序列、以及后述的檢出工序中的檢出原理等來適宜選擇即可。雖然不限于此，但例如，可以為約3個堿基以上、約4個堿基以上、約5個堿基以上、約6個堿基以上、約7個堿基以上、約8個堿基以上、約9個堿基以上、約10個堿基以上、約11個堿基以上、約12個堿基以上、約13個堿基以上、約14個堿基以上、約15個堿基以上、約20個堿基以上、約30個堿基以上、約35個堿基以上、約40個堿基以上、約45個堿基以上、約50個堿基以上、約55個堿基以上、約60個堿基以上或約65個堿基以上、約70個堿基以上、約80個堿基以上、約90個堿基以上、約100個堿基以上、約110個堿基以上、約120個堿基以上、約130個堿基以上、約140個堿基以上、約150個堿基以上、約160個堿基以上、約170個堿基以上、約180個堿基以上、約190個堿基以上、約200個堿基以上或約250個堿基以上，又可以為約300個堿基以下、約250個堿基以下、約200個堿基以下、約190個堿基以下、約180個堿基以下、約170個堿基以下、約160個堿基以下、約150個堿基以下、約140個堿基以下、約130個堿基以下、約120個堿基以下、約110個堿基以下、約100個堿基以下、約95個堿基以下、約90個堿基以下、約85個堿基以下、約80個堿基以下、約75個堿基以下、約70個堿基以下、約65個堿基以下、約60個堿基以下、約55個堿基以下、約50個堿基以下、約45個堿基以下、約40個堿基以下、約35個堿基以下、約30個堿基以下、約25個堿基以下、約20個堿基以下、約15個堿基以下或約10個堿基以下、約8個堿基以下，可以是將這些下限和上限的任一值組合而得的長度。優(yōu)選為10~200個堿基，更優(yōu)選為15~60個堿基。
[0063]另外，在本擴增反應(yīng)中，通過以擴增工序所得的復(fù)制鏈作為模板核酸進一步重復(fù)擴增工序，可以得到進一步的復(fù)制鏈。詳細在后述，即，作為與第2引物的延伸鏈對應(yīng)的第2復(fù)制鏈，得到圖1的右側(cè)倒數(shù)第2段所記載的復(fù)制鏈112。本復(fù)制鏈112包含3’末端的與S2序列互補的S2’序列113、與S2’序列113的5’側(cè)鄰接的與SI序列互補的SI，序列103a、與SI’序列103a的5’側(cè)鄰接的第I模板序列的互補序列105a、和與第I模板序列的互補序列105a的5’側(cè)鄰接的第2引物序列109。該第2復(fù)制鏈與第I復(fù)制鏈110同樣地形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。即，S2’序列 113與作為S2’序列113的互補序列的、第I模板序列的互補序列105a的一部分的序列結(jié)合，其結(jié)果形成環(huán)部分114。另外特別地，第2復(fù)制鏈通過在反應(yīng)場存在的聚合酶而3’末端被進一步延伸。由此，莖部分113沿著其互補鏈延伸，得到包含更長的莖部分的雙鏈。
[0064]圖2顯示使用第I引物作為正向引物206、使用第2引物作為反向引物209時的擴增例。特別地，是以模板核酸的正鏈和負鏈明確的方式記載的圖。圖1中的Si序列記載為“F1序列”、S2序列記載為“F2序列”、S3序列記載為“BI序列”，以及第I模板核酸為負鏈(對應(yīng)的各序列帶有“㈠”的記號)、第2模板核酸為正鏈(對應(yīng)的各序列帶有“(+ ) ”的記號)，除此以外，與圖1同樣地開始、進行擴增反應(yīng)。
[0065]圖3是特別地以模板核酸的正鏈和負鏈明確的方式記載了使用第I引物作為反向引物306、使用第2引物作為正向引物309時的擴增。圖1中的SI序列記載為“BI序列”、S2序列記載為“B2序列”、S3序列記載為“F1序列”，以及第I模板核酸為正鏈(對應(yīng)的各序列帶有“(+ ) ”的記號)、第2模板核酸為負鏈(對應(yīng)的各序列帶有“(_) ”的記號)，除此以外，與圖1同樣地開始、進行擴增反應(yīng)。
[0066]圖4顯示與第I引物具有SI序列和S2序列同樣地，第2引物中除了 S3序列之外在其5’端側(cè)具有S4序列的實施方式。具體地，第I引物被作為正向引物使用，包含與SI序列對應(yīng)的Fl序列、和與S2序列對應(yīng)的F2序列。第2引物被作為反向引物使用，包含與S3序列對應(yīng)的BI序列、和與S4序列對應(yīng)的B2序列。[0067]各個擴增工序與圖1同樣地進行，但與在圖1的擴增反應(yīng)中得到2種莖環(huán)結(jié)構(gòu)體相對，在圖4的擴增反應(yīng)中得到共計4種莖環(huán)結(jié)構(gòu)體。其中2種與圖1同樣地，由與第I引物的延伸鏈對應(yīng)的第I復(fù)制鏈和與第2引物的延伸鏈對應(yīng)的第2復(fù)制鏈構(gòu)成。另外2種由在圖3所示的擴增工序中得到的與第I引物的延伸鏈對應(yīng)的第I復(fù)制鏈和與第2引物的延伸鏈對應(yīng)的第2復(fù)制鏈構(gòu)成。
[0068]圖5是顯示圖1的與第2引物的延伸鏈對應(yīng)的復(fù)制鏈的形成過程的圖。作為將圖1進行了更具體的記載的圖2的反應(yīng)的持續(xù)擴增過程記載。圖5中作為最初的模板使用的復(fù)制鏈，在圖2中是與正向引物206的延伸鏈對應(yīng)的復(fù)制鏈210。在圖5中，與延伸鏈210結(jié)合的反向引物209延伸而生成延伸鏈502。延伸鏈502依賴于其序列而形成自發(fā)的分子內(nèi)結(jié)構(gòu)，從而形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)體505。莖環(huán)結(jié)構(gòu)體505包含3’端的F2’序列(這是“F2序列”的互補序列)、與F2’序列的5’端側(cè)鄰接的F1’序列(這是“F1序列”的互補序列)、與F1’序列的5’端側(cè)鄰接的負鏈的模板序列、和與負鏈的模板序列的5’端側(cè)鄰接的BI序列。F2’序列具有與負鏈的模板序列的一部分互補的序列，因而在同一鏈上生成分子內(nèi)結(jié)合，由此形成包含莖部分的雙鏈區(qū)域和包含環(huán)部分的單鏈區(qū)域。進而，莖環(huán)結(jié)構(gòu)體505的3’末端被反應(yīng)液中的聚合酶進一步延伸。通過其延伸，除了環(huán)部分508以外的區(qū)域全部變成雙鏈。
[0069]圖6與圖5同樣地顯示除了莖環(huán)結(jié)構(gòu)體的環(huán)部分以外的區(qū)域全部為雙鏈的進一步的復(fù)制鏈的形成過程。在圖6中，使用圖3所示的反向引物308的延伸鏈311作為最初的模板核酸。在圖6中，與延伸鏈311結(jié)合的正向引物309被延伸，生成延伸鏈602。延伸鏈602形成自發(fā)的分子結(jié)構(gòu),從而形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)體605。莖環(huán)結(jié)構(gòu)體605具有3’端的B2’序列(這是“B2序列”的互補序列)、與B2’序列的5’端側(cè)鄰接的BI’序列(這是“BI序列”的互補序列)、與BI ’序列的5’端側(cè)鄰接的正鏈的模板序列、和與正鏈的模板序列的5’端側(cè)鄰接的Fl序列。BI’序列具有與正鏈的模板序列的一部分互補的序列，因而在同一鏈上生成分子內(nèi)結(jié)合，由此形成包含莖部分的雙鏈區(qū)域和包含環(huán)部分的單鏈區(qū)域。進而莖環(huán)結(jié)構(gòu)體605的3’末端被進一步延伸。通過該延伸，莖環(huán)結(jié)構(gòu)體606除了環(huán)部分607以外的區(qū)域全部變成雙鏈。
[0070]<引物組>
[0071]實施方式中使用的引物組，只要包含通過2種引物而實現(xiàn)擴增的在其本身公知的任何擴增反應(yīng)中使用的2種引物、即第I引物和第2引物即可。
[0072]在PCR擴增的情況下，第I引物是正向引物或反向引物即可。在第I引物是正向引物的情況下，第2引物是反向引物即可。另外，在第I引物是反向引物的情況，第2引物是正向引物即可。
[0073]例如，在應(yīng)被擴增的核酸包含第I模板核酸和第2模板核酸，
[0074]第I模板核酸包含位于3’端的第I序列、與該第I序列的5’側(cè)鄰接的第I模板序列、與該第I模板序列的5’側(cè)鄰接且位于5’端的第2序列，并且
[0075]第2模板核酸是第I模板核酸的互補鏈，包含位于其3’端的第3序列、與該第3序列的5’側(cè)鄰接的第2模板序列、和與該第2模板序列的5’側(cè)鄰接且位于5’端的第4序列的情況下，
[0076]第I引物和第2引物是如下的構(gòu)成即可。
[0077][例I][0078]第I引物包含作為第I序列的互補序列的SI序列、和與SI序列的5’端側(cè)連接的
S2序列。S2序列是作為第I模板序列的至少一部分的、與第I序列的5’側(cè)鄰接或位于第I序列的5’側(cè)的附近的序列。
[0079]第2引物包含作為第3序列的互補序列的S3序列。
[0080]使用這樣的引物擴增模板核酸時得到的擴增產(chǎn)物的一部分是莖環(huán)結(jié)構(gòu)體。該莖環(huán)結(jié)構(gòu)體具有如下的2種構(gòu)成。
[0081]與第I引物的延伸鏈對應(yīng)的第I復(fù)制鏈，在其同一鏈上形成第I莖環(huán)結(jié)構(gòu)體，該第I莖環(huán)結(jié)構(gòu)體含有:包含第I莖部分的第I雙鏈區(qū)域和構(gòu)成第I環(huán)部分的第I單鏈區(qū)域。第I雙鏈區(qū)域包含來源于S2序列的第I莖部分和與該第I莖部分互補的來源于第I模板序列的互補序列的序列。構(gòu)成第I環(huán)部分的第I單鏈區(qū)域包含Si序列、和任意與該SI序列的3’側(cè)鄰接的來源于第I模板序列的互補序列的序列。這里，在第I引物中，S2序列與第I序列的5’側(cè)鄰接的情況下，構(gòu)成第I環(huán)部分的第I單鏈區(qū)域可以在SI序列的3’側(cè)不包含來源于第I模板序列的互補序列的序列。
[0082]與第2引物的延伸鏈對應(yīng)的第2復(fù)制鏈，在其同一鏈上形成第2莖環(huán)結(jié)構(gòu)體，該第2莖環(huán)結(jié)構(gòu)體含有:包含第2莖部分的第2雙鏈區(qū)域和構(gòu)成第2環(huán)部分的第2單鏈區(qū)域。第2雙鏈區(qū)域包含來源于S2序列的互補序列的第2莖部分和與該第2莖部分互補的來源于第2模板序列的互補序列的序列。構(gòu)成第2環(huán)部分的第2單鏈區(qū)域包含SI序列的互補序列、和任意與該SI序列的互補序列的5’側(cè)鄰接的來源于第2模板序列的互補序列的序列。這里，在第I引物中，S2序列與第I序列的5’側(cè)鄰接的情況下，構(gòu)成第2環(huán)部分的第2單鏈區(qū)域可以在SI序列的5’側(cè)不包含來源于第2模板序列的互補序列的序列。
[0083][例2]
[0084]或者，第I引物和第2引物也可以是如下的構(gòu)成。
[0085]所述第I引物包含作為第I序列的互補序列的SI序列、和與SI序列的5’側(cè)連接的S2序列。S2序列是作為第I模板序列的至少一部分的、與第I序列的5’側(cè)鄰接或位于第I序列的5’側(cè)的附近的序列。
[0086]第2引物包含作為所述第3序列的互補序列的S3序列、和與S3序列的5’側(cè)連接的S4序列。S4序列是作為第2模板序列的至少一部分的、與第3序列的5’側(cè)鄰接或位于第3序列的5 ’側(cè)的附近的序列。
[0087]使用這樣的引物擴增模板核酸時得到的擴增產(chǎn)物的一部分是莖環(huán)結(jié)構(gòu)體。該莖環(huán)結(jié)構(gòu)體具有如下的4種構(gòu)成。
[0088]與第I引物的延伸鏈對應(yīng)的第I復(fù)制鏈，在其同一鏈上形成第I莖環(huán)結(jié)構(gòu)體，該第I莖環(huán)結(jié)構(gòu)體含有:包含第I莖部分的第I雙鏈區(qū)域和構(gòu)成第I環(huán)部分的第I單鏈區(qū)域。第I雙鏈區(qū)域包含來源于S2序列的第I莖部分和與該第I莖部分互補的來源于第I模板序列的互補序列的序列。構(gòu)成第I環(huán)部分的第I單鏈區(qū)域包含Si序列、和任意與該SI序列的3’側(cè)鄰接的來源于第I模板序列的互補序列的序列。這里，在S2序列與第I序列的5’側(cè)鄰接的情況下，構(gòu)成第I環(huán)部分的第I單鏈區(qū)域可以在SI序列的3’側(cè)不包含來源于第I模板序列的互補序列的序列。
[0089]與第I引物的延伸鏈對應(yīng)的第2復(fù)制鏈，在其同一鏈上形成第2莖環(huán)結(jié)構(gòu)體，該第2莖環(huán)結(jié)構(gòu)體含有:包含第2莖部分的第2雙鏈區(qū)域和構(gòu)成第2環(huán)部分的第2單鏈區(qū)域。第2雙鏈區(qū)域包含來源于S4序列的互補序列的第2莖部分和與該第2莖部分互補的來源于第I模板序列的互補序列的序列。構(gòu)成第2環(huán)部分的第2單鏈區(qū)域包含S3序列的互補序列、和任意與該S3序列的互補序列的5’側(cè)鄰接的來源于第I模板序列的互補序列的序列。這里，在S4序列與第3序列的5’側(cè)鄰接的情況下，構(gòu)成第2環(huán)部分的第2單鏈區(qū)域可以在
S3序列的5’側(cè)不包含來源于第I模板序列的互補序列的序列。
[0090]與第2引物的延伸鏈對應(yīng)的第3復(fù)制鏈，在其同一鏈上形成第3莖環(huán)結(jié)構(gòu)體，該第3莖環(huán)結(jié)構(gòu)體含有:包含第3莖部分的第3雙鏈區(qū)域和構(gòu)成第3環(huán)部分的第3單鏈區(qū)域。第3雙鏈區(qū)域包含來源于S4序列的第3莖部分和與該第3莖部分互補的來源于第2模板序列的互補序列的序列。構(gòu)成第3環(huán)部分的第3單鏈區(qū)域包含S3序列、和任意與該S3序列3’側(cè)鄰接的來源于第2模板序列的互補序列的序列。這里，在S4序列與第3序列的5’側(cè)鄰接的情況下，構(gòu)成第3環(huán)部分的第3單鏈區(qū)域可以在S3序列的3’側(cè)不包含來源于第2模板序列的互補序列的序列。
[0091]與第2引物的延伸鏈對應(yīng)的第4復(fù)制鏈，在其同一鏈上形成第4莖環(huán)結(jié)構(gòu)體，該第4莖環(huán)結(jié)構(gòu)體含有:包含第4莖部分的第4雙鏈區(qū)域和構(gòu)成第4環(huán)部分的第4單鏈區(qū)域。第4雙鏈區(qū)域包含來源于S2序列的互補序列的第4莖部分和與該第4莖部分互補的來源于所述第2模板序列的互補序列的序列。構(gòu)成第4環(huán)部分的第4單鏈區(qū)域包含SI序列的互補序列、和任意與該SI序列的互補序列的5’側(cè)鄰接的來源于第2模板序列的互補序列的序列。在S2序列與第I序列的5’側(cè)鄰接的情況下，構(gòu)成第4環(huán)部分的第4單鏈區(qū)域可以在SI序列的互補序列的5’側(cè)不包含來源于第2模板序列的互補序列的序列。
[0092]<檢出工序>
[0093]接著模板核酸 的擴增之后，檢出上述的擴增工序所得的擴增產(chǎn)物中目的序列是否存在，或以怎樣程度的量存在。
[0094]檢出使用核酸探針來進行。核酸探針包含要檢出的目標序列的互補序列。在本核酸分析法中，應(yīng)被核酸探針檢出的目標序列，設(shè)計成包含在上述的擴增產(chǎn)物中的莖環(huán)結(jié)構(gòu)體的環(huán)部分中那樣即可。
[0095]檢出通過使固定化于基體上的核酸探針與擴增產(chǎn)物雜交來進行。然后，通過適宜的檢出法來檢出擴增產(chǎn)物與核酸探針的雜交。
[0096]<核酸探針>
[0097][例I]
[0098]在使用上述的〈引物組〉的項目的[例I]所記載的引物組的情況下，例如，可以使用如下的2種核酸探針、即第I核酸探針和/或第2核酸探針。
[0099]第I核酸探針可以包含第I復(fù)制鏈的構(gòu)成第I環(huán)部分的第I單鏈區(qū)域的至少一部分的序列。這樣的第I核酸探針可以在第I核酸探針的5’側(cè)進一步任意包含相對于來源于與所述一部分的序列的3’側(cè)鄰接的第I模板序列的互補序列的序列的至少一部分的序列為互補的序列。或者，第I核酸探針可以包含作為第I復(fù)制鏈的構(gòu)成第I環(huán)部分的第I單鏈區(qū)域的至少一部分的序列的、SI序列的至少一部分的序列。這樣的第I核酸探針還可以在第I核酸探針的5’側(cè)進一步任意包含相對于來源于與所述一部分的序列的3’側(cè)鄰接的第I模板序列的互補序列的序列的至少一部分的序列為互補的序列。這里，在第I引物中，S2序列與第I序列的5’側(cè)鄰接的情況下，可以不包含相對于來源于第I模板序列的互補序列的序列的至少一部分的序列為互補的序列。
[0100]第2核酸探針可以包含第2復(fù)制鏈的構(gòu)成第2環(huán)部分的第2單鏈區(qū)域的至少一部分的序列。這樣的第2核酸探針還可以在第2核酸探針的3’側(cè)進一步任意包含相對于來源于與所述一部分的序列的5’側(cè)鄰接的所述第2模板序列的互補序列的序列的至少一部分的序列為互補的序列?；蛘?，第2核酸探針還可以包含作為第2復(fù)制鏈的構(gòu)成第2環(huán)部分的第2單鏈區(qū)域的至少一部分的序列的、SI序列的互補序列(即，SI’序列)的至少一部分的序列。這樣的第2核酸探針還可以在第2核酸探針的3’側(cè)進一步任意包含相對于來源于與所述一部分的序列的5’側(cè)鄰接的所述第2模板序列的互補序列的序列的至少一部分的序列為互補的序列。這里，在第I引物中，S2序列與第I序列的5’側(cè)鄰接的情況下，可以不包含相對于來源于第2模板序列的互補序列的序列的至少一部分的序列為互補的序列。
[0101]在使用上述的〈引物組〉的項目的[例2]所記載的引物組的情況下，例如，可以從如下的4種核酸探針，即第I核酸探針、第2核酸探針、第3核酸探針和第4核酸探針中的選擇至少I種核酸探針來使用。
[0102]第I核酸探針可以包含所述第I復(fù)制鏈的所述構(gòu)成第I環(huán)部分的第I單鏈區(qū)域的至少一部分的序列。這樣的第I核酸探針還可以在第I核酸探針的5’側(cè)進一步任意包含相對于來源于與所述一部分的序列的3’側(cè)鄰接的第I模板序列的互補序列的序列的至少一部分的序列為互補的序列?；蛘撸贗核酸探針可以包含作為所述第I復(fù)制鏈的所述構(gòu)成第I環(huán)部分的第I單鏈區(qū)域的至少一部分的序列的、SI序列的互補的序列的至少一部分的序列。這樣的第I核酸探針還可以在第I核酸探針的5’側(cè)進一步任意包含相對于來源于與所述一部分的序列的3’側(cè)鄰接的第I模板序列的互補序列的序列的至少一部分的序列為互補的序列。這里，這里，在S2序列與第I序列的5’側(cè)鄰接的情況下，可以不包含相對于來源于第I模板序列的互補序列的序列的至少一部分的序列為互補的序列。
[0103]第2核酸探針可以包含第2復(fù)制鏈的構(gòu)成第2環(huán)部分的第2單鏈區(qū)域的至少一部分的序列。這樣的第2核酸探針還可以在第2核酸探針的3’側(cè)進一步任意包含相對于來源于與所述一部分的序列的5’側(cè)鄰接的第I模板序列的互補序列的序列的至少一部分的序列為互補的序列?；蛘撸?核酸`探針還可以包含作為第2復(fù)制鏈的構(gòu)成第2環(huán)部分的第2單鏈區(qū)域的至少一部分的序列的、S3序列的至少一部分的序列。這樣的第2核酸探針還可以在第2核酸探針的3’側(cè)進一步任意包含相對于來源于與所述一部分的序列的5’側(cè)鄰接的第I模板序列的互補序列的序列的至少一部分的序列為互補的序列。這里，在S4序列與第3序列的5’側(cè)鄰接的情況下，可以不包含相對于來源于第I模板序列的互補序列的序列的至少一部分的序列為互補的序列。
[0104]第3核酸探針可以包含第3復(fù)制鏈的構(gòu)成第3環(huán)部分的第3單鏈區(qū)域的至少一部分的序列。這樣的第3核酸探針還可以在第3核酸探針的5’側(cè)進一步任意包含相對于來源于與所述一部分的序列的3’側(cè)鄰接的第2模板序列的互補序列的序列的至少一部分的序列為互補的序列。或者，第3核酸探針可以包含作為第3復(fù)制鏈的構(gòu)成第3環(huán)部分的第3單鏈區(qū)域的至少一部分的序列的、S3序列的互補的序列的至少一部的序列。這樣的第3核酸探針還可以在第3核酸探針的5’側(cè)進一步任意包含相對于來源于與所述一部分的序列的3’偵彳鄰接的第2模板序列的互補序列的序列的至少一部分的序列為互補的序列。這里，在S4序列與第3序列的5’側(cè)鄰接的情況下，可以不包含相對于來源于第2模板序列的互補序列的序列的至少一部分的序列為互補的序列。
[0105]第4核酸探針還可以包含第4復(fù)制鏈的構(gòu)成第4環(huán)部分的第4單鏈區(qū)域的至少一部分的序列。這樣的第4核酸探針還可以在第4核酸探針的3’側(cè)進一步任意包含相對于來源于與所述一部分的序列的5’側(cè)鄰接的第2模板序列的互補序列的序列的至少一部分的序列為互補的序列?；蛘?，第4核酸探針還可以包含作為第4復(fù)制鏈的構(gòu)成第4環(huán)部分的第4單鏈區(qū)域的至少一部分的序列的、SI序列的至少一部分的序列。這樣的第4核酸探針還可以在第4核酸探針的3’側(cè)進一步任意包含相對于來源于與所述一部分的序列的5’側(cè)鄰接的第2模板序列的互補序列的序列的至少一部分的序列為互補的序列。這里，在S2序列與第I序列的5’側(cè)鄰接的情況下，可以不包含相對于來源于第2模板序列的互補序列的序列的至少一部分的序列為互補的序列。
[0106]<DNA 芯片 >
[0107]本實施方式中使用的DNA芯片只要具備基體和被固定化于基體上的核酸探針即可。DNA芯片的基體可以是以電流檢出型為代表的電化學(xué)檢出型、螢光檢出型、化學(xué)顯色型和放射能檢出型等現(xiàn)有公知的任一種微陣列用的基體。
[0108]任一種微陣列都可以通過其本身公知的方法制造。例如，在電流檢出型微陣列的情況下，將陰性對照探針固定化區(qū)域和檢出用探針固定化區(qū)域分別配置在不同的電極上即可。
[0109]將DNA芯片的例子作為模式圖示于圖13，但不限于此。DNA芯片130在基體131上具備固定化區(qū)域132。核酸 探針133被固定化于該固定化區(qū)域132。這樣的DNA芯片130可以通過本領(lǐng)域公知的方法制造。配置于基體131的固定化區(qū)域132的數(shù)及其配置可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)需要適宜設(shè)計變更。這樣的DNA芯片可以優(yōu)選用于使用螢光的檢出方法。
[0110]將DNA芯片的其他例示于圖14。圖14的DNA芯片140在基體141上具備電極142。核酸探針143被固定化于該電極142。電極142與小塊144連接。介由小塊144獲得來自電極142的電信息。這樣的DNA芯片140可以通過本領(lǐng)域公知的方法來制造。配置于基體141的電極142的數(shù)及其配置可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)需要適宜設(shè)計變更。進而，本例的DNA芯片根據(jù)需要可以具備參照電極和對極。
[0111]電極可以使用像金、金的合金、銀、鉬、汞、鎳、鈀、硅、鍺、鎵或鎢那樣的金屬單質(zhì)和它們的合金，或者像石墨、玻碳那樣的碳或它們的氧化物或化合物，但不限于這些。
[0112]像本例這樣的DNA芯片可以適合用于電化學(xué)的檢出方法。
[0113]<雜交條件>
[0114]雜交在雜種能充分形成的適當條件下進行即可。適當條件根據(jù)目標核酸的種類和結(jié)構(gòu)、目標序列所含的堿基的種類、核酸探針的種類不同而不同。例如，可以在離子強度為0.01~5的范圍、pH值5~9的范圍的緩沖液中進行雜交。反應(yīng)溫度可以在10°C~90°C的范圍。可以通過攪拌和/或振蕩等來提高反應(yīng)效率。反應(yīng)溶液中可以添加像硫酸葡聚糖、鮭精子DNA、和牛胸腺DNA這樣的雜交促進劑、EDTA、或表面活性劑等。
[0115]<洗滌條件>
[0116]雜交后，用于洗滌DNA芯片的洗滌液適合使用離子強度為0.01~5的范圍、pH值5~9的范圍的緩沖液。洗滌液優(yōu)選包含鹽和表面活性劑等。例如，使用氯化鈉或檸檬酸鈉調(diào)制的SSC溶液、TriS-HCl溶液、Tween20溶液、或SDS溶液等是適合使用的。洗滌溫度例如在10°C~70°C的范圍進行。洗滌液通過或滯留于探針固定化基體的表面或固定化了核酸探針的區(qū)域?；蛘?，可以在洗滌液中浸潰DNA芯片。此時，洗滌液優(yōu)選收納于可以進行溫度控制的容器中。
[0117]<檢出方法>
[0118]由雜交工序所生成的雜種的檢出，可以利用螢光檢出方式和電化學(xué)的檢出方式。
[0119](a)螢光檢出方式
[0120]使用螢光標記物質(zhì)進行檢出。可以將核酸的擴增工序中使用的引物用像FITC、Cy3, Cy5、或羅丹明等螢光色素這樣的螢光活性的物質(zhì)進行標記。或者，也可以使用經(jīng)這些物質(zhì)標記后的第二探針。也可以同時使用多種標記物質(zhì)。通過檢出裝置，來檢出被標記后的序列或2次探針中的標記。根據(jù)所使用的標記使用適當?shù)臋z出裝置。例如，在使用螢光物質(zhì)作為標記的情況下，使用螢光檢出器進行檢出。
[0121](b)電化學(xué)的檢出方式
[0122]使用本領(lǐng)域公知的雙鏈識別物質(zhì)。雙鏈識別物質(zhì)可以從H0ECHST33258、吖啶橙、喹吖因、道諾霉素、金屬嵌入劑、雙吖啶等雙嵌入劑、三嵌入劑和多嵌入劑中選擇。進而，可以將這些雙鏈識別物質(zhì)用電化學(xué)活性的金屬絡(luò)合物、例如二茂鐵、紫精等修飾。
[0123]雙鏈識別物質(zhì)根據(jù)種類不同而不同，一般以Ing/mL~lmg/mL的范圍的濃度使用。此時，可以使用離子強度為0.001~5的范圍、pH值5~10的范圍的緩沖液。
[0124]測定中，例如施加大于等于雙鏈識別物質(zhì)進行電化學(xué)反應(yīng)的電位的電位，測定來源于雙鏈識別物質(zhì)的反應(yīng)電流值 。此時，電位可以以定速方式施加，或者以脈沖方式施加，或者可以施加定電位。還可以使用像恒電位儀、數(shù)字萬用表、和函數(shù)發(fā)生器這樣的裝置來控制電流、電壓。電化學(xué)的檢出可以通過本領(lǐng)域公知的方法來實施。
[0125]<檢測試劑盒>
[0126]本實施方式還可以是檢測試劑盒的方式。檢測試劑盒只要包含上述的任一實施方式的引物組和核酸引物即可，進一步還可以任意包含稀釋液、各種酶、反應(yīng)容器、操作說明書等。
[0127]實施例1
[0128]對于通過DNA芯片來檢出使用環(huán)形成引物進行擴增而得的產(chǎn)物方法所示的實施例進行詳述。
[0129](I)擴增
[0130]< 模板 >
[0131]模板使用導(dǎo)入了枯草桿菌序列的質(zhì)粒。枯草桿菌的序列在序列號I中顯示。
[0132]< 引物 >
[0133]作為擴增297bp 的通常 PCR 引物，準備 5’ -GGGAGCGAACAGGATTAGATACC-3’ (F引物、序列號2)、5’ -CTGACGACAACCATGCACC-3’(R引物、序列號3)，作為擴增322bp 的通常 PCR 引物，準備 5’ -GTAGGTGGCAAGCGTTGTCC-3’(F 引物、序列號 4)、5’-AGCACTAAGGGGCGGAAACC-3’ (R引物、序列號5)。引物位置示于圖7。另外作為莖短的環(huán)形成 297bp 目標擴增用，準備 5’-CCCTAACACTTAGCACTCATCGTT-GGGAGCGAACAGGATTAGATACC-3’ (F 引物、序列號 6)、5’ -GAAACCCCCTAACACTTAGC-GGGAGCGAACAGGATTAGATACC-3’(F 引物、序列號 7)、5’ -AGCACTAAGGGGCGGAAACC-GGGAGCGAACAGGATTAGATACC-3，(F 引物、序列號 8)。
[0134]R引物使用與通常PCR引物同樣的引物(序列號3)。進而，作為莖長的環(huán)形成322bp 目標擴增用，準備 5’ -GGTAGTCCACGCCGTAAACG-AGCACTAAGGGGCGGAAACC-3’(R 引物、序列號 9)、5’ -ATTAGATACCCTGGTAGTCCAC-AGCACTAAGGGGCGGAAACC-3’ (R 引物、序列號 10)、5’ -GGAGCGAACAGGATTAGATACCCT-AGCACTAAGGGGCGGAAACC-3’ (R 引物、序列號 11)，F(xiàn) 引物使用與通常PCR引物同樣的引物(序列號4)。序列號6、7、8、9、10和11的單鏈環(huán)長度分別為42bp、52bp、66bp、40bp、50bp、60bp。
[0135]<擴增>
[0136]擴增使用KAPA2G Fast DNA試劑盒(ΚΑΡΑ Biosystems社制)，在95°C I分鐘的熱變性之后,將95°C 5秒一650C 5秒進行40個循環(huán)。擴增裝置在GeneAmp PCR9700 (AppliedBiosystems)中進行。擴增時間為47分鐘左右。擴增后，通過電泳確認擴增產(chǎn)物。
[0137](2)芯片檢出
[0138]<檢出探針>
[0139]為了對(I)中擴增的枯草桿菌的擴增產(chǎn)物進行芯片檢出，準備5’_ACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACT-3’(序列號 17)、5 ’-CTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAG-3 ’(序列號18)的2種長度不同的負鏈的探針。探針位置示于圖7。另外，作為陰性對照，準備顯示與枯草桿菌無關(guān)的序列的5’ -TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCA-3’ (序列號19)。以上的探針為了固定化于金電極，而將3’末端側(cè)進行硫醇修飾。
[0140]<探針固定化電極的制作>
[0141]探針的固定化利用硫醇與金的強的共價結(jié)合性來進行。將含ImM巰基己醇溶液的探針溶液點樣在金電極上，使其干燥。同一探`針點樣各4電極。干燥后，用超純水洗滌、風(fēng)干，得到探針固定化電極。
[0142]< 雜交 >
[0143]將(I)中得到的擴增產(chǎn)物在95°C進行5分熱變性后，添加2XSSC的鹽，將該溶液浸潰于如上所述制作的探針固定化電極中，在64°C靜置5分鐘，進行雜交。然后，將探針固定化電極在0.2 X SSC溶液中在25 °C浸潰I分鐘進行洗滌。接著，將探針固定化電極在包含作為嵌入劑的H0ECHST33258溶液50 μ M的PIPES緩沖液中浸潰I分鐘。然后，測定H0ECHST33258溶液的氧化電流應(yīng)答。
[0144](3)結(jié)果
[0145]圖8顯示電泳結(jié)果。用通常的PCR引物擴增而得的產(chǎn)物和用環(huán)形成引物擴增而得的產(chǎn)物，均在目的的區(qū)域確認了條帶。對于環(huán)形成引物產(chǎn)物，有多個條帶，啟示形成了多種結(jié)構(gòu)的目標結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物。圖9顯示芯片檢出結(jié)果。對于用通常PCR引物擴增而得的產(chǎn)物，未發(fā)現(xiàn)信號增加。另一方面，對于用環(huán)形成引物擴增而得的產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)了信號增加。進而，與莖部分短的擴增產(chǎn)物相比，在檢出了莖部分長的擴增產(chǎn)物的情況下，更加穩(wěn)定地檢出了高信號增加。關(guān)于環(huán)長度，至40bp~60bp確認了充分的信號增加。另外對于添加了 TE代替模板的Negative(陰性)產(chǎn)物，確認了沒有信號增加。
[0146]實施例2
[0147]作為通過DNA芯片來檢出使用環(huán)形成引物進行擴增而得的產(chǎn)物的方法的進一步應(yīng)用例，進行了不同的目標長度、不同的高速PCR酶的研究。進而進行了 F引物、R引物兩者為環(huán)形成引物的情況的研究。
[0148](I)擴增
[0149]< 模板 >
[0150]使用與實施例1同樣的模板。
[0151]< 引物 >
[0152]為了獲得顯示不同的目標長度的莖長的環(huán)形成目標，作為161bp目標用準備5’ -GCGTAGAGATGTGGAGGAAC-3，(F引物、序列號12)，作為322bp目標用準備5’ -GTAGGTGGCAAGCGTTGTCC-3’(F引物、序列號4)，作為51 Ibp目標用準備 5’ -AGGCAGCAGTAGGGAATCTTCC-3，(F 引物、序列號 13)，作為 734bp 目標用準備5 ’ -CCTGTAAGACTGGGATAACTCCG-3 ’(F引物、序列號14)。進而，為了獲得F弓丨物和R弓丨物兩者為環(huán)形成引物的情況的產(chǎn)物，作為161bp目標用準備5’-GCTCCTCAGCGTCAGTTACA-GCGTAGAGATGTGGAGGAAC-3’ (F 引物、序列號 15)、作為 322bp 目標用準備 5’-GCTTTCACATCAGACTTAAGGAACC-GTAGGTGGCAAGCGTTGTCC-3’ (F 引物、序列號 4)。R 引物全部通用 5’-ATTAGATACCCTGGTAGTCCAC-AGCACTAAGGGGCGGAAACC-3’(序列號 10)。
[0153]<擴增> [0154]擴增使用(I)中所使用的KAPA2G Fast、和 Takara SpeedSTAR? HS DNA 聚合酶(TAKARA Bio社制)、Phire Hot Start II DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific社制)。
[0155]反應(yīng)條件通過與實施例1同樣的方法進行。
[0156](2)芯片檢出
[0157]省略雜交前的擴增產(chǎn)物的熱處理。除此以外，通過與實施例1同樣的方法進行。
[0158](3)結(jié)果
[0159]圖10顯示目標長度不同的擴增產(chǎn)物的檢出結(jié)果?？梢婋S著目標長度變長，信號增加逐漸變低的傾向，但均可觀察到充分的信號增加。另外，即使在F和R引物兩者為環(huán)形成引物的情況下，也確認了充分的信號增加。進而，如圖11所示，在研究的3種高速PCR酶中全部確認了信號增加。
[0160]實施例3
[0161]作為通過DNA芯片來檢出使用環(huán)形成引物進行擴增而得的產(chǎn)物的方法的進一步應(yīng)用例，使用 RoboCycler Gradient96 (Stratagene 社制)和 UR104MKIII (Trust Medical社制)的旋轉(zhuǎn)式PCR裝置研究了擴增的短時間化。
[0162](I)擴增
[0163]< 模板 >
[0164]使用與實施例1同樣的模板。
[0165]< 引物 >
[0166]作為莖長的環(huán)形成166bp目標擴增用，使用5’ -GCGTAGAGATGTGGAGGAAC-3’ (F引物、序列號 12)、5’ -ATTAGATACCCTGGTAGTCCAC-AGCACTAAGGGGCGGAAACC-3’(R 引物、序列號10)。
[0167]<擴增>
[0168]擴增使用KAPA2G Fast DNA 試劑盒，對于 RoboCycler Gradient96，在 97°C I 分鐘的熱變性之后，將97°C 10秒一530C 10秒進行40個循環(huán)。擴增時間為18分30秒左右。對于UR104MKIII，制成酶量為推薦濃度的2倍的組成，在95°C I分鐘的熱變性之后，將95°C 4秒一650C 7秒進行40個循環(huán)。擴增時間為10分30秒左右。
[0169](2)芯片檢出
[0170]通過與實施例2同樣的方法進行。
[0171](3)結(jié)果
[0172]如圖12所示，顯示了對于用RoboCycler和UR104MKIII擴增而得的產(chǎn)物，能夠進行芯片檢出。
[0173]將上述實施例1~3中作為模板序列使用的枯草桿菌序列示于表1。
[0174]表1
[0175]序列號I 枯草桿菌序列
[0176]AGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAG GTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAA CCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTCCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGC
[0177]關(guān)于上述實施例1~3中使用的各引物的序列，在表2中記載。
[0178]表2
【權(quán)利要求】
1.核酸分析法，是對于樣本的核酸分析法， 應(yīng)被擴增的核酸包含第I模板核酸和第2模板核酸， 所述第I模板核酸包含位于3’端的第I序列、與該第I序列的5’側(cè)鄰接的第I模板序列、和與該第I模板序列的5’側(cè)鄰接且位于5’端的第2序列，以及 所述第2模板核酸是所述第I模板核酸的互補鏈，包含位于其3’端的第3序列、與該第3序列的5’側(cè)鄰接的第2模板序列、和與該第2模板序列的5’側(cè)鄰接且位于5’端的第4序列， 該核酸分析法具備以下(a_l)、(a-2)、(b)、(c)、(d)和(e)的工序: (a-Ι)準備用于擴增所述第I模板核酸和所述第2模板核酸的第I引物和第2引物， 這里， 所述第I引物包含作為所述第I序列的互補序列的SI序列、和與所述SI序列的5’端側(cè)連接的S2序列，所述S2序列是作為所述第I模板序列的至少一部分的與所述第I序列的5’側(cè)鄰接或位于所述第I序列的5’側(cè)的附近的序列，以及所述第2引物包含作為所述第3序列的互補序列的S3序列， 并且 與所述第I引物的延伸鏈對應(yīng)的第I復(fù)制鏈，在其同一鏈上形成第I莖環(huán)結(jié)構(gòu)體，該第I莖環(huán)結(jié)構(gòu)體含有:包含 第I莖部分的第I雙鏈區(qū)域、和構(gòu)成第I環(huán)部分的第I單鏈區(qū)域，所述第I雙鏈區(qū)域包含來源于所述S2序列的第I莖部分和與該第I莖部分互補的來源于所述第I模板序列的互補序列的序列，所述構(gòu)成第I環(huán)部分的第I單鏈區(qū)域包含所述Si序列，以及 與所述第2引物的延伸鏈對應(yīng)的第2復(fù)制鏈，在其同一鏈上形成第2莖環(huán)結(jié)構(gòu)體，該第2莖環(huán)結(jié)構(gòu)體含有:包含第2莖部分的第2雙鏈區(qū)域、和構(gòu)成第2環(huán)部分的第2單鏈區(qū)域，所述第2雙鏈區(qū)域包含來源于所述S2序列的互補序列的第2莖部分和與該第2莖部分互補的來源于所述第2模板序列的互補序列的序列，所述構(gòu)成第2環(huán)部分的第2單鏈區(qū)域包含所述SI序列的互補序列， (a-2)準備用于檢出所述第I復(fù)制鏈和/或所述第2復(fù)制鏈的第I核酸探針和/或第2核酸探針， 這里， 所述第I核酸探針是所述第I復(fù)制鏈的所述構(gòu)成第I環(huán)部分的第I單鏈區(qū)域的至少一部分的序列， 所述第2核酸探針是所述第2復(fù)制鏈的所述構(gòu)成第2環(huán)部分的第2單鏈區(qū)域的至少一部分的序列， (b)使用所述第I引物和第2引物來擴增所述樣本， (c)使所述(b)中獲得的擴增產(chǎn)物與所述第I核酸探針和/或第2核酸探針反應(yīng)， (d)檢出所述第I核酸探針和/或第2核酸探針與所述擴增產(chǎn)物的雜交的有無，和/或測定雜交量， (e)基于所述(d)的結(jié)果，確定所述樣本中的所述目標核酸的有無，和/或確定存在量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸分析法，所述擴增是PCR擴增反應(yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸分析法，所述核酸探針被固定化于基體上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的核酸分析法，所述被固定化于基體上的核酸探針與所述擴增產(chǎn)物的雜交的檢出和/或定量，使用顯示電化學(xué)活性的嵌入劑來進行。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的核酸分析法，所述樣本包含基因，該分析的對象是該基因。
6.檢測試劑盒，是用于在權(quán)利要求1所述的核酸分析法中使用的檢測試劑盒， 所述檢測試劑盒包含引物組和核酸探針， 由所述引物組擴增的第I模板核酸包含位于3’端的第I序列、與該第I序列的5’側(cè)鄰接的第I模板序列、和與該第I模板序列的5’側(cè)鄰接且位于5’端的第2序列，以及由所述引物組擴增的第2模板核酸是所述第I模板核酸的互補鏈，包含位于其3’端的第3序列、與該第3序列的5’側(cè)鄰接的第2模板序列、和與該第2模板序列的5’側(cè)鄰接且位于5’端的第4序列， 所述引物組是以下的⑴和/或⑵: (1)所述第I引物包含作為所述第I序列的互補序列的SI序列、和與所述SI序列的5’端側(cè)連接的S2序列，所述S2序列是作為所述第I模板序列的至少一部分的與所述第I序列的5’側(cè)鄰接或位于所述第I序列的5’側(cè)的附近的序列，以及 所述第2引物包含作為所述第3序列的互補序列的S3序列， (2)所述第I引物包含作為所述第I序列的互補序列的SI序列、和與所述SI序列的5’端側(cè)連接的S2序列，所述S2序列是作為所述第I模板序列的至少一部分的與所述第I序列的5’側(cè)鄰接或位于所述第I序列的5’側(cè)的附近的序列，以及· 所述第2引物包含作為所述第3序列的互補序列的S3序列、和與所述S3序列的5’側(cè)連接的S4序列，所述S4序列是作為所述第2模板序列的至少一部分的、與所述第3序列的5’側(cè)鄰接或位于所述第3序列的5’側(cè)的附近的序列， 所述核酸探針從以下的組中選擇至少I種: 包含所述SI序列的至少一部分的序列的核酸探針， 包含所述SI序列的互補序列的至少一部分的序列的核酸探針， 包含所述S3序列的至少一部分的序列的核酸探針，和 包含所述S3序列的互補序列的至少一部分的序列的核酸探針。
7.核酸分析法，是對于樣本的核酸分析法， 應(yīng)被擴增的核酸包含第I模板核酸和第2模板核酸， 所述第I模板核酸包含位于3’端的第I序列、與該第I序列的5’側(cè)鄰接的第I模板序列、和與該第I模板序列的5’側(cè)鄰接且位于5’端的第2序列，以及 所述第2模板核酸是所述第I模板核酸的互補鏈，包含位于其3’端的第3序列、與該第3序列的5’側(cè)鄰接的第2模板序列、和與該第2模板序列的5’側(cè)鄰接且位于5’端的第4序列， 該核酸分析法具備以下(a_l)、(a-2)、(b)、(c)、(d)和(e)的工序: (a-Ι)準備用于擴增所述第I模板核酸和所述第2模板核酸的第I引物和第2引物， 這里， 所述第I引物包含作為所述第I序列的互補序列的SI序列、和與所述SI序列的5’側(cè)連接的S2序列，所述S2序列是作為所述第I模板序列的至少一部分的、與所述第I序列的5’側(cè)鄰接或位于所述第I序列的5’側(cè)的附近的序列，所述第2引物包含作為所述第3序列的互補序列的S3序列、和與所述S3序列的5’側(cè)連接的S4序列，所述S4序列是作為所述第2模板序列的至少一部分的、與所述第3序列的5’側(cè)鄰接或位于所述第3序列的5’側(cè)的附近的序列， 另外這里， 與所述第I引物的延伸鏈對應(yīng)的第I復(fù)制鏈，在其同一鏈上形成第I莖環(huán)結(jié)構(gòu)體，該第I莖環(huán)結(jié)構(gòu)體含有:包含第I莖部分的第I雙鏈區(qū)域、和構(gòu)成第I環(huán)部分的第I單鏈區(qū)域，所述第I雙鏈區(qū)域包含來源于所述S2序列的第I莖部分和與該第I莖部分互補的來源于所述第I模板序列的互補序列的序列，所述構(gòu)成第I環(huán)部分的第I單鏈區(qū)域包含所述Si序列， 與所述第I引物的延伸鏈對應(yīng)的第2復(fù)制鏈，在其同一鏈上形成第2莖環(huán)結(jié)構(gòu)體，該第2莖環(huán)結(jié)構(gòu)體含有:包含第2莖部分的第2雙鏈區(qū)域、和構(gòu)成第2環(huán)部分的第2單鏈區(qū)域，所述第2雙鏈區(qū)域包含來源于所述S4序列的互補序列的第2莖部分和與該第2莖部分互補的來源于所述第I模板序列的互補序列的序列，所述構(gòu)成第2環(huán)部分的第2單鏈區(qū)域包含所述S3序列的互補序列， 與所述第2引物的延伸鏈對應(yīng)的第3復(fù)制鏈，在其同一鏈上形成第3莖環(huán)結(jié)構(gòu)體，該第3莖環(huán)結(jié)構(gòu)體含有:包含第3莖部分的第3雙鏈區(qū)域、和構(gòu)成第3環(huán)部分的第3單鏈區(qū)域，所述第3雙鏈區(qū)域包含來源于所述S4序列的第3莖部分和與該第3莖部分互補的來源于所述第2模板序列的互補序列的序列，所述構(gòu)成第3環(huán)部分的第3單鏈區(qū)域包含所述S3序列， 與所述第2引物的延伸鏈對應(yīng)的第4復(fù)制鏈，在其同一鏈上形成第4莖環(huán)結(jié)構(gòu)體，該第4莖環(huán)結(jié)構(gòu)體含有:包含第4莖部分的第4雙鏈區(qū)域、和構(gòu)成第4環(huán)部分的第4單鏈區(qū)域，所述第4雙鏈區(qū)域包含來源于所述S2序列的互補序列的第4莖部分和與該第4莖部分互補的來源于所述第2模板序列的互補 序列的序列，所述構(gòu)成第4環(huán)部分的第4單鏈區(qū)域包含所述SI序列的互補序列， (a-2)準備用于檢出所述第I復(fù)制鏈和/或所述第2復(fù)制鏈的、選自第I核酸探針、第2核酸探針、第3核酸探針和第4核酸探針中的至少I種探針， 這里， 所述第I核酸探針是所述第I復(fù)制鏈的所述構(gòu)成第I環(huán)部分的第I單鏈區(qū)域的至少一部分的序列， 所述第2核酸探針是所述第2復(fù)制鏈的所述構(gòu)成第2環(huán)部分的第2單鏈區(qū)域的至少一部分的序列， 所述第3核酸探針包含作為所述第3復(fù)制鏈的所述構(gòu)成第3環(huán)部分的第3單鏈區(qū)域的至少一部分的序列的、所述S3序列的互補的序列的至少一部分的序列， 所述第4核酸探針包含作為所述第4復(fù)制鏈的所述構(gòu)成第4環(huán)部分的第4單鏈區(qū)域的至少一部分的序列的、所述SI序列的至少一部分的序列， (b)使用所述第I引物和第2引物來擴增所述樣本， (c)使所述(b)中獲得的擴增產(chǎn)物與所述第I核酸探針、第2核酸探針、第3核酸探針和第4核酸探針中的至少I種探針反應(yīng)， (d)檢出由所述(C)的反應(yīng)生成的雜交的有無，和/或測定雜交量，(e)基于所述(d)的結(jié)果，確定所述樣本中的所述目標核酸的有無，和/或確定存在量。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的核酸分析法，所述擴增是PCR擴增反應(yīng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的核酸分析法，所述核酸探針被固定化于基體上。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的核酸分析法，所述被固定化于基體上的核酸探針與所述擴增產(chǎn)物的雜交的檢出和/或定量，使用顯示電化學(xué)活性的嵌入劑來進行。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的核酸分析法，所述樣本包含基因，該分析的對象是該基因。
12.檢測試劑盒，是用于在權(quán)利要求7所述的核酸分析法中使用的檢測試劑盒， 所述檢測試劑盒包含引物組和核酸探針， 由所述引物組擴增的第I模板核酸包含位于3’端的第I序列、與該第I序列的5’側(cè)鄰接的第I模板序列、和與該第I模板序列的5’側(cè)鄰接且位于5’端的第2序列，以及由所述引物組擴增的第2模板核酸是所述第I模板核酸的互補鏈，包含位于其3’端的第3序列、與該第3序列的5’側(cè)鄰接的第2模板序列、和與該第2模板序列的5’側(cè)鄰接且位于5’端的第4序列， 所述引物組是以下的⑴和/或⑵: (1)所述第I引物包含作為所述第I序列的互補序列的SI序列、和與所述SI序列的5’側(cè)連接的S2序列，所述S2序列是作為所述第I模板序列的至少一部分的、與所述第I序列的5’側(cè)鄰接或位于所述第I序列的5’側(cè)的附近的序列，以及 所述第2引物包含作為所述第3序列的互補序列的S3序列， (2)所述第I引物包含作為所述`第I序列的互補序列的SI序列、和與所述SI序列的5’側(cè)連接的S2序列，所述S2序列是作為所述第I模板序列的至少一部分的、與所述第I序列的5’側(cè)鄰接或位于所述第I序列的5’側(cè)的附近的序列， 所述第2引物包含作為所述第3序列的互補序列的S3序列、和與所述S3序列的5’側(cè)連接的S4序列，所述S4序列是作為所述第2模板序列的至少一部分的、與所述第3序列的5’側(cè)鄰接或位于所述第3序列的5’側(cè)的附近的序列， 所述核酸探針從以下的組中選擇至少I種: 包含所述SI序列的至少一部分的序列的核酸探針， 包含所述SI序列的互補序列的至少一部分的序列的核酸探針， 包含所述S3序列的至少一部分的序列的核酸探針，和 包含所述S3序列的互補序列的至少一部分的序列的核酸探針。
【文檔編號】C12Q1/68GK103717752SQ201280037302
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2012年7月27日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月5日
【發(fā)明者】中村奈緒子, 橋本幸二, 橋本美智惠, 源間信弘, 二階堂勝 申請人:株式會社 東芝