使用與嵌入劑偶聯(lián)的金屬納米粒子檢測(cè)核酸的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種使用嵌入劑偶聯(lián)的金屬納米粒子檢測(cè)核酸的方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種方法，其包含將含有靶核酸的樣品施加于具有有DNA探針固定其上的基底的DNA芯片，使與雙螺旋核酸相結(jié)合的嵌入劑在其中偶聯(lián)的金屬納米粒子起反應(yīng)，以及使金屬增強(qiáng)溶液起反應(yīng)從而放大所述金屬納米粒子的尺寸并用肉眼檢測(cè)所述靶核酸。根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)核酸的方法使用嵌入劑偶聯(lián)的金屬納米粒子，并因此能夠在沒(méi)有任何其它設(shè)備的情況下用肉眼檢測(cè)核酸；因此，與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，本發(fā)明具有降低分析成本和檢測(cè)所需時(shí)間的效果，并能夠使裝置的尺寸小型化，從而能夠在畜牧場(chǎng)、家里或類(lèi)似的地方進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)診斷。
【專(zhuān)利說(shuō)明】使用與嵌入劑偶聯(lián)的金屬納米粒子檢測(cè)核酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及使用與嵌入劑偶聯(lián)的金屬納米粒子檢測(cè)核酸的方法，更具體地說(shuō)，涉及一種方法，其中將含祀核酸的樣品施加于其中探針被固定于基底的DNA芯片，使與嵌入劑偶聯(lián)的金屬納米粒子起反應(yīng)，使金屬增強(qiáng)溶液起反應(yīng)，金屬納米粒子的尺寸被放大，并用肉眼檢測(cè)所述靶核酸。
【背景技術(shù)】
[0002]生物芯片是指生物信息檢測(cè)元件，其中生物材料比如DNA、蛋白質(zhì)、抗體、糖鏈、細(xì)胞或神經(jīng)元以高密度整合于固體基質(zhì)比如玻璃、硅樹(shù)脂、聚合物上，以超高速度分析極微量的樣品，獲得生物信息比如基因表達(dá)模式、遺傳缺陷、蛋白分布和神經(jīng)元之間的相互信息交流，并且生物化學(xué)鑒定、反應(yīng)速率或信息處理速率提高。 [0003]生物芯片可根據(jù)與生物分子的系統(tǒng)化程度分為DNA芯片、RNA芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片、神經(jīng)元芯片等等，并且可被廣義地定義為包括可檢測(cè)和分析各種生化材料的“生物傳感器”，比如以小尺寸整合樣品預(yù)處理、生化反應(yīng)、檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析并具有自動(dòng)分析功能的芯片實(shí)驗(yàn)室。
[0004]特別是，根據(jù)人類(lèi)基因組計(jì)劃的進(jìn)程，DNA芯片技術(shù)已作為取代現(xiàn)有分子生物學(xué)研究方法的技術(shù)進(jìn)入了公眾注意的中心。在DNA芯片中，數(shù)十到數(shù)百萬(wàn)種的DNA片段被整合入非常小的表面比如載玻片。使用DNA芯片的DNA檢測(cè)方法可在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)少量樣品中所包含的RNA或DNA,并已引起公眾的注意，因?yàn)樗軌蚴宫F(xiàn)有的Southern blot和Northernblot在短時(shí)間內(nèi)大規(guī)模的進(jìn)行。DNA芯片可用于基因組DNA的突變檢測(cè)、基因診斷、藥物基因組學(xué)、個(gè)體化用藥和對(duì)于基因組研究和分子生物學(xué)研究必不可少的大規(guī)模的RNA表達(dá)測(cè)量。
[0005]目前，已出臺(tái)兩種DNA芯片，寡核苷酸芯片和cDNA芯片。在寡核苷酸芯片中，成千上萬(wàn)的20到25聚體的寡核苷酸被整合。在cDNA芯片中，比所述寡核苷酸長(zhǎng)的cDNA片段被整合。
[0006]在DNA芯片的已知的基本原理中，使用各種方法將具有特異序列的探針DNA片段整合入被稱(chēng)作芯片的表面，并從整合的探針DNA片段中檢測(cè)結(jié)合所述樣品中所含靶DNA(或RNA)的大量的探針DNA。
[0007]制作和使用DNA芯片的技術(shù)包括固定可特異性與靶DNA反應(yīng)的探針的技術(shù)，檢測(cè)反應(yīng)是否發(fā)生的技術(shù)，以及可處理所檢測(cè)信息的信息處理技術(shù)。
[0008]用于檢測(cè)反應(yīng)是否發(fā)生的技術(shù)通常使用特定類(lèi)型的標(biāo)記比如熒光、彩色顯影和同位素。標(biāo)記技術(shù)對(duì)于增加靈敏度是重要的，但是生物分子可由于標(biāo)記而變形并且難以標(biāo)記低分子物質(zhì)。此外，大量的樣品用于標(biāo)記步驟，而且還需要2到3個(gè)操作。目前主要使用的代表性的標(biāo)記方法包括使用激光的熒光檢測(cè)方法。在所述使用激光的熒光檢測(cè)方法中，熒光物質(zhì)與樣品結(jié)合，并使用所結(jié)合的熒光物質(zhì)光學(xué)測(cè)定與固定于基底上的探針的反應(yīng)。盡管熒光檢測(cè)方法目前被廣泛應(yīng)用，但是需要光學(xué)測(cè)量?jī)x來(lái)測(cè)定反應(yīng)是否發(fā)生，從而需要很多時(shí)間和成本。另外，當(dāng)使用這種檢測(cè)方法時(shí)，難以最小化基于DNA芯片的分析系統(tǒng)。另外，進(jìn)一步需要將所述熒光物質(zhì)連接到樣品中的靶分子的操作，與無(wú)標(biāo)記的檢測(cè)方法相比較為繁瑣。
[0009]因此，使用無(wú)標(biāo)記方法的測(cè)量技術(shù)在DNA芯片【技術(shù)領(lǐng)域】中已越來(lái)越被需要。一種這樣的無(wú)標(biāo)記檢測(cè)方法為電化學(xué)檢測(cè)方法。在所述電化學(xué)檢測(cè)方法中，使用電極上的其它化學(xué)物質(zhì)的電化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)反應(yīng)，其中所述探針和樣品結(jié)合。然而，這種方法比熒光檢測(cè)方法具有相對(duì)低的測(cè)量能力。
[0010]如上文所述，現(xiàn)有的檢測(cè)方法具有有限的效率。因此,當(dāng)這些方法在生化實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用和進(jìn)行時(shí)，所述實(shí)驗(yàn)總是牽涉在實(shí)際使用方面可靠性和滿意度最小化的問(wèn)題。
[0011]因此，發(fā)明人試圖解決低效率以及現(xiàn)有DNA芯片中所需要的額外的昂貴的儀器的問(wèn)題。當(dāng)與嵌入劑偶聯(lián)的金屬納米粒子結(jié)合于與DNA探針結(jié)合的靶核酸并且金屬增強(qiáng)溶液起反應(yīng)時(shí)，由于所述金屬增強(qiáng)溶液，所述金屬納米粒子被放大至可用肉眼觀察，并因此能夠進(jìn)行無(wú)額外儀器的無(wú)標(biāo)記檢測(cè)。進(jìn)一步地，發(fā)明人證實(shí)了所述靶核酸的定量分析可使用一般的掃描儀進(jìn)行并完成了本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]摶術(shù)問(wèn)是頁(yè)
[0013]本發(fā)明提供了一種不需要昂貴儀器、用肉眼快速檢測(cè)和定量核酸的方法。
_4] 技術(shù)方案
[0015]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，有提供一種使用與嵌入劑偶聯(lián)的金屬納米粒子檢測(cè)核酸的方法。該方法包括(a)將包含靶核酸的樣品施加于其中固定有要與所述靶核酸雜交的DNA探針的基底，并使所述探針和所述靶``核酸雜交；(b)使與所述嵌入劑偶聯(lián)的所述金屬納米粒子與在(a)的操作中雜交的雙螺旋核酸反應(yīng)；(c)使金屬增強(qiáng)溶液與結(jié)合于所述雙螺旋核酸的所述金屬納米粒子反應(yīng)；以及(d)通過(guò)分析反應(yīng)斑點(diǎn)的顏色變化來(lái)檢測(cè)所述靶核酸。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，有提供一種使用與嵌入劑偶聯(lián)的金屬納米粒子定量核酸的方法。該方法包括(a)將包含靶核酸的樣品施加于其中固定有要與所述靶核酸雜交的探針的基底，并使所述探針和所述靶核酸雜交；(b)使與所述嵌入劑偶聯(lián)的金屬納米粒子與在(a)的操作中雜交的雙螺旋核酸反應(yīng)；(c)使金屬增強(qiáng)溶液與結(jié)合于所述雙螺旋核酸的所述金屬納米粒子反應(yīng)；以及(d)通過(guò)分析反應(yīng)斑點(diǎn)的顏色變化來(lái)定量所述靶核酸。
_7] 有益.效果
[0018]根據(jù)本發(fā)明，檢測(cè)核酸的方法使用與嵌入劑偶聯(lián)的金屬納米粒子。因此，與現(xiàn)有檢測(cè)方法相比，能夠在沒(méi)有任何儀器的情況下用肉眼檢測(cè)核酸，并減少檢測(cè)時(shí)間和分析成本。另外，它能夠使裝置最小化以及在奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)或家里進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)診斷。
附圖簡(jiǎn)介
[0019]圖1圖示說(shuō)明了根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)核酸的方法的過(guò)程。
[0020]圖2圖示說(shuō)明了根據(jù)本發(fā)明的將作為嵌入劑的道諾霉素與雙螺旋核酸結(jié)合的過(guò)程和偶聯(lián)道諾霉素和金納米粒子的過(guò)程。[0021]圖3為顯示由與靶核酸DNA的特異雜交反應(yīng)產(chǎn)生的每個(gè)DNA濃度的斑點(diǎn)和其以灰度形式的定量分析結(jié)果的圖表。
[0022]發(fā)明模式
[0023]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，有提供一種使用與嵌入劑偶聯(lián)的金屬納米粒子檢測(cè)核酸的方法。該方法包括(a)將包含靶核酸的樣品施加于其中固定有要與所述靶核酸雜交的DNA探針的基底，并使所述探針與所述靶核酸雜交；(b)使與所述嵌入劑偶聯(lián)的所述金屬納米粒子與在(a)的操作中雜交的雙螺旋核酸反應(yīng)；(c)使金屬增強(qiáng)溶液與結(jié)合所述雙螺旋核酸的金屬納米粒子反應(yīng)；以及(d)通過(guò)分析反應(yīng)斑點(diǎn)的顏色變化來(lái)檢測(cè)所述靶核酸。
[0024]在本發(fā)明中，所述基底的類(lèi)型包括在相關(guān)領(lǐng)域中常用的用于制作DNA芯片的固體基底而沒(méi)有限制。優(yōu)選地，可使用玻璃、氧化鋁、陶瓷、碳、金、銀、銅、鋁、化合物半導(dǎo)體、硅樹(shù)脂等。更優(yōu)選地，可使用玻璃基底。在所述基底上進(jìn)行表面處理。進(jìn)行表面處理以容易連接和固定探針?lè)肿印Ａ硗?，可進(jìn)行表面處理以包括用于在所述DNA芯片的物質(zhì)表面上固定生物分子的官能團(tuán)。例如，所述基底可改良成醛基、羧基或胺基。當(dāng)使用玻璃基底或半導(dǎo)體基底時(shí)，進(jìn)行硅烷處理以形成氨基(比如-NH3或-NH2)。為了有效地進(jìn)行所述硅烷處理，也可在硅烷處理前進(jìn)行生成羥基(-0H)的處理。在本發(fā)明中，在所述基底上固定探針?lè)肿拥娜魏畏椒ň墒褂枚鴽](méi)有限制，并且可使用化學(xué)或物理方法。
[0025]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，在玻璃基底的表面進(jìn)行O2等離子處理，-OH暴露于所述玻璃基底的表面，所述表面用胺基進(jìn)行功能化，用胺基處理的表面用羧基進(jìn)行取代，并且將具有氨基(-NH2)的作為探針的DNA通過(guò)肽鍵作為共價(jià)鍵固定于所述基底上。沒(méi)有結(jié)合所述DNA的基底通過(guò)與具有胺基的聚乙二醇(PEG)反應(yīng)而封閉以防止背景染色。
[0026]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“DNA探針”是指可特異地結(jié)合樣品中要被檢測(cè)的靶核酸的物質(zhì)和可通過(guò)所述結(jié)合特異地檢查靶核酸是否在樣品中存在的物質(zhì)。
[0027]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“靶核酸”是指樣品中的要被檢測(cè)的物質(zhì)。所述靶核酸的類(lèi)型包括DNA、RNA、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)等等，并且更優(yōu)選地，是指DNA。更具體地說(shuō)，所述靶核酸可作為生物材料或類(lèi)似地來(lái)源于有機(jī)體，或體外制備，DNA包括cDNA、基因組DNA和寡核苷酸，并且RNA包括基因組RNA、mRNA、寡核苷酸等。
[0028]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“樣品”是指組織、細(xì)胞、全血、血清、血漿、唾液、痰、腦脊液或尿液，其包含要被檢測(cè)的所述靶核酸，但是所述樣品不限于此。
[0029]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“斑點(diǎn)”是指其中探針被精細(xì)地整合在基底上的部分，也就是說(shuō)，是指其中DNA探針被固定于基底上比如所述DNA芯片的部分。
[0030]當(dāng)包含靶核酸的所述樣品接觸到其中具有固定的DNA探針的基底時(shí)，探針?lè)肿雍蜆悠分械陌泻怂嶂g的特異結(jié)合反應(yīng)，即靶核酸和DNA探針的互補(bǔ)序列之間的特異雜交反應(yīng)發(fā)生。
[0031]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，將能夠檢測(cè)靶核酸的探針固定于基底上，并且為了減少非特異反應(yīng)，使用封閉分子封閉其中探針不起反應(yīng)的部分。此時(shí)，當(dāng)要被測(cè)量的靶核酸起反應(yīng)時(shí)，具有互補(bǔ)序列的靶核酸和探針雜交并形成雙螺旋形式。在所述靶核酸起反應(yīng)后，與所述嵌入劑偶聯(lián)的所述金屬納米粒子起反應(yīng)，所述嵌入劑僅結(jié)合雜交的雙螺旋核酸而不結(jié)合非雜交部分，并因此納米粒子不連接到那。
[0032]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“嵌入劑”是指能嵌入雙螺旋核酸的所有物質(zhì)并且可包括硫酸鏈霉素、硫酸慶大霉素、鹽酸道諾霉素、諾加霉素、阿霉素、赫達(dá)霉素、米托蒽醌、替洛隆、赫斯特33258、奎納克林和吖啶橙。
[0033]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，制備金屬納米粒子溶液，加入所述嵌入劑并起反應(yīng)，然后制備與所述嵌入劑偶聯(lián)的金屬納米粒子。在此，加入所述金屬納米粒子溶液的所述嵌入劑的比例可為0.1mM到ImM，并且反應(yīng)時(shí)間可為大約3到10小時(shí)。在這種情況下，在所述偶聯(lián)的金屬納米粒子中，通過(guò)通過(guò)現(xiàn)有的精制方法比如透析去除未結(jié)合所述嵌入劑的金屬納米粒子從而僅獲得與道諾霉素偶聯(lián)的金屬納米粒子。
[0034]所述金屬納米粒子可包括金(Au)、銀(Ag)和鉬(Pt)，可通過(guò)混合金屬離子和還原劑而制備，或者也可很容易地從商業(yè)試劑公司比如Sigma獲得。
[0035]在本發(fā)明中，進(jìn)行其中所述金屬增強(qiáng)溶液起反應(yīng)的操作(C)以放大結(jié)合所述雜交的雙螺旋核酸的與所述嵌入劑偶聯(lián)的金屬納米粒子的尺寸，并因此用肉眼檢測(cè)和測(cè)量所述靶核酸。
[0036]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“金屬增強(qiáng)溶液”是指金屬離子的溶液并且是指當(dāng)使用所述金屬納米粒子作為催化劑還原所述金屬納米粒子周?chē)慕饘匐x子時(shí)可以放大納米粒子尺寸的溶液?？蓻](méi)有限制地使用相關(guān)領(lǐng)域中常用的能夠放大納米粒子尺寸的金屬增強(qiáng)溶液。優(yōu)選地，可使用包含金(Au)、銀(Ag)、銅(Cu)、鉬(Pt)或鈀(Pd)離子的溶液，更優(yōu)選地，可使用包含金離子的溶液。[0037]在本發(fā)明中，所述靶核酸可通過(guò)用肉眼觀察操作(d)中的斑點(diǎn)的顏色變化來(lái)檢測(cè)，但是本發(fā)明不限于此。所述靶核酸可通過(guò)使用光學(xué)原理比如反射方法或透射方法測(cè)量反射光或透射光的強(qiáng)度變化來(lái)檢測(cè)。在這種情況下，最終檢測(cè)信號(hào)可通過(guò)黑與白的灰度大小來(lái)表示。
[0038]例如，灰度光強(qiáng)度可使用短波長(zhǎng)光源比如LED或激光二極管并使用光電二極管陣列比如CMOS或CCD作為光檢測(cè)裝置進(jìn)行測(cè)量，但是本發(fā)明不限于此?？墒褂闷胀ü鈷呙杵鬟M(jìn)行分析。
[0039]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，與所述嵌入劑偶聯(lián)的金納米粒子起反應(yīng)，以及金增強(qiáng)溶液起反應(yīng)I分鐘。其結(jié)果是，金離子減少，金納米粒子的周邊包被有金屬，所述粒子的尺寸增加，以及靶核酸與其連接的部分以灰色出現(xiàn)并用肉眼觀察。特別地，觀察到與探針特異反應(yīng)的部分呈現(xiàn)深灰色而非特異部分呈現(xiàn)非常淺的灰色或者看不到。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法，能夠通過(guò)在靶核酸或探針?lè)肿由虾?jiǎn)單地標(biāo)記熒光物質(zhì)或者使用所述DNA芯片在沒(méi)有額外的光學(xué)儀器或熒光掃描器的情況下用肉眼檢測(cè)所述靶核酸(圖1)。
[0040]根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，有提供一種使用與嵌入劑偶聯(lián)的金屬納米粒子定量核酸的方法。該方法包括(a)將包含靶核酸的樣品施加于其中固定有要與所述靶核酸雜交的探針的基底，并使所述探針與所述靶核酸雜交，(b)使與所述嵌入劑偶聯(lián)的所述金屬納米粒子與操作(a)中雜交的雙螺旋核酸反應(yīng)；(C)使金屬增強(qiáng)溶液與結(jié)合所述雙螺旋核酸的金屬納米粒子反應(yīng)；以及(d)通過(guò)分析反應(yīng)斑點(diǎn)的顏色變化來(lái)定量所述靶核酸。
[0041]在本發(fā)明中，測(cè)量操作(d)中與所述金屬增強(qiáng)溶液反應(yīng)的部分的反應(yīng)強(qiáng)度用于樣品中的靶核酸的定量分析。隨著樣品中的靶核酸濃度增加，與所述金屬增強(qiáng)溶液反應(yīng)的部分的反應(yīng)強(qiáng)度也增加，并因此能夠定量所述靶核酸。
[0042]操作(d)中斑點(diǎn)的顏色變化可使用利用光學(xué)原理比如反射方法或透射方法的反射光或透射光的強(qiáng)度變化來(lái)測(cè)量。最終檢測(cè)信號(hào)可通過(guò)黑與白的灰度大小來(lái)表示。
[0043]例如，灰度光強(qiáng)度可使用短波長(zhǎng)光源比如LED或激光二極管，并使用光電二極管陣列比如CMOS或CCD作為光檢測(cè)裝置進(jìn)行測(cè)量，但是本發(fā)明不限于此?？墒褂闷胀ü鈷呙杵鬟M(jìn)行分析。
[0044]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，觀察到隨著靶核酸從IpM增至ΙΟΟηΜ，灰色的斑點(diǎn)變得較暗和較大。使用普通掃描器捕獲該變化并使用Adobe Photoshop軟件分析灰度變化。結(jié)果，觀察到，隨著靶核酸的濃度增加，灰度值也增加，并且所述靶核酸未連接其上的周?chē)谉o(wú)關(guān)所述濃度而呈恒定值。因此，能使用普通掃描器和通用軟件定量分析靶核酸。
[0045]以下，將參考實(shí)施例具體地描述本發(fā)明。這些實(shí)施例應(yīng)被認(rèn)為僅為描述性的意義，并且本發(fā)明的范圍并不限于這些實(shí)施例，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。
[0046]實(shí)施例1.制備與嵌入劑偶聯(lián)的金屬納米粒子的方法
[0047]為了制備與嵌入劑偶聯(lián)的金屬納米粒子，將18.5ml蒸餾水倒入容器中。當(dāng)所述容器以 500RPM 搖動(dòng)時(shí)，加入 500yL HAuCl4(IOmM)、500 μ L 檸檬酸鈉(IOmM)和 500 μ LNaBH4(IOOmM)并反應(yīng)三小時(shí)，加入400 μ L10%的十二烷基硫酸鈉(SDS)，以及加入400 μ L道諾霉素(lOmM，Sigma Aldrich)，反應(yīng)六小時(shí)或以上以達(dá)到0.2mM的最終濃度，以及最后在
0.2%SDS檸檬酸鈉(2.5mM)溶液中透析。在去除未連接金納米粒子的道諾霉素后，最終獲得與精制的道諾霉素偶聯(lián)的金納米粒子。
[0048]實(shí)施例2.玻璃基底的處理
[0049] 將玻璃基底使用Piranha溶液清洗，進(jìn)行O2等離子處理，并將-OH基暴露于所述玻璃基底的表面。將所述玻璃基底與在乙醇溶液中制備的2%氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)反應(yīng)兩個(gè)小時(shí)。反應(yīng)兩小時(shí)后，將所述表面用乙醇清洗、干燥并在120°C的電熱板上烘烤I小時(shí)，從而所述玻璃基底的表面用胺進(jìn)行了功能化。所述基底在二甲基甲酰胺(DMF)中與琥珀酰酐(IM)反應(yīng)過(guò)夜，然后清洗，用胺處理的玻璃基底用羧基(-C00H)進(jìn)行取代。
[0050]實(shí)施例3.制作DNA芯片
[0051]為了制作DNA芯片，首先，EDC/NHS反應(yīng)15分鐘，10 μ M的包含 NH2-0-AATGGTTTATTCTGCTCA 的 DNA (以下稱(chēng)為“Ηδ”)和 δΟμΜ 的包含NH2-0-GACATCAAGCAGCCATC的對(duì)照DNA (以下稱(chēng)為“HM”)反應(yīng)I小時(shí)，從而將作為探針的DNA固定于實(shí)施例1中所制備的玻璃基底。為了封閉其中DNA未被固定的部分,具有氨基末端的乙醇胺(IM)反應(yīng)I小時(shí)，從而制作有探針連接其中的DNA芯片。
[0052]實(shí)施例4.與靶核酸DNA的特異雜交反應(yīng)
[0053]為了核實(shí)靶核酸DNA和實(shí)施例2中制備的有探針連接其中的DNA芯片的特異雜交反應(yīng)，在作為探針的所述H5DNA中，將具有TGA GCA GAA TAA ACC ATT的序列(其為互補(bǔ)序列 ID N0.1)的靶 DNA(Bioneer，Korea)和作為所述對(duì)照的序列 ID N0.2GAT GGC TGC TTGATG TC用雜交緩沖液(5XSSC，0.2%SDS)稀釋?zhuān)⑦M(jìn)行各個(gè)濃度的雜交反應(yīng)。
[0054]實(shí)施例5.與靶核酸DNA的特異雜交反應(yīng)的放大和測(cè)暈
[0055]為了放大和測(cè)量與靶核酸DNA的特異雜交反應(yīng)，將實(shí)施例4中在其上進(jìn)行雜交反應(yīng)的DNA芯片用SSC緩沖溶液清洗，去除未反應(yīng)的DNA。然后，與所述嵌入劑偶聯(lián)的金納米粒子反應(yīng)10分鐘，用所述SSC緩沖溶液清洗，并與所述金增強(qiáng)溶液(0.85mL HAuCl4(IOmM)、
0.25mL AgNO3(IOmM)、0.27mL 抗壞血酸(IOOmM)、20mL CTAB(IOOmM))反應(yīng) I 分鐘。然后，將在其上進(jìn)行所述雜交反應(yīng)的DNA芯片用水清洗，并觀察所述特異雜交反應(yīng)。
[0056]首先，使用普通掃描器觀察玻璃基底上形成的斑點(diǎn)。如圖3中所示，能夠用肉眼觀察到，僅在其中與靶核酸DNA的特異雜交反應(yīng)發(fā)生的部分形成灰色斑點(diǎn)。在圖3中，所述靶核酸DNA特異地連接作為探針的H5并形成灰色斑點(diǎn)，所述對(duì)照DNA僅特異地連接作為對(duì)照的HN并形成灰色斑點(diǎn)。可以看出，在非互補(bǔ)的探針DNA和靶核酸DNA處沒(méi)有斑點(diǎn)出現(xiàn)或斑點(diǎn)模糊地出現(xiàn)，并且灰色的顏色強(qiáng)度根據(jù)所述靶核酸DNA的濃度而增加。因此，可以證實(shí)，本發(fā)明的雜交反應(yīng)為特異地進(jìn)行的，所述嵌入劑與其中雜交反應(yīng)發(fā)生的靶核酸DNA和探針DNA的結(jié)合相結(jié)合。當(dāng)處理引起還原反應(yīng)的金增強(qiáng)溶液時(shí)，金屬離子使用金納米粒子作為催化劑進(jìn)行還原，并且粒子的尺寸增加到能夠在沒(méi)有額外的光學(xué)儀器的存在下用肉眼觀察斑點(diǎn)的程度。
[0057]此外,使用Adobe Photoshop軟件對(duì)所獲得的各個(gè)濃度祀核酸DNA的斑點(diǎn)以灰度形式進(jìn)行定量分析。如圖3中所示，結(jié)果顯示從IpM到IOOnM的各個(gè)濃度的灰度值增加。另一方面，可以觀察到，在所述靶核酸不與其連接的周?chē)咨蠠o(wú)關(guān)濃度進(jìn)行背景染色。
[0058]已具體描述了本
【發(fā)明內(nèi)容】
的特定部分。然而，這些具體的描述僅為示例性的實(shí)施例，本發(fā)明的范圍并不限于此，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的。因此，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書(shū)及其等同物所限定。
[0059]工業(yè)實(shí)用件
[0060]在根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)核酸的方法中，能夠在沒(méi)有任何儀器的情況下用肉眼檢測(cè)核酸、使裝置最小化并進(jìn)行 現(xiàn)場(chǎng)診斷。
【權(quán)利要求】
1.一種包括以下操作的使用與嵌入劑偶聯(lián)的金屬納米粒子檢測(cè)核酸的方法，所述方法包括: (a)將包含靶核酸的樣品施加于其中固定有要與所述靶核酸雜交的DNA探針的基底，并使所述探針和所述靶核酸雜交； (b)使與所述嵌入劑偶聯(lián)的所述金屬納米粒子與在操作(a)中雜交的雙螺旋核酸反應(yīng)； (C)使金屬增強(qiáng)溶液與結(jié)合于所述雙螺旋核酸的金屬納米粒子反應(yīng)；以及 (d)通過(guò)分析反應(yīng)斑點(diǎn)的顏色變化檢測(cè)所述靶核酸。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述靶核酸的所述檢測(cè)為用肉眼進(jìn)行測(cè)量。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中操作(d)中所述斑點(diǎn)的顏色變化用于測(cè)量反射光或透射光的強(qiáng)度變化。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述基底選自由玻璃、氧化鋁、陶瓷、碳、金、銀、銅、鋁和硅樹(shù)脂組成的組。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述嵌入劑選自由硫酸鏈霉素、硫酸慶大霉素、道諾霉素、諾加霉素、阿霉素、赫達(dá)霉素、米托蒽醌、替洛隆、赫斯特33258、奎納克林和吖啶橙組成的組。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述金屬納米粒子選自由金(Au)、銀(Ag)和鉬(Pt)組成的組?！?br> 7.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述金屬增強(qiáng)溶液選自由金(Au)、銀(Ag)、銅(Cu)、鉬(Pt)、鈀及其混合物組成的組。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其中操作(c)中的所述金屬增強(qiáng)溶液還原金屬離子并放大結(jié)合于所述雙螺旋核酸的金屬納米粒子的尺寸。
9.一種包括以下操作的使用與嵌入劑偶聯(lián)的金屬納米粒子定量核酸的方法，所述方法包括: (a)將包含靶核酸的樣品施加于其中固定有要與所述靶核酸雜交的探針的基底，并使所述探針和所述靶核酸雜交； (b)使與所述嵌入劑偶聯(lián)的所述金屬納米粒子與操作(a)中雜交的雙螺旋核酸反應(yīng)； (C)使金屬增強(qiáng)溶液與結(jié)合于所述雙螺旋核酸的金屬納米粒子反應(yīng)；以及 (d)通過(guò)分析反應(yīng)斑點(diǎn)的顏色變化定量所述祀核酸。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述基底選自由玻璃、氧化鋁、陶瓷、碳、金、銀、銅、鋁和硅樹(shù)脂組成的組。
11.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述嵌入劑選自由硫酸鏈霉素、硫酸慶大霉素、道諾霉素、諾加霉素、阿霉素、赫達(dá)霉素、米托蒽醌、替洛隆、赫斯特33258、奎納克林和吖啶橙組成的組。
12.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述金屬納米粒子選自由金(Au)、銀(Ag)和鉬(Pt)組成的組。
13.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述金屬增強(qiáng)溶液選自由金(Au)、銀(Ag)、銅(Cu)、鉬(Pt)、鈀及其混合物組成的組。
14.權(quán)利要求9所述的方法，其中操作(c)中的所述金屬增強(qiáng)溶液還原金屬離子并放大結(jié)合于所述雙螺旋核酸的金屬納米粒子的尺寸。
15.權(quán)利要求9所述的方法，其中操作(d)中的斑點(diǎn)的顏色變化用于測(cè)量反射光或透射光的強(qiáng)度 變化。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103717754SQ201280038262
【公開(kāi)日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2012年7月26日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月5日
【發(fā)明者】鄭鳳鉉, 金常圭, 趙賢敏 申請(qǐng)人:英迪股份有限公司